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Developmental Biology

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62086
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

Summary

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

Abstract

Somitogenesis는 척추 동물 배아 발달의 특징입니다. 수년 동안 연구자들은 생체외 및 시험관 내 접근법을 포괄하는 광범위한 기술을 사용하여 다양한 유기체에서이 과정을 연구해 왔습니다. 그러나 대부분의 연구는 여전히 2차원(2D) 이미징 데이터의 분석에 의존하고 있으며, 이는 복잡한 3D 공간에서 매우 역동적인 상호작용을 수반하는 축방향 확장 및 소미토제네시스와 같은 발달 과정에 대한 적절한 평가를 제한합니다. 여기서는 마우스 라이브 이미징 획득, 데이터 세트 처리, 시각화 및 분석을 3D 및 4D로 하여 이러한 발달 과정에 관여하는 세포(예: 신경중배엽 선조)를 연구할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 또한 마우스 배아에서 광학 프로젝션 단층 촬영 및 전체 마운트 면역 형광 현미경 검사 (샘플 준비에서 이미지 수집까지)를위한 단계별 프로토콜을 제공하고 3D 이미지 데이터를 처리하고 시각화하기 위해 개발 한 파이프 라인을 보여줍니다. 우리는 이러한 기술 중 일부의 사용을 확장하고 축 방향 확장 및 소마이트 형성 (예 : 3D 재구성)에 대한 현재의 이해를 향상시키는 데 사용할 수있는 다양한 사용 가능한 소프트웨어 (예 : 피지 / ImageJ, Drishti, Amira 및 Imaris)의 특정 기능을 강조합니다. 전체적으로 여기에 설명 된 기술은 발달 생물학에서 3D 데이터 시각화 및 분석의 중요성을 강조하며 다른 연구자가 척추 동물 축 확장 및 세분화의 맥락에서 3D 및 4D 이미지 데이터를보다 잘 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로,이 연구는 또한 척추 동물 배아 발달을 가르치기 위해 새로운 도구를 사용합니다.

Introduction

척추 동물의 체축 형성은 배아 발달 중에 발생하는 매우 복잡하고 역동적 인 과정입니다. 위축이 끝날 때 [마우스에서, 배아 일 (E) 8.0 전후], 신경 중배엽 선조 (NMPs)로 알려진 에피아세포 전구 세포 그룹이 머리에서 꼬리 서열에서 축 방향 확장의 핵심 동인이되어 목, 몸통 및 꼬리 형성 중에 신경관과 동축 중배엽 조직을 생성합니다 1,2,3,4 . 흥미롭게도, 이러한 NMP가 인과성 표피세포에서 차지하는 위치는 중배엽 또는 신경외배엽(neuroectoderm5)으로 분화하는 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 현재 NMP에 대한 정확한 분자 지문이 부족하지만, 이들 세포는 일반적으로 T (Brachyury)와 Sox2 5,6을 공동 발현하는 것으로 생각된다. NMP 운명 결정을 조절하는 정확한 메커니즘 (즉, 신경 또는 중배엽 경로를 취하는지 여부)은 정확하게 정의되기 시작했습니다. 원시적 줄무늬 영역에서의 Tbx6 발현은 NMP 운명 결정의 초기 마커이며, 이 유전자는 중배엽 6,7의 유도 및 사양에 관여하기 때문이다. 흥미롭게도, 초기 중배엽 세포는 높은 수준의 Epha18을 발현하는 것으로 보이며, Wnt/β-catenin 신호전달뿐만 아니라 Msgn1도 역축성 중배엽 분화 및 소마이트 형성 9,10에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 단일 세포 수준에서 NMP에 대한 완전한 공간적 시간 분석은 중배엽 사양을 제어하는 분자 메커니즘을 완전히 이해하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.

somites (척추 전구체)의 형성은 척추 동물의 주요 특징입니다. 축 신장 동안, 역축 중배엽은 somites로 알려진 일련의 양측 반복 단위로 분할된다. somite의 수와 새로운 세그먼트의 형성에 필요한 시간은 종11,12에 따라 다릅니다. 소미토제네시스는 전소미성 중배엽(예를 들어, Lfng)11,12에서 Notch, Wnt 및 Fgf 신호전달 경로의 몇몇 유전자의 순환 발현에 의해 관찰될 수 있는 주기적 신호전달 진동("세그멘테이션 클록"으로 알려짐)을 수반한다. somitogenesis의 현재 모델은 또한 각각의 새로운 소마이트의 후부 경계의 위치를 정의하는 Fgf, Wnt 및 레티노산 신호 전달을 포함하는 일련의 복잡한 신호 구배인 "성숙 파면"의 존재를 가정한다. 따라서 "세분화 시계"와 "성숙 파면" 사이의 조율된 상호작용은 이러한 주요 형태형성 과정의 교란이 배아 치사율 또는 선천성 기형(예를 들어, 척추측만증)의 형성을 초래할 수 있기 때문에 이러한 척추 전구체 모듈의 생성에 필수적이다(예를 들어, 척추측만증)13,14,15.

이미징 기술, 생체 영상 분석 방법 및 소프트웨어의 상당한 최근 발전에도 불구하고, 축 신장 및 소미토제네시스에 대한 대부분의 연구는 여전히 단일 / 분리 된 이차원 이미지 데이터 (예 : 섹션)에 의존하고 있으며, 이는 완전한 다차원 조직 시각화를 허용하지 않으며 병리학 적 기형 (즉, 돌연변이로 인한) 대 배아 발달 중에 발생하는 정상적인 형태 학적 변화 사이의 명확한 분화를 복잡하게 만듭니다16 . 3D에서의 이미징은 이전에 표준 2D 방법17,18,19,20에 의해 확인되지 않은 새로운 형태 유전 학적 움직임을 이미 밝혀 냈으며, 척추 동물 소미토제네시스 및 축 방향 확장의 메커니즘을 이해하기 위해 토토 이미징의 힘을 강조합니다.

마우스 배아의 3D 및 4D 현미경 검사, 특히 라이브 이미징은 기술적으로 어려운 일이며 정확하고 의미있는 시공간 분석을 위해 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 전처리 중에 중요한 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 축 확장 및 분절 동안 NMP 및 중배엽 세포 모두를 연구하는데 사용될 수 있는 마우스 배아의 살아있는 이미징 및 전체 마운트 면역형광 염색을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 또한 오래된 배아 및 태아의 광학 투영 단층 촬영 (OPT)을위한 프로토콜을 설명하는데, 이는 소밀 토제이 (예를 들어, 뼈 융합 및 척추 측만증) 동안 문제로 인해 발생할 수있는 병리학 적 이상을 시각화하고 정량화하는 토토에서 3D를 허용합니다 13,21,22. 마지막으로, 우리는 척추 동물 세분화 및 축 신장에 대한 연구와 교육에서 3D 이미징 재구성의 힘을 설명합니다.

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Protocol

동물과 관련된 실험은 주택, 축산 및 복지에 관한 포르투갈 (Portaria 1005/92) 및 유럽 (지침 2010 / 63 / EU) 법률을 따랐습니다. 이 프로젝트는 'Instituto Gulbenkian de Ciência'의 윤리위원회와 포르투갈 국가 단체 인 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária'(라이센스 참조 : 014308)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비

참고: 여기서는 라이브 이미징을 위해 마우스 E8.25 ~ E10.5 배아(1.1), 전체 탑재 면역형광 현미경(1.2)용 E7.5 ~ E11.5 배아 및 광학 투영 단층촬영용 태아(1.3)를 해부하고 준비하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

