Summary
Utviklingen av pattedyrhjernen krever riktig kontroll av genuttrykk på oversettelsesnivå. Her beskriver vi et polysome profileringssystem med en lettmontert sukrose gradient-making og fraksjoneringsplattform for å vurdere oversettelsesstatusen til mRNAer i den utviklende hjernen.
Abstract
Den riktige utviklingen av pattedyrhjernen er avhengig av en fin balanse mellom nevral stamcelleproliferasjon og differensiering i forskjellige nevrale celletyper. Denne balansen styres tett av genuttrykk som er finjustert på flere nivåer, inkludert transkripsjon, posttranskripsjon og oversettelse. I denne forbindelse fremhever en voksende mengde bevis en kritisk rolle i oversettelsesreguleringen i koordinering av nevrale stamcelle skjebnebeslutninger. Polysom fraksjonering er et kraftig verktøy for vurdering av mRNA oversettelsesstatus på både globale og individuelle gennivåer. Her presenterer vi en intern polysomprofileringsrørledning for å vurdere translasjonseffektivitet i celler fra den utviklende musen cerebral cortex. Vi beskriver protokollene for sukrose gradient forberedelse, vev lysis, ultracentrifugation og fraksjonering-basert analyse av mRNA oversettelsesstatus.
Introduction
Under utviklingen av pattedyrhjernen sprer nevrale stamceller seg og differensierer for å generere nevroner og glia1,2 . Perturbasjonen av denne prosessen kan føre til endringer i hjernestruktur og funksjon, som sett i mange nevrodevelopmentale lidelser3,4. Riktig oppførsel av nevrale stamceller krever orkestrert uttrykk for spesifikke gener5. Mens den epigenetiske og transkripsjonelle kontrollen av disse genene har blitt intensivt studert, tyder nyere funn på at genregulering på andre nivåer også bidrar til koordinering av nevral stamcelleproliferasjon og differensiering6,7,8,9,10. Dermed vil adressering av oversettelseskontrollprogrammene i stor grad fremme vår forståelse av mekanismene som ligger til grunn for nevral stamcelle skjebnebeslutning og hjerneutvikling.
Tre hovedteknikker med forskjellige styrker har blitt mye brukt for å vurdere oversettelsesstatusen til mRNA, inkludert ribosomprofilering, oversettelse av ribosole affinitetsrensing (TRAP) og polysomprofilering. Ribosomprofilering bruker RNA-sekvensering for å bestemme ribosombeskyttede mRNA-fragmenter, slik at den globale analysen av antall og plassering av oversettelse av ribosomer på hver transkripsjon indirekte utleder oversettelsesraten ved å sammenligne den med transkripsjonsoverflod11. TRAP utnytter epitopmerkede ribosomale proteiner for å fange ribososombundne mRNAer12. Gitt at de taggede ribosomale proteinene kan uttrykkes i bestemte celletyper ved hjelp av genetiske tilnærminger, tillater TRAP analyse av oversettelse på en celletypespesifikk måte. Til sammenligning gir polysomprofilering, som bruker sukrose tetthet gradient fraksjonering for å skille fri og dårlig oversatt del (lettere monosomer) fra de som blir aktivt oversatt av ribosomer (tyngre polysomer), en direkte måling av ribosomtetthet på mRNA13. En fordel denne teknikken tilbyr er allsidigheten til å studere oversettelsen av spesifikk mRNA av interesse samt genom-bred translatomanalyse14.
I dette dokumentet beskriver vi en detaljert protokoll for polysome profilering for å analysere den utviklende musen cerebral cortex. Vi bruker et hjemmemontert system for å forberede sukrosetetthetsgradienter og samle fraksjoner for nedstrømsapplikasjoner. Protokollen som presenteres her kan enkelt tilpasses for å analysere andre typer vev og organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrebruk ble overvåket av Dyrepleiekomiteen ved Universitetet i Calgary. CD1-mus som ble brukt til eksperimentet ble kjøpt fra kommersiell leverandør.
1. Utarbeidelse av løsninger
MERK For å unngå nedbrytning av RNA, spray arbeidsbenk og alt utstyr med RNase dekontamineringsløsning. RNase-frie tips brukes til eksperimentet. Alle løsninger tilberedes i RNase-fritt vann.
