Summary
يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.
Abstract
يعتمد التطور السليم لدماغ الثدييات على توازن دقيق بين انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. يتم التحكم في هذا التوازن بإحكام من خلال التعبير الجيني الذي يتم ضبطه على مستويات متعددة ، بما في ذلك النسخ وما بعد النسخ والترجمة. وفي هذا الصدد، تبرز مجموعة متزايدة من الأدلة دورا حاسما للتنظيم التحويلي في تنسيق قرارات مصير الخلايا الجذعية العصبية. الكسر المتعدد هو أداة قوية لتقييم حالة الحمض النووي الريبي الترجمي على المستويين الجيني العالمي والفردي. هنا، نقدم خط أنابيب متعدد السمات في المنزل لتقييم الكفاءة التحويلية في الخلايا من قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نصف بروتوكولات إعداد تدرج السكروز وتحلل الأنسجة والطرد الفائق والتحليل القائم على الكسر للحالة الترجمية ل mRNA.
Introduction
أثناء تطور دماغ الثدييات ، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية وتفرق لتوليد الخلايا العصبية وجليا1،2 . اضطراب هذه العملية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في بنية الدماغ ووظيفة, كما رأينا في العديد من اضطرابات النمو العصبي3,4. السلوك السليم للخلايا الجذعية العصبية يتطلب التعبير المنظم لجينات محددة5. في حين تمت دراسة التحكم اللاجيني والنسخي لهذه الجينات بشكل مكثف ، تشير النتائج الأخيرة إلى أن تنظيم الجينات على مستويات أخرى يساهم أيضا في تنسيق انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز6و7و8و9و10. وبالتالي ، فإن معالجة برامج التحكم التحويلية سوف تعزز بشكل كبير فهمنا للآليات الكامنة وراء قرار مصير الخلايا الجذعية العصبية وتطور الدماغ.
وقد طبقت ثلاث تقنيات رئيسية مع نقاط قوة مختلفة على نطاق واسع لتقييم الوضع الترجمي من مرنا، بما في ذلك التنميط ريبوسوم، وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) والتنميط متعدد السمات. التنميط ريبوسوم يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد شظايا الحمض النووي الريبي المحمية ريبوسوم، مما يسمح للتحليل العالمي لعدد وموقع ترجمة الريبوسومات على كل نسخة لاستنتاج غير مباشر معدل الترجمة من خلال مقارنتها وفرة النص11. TRAP يستفيد من البروتينات الريبوسومية الموسومة بالظهارة لالتقاط الريبوسوم ملزمة mRNAs12. وبالنظر إلى أنه يمكن التعبير عن البروتينات الريبوسومية الموسومة في أنواع خلايا محددة باستخدام النهج الوراثية، يسمح TRAP بتحليل الترجمة بطريقة خاصة بنوع الخلية. وبالمقارنة، فإن التنميط المتعدد، الذي يستخدم تجزئة تدرج كثافة السكروز لفصل الجزء الحر والسيء الترجمة (أحاديات أخف وزنا) عن تلك التي تترجم بنشاط عن طريق الريبوسومات (البوليسومات الأثقل)، يوفر قياسا مباشرا لكثافة الريبوسوم على مرنا13. ميزة واحدة تقدم هذه التقنية هو براعة لدراسة ترجمة مرنا محددة من الفائدة، فضلا عن تحليل ترجمة الجينوم على نطاقواسع 14.
في هذه الورقة، ونحن نصف بروتوكول مفصل من التنميط متعددة لتحليل قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نستخدم نظام تجميعها في المنزل لإعداد تدرجات كثافة السكروز وجمع الكسور لتطبيقات المصب. يمكن تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة لتحليل أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأشرفت لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كالغاري على جميع استخدام الحيوانات. تم شراء فئران CD1 المستخدمة في التجربة من بائع تجاري.
1. إعداد الحلول
ملاحظة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، رش منضدة العمل وجميع المعدات مع محلول إزالة التلوث RNase. يتم استخدام نصائح خالية من RNase للتجربة. يتم إعداد جميع الحلول في المياه الخالية من RNase.