  1. 라이브 이미징을 위한 샘플 준비
    1. 마우스 배아 해부 및 라이브 이미징을 위한 준비(예를 들어, LuVeLu 리포터 23).
      1. E8.25와 E10.5 사이의 마우스 배아를 미리 가온된 M2 배지(37°C)에서 해부한다. 깨끗한 포셉을 사용하여 노른자 낭을 부드럽게 제거하고 신선한 M2 배지로 배아를 한 번 씻어 해부 중에 생성 된 혈액과 이물질을 제거하십시오.
        참고 : 어떤 식 으로든 배아를 손상시키지 않는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 라이브 이미징 절차 중에 제대로 발달하지 않습니다.
      2. 라이브 이미징 절차 동안, 배아를 가열된 챔버 (37°C)에서, 65% O2 및 5%CO2 환경 (N2 밸런 스드)에서, 10% HyClone defined 태아 소 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 저글루코스 DMEM 배지에서 인큐베이션한다.
        참고 : 이러한 배양 조건은 약 10 시간 동안 배아 발달을 가능하게합니다. 상이한 배양 조건들을 사용하는 다른 프로토콜들(9,10)은 더 긴 기간을 허용할 수도 있다.
  2. 면역형광현미경을 위한 시료 준비
    1. 마우스 배아 해부 및 고정 절차
      1. E7.5 내지 E11.5의 마우스 배아를 차가운 (4°C) 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 또는 M2 배지에서 해부한다. 모든 배아외 막(예를 들어, 레이차트 막 또는 노른자 낭)을 제거한 후 배아를 신선한 PBS로 세척하여 해부 절차 동안 생성된 혈액 및 이물질을 제거한다.
      2. 배아를 표 1에 명시된 시간 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 4°C, PBS에서 고정시킨다.
        주의 - PFA는 흄 후드 내부에서 처리해야 합니다.
        발달 단계 권장 고정 시간(PFA 4%)
        E7.5 1시간 30분
        E8.5 2시간
        E9.5 3시간
        E10.5 4시간
        E11.5 4시간
        표 1 - 다른 발달 단계에서 배아에 대한 고정 시간
      3. 고정 후, 배아를 PBS로 적어도 두 번(각각 5-10분) 세척하여 PFA를 완전히 제거하였다. 이 시점에서, 배아는 면역형광 염색 프로토콜로 곧장 취해질 수 있거나(단계 1.2.2) 또는 탈수되어 장래의 사용을 위해 저장될 수 있다(단계 1.2.1.4).
      4. 필요한 경우, 배아를 -20°C에서 100% 메탄올에 장기간 보관한다.
        1. 조직 보존을 개선하기 위해, 배아를 메탄올 농도의 10% 증가(PBS에 희석)로 서서히 탈수시키고, 각 단계는 100% 메탄올에 도달할 때까지 진탕기 상에서 실온(RT)에서 10분간 진행한다. 신선한 분취량을 사용하여 100% 메탄올을 한 번 교체한다.
        2. 역메탄올/PBS 시리즈에 이어 재수화하여 동결된 배아를 회수하고, 각 단계를 진탕기 상에서 RT에서 10분 동안 하고, 면역염색 프로토콜에 들어가기 전에 PBS로 최종 세척(각각 두 번, 5-10분)하여 회수한다.
          주의 - 메탄올은 흄 후드 내부에서 처리해야합니다.
    2. 전체 마운트 면역 형광 염색
      참고: 다음의 면역형광 염색 프로토콜은 Osorno et al.24에 기재된 절차로부터 적응되었다. 모든 세척은 쉐이커에서 수행해야합니다. 차단 단계 후에, 항체 완전성/보존을 보장하기 위해 4°C에서 인큐베이션을 수행한다.
      1. 배아를 0.1% 트리톤 X-100(0.1% PBST)을 함유하는 PBS로 3회(각각 30분) 세척한 다음, 0.5% PBST에서 1시간 동안 1회(RT)로 세척하여 투과율을 향상시킨다.
      2. 비특이적 결합을 감소시키기 위해, RT에서 30분 동안 PBS (pH 7.5) 중의 1 M 글리신으로 세척한다.
      3. 30분 동안 0.1% PBST로 3회 세척하여 글리신을 완전히 제거하였다.
      4. 배아를 PBS에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다: 혈청의 3% (이차 항체가 생성된 동물 종으로부터), 1%의 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1%의 트리톤 X-100을 함유하는 블로킹 용액.
      5. 1차 항체를 블로킹 용액(통상 T 및 Sox2 항체에 대해 1:200)에 희석하고, 4°C에서 2 내지 사흘 동안 인큐베이션한다.
      6. 이차 항체를 첨가하기 전에, 배아를 4°C에서 0.1% PBST로 3회(각각 30분) 세척한다. 2차 항체를 블로킹 용액(1:1000)에 희석하고, 4°C에서 2일 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호한다.
      7. 배아를 4°C에서 0.1% PBST로 6회(각각 30분) 세척한다.
      8. 핵 역염색을 위해, 배아를 PBST에서 1:500으로 희석한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드 (DAPI)에서 인큐베이션하고, 4°C에서 진탕기에서 하룻밤 동안, 빛으로부터 보호한다.
      9. 마지막으로, 배아를 4°C에서 0.1% PBST로 3회(각각 30분) 세척한다.
    3. 조직 제거 및 슬라이드 준비
      1. 메틸 살리실레이트 또는 벤질 알코올과 벤질 벤조에이트(BABB)의 혼합물을 사용한 조직 제거
        1. 메틸 살리실레이트 또는 BABB를 사용하여 클리어링하기 전에, 메탄올 농도의 연속적인 10% 증가로 구성된 메탄올/PBS 시리즈를 통해 이들을 100% 메탄올로 가져옴으로써 배아를 완전히 탈수시킨다(4°C에서 각각 10분의 인큐베이션 시간). 완전한 탈수를 달성하려면 100 % 메탄올을 신선한 것으로 교체하고 추가 10 분 동안 기다리십시오.
        2. 메탄올 중의 일련의 메틸 살리실레이트 또는 BABB를 20% 연속 농도 증가와 함께 임베딩하여 배아 제거를 수행하고, 각 단계에 대해 20분간 인큐베이션한다. 메틸 살리실레이트 또는 BABB 용액이 100 %에 도달하면 신선한 용액에 대해 두 가지 추가 변경을하십시오.
          주의: 메틸 살리실레이트와 BABB 모두 흄 후드 내부에서 취급해야 합니다.
          참고 : 적절한 제거를 위해서는 배아가 완전히 탈수되어야합니다. 또한 메탄올이 청산 용액 계열에서 메틸 살리실레이트 또는 BABB와 완전히 혼합되는 것이 필수적입니다.
        3. 배아가 완전히 투명 해지면 조직 손상 가능성을 줄이기 위해 형광 입체 경을 우선적으로 사용하여 개별적으로 처리하십시오.
        4. 이미징을 위해 배아를 75mm x 25mm 함몰 오목 유리 슬라이드 또는 20mm x 60mm #1.5 커버 글래스에 장착하십시오. 후자의 옵션은 필요한 경우 양쪽에서 이미징을 허용하지만 훨씬 더 취약하고 밀봉하기가 어렵습니다. 이쑤시개, 미세한 면화 팁, 파스퇴르 피펫 또는 기타 유사한 장비를 사용하여 배아를 현미경 슬라이드로 옮깁니다.
        5. 배아를 압축하지 않으려면 #1 커버 글라스 파편 (두께 170 μm), 실리콘 또는 얇은 금속 와셔로 만든 스페이서를 추가하십시오. 그런 다음 장착 매체 한 방울을 추가하고 # 1 또는 # 0 20x20mm 커버 글라스로 덮고 밀봉하십시오.
        6. 유리 또는 금속 스페이서를 사용하는 경우, 제제를 더 잘 안정화시키기 위해 용융 파라핀으로 밀봉하십시오 - 메틸 살리실레이트 또는 BABB로 용해되기 때문에 매니큐어로 밀봉하지 마십시오. 거품을 피하려면 커버 슬립을 한쪽에 놓은 다음 점차적으로 부드럽게 옆으로 밀어 넣으십시오. 필요한 경우 매체를 더 추가하십시오.
          참고 : 제거 된 배아를 조작하는 방법과 현미경 슬라이드에 장착하는 방법을 더 잘 이해하려면 비디오를 참조하십시오.
      2. RapiClear로 조직 지우기
        1. RapiClear를 사용할 때 배아 탈수가 필요하지 않습니다. 단계 1.2.2.9 후에, 배아를 75 mm x 25 mm 우울증 오목한 유리 슬라이드의 중앙에 놓고, 현미경 함몰 슬라이드에서 모든 PBST를 제거하고, 200 μL의 클리어링 용액을 첨가한다.
        2. 빛으로부터 보호 된 10 분 후, 배아가 투명해지기 시작하면 청산 용액을 교체하고 추가 20 분 (빛으로부터 보호)을 기다린 다음 덮개 슬립으로 꼭대기에서 시작하여 한쪽에서 시작하여 부드럽게 다른 쪽으로 움직입니다.
          참고 : 배아를 완전히 맑게하는 시간은 배아의 단계와 크기에 따라 몇 분에서 하룻밤으로 갈 수 있습니다. 또한 전체 과정은 입체 현미경으로 수행되어야합니다. 클리어링 및 현미경 슬라이드 준비를 더 잘 이해하려면 비디오 프로토콜을 참조하십시오.
  3. 광학 프로젝션 단층 촬영을 위한 샘플 준비
    참고: 다음 절차는 이전 프로토콜에서 수정되었습니다.19,25,26. 상기 프로토콜은 E18.5 마우스 태아의 분석에 대해 설명한다.
    1. 마우스 태아 해부 및 고정 절차
      1. E18.5 마우스 태아를 차가운 (4°C) PBS에서 해부하고, 모든 배아막을 제거한 다음, 태아를 신선한 PBS로 여러 번 세척하여 해부 과정 동안 생성된 혈액 및 이물질을 제거하였다.
      2. PBS로 만든 4% PFA에 태아를 고정시키고, 4°C에서 5 내지 7일 동안 고정시켰다.
      3. 태아를 PBS로 한 번(15분) 세척한 다음, 탈염수 또는 PBS로 3회(각각 30분) 세척한다. 셰이커에서 세척을 수행하십시오.
      4. 100% 메탄올이 될 때까지 증가된 농도(탈염수 또는 PBS에서 희석된 10% 증가)의 메탄올 용액에서 인큐베이션(진탕기 상의 RT에서 25분 시리즈)함으로써 태아를 탈수시킨다.
      5. 완전한 탈수를 보장하기 위해 100% 메탄올 용액(신선한 분취량 사용)을 세 번(각각 20분) 변경한다. 배아는 이어서 -20°C에서 저장되거나 표백 과정에 직접 (1일 후) 취해질 수 있다(단계 1.3.2).
    2. 표백 과정
      1. 자연 색소 침착을 제거하기 위해, 태아를 진탕기에서 (별도로) 배양하고, 먼저 메탄올 중 5 %H20 2 중에서 하루 동안 배양한 다음 배아가 모든 천연 색소 침착을 잃을 때까지 최대 3 일 동안 메탄올 중10 %H2 02에서 배양하십시오.
        주의:H2O2는흄 후드 내부에서 부드럽게 취급해야 합니다. 시편과 접촉할 때H2O2를 함유하는 표백 용액은 증기를 생성하고, 따라서 태아를 함유하는 튜브는 전체 표백 절차 동안 열린 상태로 유지되어야 한다. 일부 표백 프로토콜은H2O2와 포름아미드의 조합을 제안한다. 이 대안을 사용하는 경우, 희석되지 않은 포름 아미드에H2O2를 첨가하면 폭발이 발생할 수 있으므로 특별한주의를 기울여야합니다.
      2. 배아를 탈염수에서 역메탄올 계열(10% 감소와 함께)로 점진적으로 재수화시키고, 진탕기에서 RT에서 20분 동안 각각 인큐베이션하고, 최종적으로 탈염수에서 3회(각각 30분)씩 세척한다. 어느 날 기다렸다가 탈염수를 바꾸고 더 진행하십시오.
        참고: 표백 과정의 대표적인 결과에 대해서는 보충 그림 1 을 참조하십시오.
    3. 탈염 프로토콜
      참고: 탈염은 선택 사항이지만 태아나 강아지에게 권장됩니다.
      1. 태아를 42°C에서 0.1 M EDTA로 몇 시간 동안 세척하여 탈염을 수행하고[또한 Cho et al.27 참조] 이어서 EDTA를 완전히 제거하기 위해 탈염수로 다섯 번 세척(각각 20분)하였다. 셰이커에서 모든 절차를 수행하십시오.
    4. 청산을 위한 샘플 준비
      1. 태아를 1% 아가로스 블록에 삽입합니다. 녹은 아가로스로 50 mL 플라스틱 튜브 또는 주사기 (주사기의 출구 측을 차단하고 플런저를 사용하여 반대쪽을 차단하여 원통형 공간을 구축)를 준비하려면 아가로스의 태아를 수직 위치에 놓고 아가로스를 응고하는 동안 포셉의 도움으로 블록의 중심에이 위치를 유지하십시오.
      2. 블록이 있는 몰드를 4°C(30분)에 놓고 아가로오스가 완전히 젤화되도록 한다. 블록 내 태아의 잘못된 위치 결정 또는 기포의 출현의 경우, 밤새 50°C에 블록을 위치시켜 아가로스를 용융시키고, 다음날 절차를 반복한다.
      3. 곰팡이에서 태아가있는 아가로스 블록을 제거하고 탈염수가있는 용기에 넣으십시오. 15 분 후에 신선한 탈염수로 교체하십시오.
      4. BABB로 클리어링하기 전에 시편을 탈수시킵니다. 조직 완전성을 더 잘 보존하기 위해, 메탄올 농도의 10% 증가(탈염수 또는 PBS에 희석)로 태아 탈수를 점진적으로 수행하고, 각 단계는 100% 메탄올에 도달할 때까지 진탕기 상의 RT에서 45분 이상 동안 수행한다.
      5. 100% 메탄올(신선한 분취량 사용)을 먼저 한 시간 간격으로 네 번 바꾼 다음 다음 날에 다시 바꿔 완전한 탈수를 보장한다.
    5. OPT 이미징을 위한 클리어링 프로세스 및 샘플 장착
      1. 100% BABB에 도달할 때까지 메탄올 중의 BABB 용액의 시리즈(각각 2.5시간)를 통해 진탕기 상의 태아를 맑게 하고, BABB 농도가 25% 증가한다.
      2. 태아가 완전히 투명해질 때까지 BABB 용액을 매일 신선한 용액으로 교체하십시오. 이 프로세스는 3~5일이 걸릴 수 있습니다. 태아가 들어있는 블록을 전체 절차 중에 쉐이커에 보관하십시오. 태아는 오랜 기간 동안 100 % BABB 용액에 머무를 수 있습니다.
        참고 : 태아가 올바르게 탈수되지 않으면 BABB를 처음 첨가 한 후 약간 반투명 ( "희끄무레한"에멀젼)이됩니다. 이런 일이 발생하면 순수한 메탄올로 다시 들어가서 신선한 메탄올에서 두 번의 추가 세척을 수행하십시오. 탈수 및 클리어링을 수행하는 동안 샘플을 냉장 보관하지 마십시오, 온도의 변화는 물 응축으로 이어질 수 있습니다.
      3. 클리어된 아가로스 블록을 OPT 스캐너의 모터 축에 부착하고, 광학을 조정하여 전체 태아의 이미지를 획득하고, 전체 프로젝션 데이터세트(19,28)의 획득을 진행한다.

