Summary
Udviklingen af pattedyrshjernen kræver ordentlig kontrol af genekspression på oversættelsesniveau. Her beskriver vi et polysome profileringssystem med en platform, der er nem at samle saccharosegradientfremstilling og fraktioneringsplatform for at vurdere mRNA'ernes translationelle status i den udviklende hjerne.
Abstract
Den korrekte udvikling af pattedyrshjernen er afhængig af en fin balance mellem spredning af neurale stamceller og differentiering i forskellige neurale celletyper. Denne balance styres tæt af genekspression, der finjusteres på flere niveauer, herunder transskribering, posttransskription og oversættelse. I denne henseende fremhæver en voksende mængde beviser en kritisk rolle translationel regulering i koordineringen af neurale stamcelle skæbne beslutninger. Polysomefraktion er et effektivt værktøj til vurdering af mRNA-oversættelsesstatus på både globalt og individuelt genniveau. Her præsenterer vi en intern polysome profileringspipeline for at vurdere translationel effektivitet i celler fra den udviklende muse cerebral cortex. Vi beskriver protokollerne for saccharosegradientpræparat, væv lysis, ultracentrifugering og fraktioneringsbaseret analyse af mRNA-oversættelsesstatus.
Introduction
Under udviklingen af pattedyrshjernen formerer neurale stamceller sig og differentierer sig for at generere neuroner og glia1,2 . Forstyrrelsen af denne proces kan føre til ændringer i hjernens struktur og funktion, som det ses i mange neuroudviklingsforstyrrelser3,4. Den korrekte opførsel af neurale stamceller kræver orkestreret udtryk for specifikke gener5. Mens den epigenetiske og transskriptionelle kontrol af disse gener er blevet intensivt undersøgt, tyder nylige resultater på, at genregulering på andre niveauer også bidrager til koordinering af neural stamcellespredning og differentiering6,7,8,9,10. Således vil løse translationelle kontrolprogrammer i høj grad fremme vores forståelse af de mekanismer, der ligger til grund neurale stamcelle skæbne beslutning og hjernens udvikling.
Tre hovedteknikker med forskellige styrker er blevet anvendt bredt til at vurdere mRNA's translationelle status, herunder ribosome profilering, oversættelse af ribosome affinitetsrensning (TRAP) og polysome profilering. Ribosome-profilering bruger RNA-sekventering til at bestemme ribosome-beskyttede mRNA-fragmenter, hvilket gør det muligt for den globale analyse af antallet og placeringen af oversættelse af ribosomer på hver udskrift indirekte at udlede oversættelseshastigheden ved at sammenligne den med udskriftstæthed11. TRAP udnytter epitop-mærkede ribosomale proteiner til at fange ribosome-bundetmRNA'er 12. I betragtning af at de mærkede ribosomale proteiner kan udtrykkes i specifikke celletyper ved hjælp af genetiske tilgange, tillader TRAP analyse af oversættelse på en celletypespecifik måde. Til sammenligning giver polysome profilering, der bruger gradientfraktionering af saccharosetæthed til at adskille fri og dårligt oversat portion (lettere monosomer) fra dem, der aktivt oversættes af ribosomer (tungere polysomer), en direkte måling af ribosomtæthed på mRNA13. En fordel denne teknik tilbyder, er dens alsidighed til at studere oversættelsen af specifikke mRNA af interesse samt genom-dækkende translatome analyse14.
I dette papir beskriver vi en detaljeret protokol med polysome profilering for at analysere den udviklende muse cerebral cortex. Vi bruger et hjemmemonteret system til at forberede saccharosetæthedsgradienter og indsamle fraktioner til downstream-applikationer. Den protokol, der præsenteres her, kan let tilpasses til at analysere andre typer væv og organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al dyrebrug blev overvåget af Animal Care Committee ved University of Calgary. CD1 mus, der anvendes til eksperimentet blev købt fra kommercielle leverandør.
1. Udarbejdelse af løsninger
BEMÆRK For at forhindre RNA-nedbrydning skal arbejdsbænken og alt udstyr med RNase dekontamineringsopløsning forhindres. RNase-fri tips bruges til eksperimentet. Alle løsninger er tilberedt i RNase-fri vand.
