Summary
Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.
Abstract
Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.
Introduction
Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungengesehen 3,4. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene5. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass die Genregulation auf anderen Ebenen auch zur Koordination der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beiträgt6,7,8,9,10. Daher wird die Adressierung der translationalen Kontrollprogramme unser Verständnis der Mechanismen, die der Entscheidung über das Schicksal von neuronalen Stammzellen und der Entwicklung des Gehirns zugrunde liegen, erheblich voranbringen.
Drei Haupttechniken mit unterschiedlichen Stärken wurden weit verbreitet, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, einschließlich Ribosom-Profiling, Übersetzen ribososome-Affinitätsreinigung (TRAP) und Polysome-Profiling. Ribosome Profiling verwendet RNA-Sequenzierung, um ribosome-geschützte mRNA-Fragmente zu bestimmen, was die globale Analyse der Anzahl und Position der Übersetzung von Ribosomen auf jedem Transkript ermöglicht, um indirekt die Translationsrate abzuleiten, indem man sie mit transkriptionsüberfluss11vergleicht. TRAP nutzt epitopgemarkierte ribosomale Proteine, um ribosomgebundene mRNAs12zu erfassen. Da die markierten ribosomalen Proteine mit genetischen Ansätzen in bestimmten Zelltypen exprimiert werden können, ermöglicht TRAP die zelltypspezifische Analyse der Translation. Im Vergleich dazu bietet die Polysomenprofilierung, die die Saccharosedichtegradientenfraktionierung verwendet, um freie und schlecht übersetzte Portionen (leichtere Monosomen) von denen zu trennen, die aktiv durch Ribosomen (schwerere Polysomen) übersetzt werden, eine direkte Messung der Ribosomdichte auf mRNA13. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, die Übersetzung spezifischer mRNA von Interesse sowie genomweite Translatome-Analyse14zu studieren.
In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll der Polysomenprofilierung zur Analyse der sich entwickelnden Mausgroßhirnrinde. Wir verwenden ein selbst montiertes System, um Saccharosedichtegradienten vorzubereiten und Brüche für nachgelagerte Anwendungen zu sammeln. Das hier vorgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Arten von Geweben und Organismen zu analysieren.
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Protocol
Der gesamte Gebrauch von Tieren wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary überwacht. CD1-Mäuse, die für das Experiment verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern gekauft.
1. Vorbereitung von Lösungen
HINWEIS Um den ABBAU der RNA zu verhindern, sprühen Sie die Werkbank und alle Geräte mit RNase-Dekontaminationslösung. Für das Experiment werden RNase-freie Spitzen verwendet. Alle Lösungen werden in RNase-freiem Wasser vorbereitet.
- Cycloheximid-Stammlösung (100 mg/ml) in DMSO vorbereiten und bei -20 °C lagern.
- 2,2 M Saccharose-Stammlösung vorbereiten, indem 75,3 g Saccharose zu RNase-freiem Wasser hinzugefügt und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt wird (für die Gradientenvorbereitung von 16 €). Die Lösung kann bei -20 °C für eine langzeitige Lagerung gehalten werden.
- 10x Salzlösung vorbereiten (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).
- Bereiten Sie 60% (w/v) Saccharose-Jagdlösung vor, die 30 g Saccharose, 5 ml 10x Salzlösung enthält und das Volumen bis zu 50 ml mit RNase-freiem Wasser aufstocken kann.
- Optional fügen Sie der Chase-Lösung einen Fleck Bromphenolblau oder ca. 5 l Bromphenolblau in RNase-freiem Wasser hinzu. 1.6. Lösungen bei 4 °C lagern.