2. 현미경/이미지 수집

  1. 올바른 3D 및 4D 이미징을 위해서는 실험 목표에 가장 적합한 현미경을 선택하십시오. 표 2는 선택을 안내하는 일반적인 정보를 제공한다.
광학 현미경 기술 이미징 원리 실험 목표 및 고려 사항
와이드필드 이미징 형광, 반사 또는 투과 된 빛을 사용합니다. 배아에 대한 빠르고 일반적인 개요 (예 : 검진 및 발달 단계 및 명백한 표현형을 평가하는 것)에 이상적입니다. 높은 배율에서 관찰 가능한 두께에 비해 감소된 피사계 심도는 3D 형태학의 정확한 해석 또는 분석을 허용하지 않습니다.
공초점 (레이저 스캐닝; CLSM) 레이저 스캐닝 조명과 핀홀을 통한 형광 검출을 사용합니다. 형광 라벨이 붙은 샘플의 광학 조각을 이미징 할 수 있으며 이상적으로는 강한 신호로 이미징 할 수 있습니다. 핀홀을 통한 이미징은 피사계 심도 밖으로 신호를 제거하여 3D에서 정보를 정확하게 구분할 수 있습니다. 이 인수는 광시야보다 훨씬 느리지 만 비교할 수없는 대비와 형태학의 3D 차별이 있습니다. 높은 시간 해상도는 이미지가 한 번에 1픽셀씩 획득되기 때문에 달성할 수 없습니다. E9.5까지의 고정 마우스 배아의 3D 이미징에 적합합니다. 전체 presomitic 중배엽 또는 somite를 통한 이미징은 더 깊은 조직에서 광산란으로 인해 조직 제거가 필요합니다. 광독성 및 표백은 고려 사항입니다. 광표백은 한계 내에서 후방을 보상 할 수 있습니다. 그러나, 살아있는 샘플에서의 광독성 효과는 할 수 없으며, 종종 결정하기가 쉽지 않다. 샘플이 낮은 표현을 보여주고 높은 레이저 파워가 필요한 경우 더 분명합니다.
이광자 여기 형광 (TPEFM) 가시 레이저 조명 대신 펄스 근적외선(NIR) 레이저 여기를 사용합니다. TPEFM은 CLSM보다 두꺼운 샘플을 통해 광학 슬라이싱을 허용합니다. 해상도는 약간 낮지 만 더 깊은 조직의 대비는 상당히 우수하여 마우스 배아의 라이브 이미징에 이상적입니다. TPEFM은 종종 기존의 CLSM보다 광독성이 적은 것으로 간주되지만 높은 레이저 파워가 필요하며 이는 세포와 조직에 해로운 영향을 줄 수 있습니다. E11.5까지의 배아의 3D 이미징에 이상적이지만 전체 presomitic 중배엽을 통한 이미징은 여전히 조직 제거가 필요합니다.
공초점(회전 디스크) 단일 레이저 대신 여러 점과 같은 소스를 사용하는 공초점의 한 형태입니다. 여러 점과 유사한 구조를 사용하면 CLSM보다 광학 슬라이스를 더 빠르게 만들 수 있습니다 (초당 여러 프레임 또는 분당 스택을 달성 할 수 있음). 인수는 합리적인 3D 차별로 광역만큼 빠릅니다. 그러나, 그것은 단지 마우스 배아의 가장 피상적 인 조직의 이미징을 허용합니다. CLSM보다 더 민감한 검출을 허용하여 형광 단백질의 발현이 낮은 배아에 대한 대안이 될 수 있습니다.
라이트 시트 / 단일 평면 (LSFM / SPIM) 광시야 또는 점과 같은 조명 대신 샘플은 한 번에 하나의 직교 평면으로 조명됩니다. 대부분의 구성에서는 여러 각도에서 이미징 할 수 있습니다. 또한 형광 라벨이 붙은 샘플이 필요합니다. 광학 슬라이스 획득의 획득은 매우 빠르며 (초당 여러 프레임) 광독성 또는 표백의 영향을 감소시킵니다. 그러나 멀티뷰가 필요한 경우 후속 데이터 세트 전처리 단계에는 몇 시간/일의 계산이 필요할 수 있습니다. LSFM/SPIM은 CLSM보다 낮은 발현 수준을 더 잘 검출할 수 있게 해줍니다. 위태 동안 토토 마우스 배아의 3D 이미징에 이상적입니다. 샘플은 종종 현탁액 (비전통적인 준비)에 장착되고 유지되어야합니다.
광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT) 광학 슬라이스는 검출되지 않지만 다른 각도에서 전체 배아의 일련의 와이드 필드 이미지 ( "투영")에서 계산됩니다. 후기 단계의 마우스 배아 / 태아 (>5mm)의 3D 이미징에 이상적이지만 고정 및 제거 만 가능합니다. 형광 및 비형광 샘플 모두의 광학 슬라이스의 3D 스택을 생산하는 장점이 있습니다. 데이터 세트는 아이소메트릭(세 차원 모두에서 동일한 해상도의 조각)이므로 해부학적 분석에 이상적입니다. 프로젝션 데이터 세트를 획득하려면 몇 분만 소요될 수 있으며, 그 후 15-30분 동안 재구성해야 합니다.
광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 샘플을 통한 NIR 조명을 사용하여 광 반사 간섭을 기반으로 광학 슬라이스를 얻습니다. OCT는 수십 마이크로미터 해상도로 살아있는 조직(형광 대비 없이 시료 속으로 몇 밀리미터 깊이)을 통해 쉽게 이미징할 수 있습니다. 획득은 매우 빠릅니다 (초당 몇 조각). OPT에 대한 가능한 대안이지만이 기술은 일반적으로 사용할 수 없습니다.
초분해능(SR), 원자력(AFM) 또는 근거리 이미징(NSOM) SR은 일반적으로 하위 회절 분해능 (수 나노 미터)에서 주사 표면의 단일 분자 국소화 및 AFM / NSOM을 기반으로합니다. 하위 회절 수준 (<200nm 해상도)에서 이미징을 허용하며, 종종 세포 표면에서 단일 분자 또는 분자를 검출 할 의도가 있습니다. 마우스 배아와 같은 큰 샘플의 형태 학적 분석에는 이상적이지 않습니다. 획득은 일반적으로 느린 프로세스(이미지당 몇 초에서 몇 분)입니다.

표 2 - 연구자의 특정 실험 목표에 더 적합한 이미징 기술 / 현미경의 선택을 안내하는 일반적인 정보.

3. 이미지 데이터 세트 전처리

참고: 여기서는 이미지 데이터 세트 전처리의 주요 단계, 즉 노이즈 감소(3.1) 및 디컨볼루션(3.2)을 강조하고 3D 데이터 세트 시계열(3.3) 및 전체 탑재 면역형광 염색(3.4)의 적절한 준비 및 전처리를 허용하는 알고리즘을 제공합니다. 마지막으로 OPT 데이터 세트 전처리 및 재구성을 위한 프로토콜을 자세히 설명하는 참조를 나타냅니다.