- Cykloheximidopløsningen (100 mg/mL) fremstilles i DMSO og opbevares ved -20 °C.
- 2,2 M saccharoseopløsning fremstilles ved tilsætning af 75,3 g saccharose til RNase-frit vand, og volumentilføres til 100 ml (til ~16 gradientpræparat). Opløsningen kan opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring.
- Forbered 10x saltopløsning (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).
- Der fremstilles en saccharosejagtopløsning på 60% (w/v), der indeholder 30 g saccharose, 5 ml 10x saltopløsning, og volumen op til 50 ml med RNase-frit vand.
- Der kan eventuelt tilsættes en plet bromophenolblå eller ca. 5 μL 1% bromophenolblå i RNase-frit vand til jagtopløsningen. 1.6. Opbevar opløsninger ved 4 °C.
2. Tilberedning af saccharosegradient
BEMÆRK: Nøjagtigheden ved tilberedning af saccharosegradienter er afgørende for at opnå konsistente og reproducerbare resultater.
- Tilberedning af 6 10-50% saccharosegradienter fortyndes 2,2 M saccharoseopløsning som i tabel 1.
| Saccharoseopløsning | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2,2 M saccharose | 2 mL | 4 mL | 6 mL | 8 mL | 10 mL |
| 10X saltopløsning | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL |
| Cycloheximide | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Vand | 11,5 mL | 9,5 mL | 7,5 mL | 5,5 mL | 3,5 mL |
| Samlet volumen | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL |
Tabel 1: Saccharosefortyndinger til tilberedning af saccharosegradienter.
BEMÆRK: Forbered altid saccharosegradienter i multipla af to for at afbalancere vægten under ultracentrifugering.
- Tør metalstumpet endenålen af med RNase dekontamineringsopløsning. Skyl kortvarigt ultracentrifugerørene, slangen og sprøjten med RNase-frit vand. Lufttørre rørene, så der ikke er vanddråbe tilbage i rørene, da eventuelt resterende vand vil ændre saccharosekoncentrationen.
- Placer metalnålen på klemmeholderen og centrifugerøret på den motoriserede scene. For at forberede stigninger konsekvent blev der anvendt et hjemmemonteret system, der indeholder et motoriseret stadium til at holde ultracentrifugerøret og en sprøjtepumpe til injektion af saccharoseopløsninger(figur 1, se trin 9 for detaljer).
- Fyld en 30 mL sprøjte med ~ 16 mL af 10% saccharose (nok til seks stigninger), læg den på sprøjtepumpen og tilslut den til nålen. Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten, slangen og nålen. Tør spidsen af kanylen for at fjerne eventuelle resterende opløsninger.
- Flyt den motoriserede fase op, så nålespidsen rører midten af røret i bunden.
- Sæt sprøjtepumpen til en strømningshastighed på 2 mL/min for et volumen på 2,3 mL.
- Efter at have dispenseret 2,3 ml 10% saccharoseopløsning skal du gå ned ad motoriseret fase og gentage processen for alle seks stigninger.
- Gentag trin 2.4-2.7 for at tilsætte 20% saccharoseopløsning til bunden af rørene, efterfulgt af 30%, 40% og 50% saccharoseopløsninger på samme måde.
- Efter forberedelse af gradienten forsegles ultracentrifugerøret ved hjælp af en paraffinfilm.
- Lad rørene stå natten over ved 4 °C, således at de forskellige saccharoselag diffuses sammen for at give en kontinuerlig hældning.
3. Væv dissektion
BEMÆRK: Gravide mus blev aflivet af cervikal dislokation efterfulgt af anæstesi med 5% isofluran.
- Saml CD1 musefostre på embryonal dag 12 eller andre tidspunkter efter behov, og læg embryoner i en Ø 10 cm plade, der indeholder iskold Hanks Balancerede Salt Solution (HBSS) på is for at bevare cellegabiliteten.
- Under dissektionsomfanget overføres et foster til en Ø 6 cm plade, der indeholder iskold HBSS.
- Brug 21-23 G nåle til at fastgøre hovedets position ved at trænge gennem øjnene i en vinkel på ca. 45° og anvende kraft for at sikre, at nålene er fastgjort på pladen (Figur 2A).