- Klargjør cycloheximid lageroppløsning (100 mg/ml) i DMSO og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered 2,2 M sukrose lagerløsning ved å tilsette 75,3 g sukrose til RNase-fritt vann og fylle opp volumet til 100 ml (for ~ 16 gradientpreparat). Oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C for langvarig lagring.
- Forbered 10x saltoppløsning (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).
- Forbered 60% (w / v) sukrosejaktløsning, som inneholder 30 g sukrose, 5 ml 10x saltoppløsning og topp volumet opp til 50 ml med RNase-fritt vann.
- Eventuelt, legg til en flekk av bromophenol blå eller ca 5 μL av 1% bromophenol blå i RNase-fritt vann til jaktløsningen. 1.6. Oppbevar oppløsninger ved 4 °C.
2. Forberedelse av sukrose gradient
MERK: Nøyaktighet ved tilberedning av sukrosegradienter er avgjørende for å oppnå konsistente og reproduserbare resultater.
- For å forberede seks 10-50% sukrose gradienter, fortynn 2,2 M sukroseoppløsning som i tabell 1.
| Sukrose løsning | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2,2 M sukrose | 2 ml | 4 ml | 6 ml | 8 ml | 10 ml |
| 10X saltoppløsning | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml |
| Cycloheximide | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Vann | 11,5 ml | 9,5 ml | 7,5 ml | 5,5 ml | 3,5 ml |
| Totalt volum | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml |
Tabell 1: Sukrosefortynning for preparater av sukrosegradienter.
MERK: Klargjør alltid sukrosegradienter i multiplum av to for å balansere vekten under ultracentrifugation.
- Tørk av den stumpe endenålen av metall med RNase dekontamineringsløsning. Skyll kort de ultracentrifuge rørene, slangen og sprøyten ved hjelp av RNase-fritt vann. Lufttørk rørene slik at ingen vanndråper forblir i rørene, da eventuelt gjenværende vann vil endre sukrosekonsentrasjonen.
- Plasser metallnålen på klemmeholderen og sentrifugerøret på det motoriserte stadiet. For å forberede graderinger konsekvent, ble det brukt et hjemmemontert system som inneholder et motorisert stadium for å holde ultracentrifugerøret og en sprøytepumpe for å injisere sukroseløsninger (Figur 1, se trinn 9 for detaljer).
- Fyll en 30 ml sprøyte med ~16 ml 10 % sukrose (nok til seks graderinger), plasser den på sprøytepumpen og koble den til kanylen. Pass på at det ikke er luftbobler i sprøyten, slangen og nålen. Tørk spissen av kanylen for å fjerne eventuelle gjenværende oppløsninger.
- Flytt det motoriserte stadiet opp slik at spissen av nålen berører midten av røret nederst.
- Sett sprøytepumpen med en strømningshastighet på 2 ml/min i et volum på 2,3 ml.
- Etter å ha dispensert 2,3 ml 10% sukroseoppløsning, flytt ned det motoriserte stadiet og gjenta prosessen for alle seks gradienter.
- Gjenta trinn 2.4-2.7 for å legge til 20% sukroseløsning til bunnen av rørene, etterfulgt av 30%, 40% og 50% sukroseløsninger på samme måte.
- Etter tilberedning av gradienten, forsegle ultracentrifugerøret ved hjelp av en parafinfilm.
- La rørene ligge over natten ved 4 °C, slik at de forskjellige sukroselagene sprer seg sammen for å gi en kontinuerlig gradient.
3. Vev disseksjon
MERK: Gravide mus ble euthanized av cervical dislocation forut for anestesi med 5% isofluran.
- Samle CD1 museembryoer på embryonal dag 12, eller andre tidspunkter etter behov, og legg embryoer i en Ø 10 cm plate som inneholder iskald Hanks balanserte saltløsning (HBSS) på is for å beholde celle levedyktighet.
- Under disseksjonsområdet overfører du ett embryo til en Ø 6 cm plate som inneholder iskald HBSS.
- Bruk 21-23 G nåler til å feste hodets posisjon ved å trenge gjennom øynene i en ca. 45° vinkel og påfør kraft for å sikre at nålene er festet på platen (Figur 2A).
- Bruk No.5 tang for å fjerne hud og hodeskalle, fra midten til sidene.