2. Herstellung des Saccharosegradienten
HINWEIS: Die Genauigkeit bei der Herstellung von Saccharosegradienten ist entscheidend, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Zur Herstellung von sechs 10-50% Saccharosegradienten 2,2 Mio. Saccharoselösung wie in Tabelle 1verdünnen.
| Saccharoselösung | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M Saccharose | 2 mL | 4 ml | 6 ml | 8 mL | 10 ml |
| 10X Salzlösung | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml |
| Cycloheximid | 15 l | 15 l | 15 l | 15 l | 15 l |
| Wasser | 11,5 ml | 9,5 ml | 7,5 ml | 5,5 ml | 3,5 ml |
| Gesamtvolumen | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml |
Tabelle 1: Saccharoseverdünnungen zur Zubereitung von Saccharosegradienten.
HINWEIS: Bereiten Sie immer Saccharosegradienten in Vielfachen von zwei vor, um das Gewicht während der Ultrazentrifugation auszugleichen.
- Wischen Sie die metallstumpfe Endnadel mit RNase Dekontaminationslösung ab. Spülen Sie die Ultrazentrifugenrohre, Schläuche und die Spritze kurz mit RNase-freiem Wasser ab. Die Rohre werden so lufttrocken, dass kein Wassertropfen in den Rohren verbleibt, da jedes verbleibende Wasser die Saccharosekonzentration verändert.
- Legen Sie die Metallnadel auf den Klemmhalter und das Zentrifugenrohr auf die motorisierte Bühne. Um Gradienten konsistent vorzubereiten, wurde ein selbstgebautes System verwendet, das eine motorisierte Stufe enthält, um das Ultrazentrifugenrohr und eine Spritzenpumpe zur Injektion von Saccharoselösungen zu halten(Abbildung 1, siehe Schritt 9 für Details).
- Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit 16 ml 10% Saccharose (genug für sechs Gradienten), legen Sie sie auf die Spritzenpumpe und schließen Sie sie an die Nadel an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze, den Schläuchen und der Nadel befinden. Wischen Sie die Spitze von der Nadel ab, um eine Restlösung zu entfernen.
- Bewegen Sie die motorisierte Bühne so nach oben, dass die Spitze der Nadel die Mitte des Rohres an der Unterseite berührt.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe bei einem Durchfluss von 2 ml/min für ein Volumen von 2,3 ml ein.
- Nach abgabe 2,3 ml 10% Saccharoselösung, bewegen Sie die motorisierte Stufe nach unten und wiederholen Sie den Prozess für alle sechs Steigungen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.7, um 20% Saccharoselösung an den Boden der Rohre hinzuzufügen, gefolgt von 30%, 40% und 50% Saccharoselösungen in ähnlicher Weise.
- Nach der Vorbereitung des Farbverlaufs das Ultrazentrifugenrohr mit einem Paraffinfilm versiegeln.
- Lassen Sie die Rohre über Nacht bei 4 °C so, dass die verschiedenen Saccharoseschichten zusammen diffundieren, um einen kontinuierlichen Gradienten zu erhalten.
3. Gewebesektion
HINWEIS: Schwangere Mäuse wurden durch zervikale Dislokation vor anästhesien mit 5% Isofluran eingeschläfert.
- Sammeln Sie CD1-Maus-Embryonen am embryonalen Tag 12 oder andere Zeitpunkte nach Bedarf, und legen Sie Embryonen in eine Platte mit einem Durchmesser von 10 cm, die eiskalte Hankes Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
- Übertragen Sie im Sezierbereich einen Embryo auf eine Platte von 6 cm, die eiskalte HBSS enthält.
- Verwenden Sie 21-23 G Nadeln, um die Position des Kopfes zu fixieren, indem Sie durch die Augen in einem etwa 45°-Winkel eindringen und Kraft anwenden, um sicherzustellen, dass die Nadeln auf der Platte befestigt sind (Abbildung 2A).
- Verwenden Sie No.5 Zangen, um Haut und Schädel von der Mitte bis zu den Seiten zu entfernen.