- Brug No.5 pincet til at fjerne hud og kranium, fra midten til siderne.
- Brug pincet til at skære de olfaktoriske pærer og fjerne meninges at eksponere kortikale væv.3.6.Brug buede pincet til at skære kortikale væv i 2-3 mL af neurobasal medium på is (Figur 2B). Pool kortikale væv fra forskellige embryoner efter behov. Væv fra 8-10 embryoner normalt giver ~ 200 μg samlede RNA.
4. Celle lysis
- På dagen for vævsdissektionen fremstilles frisk celle lysis buffer som beskrevet i tabel 2.
| opløsning | Endelig koncentration | lydstyrke |
| Tris-HCl (pH 7,5) | 20 mM | 100 μL |
| KCl | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Triton X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| Natriumdeoxycholat | 0,5% (w/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| Cycloheximide | 100 μg/mL | 5 μL |
| RNase gratis vand | Fyld op til 5 mL | |
| total | 5 mL | 5 mL |
Tabel 2: Fremstilling af polysom lysis buffer.
BEMÆRK: Tillægge lysis buffer med protease- og fosfatasehæmmere.
- Cykloheximid til neurobasalmediet tilsættes dissekeret væv til en endelig koncentration på 100 μg/mL og inkuberes ved 37 °C i 10 min. Cycloheximide blokerer oversættelsesforlængelse og forhindrer derfor ribosom afstrømning 15.
- Centrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Vævene vaskes to gange med iskold fosfatbufferet saltvand (PBS) suppleret med 100 μg/mL cykloheximid.
- Der tilsættes 500 μL celle lysis buffer suppleret med 4 μL RNase-hæmmer. Pipette op og ned for at genbruge vævet i lysis buffer. Brug en insulinnål til forsigtigt at lyse vævet.
- Inkuber vævene på is i 10 minutter med kort hvirvelstrømning hver 2-3 min.
BEMÆRK: For at forhindre vævsforringelse skal det sikres, at alle trin i vævslys udføres på is. - Centrifuge ved 2.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør på is.
- Centrifuge ved ~13.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør på is.
- RNA-koncentrationen i vævslysatet måles ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer.
BEMÆRK: Hvis der indgår flere prøver i forsøget, fortyndes prøverne til samme koncentration med ekstra celle lysis buffer for at minimere variationen.
5. Prøvebelastning og ultracentrifugering
- Ultracentrifugationsrotoren og svingspandene forkøles ved 4 °C, og temperaturen på ultracentrifuge indstilles til 4 °C.
- Hold 20 μL af vævslysaten som samlet RNA-indgang.
- Der på toppen af saccharosegradienterne på de øverste del af saccharosegradienterne på 50-300 μg RNA(μg) på toppen af saccharosegradienterne dispenseres langsomt lysatet til ultracentrifugerørenes vægge.
- Placer forsigtigt ultracentrifugerørene i svingspanden. Sørg for, at alle diametralt modsatte spande er afbalancerede.
- Læg svingspandene på rotoren. Sæt ultracentrifuge til 190.000 x g (~39.000 omdrejninger i minuttet) ved 4 °C i 90 min.
- Placer forsigtigt gradienterne på is efter centrifugering.
6. Fraktionering og prøveopsamling
BEMÆRK: Der anvendes et hjemmemonteret fraktionerings-, registrerings- og opsamlingssystem til analyse og indsamling af prøver fra gradienterne (Figur 3, se Enhedskomponenter).
- Placer et tomt ultracentrifugerør på rørborehulen, og træd forsigtigt ind i røret med nålen fra bunden.
- Tænd UV-skærmen, og åbn den digitale signaloptagelsessoftware.
- Fyld en 30 ml sprøjte med 25 ml 60% saccharosejagtopløsning. Tryk forsigtigt på sprøjten, så chase-opløsningen fylder det tomme rør og går gennem 254 nm UV-skærmen for at indstille baseline til detektion.
- Tryk på auto-nul på UV-skærmen for at registrere en baseline til detektion. Tryk på afspil på softwaren for at begynde at optage.