  1. 소음 감소
    1. 이미지에 신호 대 잡음비가 감소한 것으로 표시되는 경우 피지/ImageJ29에서 사용할 수 있는 "중앙값" 필터 또는 "이방성 확산"과 같은 고전적인 방법이나 "CARE"30 또는 "Noise2Void"31과 같은 기계 학습을 기반으로 하는 보다 정교한 방법을 적용하는 것이 좋습니다.
      참고: 이는 특히 광표백 및 광손상이 주요 관심사이며 낮은 노출과 더 높은 검출기 이득이 필요한 라이브 이미징 데이터 세트와 관련이 있습니다.
  2. 디컨볼루션
    1. 이미지가 고해상도(Nyquist 샘플링 근처 또는 근처)로 획득된 경우 분석 전에 데이터 세트의 품질을 향상시키기 위해 디컨볼루션을 사용하여 이미지 복원을 수행하는 것이 좋습니다. 일부 디컨볼루션 도구에는 디노이징 단계도 포함되어 있습니다.
      참고 : 이것은 Krull et al.32 및 Huygens deconvolution software 웹 사이트 (https://svi.nl/HomePage 에서 사용할 수있는 문서에서 광범위하게 다루어졌습니다.
  3. 적절한 시각화 및 분석을 위한 3D 데이터 세트 시계열 준비
    참고 : 종종 배아 또는 단계 드리프트는 타임랩스 이미징 중에 발생할 수 있습니다. 분석을 수행하기 전에 이 문제를 해결해야 합니다. 때로는 드리프트가 심각하여 인수를 중단하고 조정해야합니다. 이 경우 동일한 X, Y 및 Z 치수를 유지하는 것이 가장 좋습니다.
    1. 별도의 4D 스택은 Fiji의 "연결"기능을 사용하여 단일 4D 하이퍼 스택으로 연결할 수 있습니다. 그러나이 도구는 복합 / 하이퍼 스택을 처리하지 않으므로 Image | 작업을 사용하여 모든 4D 세그먼트를 간단한 스택으로 변환해야합니다. 하이퍼스택 | 스택 할 하이퍼 스택. 이러한 4D 세그먼트의 순서를 유지하고 각 세그먼트에 대한 정보 (채널, 슬라이스, 시간대)를 기록하기 위해 번호 매기기 시스템을 유지하십시오. 모든 세그먼트에 대해 이 절차를 반복한 다음 Image | 절차를 사용하여 세그먼트를 연결합니다. 스택 | 도구 | 연결.
    2. 작업 이미지를 사용하여 연결된 하이퍼스택 재구성 이미지 | 하이퍼스택 | 하이퍼스택에 스택 하고 다양한 차원의 올바른 순서를 선택합니다. 하이퍼스택을 검사하여 모든 차원의 순서가 올바르게 지정되었는지 확인합니다.
      참고: 채널(c )과 슬라이스(z)의 수는 모든 4D 세그먼트에 대해 동일해야 합니다. (시간) 프레임 수(t) 는 모든 4D 세그먼트에 대해 추가된 총 시점과 같아야 합니다. 하이퍼스택으로 변환하기 전에 스택을 탐색하여 서로 다른 차원이 보간되는 방식을 이해하는 것이 중요합니다. 피지/ImageJ 기본값은 채널을 번갈아 가며 Z 슬라이스를 번갈아 가며 시간 포인트를 번갈아 가며 사용하는 것입니다("XYCZT"). 이것이 현미경에 의해 생성 된 데이터에 적용되는지 확인하십시오.
    3. 컴포지트를 디스플레이 모드로 선택하고 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)으로 저장합니다. 대규모 데이터 세트의 경우 플러그인 작업을 수행하여 BigDataViewer33 형식으로 변환하는 것이 좋| 빅데이터뷰어 | 현재 이미지를 XML/HDF5로 내보냅니다. 이렇게 하면 BigDataViewer를 사용하여 보다 효율적이고 3D로 탐색할 수 있는 데이터 세트가 생성되며 빅 데이터 데이터 세트를 위한 다른 피지/ImageJ 도구에서 처리할 수 있습니다.
    4. 필요한 드리프트 보정의 정도에 따라 "올바른 3D 드리프트" ImageJ 플러그인(34) 또는 BigStitcher 플러그인(35 )을 사용하여 배아/스테이지 드리프트를 보상하기 위해 연결된 하이퍼스택(3D 스택의 시계열)을 등록합니다. XML / HDF5 파일은 BigStitcher로 열 수 있습니다.
      참고 : 세포 추적 또는 이동 분석을 수행하기 전에 배아 드리프트를 보여주는 3D 시간 경과의 등록을 수행해야합니다. 드리프트에 대한 교정은 형태 유전 적 움직임을 적절하게 해석하기 위해서도 필요합니다.
  4. 면역형광 영상의 데이터 세트의 전처리
    1. Z 깊이 신호 감쇠
      참고: 신호 감쇠를 수정하기 위해 제안하는 방법이 유용할 수 있지만, 심도가 낮은 신호는 광학 현상이 아닌 생물학적 현상을 실제로 반영할 수 있으므로 신중하게 사용해야 합니다. 관심있는 분자가 존재하거나 발현 될 것으로 예상되지 않는 조직 영역에서 붕괴를 측정하고 해당 영역에 대한 보상을 조정하는 것을 고려하십시오. 깊이가 여전히 낮은 양의 신호가 있다면, 그것은 실제 생물학적 현상을 나타낼 수 있습니다. 또한 샘플의 일부 영역이 다른 영역보다 더 많은 산란 또는 레이저 감쇠를 생성 할 수 있으며이 간단한 방법으로 완전히 수정되지 않을 수도 있음을 고려하십시오.
      1. 더 두껍거나 늦은 단계 배아의 경우, 굴절률의 불일치 (장착 매체와 현미경 목표 사이)로 인한 빔 감쇠, 광표백 및 구형 수차는 형광 강도가 Z 스택의 더 깊은 조각에서 크게 감쇠되는 데이터 세트를 초래할 수 있습니다. 따라서 분석 전에 이러한 신호 손실을 보상하십시오. 분석적으로 가장 정확한 감쇠를 결정하는 것은 복잡하고 매우 샘플 의존적이지만(36), 빠른 근사치는 Process |를 사용하여 ImageJ/Fiji에서 경험적으로 결정될 수 있다. 수학 | 매크로 기능과 미리보기를 클릭합니다.
      2. 피지 / ImageJ에서 Z 스택을로드 한 다음 이미지 | 절차를 수행하십시오. 스택 | 다시 슬라이스. 시작 : 상단, 보간을 피하십시오 똑딱 거리고 OK를 유지하십시오. 이제 "Z"는 "Y"축이됩니다. 그런 다음 이미지 |을 수행하십시오. 조회 테이블(LUT) | 화재 (또는 다른 여러 가지 색상의 LUT). 이렇게 하면 다음 단계에서 최상의 보상을 시각적으로 평가하는 데 도움이 됩니다. 배아 중간에있는 조각으로 전환하여 깊이있는 감쇠의 효과가 명확하게 보입니다 (강도는 위쪽 [피상적]에서 아래쪽 [더 깊은]으로 떨어집니다).
      3. 상기 절차를 통해 수직("y") 강도 강하의 보정을 결정하는 과정을 진행하여 | 수학 | 매크로를 사용하고 여기에 쓰여진 대로 정확히 다음 "코드"를 추가합니다.
        v = v * A * exp ( B * y / h )
        이 표현식에서 "v"는 픽셀 강도 (깊이에 대한 함수로 조정됨)의 변수이며, 깊이에 대한 변수 "y"는 최대 깊이의 변수이며, "h"는 지수 함수입니다. "A"는 0.5와 1.0 사이의 숫자로 대체해야합니다 (Z 스택의 최상위 레이어의 과포화를 피하기 위해 더 낮은 값을 선택하십시오). B는 Z 깊이 감쇠가 얼마나 심각한지에 따라 0.5와 2.0 사이의 숫자로 대체됩니다 - 이상적으로는 1이어야하지만 어떤 경우에는 바닥층을 올바르게 보상하기 위해 더 적은(또는 그 이상) 필요가 있습니다. B의 값이 높을수록 더 많은 감쇠 보상이 발생합니다. 미리보기 를 클릭하여 첫 번째 평가를 수행합니다. 이미지의 위쪽에서 아래쪽으로 적절한 보정을 얻을 때까지 A와 B의 서로 다른 값을 테스트합니다("Fire" LUT가 이 평가에 도움이 될 수 있음). 만족하면 확인을 클릭하여 설정을 적용 합니다.
        참고: 적색 이동 염료와 레이저가 감쇠가 적고 일부 염료가 다른 염료보다 빠르게 표백될 수 있기 때문에 각 채널에서 개별적으로 수행해야 합니다. 이 절차는 형광 강도 변화를 깊이있게 정량화할 수 있을 만큼 정확하지 않을 수 있지만, 신호 심도의 감쇠에 의해 심각하게 영향을 받는 원래의 3D 데이터 세트에서 직접 정량화를 수행하는 것보다 확실히 더 신뢰할 수 있습니다. 이 효과를 확인하고 제어하는 한 가지 방법은 등쪽 또는 복부 측에서 다른 배아를 이미징하는 것을 비교하는 것입니다.
      4. Image |를 수행하여 보정된 Z-스택의 원래 형상을 복원합니다 . 스택 | 다시 슬라이스하고, 위에서 시작하고, 보간을 피하십시오 똑딱 거리며, 이제 "Y"는 다시 "Z"평면이되어야합니다. "이미지 |를 수행하여 색상을 바꿉니다. 조회 테이블 | 회색"(또는 선택한 다른 LUT). 원래 보정되지 않은 z-스택을 버리고 보정된 버전을 저장합니다.
        참고: Z 깊이 신호 감쇠 방법의 대표적인 결과로 보충 그림 2 를 참조하십시오.
    2. Z축 스케일링 보정
      1. 배아 장착에 사용되는 것과 다른 굴절률을 위해 설계된 목적으로 이미징하는 경우, 슬라이스 두께의 재 스케일링을 수행 할 필요가 있으며, 그렇지 않으면 깊이에서의 측정이 부정확 할 것입니다 (조직 제거 배아에서 "건조한"목표를 사용하는 경우 잠재적으로 50 %까지). 이것은 37 과 38에서 설명되고 검토되며 논의 된 다양한 방법이 논의됩니다. 실제 Z축 왜곡 스케일을 분석적으로 결정하는 것은 복잡하지만, 수용가능한 근사치는 샘플의 굴절률과 목적의 굴절률 사이의 비율을 발견함으로써 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, 건조 20 x 목표로 이미지화된 메틸 살리실레이트-클리어링된 배아의 경우 1.53/1.0, 또는 BABB로 클리어링되고 수침 목표로 이미지화된 배아의 경우 1.56/1.33).
      2. Z 스택 데이터 세트가 피지 / ImageJ에서 이미 열린 상태에서 (다중 채널 이미지의 경우 모든 채널에서 "합성"으로 어셈블 된 후) 이미지 |로 이동하십시오. 특성 및 이미지 획득 시 획득된 슬라이스 두께로 Voxel 깊이 를 변경하고 이전 단계에서 결정된 Z축 스케일링 보정을 곱한다(4.2.1; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션). 이미지 |를 사용하여 결과 확인 스택 | 직교 뷰.
    3. 피지 / ImageJ를 사용하여 배아를 해부학 적으로 표준 위치로 재배치
      참고 : 배아의 위치 변경 (에서 강조 표시된 장점 참조) 보충 그림 3)를 피지 / ImageJ를 사용하여 표준화 된 전후 [A-P] 및 등쪽 - 복부 [D-V] 축 위치로 TransformJ를 설치해야합니다. 39 피지의 "ImageScience"업데이트 웹 사이트의 플러그인 제품군.
      참고: 이 기술은 앨리어싱 아티팩트와 해상도 저하를 초래하는 세 평면의 회전 라운드보다 바람직합니다. 그러나 피지/ImageJ 3D 뷰어 플러그인은 200-300Mb보다 큰 데이터 세트를 제대로 처리할 수 없기 때문에(플러그인이 시야각을 회전하려고 할 때 렌더링되거나 예측할 수 없는 동작을 표시하지 않을 수 있음) 원래 3D 데이터 세트를 먼저 다운샘플링해야 합니다.
      1. 먼저 피지의 이미지 |에서 데이터 세트 크기를 줄입니다 . 데이터 세트를 200Mb 미만으로 줄이는 데 필요한 X, Y 및 Z "크기 조정" 값을 크기 조정한 다음 삽입합니다(예: 0.5 x 0.5 x 0.5 다운샘플링을 수행하면 데이터 세트가 8배 더 작아집니다). 새 창 만들기 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다.
      2. 그런 다음 플러그인 | 3D 뷰어로 이동하십시오. 3D 뷰어 창 내에서 배아를 클릭하여 선택하면 빨간색 3D 상자가 나타납니다. 빨간색 상자가 활성화된 상태에서 이 모드를 사용하는 경우 시야각을 회전하는 기본 동작과 달리 마우스를 사용하여 데이터 세트의 회전을 제어할 수 있습니다. 마우스로 배아의 위치를 바꿀 때 외부를 클릭하지 않으면 데이터 세트가 선택 취소됩니다.
      3. 배아의 새 위치에 만족하면 편집을 선택합| 변형 | "3D 뷰어" 창의 메뉴에서 변환된 이미지를 내보냅니다. 다른 직교 평면을 검사하려면 이미지 |로 이동하십시오. 스택 | 직교 뷰. 배아가 올바르게 위치하지 않으면 창을 닫고 3D 뷰어 창으로 돌아가서 다시 조정하십시오. 4.3.2단계를 반복합니다.
      4. 배아가 올바르게 위치하면 "3D 뷰어"창 메뉴에서 | 편집 변형 | 변형 을 저장하고 변형 행렬을 확장명이 *.mat인 텍스트 파일에 저장합니다. 피지 / ImageJ를 사용하여이 텍스트 파일을 열고 처음 두 줄 (텍스트)을 제거한 다음 다시 저장하십시오. 이것은 39에 설명 된 "TransformJ"플러그인과 호환되는 변환 매트릭스 파일을 만듭니다.
      5. 전체 해상도 데이터 세트(다중 채널 복합 하이퍼스택이 될 수 있음)로 전환하고 플러그인 | 작업을 수행합니다. 트랜스포메이션J | TransformJ affine. 새 창에서 이전에 저장한 매트릭스 파일을 검색하고 큐빅 B-스플라인 보간을 선택하| 등방성으로 다시 샘플링| 좋습니다.
        참고: 이 작업은 메모리와 CPU를 많이 사용합니다. 워크스테이션 및 데이터 집합 크기에 따라 작업은 몇 분에서 몇 시간까지 걸릴 수 있습니다. 등방성 리샘플링 옵션을 사용하면 변환 작업 중에 해상도가 손실되지 않으므로 데이터 세트의 크기가 크게 증가하고 더 이상 원래 공초점 z-스택과 같은 이방성이 되지 않습니다. Z축의 슬라이스 수가 각 슬라이스의 동일한 X 및 Y 픽셀 수로 증가하고 스택이 원래 크기의 5-10배로 부풀어 오를 것으로 예상됩니다. 이것은 회전 및 번역 중에 복셀의 보간 과정에서 정보가 손실되지 않도록 보장하는 데 필요합니다.
      6. 배아가 적절하게 재배치되면 배아 주위에 생성 된 빈 공간의 대부분을 다듬을 수있는 경우가 종종 있습니다. 전체 Z 프로젝션 이미지 | 수행 스택 | Z 프로젝트... 최대 강도를 선택합니다. X와 Y에 전체 배아가 포함 된 최소 ROI를 그립니다. 원래 데이터 세트 이미지 창으로 전환하고 편집으로 이동하십시|. 선택 | 선택 항목을 복원하고 자르기 | 이미지를 선택하여 자릅니다.
      7. 배아 조직을 교차시키지 않는 시작과 끝의 조각을 다듬습니다. 이를 위해 이미지 |를 선택하십시오. 스택 | 도구 | 슬라이스 리무버 를 제거하고 제거할 첫 번째 슬라이스와 마지막 슬라이스를 지정하여 "증분"을 1로 변경해야 합니다(그렇지 않으면 다른 모든 슬라이스만 제거됨).
      8. 새 데이터 세트의 위치를 변경하고 트리밍한 후 새 TIFF 파일로 저장해야 합니다. 이 데이터 세트가 너무 큰 경우(GPU RAM 이상) 3.3단계에서 설명한 대로 BigDataViewer를 사용하여 XML/DHF5로 내보내는 것이 좋습니다("이미지 데이터 세트 전처리" 섹션의 내용).
  5. OPT 데이터 세트 전처리 및 재구성
    1. Martins et al.19 및 Gualda et al.28에 기재된 OPT 데이터 세트 전처리 및 재구성을 위한 프로토콜을 사용하십시오.