- إعداد محلول مخزون سيكلوهيكسميد (100 ملغم/مل) في DMSO وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
- إعداد 2.2 M حل مخزون السكروز بإضافة 75.3 غرام من السكروز إلى المياه الخالية من RNase وتتصدر حجم إلى 100 مل (لإعداد ~ 16 التدرج). يمكن الاحتفاظ بالمحلول عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- إعداد محلول الملح 10x (1 M NaCl; 200 mM تريس-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2).
- إعداد 60٪ (ث / v) محلول مطاردة السكروز، التي تحتوي على 30 غرام من السكروز، 5 مل من محلول الملح 10x وأعلى حجم يصل إلى 50 مل مع المياه الخالية من RNase.
- اختياريا، إضافة بقعة من بروموفينول الأزرق أو ما يقرب من 5 ميكرولتر من 1٪ بروموفينول الأزرق في المياه الخالية من RNase إلى الحل مطاردة. 1.6. تخزين الحلول عند 4 °C.
2. إعداد تدرج السكروز
ملاحظة: الدقة في إعداد تدرجات السكروز أمر بالغ الأهمية في الحصول على نتائج متسقة وقابلة للاستنساخ.
- لإعداد ستة 10-50٪ تدرجات السكروز، تمييع محلول السكروز 2.2 M كما هو الحال في الجدول 1.
| محلول السكروز | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 م السكروز | 2 مل | 4 مل | 6 مل | 8 مل | 10 مل |
| محلول ملح 10X | 1.5 مل | 1.5 مل | 1.5 مل | 1.5 مل | 1.5 مل |
| سيكلوهيكسميد | 15 ميكرولتر | 15 ميكرولتر | 15 ميكرولتر | 15 ميكرولتر | 15 ميكرولتر |
| الماء | 11.5 مل | 9.5 مل | 7.5 مل | 5.5 مل | 3.5 مل |
| إجمالي حجم الصوت | 15 مل | 15 مل | 15 مل | 15 مل | 15 مل |
الجدول 1: تخفيف السكروز للمستحضرات من تدرجات السكروز.
ملاحظة: قم دائما بإعداد تدرجات السكروز في مضاعفات اثنين لتحقيق التوازن بين الوزن أثناء الطرد الفائق.
- مسح إبرة نهاية معدنية حادة مع محلول إزالة التلوث RNase. شطف لفترة وجيزة أنابيب الطرد المركزي للغاية، والأنابيب والمحاقن باستخدام المياه الخالية من RNase. الهواء الجاف الأنابيب بحيث لا يبقى قطرة ماء في الأنابيب كما أي الماء المتبقي سوف يغير تركيز السكروز.
- ضع الإبرة المعدنية على حامل المشبك وأنبوب الطرد المركزي على المسرح الآلي. لإعداد التدرجات باستمرار، تم استخدام نظام تجميع المنزل الذي يحتوي على مرحلة الآلية لعقد أنبوب الطرد الفائق ومضخة حقنة لحقن حلول السكروز(الشكل 1،انظر الخطوة 9 للحصول على تفاصيل).
- ملء حقنة 30 مل مع ~ 16 مل من السكروز 10 ٪ (ما يكفي لستة تدرجات) ، ووضعها على مضخة حقنة وتوصيله إلى الإبرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة، والأنابيب، والإبرة. مسح طرف قبالة الإبرة لإزالة أي حل المتبقية.
- تحريك المرحلة الآلية حتى بحيث غيض من الإبرة يمس وسط الأنبوب في الجزء السفلي.
- ضبط مضخة حقنة بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة لحجم 2.3 مل.
- بعد الاستغناء عن 2.3 مل من محلول السكروز 10٪، انتقل إلى أسفل المرحلة الآلية وتكرار العملية لجميع التدرجات الستة.
- كرر الخطوات 2.4-2.7 لإضافة محلول السكروز 20٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب، تليها حلول السكروز 30٪، 40٪ و 50٪ بالمثل.
- بعد إعداد التدرج، ختم أنبوب الطرد المركزي الفائق باستخدام فيلم البارافين.