- Når systemet har etableret en baseline, skal du sætte optagelsen på softwaren på pause og trække chase-løsningen tilbage. Sørg for, at der ikke er nogen restjagtopløsning tilbage i systemet.
BEMÆRK: Skyl systemet med RNase-frit vand for at fjerne rest saccharoseopløsninger, der er tilbage fra det foregående løb. - Lad et prøverør på rørboremaskinen. Træd forsigtigt ind i røret med nålen fra bunden.
- Begynd at optage på softwaren. Start sprøjtepumpen (strømningshastighed på 1 mL/min for et volumen på 25 mL) og fraktionsopsamleren for at indsamle polysomefraktioner. Angiv brøkindstillingerne til 30 s.
BEMÆRK: Før hver kørsel skal du sikre dig, at der ikke er luftbobler i sprøjten eller slangen ved forsigtigt at trykke på sprøjten for at lade chaseopløsningen strømme kontinuerligt gennem nålen. - Fraktionerne opsamles i 1,5 mL rør (500 μL hver) ved hjælp af en fraktioneret opsamler.
- Fraktionerne kan behandles straks eller opbevares ved -80 °C.
- Efter fraktionering skylles systemet med RNase-frit vand for at fjerne eventuel restbevæbejdning.
7. Udvinding af RNA
- Til hver brøk tilsættes 10 ng luciferase mRNA-indsnætningskontrol.
- Der tilsættes tre mængder guanidiumhydridbaseret kommercielt RNA-isolationsreagens til hver fraktion.
- Vortex kort for 15 s.
- Ekstrakt RNA ved hjælp af et RNA-udtrækssæt, der er kompatibelt med den i 7.2 anvendte opløsning.
8. Omvendt transskribering og PCR i realtid
- Koncentrationen af RNA måles ved hjælp af UV-Vis-spektrofotometer.
- Emne RNA til omvendt transskribering ved hjælp af en cDNA syntese kit, i henhold til producentens protokol.
- Brug kvantitativ pcr i realtid (qPCR) til at undersøge polysomalfordelingen af gapdh mRNA som et eksempel. qPCR blev udført ved hjælp af et qPCR-detektionssystem og et qPCR mastermix-reagens med følgende cykelforhold: 95 °C i 10 minutter, derefter 40 cyklusser på 95 °C for 15 s, 60 °C for 30 s, 72 °C for 40 s, efterfulgt af 95 °C for 60 s.
- Hent tærskelcyklusværdier (Ct) fra forstærkningsområderne og bruges til at beregne foldningsændringer ved hjælp af metoden ΔΔCt.
9. Samling af saccharosegradientfremstillingssystem
BEMÆRK: Følg trinnene for at samle hver komponent (som beskrevet i tabel 3) af saccharosegradientproducenten (figur 1).
- Monter to lodrette beslag (A2) på bund breadboardet (A1).
- Brug to slanke retvinklede beslag (B2) til at montere den lineære scene aktuator til bund breadboard (A1).
- Brug sætskruen på Ø12,7 mm aluminiumspælen (C2) til at fastgøre den på rørholderens bund breadboard (C1) som stativ til rørholderen.
- Den retvinklede Ø1/2" monteres på Ø6 mm stolpeklemmen (C3) med stolpen (C2) og miniserien optisk stolpe (C4).
- Brug setscrew på den optiske stolpe (C4) til at tilslutte en lille V-klemme (C5) som rørholder.
- Sæt et centrifugerør i rørholderen, og juster vinklen for at gøre den lodret. Marker rørets position, og monter piedestalpostholderen (C6) på bund breadboardet (C1) for at understøtte røret.
- På den anden side af brødpladen (A1) skal du bruge sætskruen på Ø12.7 mm aluminiumspælen (D1) til at fikse den og tilslutte et optisk indlæg i miniserien (D3) ved hjælp af en retvinklet Ø1/2" til Ø6 mm stolpeklemmer (D2).
- Tilslut miniature V-klemmen (D4) med stump kanyle (D5) til stolpen (D3). Juster klemmens vinkel for at indstille nålen lodret, og juster længden af stolpen for at sikre, at nålen møder centrifugerøret.