4.3D 렌더링, 시각화 및 분석

참고: 여기서는 3D 이미징 데이터 세트의 시각화 및 분석을 허용하거나 향상시키는 다양한 소프트웨어 도구의 가능한 응용 프로그램 목록을 제공합니다.

  1. Drishti를 사용한 3D 렌더링 및 시각화
    참고: Drishti40 은 마이크로 CT, 공초점/다중 광자 및 광 시트 현미경에서 3D 및 4D 데이터 세트를 탐색하고 제시하도록 설계된 무료 과학 시각화 소프트웨어입니다. 여기서 우리는 전체 마운트 면역 형광 염색의 3D 렌더링 및 시각화를 위해이 소프트웨어를 사용합니다 (단계 2; "3D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션). 사용자가 Drishti를 운영하는 방법을 이해하는 데 도움이되는 온라인 자습서가 여러 개 있습니다. 온라인으로 "Ajay Limaye Drishti 3D 자습서"를 검색하십시오. Drishti는 TIFF 파일의 스택을 직접 읽을 수 없으므로 먼저 기본 "pvl.nc" 형식으로 변환해야 합니다.
    1. Drishti 설치 폴더에 있는 "drishtiimport.exe" 도구를 실행합니다: 파일 | | 불러오기 파일 | "그레이 스케일 TIFF 이미지 파일을 선택하고 피지 / ImageJ에서 저장 한 단일 채널 3D 스택을로드하십시오. 다중 채널 복합 스택의 경우 피지/ImageJ에서 채널을 분할하고 각각을 개별적으로 저장합니다. 복셀 타입은 "ushort"입니다. "파일"..."다른 이름으로 저장"..."TIF", 모든 질문에 "y"라고 대답하십시오. 복셀 크기를 묻는 추가 정보 창에서 올바른 "X Y Z" 복셀 크기를 추가 했는지 확인하십시오.
    2. *.pvl.nc 파일을 Drishti에로드하고 렌더링 : Drishti의 주 창에서 파일이 | | 불러오기 사용 가능한 채널 수에 따라 1( - 4) 볼륨을 로드합니다(별도의 파일로). 로드한 후 F2 키를 눌러 고품질 렌더링을 수행합니다. 이 작업을 수행하려면 강력한 GPU 카드가 필요합니다. 렌더링 매개 변수를 처리하는 정보, 전송 함수 편집기, 온라인 자습서에서 검색. 렌더링 속성에 만족하면 애니메이션 렌더링 생성을 진행합니다.
    3. 보기로 이동하여 키프레임 편집기를 활성화합니다. 배아를 처리하고 원하는 시작 위치에 놓습니다. 필요한 경우 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 배아를 중앙으로 "드래그"하거나 마우스를 스크롤하여 확대/축소합니다. 키프레임 편집기에서 키 프레임 설정을 누른 다음 다른 위치, 각도 또는 확대 / 축소를 선택하고 타임 라인 마커를 다른 시점으로 드래그 한 다음 키프레임 설정을 다시 설정하십시오. 이제 배아가 2 개의 다른 위치 / 각도 / 줌으로 표현되는 2 개의 키 프레임과 그 사이에 여러 프레임이 있습니다. 플레이 버튼을 누르면 Drishti는 누락 된 조건을 보간하여 애니메이션으로 재생할 수 있습니다. 파일 |로 이동 이미지 시퀀스를 저장하여 모든 프레임의 애니메이션 시퀀스를 저장합니다. 이 프레임 시퀀스는 나중에 피지 / ImageJ에서 열고 AVI (파일 |로 저장할 수 있습니다. 가져오기 | 이미지 시퀀스 ... 파일 | |한 이름으로 저장 합리적인 프레임 속도로 JPEG 압축 (우리는 15 - 30을 제안합니다).
      참고 : Drishti는 * .wmv 비디오를 저장할 수 있지만 대신 별도의 프레임으로 저장하고 나중에 시리즈를 AVI 또는 MOV 비디오 형식으로 변환하는 것이 좋습니다 (피지 / ImageJ를 사용하여 수행 할 수 있음).
  2. Amira를 사용한 조직의 3D 재구성 및 수동 세분화
    참고: 이 상용 소프트웨어는 3D 데이터 세트에서 배아 조직의 수동 또는 자동/반자동, 3D 세분화를 허용합니다. 이 소프트웨어에는 여러 자습서를 사용할 수있는 온라인 "학습 센터"가 있습니다 41. 이하에서는 면역형광 염색된 배아로부터 배아 조직을 수동으로 분절하는 데 필요한 기본 단계를 설명한다(단계 1.2). 배아가 표준 A-P/D-V 축에 올바르게 배치된 후에는 수동 세분화가 훨씬 쉬워집니다("이미지 데이터 세트 전처리" 섹션, 4.3단계 참조).
    1. 3D TIFF 데이터 세트를 로드합니다. 메시지가 표시되면 올바른 복셀 치수를 지정해야 합니다. 시각화 모듈(예: "Orthoslice" 또는 "Volren")을 만들어 연결하고 3D로 데이터 세트를 검사합니다.
    2. 레이블 필드를 연결합니다(또는 최신 버전의 Amira에서 새 레이블 필드 편집). 이 소프트웨어에서는 수동 세분화 결과가 "재료"에 저장되므로 관심있는 각 조직에 대해 하나의 재료를 만듭니다. 수동 세분화를 위해 "올가미"도구를 사용하십시오. 이 작업을 수행하는 방법을 설명하는 몇 가지 자습서가 있습니다 ( "Amira Segmentation Editor 자습서"를 온라인으로 검색하십시오).
    3. 관심 있는 모든 조직의 세분화가 완료되면 프로젝트 모드로 다시 전환하여 세그멘테이션 편집기를 종료합니다. 각 자료에 속한 픽셀이 동일한 값을 갖는 데이터 세트의 새 버전(현재 원래 데이터 세트 모듈에 연결된 "레이블 필드")을 만들었습니다.
    4. "레이블" 데이터 세트에서 3D 표면 모델을 생성하여 이러한 "재료"를 3D 객체로 변환합니다. 이 작업은 "서피스 생성" 모듈을 부착하고 필요에 따라 매개 변수를 조정하여 수행할 수 있습니다("압축", "테두리", "조정 조정" 및 "제한되지 않은 스무딩" 옵션 활성화). 적용 을 클릭하면 새 모듈 *.surf가 생성됩니다.
    5. 표면 객체를 시각화하고 개별적으로 *obj 파일로 추출 및 내보냅니다. 디스플레이 | 부착 SurfaceView 모듈을 *.surf 모듈로 연결하고 메인 뷰어에서 검사합니다. "SurfaceView" 모듈의 "속성" 패널에서 "재질" 속성에서 모두 + 모두를 선택하고 제거를 클릭하면 뷰어의 버퍼가 비워집니다. 그런 다음 Materials 속성의 두 번째 풀다운에서 하나의 재질만 선택하고 버퍼에 추가를 클릭합니다. 그 재료 만 볼 수 있어야합니다.
    6. 그리기 스타일 속성에서 더 많은 옵션을 클릭|여 서피스를 만들고 새 *.surf 모듈이 생성되어 프로젝트에 추가됩니다. 조직 이름(키보드에서 F2 키를 누름) 및 파일 | 데이터를 다른 이름으로 내보내기... 유형으로 저장 : 웨이브 프론트 (* .obj). 각 재료에 대해 작업을 반복합니다.
      참고 :이 * .obj 파일은 각각 Amira로 분할 된 조직 중 하나를 포함하고 있으며 다른 도구 (피지 / ImageJ 및 SimLab의 "3Dviewer"플러그인)에서 사용할 수 있습니다.
  3. SimLab Composer를 사용하여 휴대용 문서 형식(PDF)으로 대화형 3D 시각화
    참고: 이 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어는 표면 렌더링 이미지, 애니메이션 및 시뮬레이션의 생성을 용이하게 합니다. 유용한 자습서는 42 행에서 찾을 수 있습니다. 여기에서는이 소프트웨어가 Amira로 생성 된 웨이브 프론트 (* .obj) 3D 표면 파일을 사용하여 3D PDF 대화 형 일러스트레이션을 만드는 방법을 설명합니다 (단계 2.3; "3D 렌더링, 시각화 및 분석" 섹션).
    1. 파일 |로 이동 새로 만들고 빈 장면을 만듭니다. 그런 다음 파일| Amira에서 저장된 1st *.obj 파일을 가져오고 가져옵니다. 파일 가져오기 창의 모든 옵션을 선택 없는 상태로 유지하고 확인을 클릭합니다.
    2. 작곡가의 표시 창에 아무 것도 나타나지 않으면 Ctrl+F 를 클릭하거나 아이콘을 클릭하여 모두 맞춤을 클릭합니다. 이제 분할 된 객체가 창 중앙에 나타납니다. 이 과정을 반복하여 다른 세그먼트화된 객체를 추가하고 1번째 객체(예: 인접한 소미트 2개)를 기준으로 해당 위치를 확인합니다.
    3. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 표시 창에서 객체 중 하나를 선택하고 해부학 적 구조 또는 조직의 이름을 반영하도록 이름을 변경 한 다음 "3DGeom ~ 1"표현으로 전환하고 재료 패널을 사용하여 R, G, B 값을 변경하여 색상을 변경하십시오.
    4. 3D 그림이 완전히 어셈블될 때까지 모든 객체에 대해 반복합니다. 일부 재료는 RGB 값 옆의 "알파"채널을 조작하여 투명하게 만들 수 있으므로 내부 또는 폐색 된 객체를 관찰 할 수 있습니다.