- اترك الأنابيب بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية بحيث تنتشر طبقات السكروز المختلفة معا لإعطاء تدرج مستمر.
3. تشريح الأنسجة
ملاحظة: الفئران الحوامل قتل رحيم عن طريق خلع عنق الرحم يسبقه التخدير مع 5٪ isoflurane.
- جمع أجنة الفئران CD1 في اليوم الجنيني 12، أو غيرها من النقاط الزمنية حسب الحاجة، ووضع الأجنة في لوحة Ø 10 سم التي تحتوي على الجليد الباردة هانك متوازنة الملح الحل (HBSS) على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية.
- تحت نطاق التشريح، نقل جنين واحد إلى لوحة Ø 6 سم تحتوي على HBSS الجليد الباردة.
- استخدام الإبر 21-23 G لإصلاح موقف الرأس عن طريق اختراق من خلال عيون في زاوية 45 درجة تقريبا وتطبيق القوة للتأكد من الإبر ثابتة على لوحة(الشكل 2A).
- استخدام ملقط No.5 لإزالة الجلد والجمجمة، من الوسط إلى الجانبين.
- استخدام ملقط لقطع المصابيح الشمية وإزالة السحايا لفضح الأنسجة القشرية.3.6.Use ملقط منحني لقطع الأنسجة القشرية إلى 2-3 مل من المتوسطة العصبية على الجليد (الشكل 2B). تجمع الأنسجة القشرية من أجنة مختلفة حسب الحاجة. الأنسجة من 8-10 الأجنة عادة ما تعطي ~ 200 ميكروغرام مجموع الحمض النووي الريبي.
4. تحلل الخلية
- في يوم تشريح الأنسجة، وإعداد العازلة تحلل الخلايا الطازجة كما هو موضح في الجدول 2.
| حل | التركيز النهائي | حجم |
| تريس-HCl (pH 7.5) | 20 مليون متر | 100 ميكرولتر |
| KCl | 100 مليون متر | 250 ميكرولتر |
| مجمكل2 | 5 مليون متر | 25 ميكرولتر |
| تريتون X-100 | 1٪ (v/v) | 500 ميكرولتر |
| ديوكسيكولات الصوديوم | 0.5٪ (ث/5) | 500 ميكرولتر |
| ديثيوثيريتول (DTT) | 1 مليون متر | 5 ميكرولتر |
| سيكلوهيكسميد | 100 ميكروغرام/مل | 5 ميكرولتر |
| RNase المياه الحرة | أعلى حتى 5 مل | |
| مجموع | 5 مل | 5 مل |
الجدول 2: إعداد العازلة تحلل متعدد.
ملاحظة: ملحق تحلل العازلة مع مثبطات البروتيز والفوسفاتاز.
- إضافة سيكلوهيكسيميد إلى الوسط العصبي مع الأنسجة تشريح إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. Cycloheximide كتل استطالة الترجمة، وبالتالي، يمنع ريبوسوم الجريان 15.
- جهاز الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
- غسل الأنسجة مرتين مع الجليد الباردة الفوسفات العازلة المالحة (PBS) تكملها مع 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية تكملها مع 4 ميكرولتر من مثبط RNase. ماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الأنسجة في عازلة تحلل. استخدم إبرة الأنسولين لتسلي الأنسجة برفق.
- احتضان الأنسجة على الجليد لمدة 10 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 2-3 دقائق.
ملاحظة: لمنع تدهور الأنسجة، تأكد من أن جميع خطوات تحلل الأنسجة تتم على الجليد. - جهاز طرد مركزي عند 2000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد على الجليد.
- جهاز طرد مركزي عند ~13,000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
- نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد على الجليد.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي في الأنسجة lysate باستخدام الطيف الأشعة فوق البنفسجية فيس.
ملاحظة: إذا تم تضمين عينات متعددة في التجربة، قم بتخفيف العينات إلى نفس التركيز مع مخزن تحلل خلايا إضافي لتقليل التباين.
5. تحميل العينة والطرد الفائق
- قم بالتبريد المسبق لدوار الطرد الفائق ودلاء التأرجح عند 4 درجات مئوية، وحدد درجة حرارة جهاز الطرد المركزي الفائق إلى 4 درجات مئوية.