- Bruk tang til å kutte de olfaktoriske pærene og fjern meningene for å eksponere kortikale vev.3.6.Bruk buede tang for å kutte kortikale vev i 2-3 ml nevrobasalt medium på is (Figur 2B). Basseng kortikale vev fra forskjellige embryoer etter behov. Vev fra 8-10 embryoer gir vanligvis ~ 200 μg totalt RNA.
4. Celle lysis
- På dagen for vevs disseksjon, lag fersk cellelysbuffer som beskrevet i tabell 2.
| løsning | Endelig konsentrasjon | volum |
| Tris-HCl (pH 7,5) | 20 mM | 100 μL |
| KCl | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Triton X-100 | 1 % (v/v) | 500 μL |
| Natrium deoksycholat | 0,5 % (m/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| Cycloheximide | 100 μg/ml | 5 μL |
| RNase fritt vann | Fyll opptil 5 ml | |
| total | 5 ml | 5 ml |
Tabell 2: Fremstilling av polysome lysisbuffer.
MERK: Tilsuppler lysisbuffer med protease- og fosfatasehemmere.
- Tilsett cykloheximid til nevrobasalmediet med dissekert vev til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml og inkuber ved 37 °C i 10 minutter. Cycloheximide blokkerer oversettelsesforlengelse og forhindrer derfor ribosomavrenning 15.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
- Vask vevet to ganger med iskald fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 100 μg/ml cycloheximid.
- Tilsett 500 μL cellelysbuffer supplert med 4 μL RNase-hemmer. Pipette opp og ned for å resuspendere vevet i lysisbuffer. Bruk en insulinnål til å lyse vevet forsiktig.
- Inkuber vevet på is i 10 min med kort virvel hver 2-3 min.
MERK: For å forhindre vevsforringelse må du sørge for at alle trinn i vevslys utføres på is. - Sentrifuge ved 2000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør på is.
- Sentrifuge ved ~13 000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør på is.
- Mål RNA-konsentrasjonen i vevslyset ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer.
MERK: Hvis flere prøver er inkludert i eksperimentet, fortynn prøver til samme konsentrasjon med ekstra cellelysbuffer for å minimere variasjon.
5. Prøvelasting og ultracentrifugation
- Forkjøl ultracentrifugeringsrotoren og svingbøttene ved 4 °C, og sett temperaturen på ultracentrifugen til 4 °C.
- Hold 20 μL av vevet lyser som total RNA-inngang.
- Lastprøver (50-300 μg RNA med lik volum) på toppen av sukrosegradientene ved å sakte dispensere lysatet til veggene i ultracentrifuge rørene.
- Plasser ultracentrifuge rørene forsiktig i svingbøtten. Forsikre deg om at alle diametralt motsatte skuffer er balansert.
- Legg svingbøttene på rotoren. Sett ultracentrifuge til 190,000 x g (~ 39,000 RPM) ved 4 °C i 90 min.
- Plasser forsiktig gradientene på is etter sentrifugering.
6. Fraksjonering og utvalgssamling
MERK: Et hjemmemontert fraksjonerings-, opptaks- og innsamlingssystem brukes til analyse og innsamling av prøver fra gradientene (Figur 3, se Enhetskomponenter).
- Plasser et tomt ultracentrifuge rør på rørboret og penetrer forsiktig røret med nålen fra bunnen.
- Slå på UV-skjermen, og åpne programvaren for digital signalopptak.
- Fyll en 30 ml sprøyte med 25 ml 60 % sukrosejaktløsning. Trykk forsiktig på sprøyten slik at jaktløsningen fyller opp det tomme røret og går gjennom 254 nm UV-skjermen for å stille inn grunnlinjen for deteksjon.
- Trykk automatisk null på UV-skjermen for å registrere en grunnlinje for gjenkjenning. Trykk spill av på programvaren for å starte innspillingen.
- Når systemet har etablert en basislinje, setter du registreringen på nytt på programvaren og trekker tilbake jaktløsningen. Forsikre deg om at ingen gjenværende jaktløsning forblir i systemet.
MERK: Skyll systemet med RNasefritt vann for å fjerne gjenværende sukroseløsninger som gjenstår fra forrige kjøring. - Last ett prøverør til rørboreren. Penetrer forsiktig røret med nålen fra bunnen.