    5. 이 소프트웨어를 사용하면 조립 된 배아 그림을 간행물에 포함 할 수있는 "3D PDF"파일로 내보낼 수 있습니다. 먼저 텍스트와 활성 링크가 있는 "템플릿"을 만들어 "장면 상태"를 변경하여 동일한 그림에 지침과 세 가지 단계를 포함할 수 있습니다. 이 작업은 "장면 작성"에서 "공유"모드 (작곡가 창 왼쪽의 버튼)로 전환 한 다음 PDF 설정 표시를 클릭하고 새 페이지 템플릿을 만들어 수행 할 수 있습니다. 원고에 포함할 간단한 대화형 그림을 만들려면 템플릿을 사용하지 말고 PDF 내보내기만 하면 됩니다.
      참고: Adobe Acrobat Reader 소프트웨어를 사용하여 3D PDF와 상호 작용합니다(대화형 3D PDF 그림의 기능 조작성은 사용 가능한 Acrobat Reader 버전에 따라 다를 수 있음). 대부분의 다른 뷰어는 웹 브라우저를 포함한 3D PDF 형식과 호환되지 않습니다. 이러한 3D PDF 인터랙티브 일러스트레이션은 간행물에 포함될 수 있습니다. 편집자에게이 가능성에 대해 미리 물어보십시오.
  4. Imaris를 사용한 3D 시각화 및 분석
    참고: 이 소프트웨어를 사용하면 직관적인 인터페이스와 워크플로우를 통해 2D-4D 현미경 데이터 세트의 포괄적인 이미징 시각화, 분석 및 해석이 가능합니다. 이 소프트웨어를 시작하는 방법에 대한 몇 가지 유용한 자습서가 온라인에 있으며 웹 사이트 (https://imaris.oxinst.com/tutorials)에서 구할 수 있습니다. Imaris의 대규모 데이터 세트(일반적으로 GPU 메모리보다 큰 데이터 세트)를 로드하고 상호 작용하려면 Imaris 설치 폴더에 설치된 "ImarisFileConverter.exe" 프로그램을 사용하여 데이터 세트를 먼저 "*.ims"로 변환하는 것이 좋습니다. ImarisFileConverter는 피지의 BigDataViewer에 의해 저장된 OME 및 "h5"파일을 포함한 많은 현미경 이미지 형식을 읽을 수 있습니다.
    1. 3D 시각화
      1. 이 소프트웨어는 "3D 뷰"모드를 사용하여 데이터 세트의 3D 시각화를 렌더링 할 수 있으며 사용자는 데이터 세트가 표시되는 방식을 여러 번 조정할 수 있습니다 [예 : MIP (최대 강도 투영) 또는 블렌드 모드 (깊이 신호 및 그림자로 더 나은 렌더링) 중에서 선택).
      2. 직교 뷰" 모드 - 적절한 배아 위치 지정(단계 4.3; "이미지 데이터 세트 전처리"섹션) 하나는 "섹션"탭을 사용하여 전체 배아를 탐색하고 정상 평면 (횡단, 코로나 및 시지탈)에서 광학 섹션을 볼 수 있습니다. 배아가 제대로 재배치되지 않으면 직교 평면으로 해부학을 해석하는 것이 매우 어렵습니다 ( 보충 그림 3 참조). Imaris는 3D 배아를 분석 할 때이 문제를 해결하기 위해 "참조 프레임"이라는 기능을 가지고 있지만 데이터 세트를 선험적으로 재배치하는 것이 바람직합니다.
    2. 3D 분석
      참고 :이 소프트웨어에는 형태학 및 형광 강도를 분석하기위한 몇 가지 도구가 있습니다. 예를 들어, 여기서는 Imaris "Spots" 도구를 사용하여 시간에 따른 조직 형광 강도 변화를 분석하는 간단한 워크플로우를 설명하며, 여기서 사용자는 배아에 구형 관심 영역(ROI)을 수동으로 3D로 배치하고, Imaris는 이러한 구형 ROI 내부의 조직 형광을 측정할 수 있습니다.
      1. Imaris에서 3D 또는 4D 데이터 세트를 로드하고 3D 보기 모드에서 새 지점을 추가합니다. 그런 다음 배아의 특정 지점 (4D 데이터 세트를 사용하는 경우 여러 시점 동안)을 선택하고 그 점 내에서 정량화 할 수 있습니다 (예 : 강도 평균).
        참고 :이 소프트웨어는 또한 시간이 지남에 따라 강도를 플로팅 할 수 있습니다. 이를 통해 사용자는 "시간이 지남에 따라 소마이트 내부의 형광이 어떻게 변합니까?"와 같은 질문에 쉽게 대답 할 수 있습니다.
      2. 새 지점 추가 단추를 클릭하거나 3D 뷰를 선택하여 스팟 모듈을 추가 | 이마리스 메뉴의 명소. 자동 반응 건너뛰기를 선택하고 수동으로 편집합니다. Imaris 포인터 모드를 탐색 에서 선택 으로 전환합니다(키보드의 ESC 키를 눌러 수행할 수도 있음).
      3. 스팟 속성 창에서 스팟이 연결될 특정 채널(예: "채널 1")을 선택하고 수동으로 선택한 스폿에 대한 자동 연결 추적 및 자동 전진 옵션 전에 지연 활성화를 활성화합니다.
      4. 마우스 커서를 시각화 창으로 이동하면 커서가 빈 노란색 와이어 구로 변경됩니다. 시점 1로 이동하고 관심 있는 조직을 클릭하여 스폿(=sphere)을 추가합니다. 구("스폿")는 Shift 키를 누른 채 클릭하는 경우에만 추가됩니다. 원하는 모든 시점에 대해 반복하여 시간이 지남에 따라 조직의 동일한 부분을 추적하십시오.
      5. 스팟 속성 창에서 통계 탭으로 전환하고 통계 내에서 전체에서 세부 통계로 전환합니다. 첫 번째 풀다운에서 특정 값을 선택하고 두 번째 풀다운에서 "강도 평균 Ch=*..."를 선택합니다. 여기서 Ch*는 측정이 수행될 채널입니다. "시간 플롯 패널을 열려면 클릭"에 대한 오른쪽 버튼은 스팟 속성 창의 왼쪽 하단에 있습니다. 이 버튼을 클릭하면 시간이 지남에 따라 플롯 된 "반점"내부의 중간 형광 강도가있는 플롯이 열립니다. 추가 분석을 위해 이러한 값을 스프레드시트로 내보낼 수도 있습니다.

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Representative Results

살아있는 및 면역형광 이미징 둘 다에 대해 본 논문에 나타난 대표적인 결과는, 20 × 1.0 NA 물 목표물, 960 nm로 튜닝된 여기 레이저, 및 GaAsP 광검출기 (Dias et al. (2020)43에 기재된 바와 같이)를 갖는 이광자 시스템을 사용하여 수득되었다. 광학 프로젝션 단층 촬영은 맞춤형 OPenT 스캐너를 사용하여 수행되었다 (Gualda et al. (2013)28에 기재된 바와 같이).

라이브 이미징(4D 분석)
축 연장 동안 마우스 배아에서의 LuVeLu 리포터 활성의 대표적인 분석을, "라이브 이미징을 위한 샘플 준비"에 대해 기술된 프로토콜에 따라 수득한다(단계 1.1; "3D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션), "라이브 이미징 데이터 세트 전처리"(단계 3; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션) 및 "Imaris를 이용한 3D 시각화 및 분석"(단계 4.4; "3D 렌더링, 시각화 및 분석")은 그림 1 및 비디오 1에서 관찰할 수 있습니다.

3D 시각화 및 분석
중배엽 분화의 잠재적 NMP 및 주요 조절인자를 검출하기 위한 면역형광 분석법의 사용에 대한 대표적인 결과로서, "면역형광 현미경을 위한 샘플 준비" ("3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션, 단계 1.2), "Deconvolution" 및 "면역형광 이미징 데이터 세트 전처리"(각각 "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션, 단계 3.2 및 3.4), 및 "Imaris를 이용한 3D 시각화 및 분석"에 대해 설명된 프로토콜에 따라 수득된다. ("3D 렌더링, 시각화 및 분석", 단계 4.4)은 그림 2에서 관찰할 수 있다.

면역형광염색의 3D 렌더링화
비디오 2는 "면역형광 현미경을 위한 샘플 제조"를 위한 기술된 프로토콜에 따라 수득된 잠재적 NMPs를 검출하기 위한 면역형광 분석에 대한 대표적인 결과를 나타낸다(단계 1.2; "3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션), "Deconvolution" 및 "면역형광 이미징 데이터세트 전처리"(각각 단계 3.2 및 3.4; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션) 및 "Drishti를 이용한 3D 렌더링 및 시각화"(단계 4.1; "3D 렌더링, 시각화 및 분석" 섹션).

3D 재구성
비디오 3 은 "면역형광 현미경을 위한 샘플 제조"를 위해 기술된 방법에 따라 생성되었다(단계 1.2; "3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션), "면역형광 이미징 데이터 세트 전처리"(단계 3.4; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션) 및 "아미라를 이용한 조직의 3D 재구성 및 수동 세분화"(단계 4.2; "3D 렌더링, 시각화 및 분석"). E9.5 야생형(WT) 마우스 배아의 꼬리 조직의 면역형광 염색에 기초한 3D 재구성을 나타낸다.