- الحفاظ على 20 ميكرولتر من الأنسجة lysate كما إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي.
- عينات الحمل (50-300 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مع حجم متساو) على الجزء العلوي من التدرجات السكروز عن طريق الاستغناء ببطء lysate إلى جدران أنابيب الطرد المركزي للغاية.
- ضع أنابيب الطرد الفائق برفق في دلو الأرجوحة. تأكد من أن جميع الدلاء المعاكسة تماما متوازنة.
- تحميل دلاء سوينغ على الدوار. تعيين جهاز الطرد المركزي الفائق إلى 190،000 × ز (~ 39،000 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- ضع التدرجات برفق على الثلج بعد الطرد المركزي.
6. الكسر وجمع العينات
ملاحظة: يتم استخدام نظام تجزئة وتسجيل وجمع منزلي للتحليل وجمع العينات من التدرجات(الشكل 3، راجع مكونات الجهاز).
- ضع أنبوب طرد مركزي فارغ على مثقب الأنبوب واخترق الأنبوب برفق بواسطة الإبرة من الأسفل.
- قم بتشغيل شاشة الأشعة فوق البنفسجية، وافتح برنامج تسجيل الإشارات الرقمية.
- ملء حقنة 30 مل مع 25 مل من محلول مطاردة السكروز 60٪. اضغط بلطف على الحقنة بحيث يملأ محلول المطاردة الأنبوب الفارغ ويمر عبر شاشة الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر لتعيين خط الأساس للكشف.
- اضغط على الصفر التلقائي على شاشة الأشعة فوق البنفسجية لتسجيل خط أساس للكشف. اضغط على تشغيل البرنامج لبدء التسجيل.
- بمجرد أن يقوم النظام بإنشاء خط أساس ، أوقف التسجيل مؤقتا على البرنامج وتراجع عن حل المطاردة. تأكد من عدم بقاء أي حل مطاردة متبقية في النظام.
ملاحظة: شطف النظام مع المياه الخالية من RNase لإزالة حلول السكروز المتبقية المتبقية من المدى السابق. - تحميل أنبوب عينة واحدة إلى أنبوب مثقب. تخترق بلطف أنبوب مع الإبرة من أسفل.
- بدء التسجيل على البرنامج. بدء ضخ حقنة (معدل تدفق 1 مل / دقيقة لحجم 25 مل) وجامع الكسور لجمع كسور متعددة. تعيين إعدادات الكسر إلى 30 s.
ملاحظة: قبل كل تشغيل، تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة أو الأنابيب عن طريق الضغط بلطف على الحقنة للسماح للحل مطاردة تدفق مستمر من خلال الإبرة. - جمع الكسور في أنابيب 1.5 مل (500 ميكرولتر لكل منهما) باستخدام جامع الكسور.
- يمكن معالجة الكسور فورا أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
- بعد جمع الكسور، شطف النظام مع المياه الخالية من RNase لإزالة أي السكروز المتبقية.
7. استخراج الحمض النووي الريبي
- لكل كسر، إضافة 10 نانوغرام من لوسيفيراز مرنا ارتفاع في السيطرة.
- إضافة ثلاثة مجلدات من guanidium هيدروكولريد القائم على وكيل العزل الحمض النووي الريبي التجارية لكل كسر.
- دوامة لفترة وجيزة لمدة 15 s.
- استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي متوافقة مع الحل المستخدم في 7.2.
8. النسخ العكسي وPCR في الوقت الحقيقي
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف.
- موضوع الجيش الملكي النيبالي لعكس النسخ باستخدام مجموعة توليف cDNA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- استخدم PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) لفحص التوزيع المتعدد الصبغات ل gapdh mRNA كمثال. تم إجراء qPCR باستخدام نظام الكشف qPCR وكواشف qPCR mastermix، مع ظروف ركوب الدراجات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 40 s، تليها 95 درجة مئوية لمدة 60 s.
- الحصول على قيم دورة العتبة (Ct) من مخططات التضخيم واستخدامها لحساب تغيير الطي باستخدام أسلوب ΔΔCt.