- Begynn innspillingen av programvaren. Start sprøytepumpen (strømningshastighet på 1 ml/min for et volum på 25 ml) og brøksamleren for å samle polysome fraksjoner. Sett brøkinnstillingene til 30 s.
MERK: Før hver løpetur må du påse at det ikke kommer luftbobler i sprøyten eller slangen ved å trykke forsiktig på sprøyten for å la jaktløsningen strømme kontinuerlig gjennom kanylen. - Samle fraksjonene i 1,5 ml rør (500 μL hver) ved hjelp av en fraksjonssamler.
- Fraksjonene kan behandles umiddelbart eller lagres ved -80 °C.
- Etter fraksjonsoppsamling, skyll systemet med RNase-fritt vann for å fjerne rester av sukrose.
7. Utvinning av RNA
- Til hver brøkdel legger du til 10 ng luciferase mRNA spike-in kontroll.
- Tilsett tre bind guanidiumhydrokolridbasert kommersielt RNA-isolasjonsreagens til hver brøkdel.
- Vortex kort for 15 s.
- Trekk ut RNA ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett som er kompatibelt med løsningen som brukes i 7.2.
8. Omvendt transkripsjon og PCR i sanntid
- Mål konsentrasjonen av RNA ved hjelp av UV-Vis spektrofotometer.
- Emne RNA for omvendt transkripsjon ved hjelp av et cDNA-syntesesett, i henhold til produsentens protokoll.
- Bruk kvantitativ PCR (qPCR) i sanntid til å undersøke polysomalfordelingen av gapdh mRNA som eksempel. qPCR ble utført ved hjelp av et qPCR-deteksjonssystem og et qPCR mastermix-reagens, med følgende sykkelforhold: 95 °C i 10 minutter, deretter 40 sykluser på 95 °C i 15 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 40 s, etterfulgt av 95 °C i 60 s.
- Hent terskelsyklusverdier (Ct) fra forsterkningsplottene og brukes til å beregne bretteendring ved hjelp av ΔΔCt -metoden.
9. Sukrose gradient gjør systemmontering
MERK: Følg trinnene for å sette sammen hver komponent (som beskrevet i tabell 3) i sukrosegraderingsmaskinen (figur 1).
- Monter to vertikale braketter (A2) på bunnbrødplaten (A1).
- Bruk to slanke rettvinklede braketter (B2) til å montere den lineære trinnaktuatoren på bunnbrødplaten (A1).
- Bruk settskruen på Ø12,7 mm aluminiumspinnen (C2) til å feste den på rørholderens bunnbrødplate (C1) som stativ for rørholderen.
- Monter rettvinklede Ø1/2" til Ø6 mm stiftklemme (C3) med stiften (C2) og mini-seriens optiske stift (C4).
- Bruk settskruen på den optiske stiften (C4) til å koble til en liten V-klemme (C5) som rørholder.
- Sett et sentrifugerør i rørholderen og juster vinkelen for å gjøre den vertikal. Merk posisjonen til røret og monter sokkelpinneholderen (C6) på bunnbrødplaten (C1) for å støtte røret.
- På den andre siden av brødplaten (A1) bruker du settskruen på Ø12,7 mm aluminiumspinnen (D1) til å feste den og koble til en optisk stolpe i mini-serien (D3) ved hjelp av en rettvinklede Ø1/2" til Ø6 mm stiftklemme (D2).
- Koble den miniatyr V-klemmen (D4) med stump nål (D5) til stiften (D3). Juster klemmens vinkel for å stille nålen vertikalt, og juster lengden på stiften for å sikre at nålen oppfyller sentrifugerøret.
- Koble aktuatoren (B1) til steppermotordriveren (E1) og bruk UNO R3-kontrollerkortet og styrespakmodulen fra UNO-startsettet (E2) til å styre aktuatoren. En strømadapter (f.eks. 9-24 V vekselstrøm/likestrøms justerbar strømadapter) kan brukes til å kjøre motoren separat.
- Plasser sprøytepumpen (F) ved siden av gradientstasjonen og koble sprøyten til kanylen.