인터랙티브 3D 일러스트레이션
도 3에서는 마우스 배아의 꼬리 조직의 재구성에 대한 인터랙티브한 3D 시각화를 휴대용 문서 포맷(3D PDF)으로 제시하고, "면역형광 현미경을 위한 샘플 준비"를 위해 설명된 프로토콜에 따라 준비한다(단계 1.2; "3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션), "면역형광 이미징 데이터 세트 전처리"(단계 3.4; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션), "Amira를 사용한 조직의 3D 재구성 및 수동 세분화" 및 "SimLab을 사용하여 휴대용 문서 형식(PDF)으로 인터랙티브 3D 시각화"(각각 "3D 렌더링, 시각화 및 분석", 4.2 및 4.3단계). 이러한 유형의 형식은 과학 내용을보다 일반적인 청중, 특히 교육 환경에서 쉽게 전달할 수 있도록 쉽게 사용할 수 있습니다. 대화형 시각화를 사용하려면 Adobe Acrobat Reader(3D 플러그인 허용)를 사용해야 합니다.

OPT 데이터 세트 시각화
비디오 4 는 E18.5 마우스 태아를 이미징한 후 재구성된 OPT 데이터셋의 대표적인 예를 나타낸다. 샘플은 "광학 프로젝션 단층 촬영을 위한 샘플 준비"("3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션; 단계 1.3) "OPT 데이터 세트 전처리 및 재구성"(단계 3.5) 및 "3D 렌더링, 시각화 및 분석"의 상이한 모듈(단계 4). 상세한 해부학적 분석(예를 들어, 측정)은 또한 피지/ImageJ, 아미라 또는 Imaris 소프트웨어를 사용하여 이 데이터세트에서 수행될 수 있다. 영화에는 네 개의 비디오 세그먼트가 포함되어 있습니다 : 첫 번째는 피지 / ImageJ로 제작 된 흑백 시상 조각의 시퀀스를 보여줍니다. 두 번째로, Imaris로 제작된 직교 뷰는 직교 조직 부분의 인터랙티브 3D 슬라이싱 및 렌더링을 보여줍니다. 세 번째는 아미라에서 준비한 것처럼 유색 시상 조각에서 태아가 "조립"하는 것을 보여줍니다. 마지막 비디오 세그먼트는 Drishti로 준비된 다양한 뷰에서 태아의 애니메이션을 3D로 표시합니다.

비디오 1 - Snai1-cKO에서의 LuVeLu 리포터 발현의 이광자 라이브 이미징 및 대조군 E8.5 배아 (참조 43으로부터 적응). 첫 번째 세그먼트는 시간 = 0 (5 μm 스텝 크기의 z-스택)에서 리포터 활동을 보여주고 두 번째 부분은 전체 라이브 이미징 (8.5 분마다 10 μm z-스택)을 포함합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2 - E10.5 야생형 테일버드의 T(Brachyury) 및 Sox2에 대한 전체 마운트 면역형광 염색의 3D 렌더링. T 발현은 자홍색으로, Sox2는 노란색으로, DAPI는 회색으로 나타내었다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3 - 중배엽을 포함한 다양한 꼬리 조직의 윤곽에 중점을 둔 후기 E9.5 야생형 마우스 배아의 꼬리 부분의 3D 재구성. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

비디오 4 - E18.5 야생형 배아는 광학 프로젝션 단층 촬영으로 이미징되어 in toto 이미징 및 3D 데이터 세트를 시각화하고 렌더링하기위한 몇 가지 기술을 강조합니다. 첫 번째 세그먼트는 피지 / ImageJ로 준비된 시상 슬라이스 시퀀스, Imaris에서 렌더링 된 두 번째 "라이브"직교 뷰, 세 번째 세그먼트는 Amira에서 준비된 컬러 시상 슬라이스의 순차적 렌더링, 네 번째 세그먼트는 Drishti에서 준비된 애니메이션 렌더링을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 1
도 1: E8.5 Snai1-cKO 및 대조군 배아에서의 LuVeLu 리포터 발현의 4D 분석 (참고문헌 43으로부터 적응됨). (A) Snai1-cKO(Meox2-Cre+/0::Snai1flox/-) (Aa) 및 대조군(Ab) 배아에서 LuVeLu 리포터의 시점 = 0에서의 스냅샷. 전소성 중배엽에서의 정상적인 LuVeLu 신호 이외에, Snai1-cKO 배아는 또한 원시적 줄무늬(흰색 화살표)로부터 발생하는 자궁외 팽창에서 LuVeLu 발현을 표시한다. (B) Snai1-cKO::LuVeLu+/0 적색 반점(Ba)에 의해 강조된 영역에서의 시간적 강도 평균 정량 분석은 두 개의 피크(시간 경과의 t=1.3h 및 t=3.6h에서)의 존재와 이들 사이의 실질적인 감소를 나타내며, 따라서 조건부 돌연변이 배아의 팽창에서의 사이클링 활성을 시사한다. LuVeLu 사이클링 활성의 징후는 원시적 인 줄무늬 근처에서 관찰되지 않았다 (녹색 반점; Bb) LuVeLu+/0 대조군 배아에서. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: E9.5 Snai1-cKO 및 WT 배아에서의 전체 탑재 면역조직화학 (참조문헌 43으로부터 적응됨). (A) T(녹색) 및 Sox2(적색)에 대한 면역염색. (B) Tbx6 (녹색) 및 Lam1 (적색)에 대한 면역 염색. DAPI는 파란색으로 표시됩니다. 다른 배아 (Aa, Ab, Ba, 및 Bb)의 꼬리 부분의 3D 렌더링 (블렌드 모드). 횡단 (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 및 Bb2) 및 시상 (Aa2, Ab2, Ba3 및 Bb3) 배율 (Mag.)과 함께 광학 섹션이 또한 상이한 배아에 대해 도시된다. 배율은 DAPI 없이 표시됩니다. 흰색 화살표는 돌연변이 배아에서 일부 NMP (T 및 Sox2 이중 양성 세포)의 위치 차이를 강조합니다. 노란색 화살표와 화살촉은 Snai1-cKO 배아에서 각각 자궁외 / 비정상적인 Tbx6 및 Lam1 발현을 가리 킵니다. 배율 막대는 50μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 - 3D PDF - 축 방향 확장 동안 야생형 마우스 배아의 세그먼트 된 꼬리 조직의 3D 재구성을 보여주는 3D PDF 형식의 대화 형 3D 그림 (E8.5, E9.5 및 E10.5). 세분화는 Amira에서 수동으로 수행되었으며 3D PDF는 Simlab Composer에서 조립 및 내보내졌습니다. 대화형 시각화를 수행하려면 Adobe Acrobat Reader(3D 플러그인 허용)가 필요합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1 - 표백 배아의 대표적인 결과(단계 3.2 이후; "3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2 - Z 깊이 신호 감쇠의 대표적인 결과(단계 4.1; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션). A- Z 깊이 신호 감쇠 전; B - 양호한 Z 깊이 신호 감쇠; C - 잘못된 Z 깊이 신호 감쇠. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3 - "피지/ImageJ를 사용하여 배아를 해부학적으로 표준 위치로 재배치"한 후 (A) 재배치된 E7.5 마우스 배아를 보여주는 전체 탑재형 면역형광 염색의 대표적인 결과(단계 3.4.3; "이미지 데이터 세트 전처리"섹션) 대 위치를 변경하지 않고 동일한 배아 (B). 시각화는 Imaris를 사용하여 획득하였다(단계 4.1.2 참조; "3D 렌더링, 시각화 및 분석" 섹션). 노란색의 T, 자홍색의 Sox2, 파란색의 DAPI. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

축 신장과 세분화는 척추 동물 배아 발달 중에 발생하는 가장 복잡하고 역동적 인 과정 중 두 가지입니다. 단일 세포 추적과 함께 3D 및 4D 이미징의 사용은 한동안 제브라 피쉬와 닭 배아 모두에서 이러한 과정을 연구하기 위해 적용되었으며, 접근성과 배양 조건은 복잡한 이미징을 용이하게합니다 19,44,45,46,47,48,49 . 대조적으로, 마우스 배아의 중간 및 후기 유기생성 단계는 그러한 세부 사항에서 제대로 연구되지 않은 채로 남아 있지만, 예를 들어 생체 내 영상(50)에서 약간의 진전이 이루어졌다. 이 원고에서 우리는 목, 몸통 및 꼬리 형성 중에 NMP 및 중배엽 유도체에 대한 연구를 용이하게하기 위해 다차원 이미지 및 그 분석의 획득에 사용할 수있는 몇 가지 방법론에 대한 특정 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 마우스 배아를 위해 설계되었지만, 가스트룰로이드51,52와 같은 3D 배아 줄기 세포 응집체와 같은 explant 시스템 및 시험관내 모델에서 작동하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 실제로, 인간 위스트룰로이드(53)에 적용된다면, 이러한 방법들은 인간 축방향 신장 및 세분화의 토토 이미징 및 데이터 분석에서 더 잘 촉진될 것이며, 특히 이러한 시험관내 모델 시스템과 장기 4D 라이브 이미징의 호환성을 고려할 때. 이러한 프로토콜 외에도 다양한 현미경 검사 기술과 특정 실험 목표에 맞게 어떻게 사용할 수 있는지에 대한 일반적인 정보도 제공합니다. 우리는이 정보가 연구자가 실험 설계를 개선하고 실험실 및 기관에서 사용할 수있는 현미경 장비 및 이미지 분석 도구를 최대한 활용하는 데 도움이되기를 바랍니다.

샘플 준비는 해부에서 현미경에 장착에 이르기까지 전체 절차 동안 배아의 적절한 보존 및 처리가 고품질의 데이터를 얻는 데 필수적이기 때문에이 원고에 설명 된 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 탈수 (및 재수화), 표백 및 제거 절차는 샘플 준비 중에 가장 중요한 단계이며 이미징의 최종 결과에 큰 영향을 미칩니다. 따라서 우리는 프로토콜에서 이러한 단계를 자세히 설명하고 연구자가 샘플의 흠 잡을 데없는 준비를 달성하는 데 도움이되는 팁을 제공했습니다. 특히, 우리는 이식 후 마우스 배아를 지우기위한 세 가지 솔루션의 사용을 자세히 설명했습니다 (E11.5까지). 메틸 살리실레이트와 BABB는 수년 동안 사용되어 왔으며 효율적인 클리어링 시약이지만 일부 조직, 특히 중배엽에서 완전한 레이저 침투는 때로는 달성하기 어렵습니다. 반대로, RapiClear는 이러한 발달 단계에서 마우스 배아를 제거하는 데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 우리 손에서는 다양한 배아 조직에서 완전한 레이저 침투를 가능하게하는 것으로 입증되었으며, 독성이 없으며 배아 탈수가 필요하지 않기 때문에 현미경 슬라이드에 배아를 장착하는 핵심 단계를 크게 단순화합니다. 또한 슬라이드에서 배아를 조작할 필요성(제거된 배아는 매우 취약해지고 투명해지면 조작하기 어려워짐) 또는 상용 소프트웨어(예: Amira 또는 Imaris)에 의존해야 할 필요성을 극복하기 위해 Fiji/ImageJ(무료 오픈 소스 소프트웨어)를 사용하여 데이터 품질을 잃지 않고 이미지 전처리 중에 해부학적으로 표준/특정 위치로 배아를 재배치할 수 있는 간단하지만 효율적인 파이프라인을 제공했습니다. 따라서 우리는이 원고에서 제공하는 방법과 세부 사항이 면역 형광 분석 중 샘플 준비의 핵심 단계를 용이하게하고 개선하는 데 기여할 것으로 기대합니다.