- Tilslut aktuatoren (B1) til steppermotordriveren (E1), og brug UNO R3-controllerkortet og joystickmodulet fra UNO-startsættet (E2) til at styre aktuatoren. En effektadapter (f.eks. 9-24 V VEKSELSTRØM/DC justerbar effektadapter) kan bruges til at køre motoren separat.
- Placer sprøjtepumpen (F) ved siden af gradientfremstillingsstationen, og tilslut sprøjten med nålen.
- Styr rørholderens trin op og ned ved hjælp af joysticket.
| komponent | vare |
| B1 | Lineær scene aktuator |
| E1 | Stepper bilist |
| E2 | UNO-projekt super startsæt |
| A1 | Breadboard |
| A2 | Lodret parentes |
| B2 | Slank retvinklet beslag |
| C1 | Brødbræt i miniserie |
| C5 | Lille V-klemme |
| D4 | Miniature V-klemme |
| C2 | Ø12,7 mm aluminiumspæl |
| C4, D3 | Mini-serie optisk indlæg |
| D1 | Ø12,7 mm aluminiumspæl |
| C3, D2 | Retvinklet Ø1/2" til Ø6 mm stolpeklemme |
| C6 | Mini-serie piedestal postholder base |
| D5 | Stump ende nål |
| F. | Sprøjtepumpe |
Tabel 3: Systemkomponenter til graduering.
10. Fraktionering og påvisning af systemmontage (figur 2).
- Brug en almindelig rund kæbe burette klemme til at montere optik modulet af UV-skærmen på røret piercer. Fastgør den ene ende af slangen (1 cm lang og 0,56 mm indvendig diameter) til rørets forbindelsesled og den anden ende til væsken i optikmodulets port. Tilslut fluid out-porten til fraktioneringsmaskinen.
- Tilslut optikmodulet med UV-skærmens styreenhed i overensstemmelse med producentens manual.
- Brug et undergruppekabel til at tilslutte signaludgangsstikket til den digitale konverter ved jorden og analoge indgangsforbindelser i henhold til producentens manual.
- Tilslut den digitale konverter til en bærbar computer ved hjælp af et almindeligt USB-kabel, og optag de konverterede digitale signaler ved hjælp af dataopsamlingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration blev det kortikale lysat, der indeholder 75 μg RNA (samlet fra 8 embryoner), adskilt af saccharosegradienten i 12 fraktioner. Toppe af UV-absorbans ved 254 nm identificerede fraktioner, der indeholder 40S-underenheden, 60S-underenheden, 80S monosom og polysomer (Figur 4A). Analyse af fraktioner efter vestlig skamplet for den store ribosomale underenhed, Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S underenheden (brøk 3), monosom (brøk 4) og polysomer (fraktioner 5-12) (Figur 4B). I modsætning hertil var cytoplasmiske proteiner Gapdh og Csde1 ikke forbundet med ribosomer, men blev beriget med fraktioner, der indeholdt frit RNA (brøk 1) (Figur 4B). I overensstemmelse med adskillelsen af proteiner i forskellige fraktioner fandt vi, at gapdh og sox2 mRNA'er var højt beriget i fraktioner, der indeholder tunge polysomer (mere end tre ribosomer i fraktioner 7-12), hvilket tyder på, at gapdh og sox2 mRNA'er effektivt oversættes i den udviklende cortex (Figur 4C, D). I modsætning hertil blev rpl7 og rpl34 mRNA'er beriget i den fraktion, der indeholder monosomer, hvilket tyder på undertrykt oversættelse (figur 4E, F)16. Disse resultater validerede vores polysomefraktionsprotokol.