- Kontroller rørholdertrinnet opp og ned ved hjelp av styrespaken.
| komponent | vare |
| B1 | Aktuator for lineær stadium |
| E1 | Stepper motor driver |
| E2 | UNO-prosjekt superstartersett |
| A1 | Brødbrett |
| A2 | Loddrett hakeparentes |
| B2 | Slank høyre vinkelbrakett |
| C1 | Brødbrett i miniserien |
| C5 | Liten V-klemme |
| D4 | Miniatyr V-klemme |
| C2 | Ø12,7 mm aluminiumsstolpe |
| C4, D3 | Optisk stolpe i miniserien |
| D1 | Ø12,7 mm aluminiumsstolpe |
| C3, D2 | Rettvinklede Ø1/2" til Ø6 mm stiftklemme |
| C6 | Mini-serien pidestall stolpeholder base |
| D5 | Stump endenål |
| F. | Sprøyte pumpe |
Tabell 3: Gradient lage systemkomponenter.
10. Fraksjonering og registrering av systemenhet (Figur 2).
- Bruk en vanlig rund kjeve burette klemme for å montere optikkmodulen til UV-skjermen på rørboreren. Fest den ene enden av slangen (1 cm lang og 0,56 mm innvendig diameter) til rørets koblingsboremater og den andre enden til væskeporten til optikkmodulen. Koble Væske ut-porten til brøkatoren.
- Koble optikkmodulen til uv-monitorens styreenhet i henhold til produsentens bruksanvisning.
- Bruk en utbryterkabel for å koble signalutgangen til den digitale omformeren på bakken og analoge inngangstilkoblinger, i henhold til produsentens bruksanvisning.
- Koble den digitale omformeren til en bærbar datamaskin ved hjelp av en vanlig USB-kabel, og registrer de konverterte digitale signalene ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstrasjon ble det kortikale lysatet som inneholder 75 μg RNA (samlet fra 8 embryoer) skilt av sukrosegradienten i 12 fraksjoner. Topper av UV-absorbans ved 254 nm identifiserte brøker som inneholder 40S-underenheten, 60S-underenheten, 80S monosom og polysomer (Figur 4A). Analyse av brøker ved vestlig blot for den store ribosomale underenheten, Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S-underenheten (brøkdel 3), monosom (brøkdel 4) og polysomer (brøker 5-12) (Figur 4B). I motsetning var cytoplasmatiske proteiner Gapdh og Csde1 ikke forbundet med ribosomer, men ble beriket i fraksjoner som inneholder fri RNA (brøkdel 1) (Figur 4B). I samsvar med separasjonen av proteiner i forskjellige fraksjoner fant vi ut at gapdh og sox2 mRNAer var svært beriket i fraksjonene som inneholder tunge polysomer (mer enn tre ribosomer i fraksjoner 7-12), noe som tyder på at gapdh og sox2 mRNAer effektivt oversettes i den utviklende cortexen (Figur 4C,D). I motsetning til dette ble rpl7 og rpl34 mRNAer beriket i brøken som inneholder monosomer, noe som tyder på undertrykt oversettelse (Figur 4E, F)16. Disse resultatene validerte vår polysome fraksjoneringsprotokoll.