이미지 획득 중에 라이브 이미징을 위해 샘플을 유지 관리하거나 3D로 최적의 관찰을 위해 장착해야하는 방법에 영향을 미치는 시스템 구성을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 마우스 배아는 가열원, 높은 수준의O2 및 액체 영양소가 풍부한 배지 (고체가 아님)를 필요로하므로 직립 또는 기존의 라이트 시트 구성으로 현미경으로 유지하기가 더 어려워집니다. 배아의 정확한 3D 이미징을 위해서는 고정화 또한 중요합니다. 사용 가능한 광학 장치도 고려해야 할 또 다른 중요한 요소입니다. 적절한 3D 이미징을 위해서는 높은 수치 조리개 목표가 선호되어야하지만 특히 큰 작동 거리 (수백 마이크로 미터 이상)가 필요한 경우 항상 사용할 수있는 것은 아닙니다. 생리적 (즉, "담그기") 렌즈는 라이브 이미징에 매우 일반적이지만 유리 바닥 접시를 통한 이미징이나 BABB 또는 메틸 살리실레이트에 장착 된 클리어 샘플에는 이상적이지 않습니다. 클리어 조직에 최적화 된 목표가 점점 보편화되고 있지만, 대부분의 실험실에서 여전히 찾기가 상대적으로 드뭅니다. 기존 목표로 클리어 된 조직을 이미지 할 수도 있지만 사용자는 위의 섹션에서 설명했듯이 데이터 세트를 해석하고 분석하기 전에 한계와 필요한 치료를 알고 있어야합니다. 또한 이미징 결과의 정확한 감지 및 해석에는 항상 장비뿐만 아니라 작동 조건 및 매개 변수 설정도 신중하게 선택해야 합니다. 사용자는 다음 리뷰 54,55,56,57을 읽고 바이오 이미지의 적절한 디지털 이미징 및 해석의 원칙을 완전히 이해하는 것이 좋습니다.

(2D) 조직학적 절편에 적용된 면역형광은 배아 내부의 조직 및 세포 조직을 이해하고자 하는 연구의 특징이었다. 전체 탑재 면역 표지 방법 및 비파괴적인 3D 이미징 기술 (여기에 설명 된 바와 같이)의 출현은 발달 생물 학자들에게 유전자 및 단백질 발현 및 형태 형성 과정과의 관계를 이해하는 것이 더 쉽고 정확한 손상되지 않은 배아에서 조직 및 세포 공간 조직을 조사 할 수있는 수단을 제공했습니다. toto 이미징을 사용하면 가상 조직학 (임의의 슬라이스에서 가상 단면화; 보충 그림 3) 및 3D 시각화 및 분석 도구를 사용하여 세포 및 조직 아키텍처 및 통신에 대한 다양한 가설을 쉽게 탐색할 수 있습니다( 그림 2, 비디오 2 및 비디오 4 참조). 많은 저널 (예 : eLife and Development)이 현재 논문의 온라인 버전에 비디오를 포함 할 수있는 기회를 제공하고 있음을 고려할 때, 연구자는이 기회를 활용하고 3D 및 4D 이미징 실험 및 분석을 수행 할뿐만 아니라 결과를 강조하는 3D 비디오를 만들 것을 촉구합니다. 데이터가 제시되고 출판되는 방식의 이러한 중요한 변화는 연구자와 동료들이 결과를 더 잘 이해할 수있게 해줄 것입니다. 궁극적으로, 이러한 방법은 척추동물 세분화에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 특히 NMP의 역할과 관련하여 (Attardi et al. (2018)45 및 Dias et al. (2020)43 은 두 가지 좋은 예이다).

이 작업에서 우리는 일부 소프트웨어 도구 (예 : Amira 및 Imaris뿐만 아니라 피지 / ImageJ 및 Drishti와 같은 무료 오픈 소스 도구)를 사용하여 척추 동물 축 확장 및 소미토 제네시스의 맥락에서 3D 데이터 시각화 및 분석을 허용하고 향상시키는 방법을 강조했습니다. 대부분의 경우, 몇몇 생물정보학 도구와 마찬가지로, 여기에 설명된 소프트웨어는 잠재적으로 다른 것으로 대체될 수 있다(즉, 몇몇 소프트웨어 솔루션과 중복이 있다). 그러나 Imaris의 "3D View"기능을 사용하면 "3D 뷰어"Fiji / ImageJ 플러그인을 사용하여 얻은 것보다 훨씬 우수한 품질의 3D 시각화를 사용할 수 있으므로 MIP 또는 블렌드 모드 중에서 선택할 수 있습니다. 또한 Imaris의 "직교 뷰"기능과 3D 분석 및 정량화 (예 : "스팟"모듈)를위한 파이프 라인이 사용자 친화적입니다. 이 문제에서는 거의 모든 소프트웨어 도구가 어떤 형태의 3D 렌더링을 허용하지만 매우 사실적인 렌더링을 생성 할 수있는 고유 한 조명 모델과 음영 때문에 Drishti를 권장합니다 ( 비디오 4의 마지막 세그먼트 참조). 이미지 데이터 세트 (전처리 및 3D 렌더링)의 모든 생물 정보학 처리에 대한 엄지 손가락의 규칙은 최종 결과가 배아에서 관찰되는 것을 충실하게 표현해야한다는 것입니다. 따라서 이미지 데이터 세트의 품질과 해석에 심각한 영향을 미치는 Z축 스케일링 왜곡(굴절률 불일치로 인한) 및 깊이 신호 감쇠(심층 샘플의 광 산란으로 인한)로 인해 발생하는 문제를 완화하는 간단한 방법을 제공했습니다. 이러한 알고리즘을 사용하여 Amira 소프트웨어를 사용하여 수동 윤곽선 (종종 자동화 된 세분화 도구로는 불가능함)을 통해 전체 마운트 면역 형광 염색에서 중배엽 조직을 수동으로 세그먼트화하고 3D 재구성하는 지침을 제공했습니다. 우리는이 소프트웨어가 명확한 물리적 분리 또는 대조 차이가없는 조직의 수동 계수 (예 : 특정 전사 인자의 표현)에 특히 유용하다는 것을 알게되었습니다. Amira에 대한 비상업적 권장 대안은 덜 강력하지만 LabKIT 피지 / ImageJ 플러그인 (https://imagej.net/Labkit)입니다.

우리는 또한 광학 투사 단층 촬영으로 이미징 된 toto E18.5 마우스 태아의 3D 시각화의 예를 대표적인 결과 중 포함시켰으며, 이는 광학 이미징 및 3D 이미지 분석의 기능을 전체 마우스 배아 발생(22)으로 확장시킨다. 이러한 방법론은 융합된 척추, 척추측만증 또는 척추 이질증과 같은 골격 이상을 (예를 들어, 형태학적 측정을 통해) 이해하고 분석하는데 사용될 수 있으며, 이는 나중에 소미토제네시스 동안 문제로 인해 발생할 수 있다(예를 들어, Lfng 돌연변이)13,58,59,60,61,62 . 중요하게도, 이러한 영상화 접근법은 척추 컬럼(63)에 영향을 미치는 표현형에 또한 기여할 수 있는 다른 조직(예를 들어, 근육)을 포함하는 전지구적 맥락에서 골격 기형의 관찰을 허용한다.

마지막으로, eMouse Atlas Project64의 이미징 데이터 세트로 만든 체적 모델을 강조하는 최근 작업과 일치하여, 우리는 3D 모델 (예 : 3D PDF)의 힘을보다 일반적인 청중에게 설명하고 척추 동물의 축 신장 및 세분화에 대한 연구 및 교육을 돕는 데 사용할 수있는 상세한 단계별 방법을 설명했습니다. 우리는이 원고에 제시된 정보가 연구자가 실험을 설계, 분석 및 제시하는 방식을 바꾸고 척추 동물 신체 축 형성에 대한 지식을 향상시키는 데 기여하기를 바랍니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

LuVeLu 기자 균주에 대한 Olivier Pourquié와 Alexander Aulehla, RapiClear 테스트 샘플의 SunJin 실험실, BigStitcher를 사용하여 도움을 주신 Hugo Pereira, 라이브 이미징 장치, IGC 동물 시설 및 Mallo 실험실의 과거와 현재 구성원에게 유용한 의견과 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

포르투갈 기금 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 및 ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017이 지원하는 IGC의 고급 이미징 시설의 기술 지원에 감사 드리며, 포르투갈 2020 파트너십 계약에 따라 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) 및 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)를 통해 Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020)이 공동 자금을 지원합니다. 이 원고에 설명 된 작업은 LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, 포르투갈) 및 SCML-MC-60-2014 (포르투갈 산타 카사 다 미세 리코 디아)를 M.M., 연구 인프라 Congento, 프로젝트 LISBOA-01-0145-FEDER-022170 및 박사 학위 펠로우십 PD / BD / 128426 / 2017을 A.D.에 부여함으로써 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose low gelling temperature Sigma A9414 Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software Thermofisher - Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal) R and D Systems AF2085 RRID:AB_2200235 For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) Abcam ab92494 RRID:AB_10585428 For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) R and D Systems AF4744 RRID:AB_2200834 For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) Sigma L9393 RRID:AB_477163 For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) Molecular Probes A11055 RRID:AB_2534102 For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) ThermoFisher   Scientific A10042 RRID:AB_2534017 For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%) (any) - Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin Biowest P6154 For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0 (any) - 100um thick
Coverglass 20x20 mm #1 (any) - 170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5 (any) - To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) Life Technologies D3571 For immunofluorescence
Drishti software (open source) - Free software tool
EDTA Sigma ED2SS For demineralization
Fiji/ImageJ software (open source) - Free software tool
Glycine NZYtech MB01401 For immunofluorescence
Huygens software Scientific Volume Imaging - Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum GE Healthcare #HYCLSH30070.03 For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 % Milipore 1085971000 For clearing
Imaris software Bitplane / Oxford instruments - Commerial software tool
iSpacers SunJin Lab (varies) Use as spacers for preparations
L-glutamine Gibco #25030–024 For live imaging medium
Low glucose DMEM Gibco 11054020 For live imaging medium
M2 medium Sigma M7167 To dissect embryos
Methanol VWR VWRC20847.307 For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate Sigma M6752 Used to clear embryos
Paraformaldehyde Sigma P6148 Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin Sigma #P0781 For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution) Biowest L0615-500 -
RapiClear SunJin Laboratory RapiClear 1.52 Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers Sigma C5474 Use as spacers for preparations
simLab software SimLab soft - Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm (any) - To mount thick embryos.
Triton X-100 Sigma T8787 For immunofluorescence

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Dias, A., Martins, G. G., Lopes, A., Mallo, M. Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation. J. Vis. Exp. (168), e62086, doi:10.3791/62086 (2021).

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