Figur 1: Opsætning afsaccharosegradientpræparat. (B) For at forberede saccharosegradienten anbringes ultracentrifugerøret i rørholderen. Saccharoseopløsninger udleveres gennem den stumpe kanyle ved hjælp af en sprøjtepumpe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dissektion af det kortikale væv fra udviklingsmusembryoner. (B) Billede, der viser den dissekerede cortex efter fjernelse af hud, kranium og meninges (markeret med hvide stiplede linjer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opsætning til fraktionering, registrering og indsamling af prøver. Billede, der viser det hjemmemonterede fraktionerings-, optagelses- og prøveindsamlingssystem bestående af en automatiseret sprøjtepumpe, en rørboremaskine, en fraktionsopsamler og en UV-skærm med en digital konvertor tilsluttet en bærbar computer til kontinuerlig overvågning af UV-absorbans. Dataindsamling håndteres af softwaren til kommerciel dataindsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Polysome profileringsanalyse af den udviklende musebark. (A) UV-absorbans, der viser fraktioner, der indeholder frit RNA (brøk 1), 40S-underenhed (brøk 2), 60S-underenhed (brøk 3), 80S-monosomer (brøk 4) og polysomer (brøk 5-12). Der blev anvendt 75 μg samlet RNA, der var samlet af 8 embryoner. (B) Vestlige blots, der viser fordelingen af Gapdh-, Rpl10- og Csde1-proteiner i fraktioner. qPCR-analyse, der viser fordelingen af gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) og rpl34 (F) mRNA'er i fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome profilering er en almindeligt anvendt og kraftfuld teknik til at vurdere oversættelsesstatus på både enkelt gen og genom-dækkende niveauer14 . I denne rapport præsenterer vi en protokol med polysome profilering ved hjælp af en hjemmemonteret platform og dens anvendelse til at analysere den udviklende musebark. Denne omkostningseffektive platform er nem at samle og generere robuste, reproducerbare saccharosegradienter og polysomprofilering med høj følsomhed.
Det er værd at bemærke , at fremstilling af konsistente saccharosegradienter af god kvalitet er afgørende for at opnå reproducerbare polysomprofileringsresultater17. Ændringer i mængden af 10-50% saccharoseopløsninger under gradientpræparater kan forårsage forskydning af polysomtoppene og inkonsekvensen af resultaterne i downstream-analyse. Desuden kan forstyrre gradienten under indføring og fjernelse af nålen bidrage til gradientpræparatets inkonsekvens. Sammenlignet med andre tilgange og kommercielle enheder brugte vores hjemmelavede gradientfremstillingssystem et motoriseret stadium til at reducere forstyrrelse af gradienter under forberedelse og en sprøjtepumpe til nøjagtigt at dispensere saccharoseopløsninger, som tilbyder en billig og enkel løsning til gradientpræparat.
Anvendelse af polysome profilering platform og protokol til stede her til udviklingslandene musebarken, fandt vi, at ribosomal protein Rpl10 og cytoplasmiske proteiner Gapdh og Csde1 blev fordelt i de korrekte fraktioner. Desuden blev de stærkt oversatte gapdh og sox2 mRNA'er beriget med polysomale fraktioner, mens translationelt undertrykte rpl34 og rpl7 mRNA'er viste mindre berigelse i polysomer, som validerer vores platform og protokol. Med en lignende tilgang kan oversættelsesstatus for andre gener i den udviklende cortex bestemmes individuelt af REAL-time PCR. Det skal bemærkes, at polysomeprofilering er blevet brugt til at analysere translationel status i den udviklende hjerne på genomniveau. I denne henseende kan fraktioner, der indeholder polysomer, kombineres, og ekstraheret RNA kan analyseres ved hjælp af dyb sekventering. Platformen og protokollen her kan tilpasses og optimeres yderligere, så den passer til translatomiske undersøgelser ved hjælp af andre celletyper og væv. I betragtning af tilgængeligheden af kortikale væv, der er begrænset af forsøgsbetingelser (f.eks. <50 μg RNA), kan yderligere optimering af protokollen give yderligere øget effektivitet og reproducerbarhed af forsøgene.
Mens polysome profilering giver indsigt i translationelle status mRNA'er i udviklingslandene cortex, det har begrænsninger til at analysere specifikke celletyper på senere udviklingsstadier, når forskellige neurale celletyper er til stede. For at løse dette spørgsmål kan polysomeprofilering integreres med TRAP ved at trække epitop mærket ribosomalprotein udtrykt under en vævsspecifik promotor11.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den platform og protokol, som vi rapporterer her om fremstilling og fraktionering af saccharosegradient, giver en økonomisk løsning på polysomeprofileringseksperimenter i forbindelse med hjerneudvikling såvel som andre biologiske sammenhænge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 til G.Y.). G.Y. er en Canada Research Chair. S.K. blev finansieret af Mitacs Globalink Graduate Fellowship og ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