9. السكروز التدرج جعل تجميع النظام
ملاحظة: اتبع الخطوات لتجميع كل مكون (كما هو موضح في الجدول 3)من صانع التدرج السكروز (الشكل 1).
- قم بتركيب قوسين عموديين (A2) على لوحة الخبز الأساسية (A1).
- استخدم قوسين نحيفين من الزاوية اليمنى (B2) لتركيب مشغل المرحلة الخطية إلى لوحة الخبز الأساسية (A1).
- استخدم أطقم الأقراص على وظيفة الألومنيوم Ø12.7 مم (C2) لإصلاحه على لوحة الخبز الأساسية لحامل الأنبوب (C1) كموقف لحامل الأنبوب.
- تجميع الزاوية اليمنى Ø1/2 "إلى Ø6 مم آخر المشبك (C3) مع آخر (C2) ووظيفة بصرية مصغرة سلسلة (C4).
- استخدم جهاز الأطقم على الوظيفة البصرية (C4) لتوصيل مشبك V صغير (C5) كحامل أنبوب.
- وضع أنبوب الطرد المركزي في حامل أنبوب وضبط زاوية لجعله عمودي. وضع علامة على موضع الأنبوب وتركيب حامل وظيفة قاعدة التمثال (C6) على لوحة الخبز الأساسية (C1) لدعم الأنبوب.
- على الجانب الآخر من لوح الخبز (A1)، استخدم طاقم المجموعة من منشور الألومنيوم Ø12.7 مم (D1) لإصلاحه وتوصيل منشور بصري قصير السلسلة (D3) باستخدام Ø1/2 الزاوية اليمنى إلى مشبك آخر Ø6 مم (D2).
- قم بتوصيل المشبك الخامس المصغر (D4) بإبرة حادة (D5) بالمرحلة اللاحقة (D3). ضبط زاوية المشبك لتعيين الإبرة العمودية، وضبط طول آخر لضمان الإبرة تجتمع أنبوب الطرد المركزي.
- قم بتوصيل المحرك (B1) بمحرك السائر (E1) واستخدم لوحة تحكم UNO R3 ووحدة عصا التحكم من مجموعة أدوات بدء UNO (E2) للتحكم في المحرك. يمكن استخدام محول الطاقة (على سبيل المثال، محول طاقة قابل للتعديل 9-24 فولت AC/DC) لقيادة المحرك بشكل منفصل.
- ضع مضخة الحقنة (F) بجوار محطة صنع التدرج وربط الحقنة بالإبرة.
- التحكم في مرحلة حامل أنبوب صعودا وهبوطا باستخدام عصا التحكم.
| مكون | بند |
| B1 | مشغل المرحلة الخطية |
| E1 | سائق سيارة السائر |
| E2 | UNO مشروع سوبر بداية عدة |
| A1 | لوح الخبز |
| A2 | قوس عمودي |
| B2 | قوس زاوية أيمن نحيف |
| C1 | لوحة خبز مصغرة |
| C5 | صغير V-المشبك |
| D4 | مصغرة V-المشبك |
| C2 | Ø12.7 مم الألومنيوم آخر |
| C4، D3 | مصغرة سلسلة البصرية وظيفة |
| D1 | Ø12.7 مم الألومنيوم آخر |
| C3، D2 | الزاوية اليمنى Ø1/2 " إلى Ø6 مم آخر المشبك |
| C6 | قاعدة حامل وظيفة قاعدة التمثال سلسلة مصغرة |
| D5 | إبرة نهاية حادة |
| و | مضخة حقنة |
الجدول 3: التدرج في صنع مكونات النظام.
10. تجزئة وكشف تجميع النظام (الشكل 2).
- استخدام الفك المستدير العادية burette المشبك لتركيب وحدة البصريات من شاشة الأشعة فوق البنفسجية على أنبوب مثقب. إرفاق نهاية واحدة من الأنابيب (1 سم طويلة وقطرها الداخلي 0.56 ملم) إلى الرابط من مثقب أنبوب والطرف الآخر إلى السائل في ميناء وحدة البصريات. قم بتوصيل منفذ Fluid Out بالكسر.