Figur 1: Oppsett for sukrose gradient forberedelse. (A) Hjemmemontert sukrose gradient maker bestående av en lineær sceneaktuator, en rørholder på motorisert stadium, et trinnkontrollersett, en metall stump-end nål montert på en nålholder, og en automatisert sprøytepumpe med en sprøyte koblet til nålen (se tabell 3). (B) For å klargjøre sukrosegradienten plasseres ultracentrifugerøret i rørholderen. Sukroseløsninger dispenseres gjennom den stumpe nålen ved hjelp av en sprøytepumpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Disseksjon av kortikale vev fra utviklingsmusembryoet. (A) Bilde som viser et E12.5 CD1-embryo festet til en Ø 6 cm plate ved hjelp av 21G-23G nåler. (B) Bilde som viser dissekert cortex etter fjerning av hud, hodeskalle og meninges (merket med hvite stiplede linjer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett for fraksjonering, registrering og prøveinnsamling. Bilde som viser den hjemmemonterte fraksjonerings-, opptaks- og prøveinnsamlingssystemet som består av en automatisert sprøytepumpe, en rørborer, en brøksamler og en UV-skjerm med en digital omformer koblet til en bærbar PC for kontinuerlig overvåking av UV-absorbans. Datainnsamling håndteres av programvaren for innsamling av kommersielle data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Polysom profileringsanalyse av den utviklende musebarken. (A) UV-absorbans som viser brøker som inneholder fri RNA (brøkdel 1), 40S subenhet (brøkdel 2), 60S subenhet (brøkdel 3), 80S monosomer (brøkdel 4) og polysomer (brøkdel 5-12). 75 μg totalt RNA samlet fra 8 embryoer ble brukt. (B) Vestlige flekker som viser fordelingene av Gapdh, Rpl10 og Csde1 proteiner i fraksjoner. qPCR-analyse som viser fordelingen av gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) og rpl34 (F) mRNAer i brøker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysomprofilering er en vanlig brukt og kraftig teknikk for å vurdere oversettelsesstatusen på både enkeltgen og genom-brede nivåer14 . I denne rapporten presenterer vi en protokoll for polysome profilering ved hjelp av en hjemmemontert plattform og dens anvendelse for å analysere den utviklende musebarken. Denne kostnadseffektive plattformen er enkel å montere og generere robuste, reproduserbare sukrosegradienter og polysomprofilering med høy følsomhet.
Det er verdig å merke seg at utarbeidelsen av konsistente og god kvalitet sukrose gradienter er avgjørende for å oppnå reproduserbare polysome profileringsresultater17. Endringer i volumet på 10-50% sukroseløsninger under gradientpreparatet kan føre til skifte av polysome topper og inkonsekvens av resultater i nedstrømsanalyse. Videre kan forstyrre gradienten under innsetting og fjerning av nålen bidra til inkonsekvensen av gradientpreparatet. Sammenlignet med andre tilnærminger og kommersielle enheter, brukte vårt hjemmelagde gradientsystem et motorisert stadium for å redusere forstyrrelser av gradienter under tilberedning og en sprøytepumpe for å nøyaktig dispensere sukroseløsninger, som tilbyr en billig og enkel løsning for gradientforberedelse.
Ved å bruke polysomeprofileringsplattformen og protokollen som er tilstede her på den utviklende musebarken, fant vi ut at ribosomalproteinet Rpl10 og cytoplasmatiske proteiner Gapdh og Csde1 ble fordelt i de riktige fraksjonene. Videre ble de svært oversatte gapdh- og sox2 mRNAene beriket i polysomale fraksjoner, mens oversettelsesundertrykkede rpl34 og rpl7 mRNAer viste mindre berikelse i polysomer, noe som validerer plattformen og protokollen vår. Med en lignende tilnærming kan oversettelsesstatusen til andre gener i utviklingsbarken bestemmes individuelt av sanntids PCR. Vær oppmerksom på at polysomprofilering har blitt brukt til å analysere translasjonsstatus i den utviklende hjernen på genomnivå. I denne forbindelse kan fraksjoner som inneholder polysomer kombineres og ekstraheres RNA kan analyseres ved hjelp av dyp sekvensering. Plattformen og protokollen som finnes her kan tilpasses og optimaliseres ytterligere for å passe translatomiske studier ved hjelp av andre celletyper og vev. Tatt i betraktning tilgjengeligheten av kortikale vev begrenset av eksperimentelle forhold (f.eks. <50 μg RNA), kan ytterligere optimalisering av protokollen gi ytterligere økning i effektiviteten og reproduserbarheten til forsøkene.
Mens polysom profilering gir innsikt i oversettelsesstatusen til mRNAer i utviklingsbarken, har den begrensninger for å analysere bestemte celletyper i senere utviklingsstadier, når forskjellige nevrale celletyper er til stede. For å løse dette spørsmålet kan polysomprofilering integreres med TRAP ved nedtrekk av epitopmerket ribosomalt protein uttrykt under en vevsspesifikk promotor11.
Til slutt gir plattformen og protokollen som vi rapporterer her for sukrose gradientproduksjon og fraksjonering en økonomisk løsning på polysome profileringsforsøk i sammenheng med hjerneutvikling så vel som andre biologiske sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av et NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 til G.Y.). G.Y. er en canada forskningsleder. S.K. ble finansiert av Mitacs Globalink Graduate Fellowship og ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