- قم بتوصيل وحدة البصريات مع وحدة التحكم في شاشة الأشعة فوق البنفسجية وفقا لدليل الشركة المصنعة.
- استخدم كابل اختراق لتوصيل مأخذ إخراج الإشارة بالمحول الرقمي على الأرض واتصالات الإدخال التناظرية، وفقا لدليل الشركة المصنعة.
- قم بتوصيل المحول الرقمي بجهاز كمبيوتر محمول باستخدام كابل USB عادي، وسجل الإشارات الرقمية المحولة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كمظاهرة، تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (مجمعة من 8 أجنة) عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا. قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر حددت الكسور التي تحتوي على وحدة فرعية 40S، وحدة فرعية 60S، 80S أحادية والبوليسومات(الشكل 4A). تحليل الكسور من قبل لطخة الغربية للوحدات الفرعية الريبوسومية الكبيرة، Rpl10 أظهرت وجودها في وحدة فرعية 60S (كسر 3)، أحادية (كسر 4) والبوليسومات (كسور 5-12)(الشكل 4B). في المقابل، لم تكن مرتبطة البروتينات السيتوبلازمية Gapdh و Csde1 مع الريبوسومات ولكن تم إثراء في كسور تحتوي على الحمض النووي الريبي الحرة (كسر 1) (الشكل 4B). بما يتفق مع فصل البروتينات في كسور مختلفة، وجدنا أن gapdh وs sox2 mRNAs كانت غنية للغاية في الكسور التي تحتوي على البوليسومات الثقيلة (أكثر من ثلاثة ريبوسومات في كسور 7-12)، مما يشير إلى أن يتم ترجمة gapdh وsc2 mRNAs بكفاءة في القشرةالنامية (الشكل 4C،D). في المقابل، تم إثراء rpl7 و rpl34 mRNAs في الكسر الذي يحتوي على أحاديات، مما يشير إلى ترجمة مكبوتة (الشكل 4E، F)16. هذه النتائج التحقق من صحة بروتوكول الكسر المتعدد لدينا.
الشكل 1: إعداد لإعداد التدرج السكروز. (أ) صانع التدرج السكروز تجميعها في المنزل تتكون من المحرك المرحلة الخطية، حامل أنبوب على المرحلة الآلية، مجموعة تحكم المرحلة، إبرة معدنية حادة نهاية محمولة على حامل إبرة، ومضخة حقنة الآلي مع حقنة متصلة الإبرة (انظر الجدول 3). (B) لإعداد تدرج السكروز، يتم وضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في حامل الأنبوب. يتم الاستغناء عن حلول السكروز من خلال إبرة نهاية حادة باستخدام مضخة حقنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تشريح الأنسجة القشرية من جنين فأر التطور. (A)صورة تظهر جنين CD1 E12.5 مثبت على لوحة Ø 6 سم باستخدام إبر 21G-23G. (ب) صورة تظهر القشرة المشقوقة بعد إزالة الجلد والجمجمة السحاية (معلمة بخطوط بيضاء متقطعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد للتكريس والتسجيل وجمع العينة. صورة تصور نظام الكسر والتسجيل وجمع العينات الذي تم تجميعه منزليا ويتألف من مضخة حقنة آلية، ومثقب أنبوب، وجامع كسور، وشاشة للأشعة فوق البنفسجية مزودة محول رقمي متصل بجهاز كمبيوتر محمول للرصد المستمر لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. يتم التعامل مع الحصول على البيانات من قبل برنامج الحصول على البيانات التجارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:تحليل التنميط المتعدد لقشرة الفأر النامية. (A)امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تظهر الكسور التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الحر (الكسر 1)، وحدة فرعية 40S (كسر 2)، وحدة فرعية 60S (كسر 3)، 80S أحادية (كسر 4) والبوليسومات (كسر 5-12). تم استخدام 75 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي المجمع من 8 أجنة. (ب)بقع غربية تظهر توزيعات بروتينات جابد و Rpl10 و Csde1 في كسور. qPCR تحليل تبين توزيع gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) و rpl34 (F) mRNAs في كسور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنميط المتعدد هو تقنية شائعة الاستخدام وقوية لتقييم الحالة الترجمية في كل من الجينات الفردية ومستويات الجينوم على نطاق14. في هذا التقرير، نقدم بروتوكولا للتنميط المتعدد باستخدام منصة تجميعها في المنزل وتطبيقها لتحليل قشرة الماوس النامية. هذه المنصة الفعالة من حيث التكلفة سهلة التجميع وتوليد تدرجات السكروز القوية القابلة للاستنساخ والتنميط المتعدد مع حساسية عالية.
ومن الجدير بالذكر أن إعداد تدرجات السكروز متسقة وجيدة النوعية أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج التنميط متعددة السمات القابلة للاستنساخ17. التغيرات في حجم حلول السكروز 10-50٪ أثناء إعداد التدرج يمكن أن يسبب تحول قمم متعددة وعدم اتساق النتائج في تحليل المصب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إزعاج التدرج أثناء إدخال الإبرة وإزالتها إلى عدم اتساق إعداد التدرج. بالمقارنة مع النهج الأخرى والأجهزة التجارية، استخدم نظام صنع التدرج المصنوع منزليا مرحلة آلية للحد من اضطراب التدرجات أثناء التحضير ومضخة حقنة للاستغناء بدقة عن حلول السكروز، والتي توفر حلا رخيصا وبسيطا لإعداد التدرج.
تطبيق منصة التنميط متعددة الأضلاع والبروتوكول الموجود هنا على قشرة الماوس النامية، وجدنا أن البروتين ريبوسوم Rpl10 والبروتينات السيتوبلازمية Gapdh و Csde1 وزعت في الكسور الصحيحة. وعلاوة على ذلك، تم إثراء gapdh وsox2 mRNAs المترجمة للغاية في كسور متعددة الوسوم، في حين أظهرت rpl34 و rpl7 mRNAs المكبوتة ترجمة أقل إثراء في البوليسومات، والتي تحقق من صحة منصتنا وبروتوكولنا. مع نهج مماثل ، يمكن تحديد الحالة التحويلية للجينات الأخرى في القشرة النامية بشكل فردي من خلال PCR في الوقت الحقيقي. وتجدر الإشارة إلى أن التنميط المتعدد الأضلاع قد استخدم لتحليل الحالة التحويلية في الدماغ النامي على مستوى الجينوم على نطاق واسع. وفي هذا الصدد، يمكن الجمع بين الكسور التي تحتوي على البوليسومات ويمكن تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام التسلسل العميق. يمكن تكييف المنصة والبروتوكول الموجود هنا وتحسينهما بشكل أكبر ليناسب الدراسات المترجمة باستخدام أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى. وبالنظر إلى توافر الأنسجة القشرية التي تحد منها الظروف التجريبية (مثل <50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي)، فإن التحسين الإضافي للبروتوكول قد يوفر زيادات إضافية في كفاءة التجارب وقابليتها للاستنساخ.
في حين أن التنميط المتعدد يوفر رؤى حول الحالة الترجمية للرنانات في القشرة النامية ، إلا أنه يحتوي على قيود لتحليل أنواع خلايا محددة في مراحل النمو اللاحقة ، عندما تكون أنواع الخلايا العصبية المختلفة موجودة. لمعالجة هذه المسألة، يمكن دمج التنميط متعددة مع TRAP عن طريق سحب إلى أسفل من البروتين ريبوسوم الموسومة epitope أعرب تحت نسيج محدد المروج11.
في الختام، توفر المنصة والبروتوكول الذي نقدمه هنا لصنع التدرج السكروز والكسر حلا اقتصاديا لتجارب التنميط متعددة الأضلاع في سياق نمو الدماغ وكذلك السياقات البيولوجية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من منحة اكتشاف NSERC (RGPIN/04246-2018 إلى G.Y.). G.Y. هو كرسي البحوث الكندية. تم تمويل S.K. من قبل زمالة Mitacs Globalink للدراسات العليا ومنحة طلاب الدراسات العليا في ACHRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