- Verwenden Sie Zangen, um die olfaktorischen Glühbirnen zu schneiden und die Hirnungzuschläge zu entfernen, um die kortikalen Gewebe freizulegen.3.6.Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das kortikale Gewebe in 2-3 ml neurobasales Medium auf Eis zu schneiden (Abbildung 2B). Pool kortikale Gewebe aus verschiedenen Embryonen nach Bedarf. Gewebe von 8-10 Embryonen geben in der Regel eine Gesamt-RNA von 200 g.
4. Zelllyse
- Am Tag der Gewebesektion den Frischzelllysepuffer vorbereiten, wie in Tabelle 2beschrieben.
| Lösung | Endgültige Konzentration | Volumen |
| Tris-HCl (pH 7.5) | 20 mM | 100 l |
| Kcl | 100 mM | 250 l |
| MgCl2 | 5 mM | 25 l |
| Triton X-100 | 1% (v/v) | 500 l |
| Natriumdesoxycholat | 0,5% (mit/v) | 500 l |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 l |
| Cycloheximid | 100 g/ml | 5 l |
| RNase freies Wasser | Aufladen bis zu 5 ml | |
| gesamt | 5 mL | 5 mL |
Tabelle 2: Herstellung des Polysomenlysepuffers.
HINWEIS: SupplementLyse Puffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren.
- Cycloheximid dem neurobasalen Medium mit seziertem Gewebe zu einer Endkonzentration von 100 g/ml hinzufügen und 10 min bei 37 °C inkubieren. Cycloheximid blockiert die Translationsdehnung und verhindert somit ribosomen Ablauf 15.
- Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Saline (PBS), ergänzt mit 100 g/ml Cycloheximid.
- Fügen Sie 500 L Zelllysepuffer hinzu, ergänzt durch 4 L RNase-Inhibitor. Pipette nach oben und unten, um das Gewebe im Lysepuffer wieder auszusetzen. Verwenden Sie eine Insulinnadel, um das Gewebe sanft zu lysieren.
- Inkubieren Sie das Gewebe auf Eis für 10 min mit kurzen Wirbeln alle 2-3 min.
HINWEIS: Um einen Gewebeabbau zu verhindern, stellen Sie sicher, dass alle Schritte der Gewebelyse auf Eis durchgeführt werden. - Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis.
- Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis.
- Messen Sie die RNA-Konzentration im Gewebelysat mit einem UV-Vis-Spektrophotometer.
HINWEIS: Wenn mehrere Proben in das Experiment einbezogen sind, verdünnen Sie Proben auf die gleiche Konzentration mit zusätzlichem Zelllysepuffer, um Variationen zu minimieren.
5. Probenbeladung und Ultrazentrifugation
- Den Ultrazentrifugationsrotor und die Schwenkschaufeln auf 4 °C vorkühlen und die Temperatur der Ultrazentrifuge auf 4 °C einstellen.
- Halten Sie 20 l des Gewebelysats als Gesamt-RNA-Eingang.
- Laden Sie Proben (50-300 g RNA mit gleichem Volumen) auf die Oberseite der Saccharosegradienten, indem Sie das Lysat langsam an die Wände der Ultrazentrifugenrohre abgeben.
- Legen Sie die Ultrazentrifugenrohre vorsichtig in den Schwenkeimer. Stellen Sie sicher, dass alle diametral gegenüberliegenden Buckets ausgeglichen sind.
- Laden Sie die Schwenkschaufeln auf den Rotor. Stellen Sie die Ultrazentrifuge 90 min auf 190.000 x g (39.000 U/min) bei 4 °C.
- Legen Sie die Steigungen nach der Zentrifugation vorsichtig auf Eis.
6. Fraktionierung und Probensammlung
HINWEIS: Für die Analyse und das Sammeln von Proben aus den Gradienten wird ein selbst gebautes Fraktionierungs-, Aufzeichnungs- und Sammelsystem verwendet(Abbildung 3, siehe Gerätekomponenten).
- Legen Sie ein leeres Ultrazentrifugenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein.
- Schalten Sie den UV-Monitor ein, und öffnen Sie die digitale Signalaufzeichnungssoftware.
- Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit 25 ml 60% Saccharose-Chase-Lösung. Drücken Sie die Spritze vorsichtig so, dass die Chase-Lösung das leere Rohr auffüllt und durch den 254 nm UV-Monitor geht, um die Basis für die Erkennung festzulegen.
- Drücken Sie auf dem UV-Monitor auf Auto-Null, um eine Baseline für die Erkennung zu registrieren. Drücken Sie die Wiedergabe auf der Software, um mit der Aufnahme zu beginnen.
- Sobald das System eine Baseline erstellt hat, halten Sie die Aufzeichnung auf der Software an und ziehen Sie die Chase-Lösung zurück. Stellen Sie sicher, dass keine Restverfolgungslösung im System verbleibt.
HINWEIS: Spülen Sie das System mit RNase-freiem Wasser, um Rest-Saccharose-Lösungen zu entfernen, die vom vorherigen Lauf übrig geblieben sind. - Laden Sie ein Probenrohr auf den Rohrpiercer. Eindringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr.
- Beginnen Sie mit der Aufzeichnung auf der Software. Starten Sie die Spritzenpumpe (Durchfluss von 1 ml/min bei einem Volumen von 25 ml) und den Bruchkollektor, um Polysomenfraktionen zu sammeln. Legen Sie die Fractionator-Einstellungen auf 30 s fest.
HINWEIS: Stellen Sie vor jedem Lauf keine Luftblasen in der Spritze oder dem Schlauch sicher, indem Sie die Spritze vorsichtig drücken, damit die Chase-Lösung kontinuierlich durch die Nadel fließt. - Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 ml-Rohre (jeweils 500 l) mit einem Fraktionskollektor.
- Die Fraktionen können sofort verarbeitet oder bei -80 °C gelagert werden.
- Nach der Bruchaufnahme das System mit RNase-freiem Wasser abspülen, um restliche Saccharose zu entfernen.
7. Extraktion von RNA
- Zu jeder Fraktion, fügen Sie 10 ng Luziferase mRNA Spike-in-Kontrolle.
- Fügen Sie drei Bände Guanidiumhydrocholrid-basiertes kommerzielles RNA-Isolationsreagenz zu jeder Fraktion hinzu.
- Wirbel kurz für 15 s.
- Extrahieren Sie RNA mit einem RNA-Extraktionskit, das mit der in 7.2 verwendeten Lösung kompatibel ist.
8. Reverse Transkription und Echtzeit-PCR
- Messen Sie die Konzentration der RNA mit dem UV-Vis Spektralphotometer.
- Die RNA wird gemäß dem Herstellerprotokoll mit einem cDNA-Synthesekit einer umgekehrten Transkription unterzogen.
- Verwenden Sie quantitative Echtzeit-PCR (qPCR), um die polysomale Verteilung von gapdh mRNA als Beispiel zu untersuchen. qPCR wurde mit einem qPCR-Erkennungssystem und einem qPCR-Mastermix-Reagenz mit folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, dann 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 40 s, gefolgt von 95 °C für 60 s.
- Abrufen von Schwellenwertzykluswerten (Ct) aus den Amplifikationsdiagrammen und zur Berechnung der Falzänderung mit der Methode "Ct".
9. Saccharose Gradientenherstellung Systemmontage
ANMERKUNG: Führen Sie die Schritte aus, um jede Komponente (wie in Tabelle 3beschrieben) des Saccharosegradientenherstellers(Abbildung 1) zusammenzusetzen.
- Montieren Sie zwei vertikale Halterungen (A2) auf der Basis-Brotplatte (A1).
- Verwenden Sie zwei schlanke, rechtwinklige Halterungen (B2), um den linearen Stufenantrieb an der Basis-Breadboard (A1) zu montieren.
- Befestigen Sie ihn mit der Setschraube am Aluminiumpfosten (C2) mit 12,7 mm, um sie als Ständer für den Rohrhalter auf dem Rohrhalter basistisch zu befestigen.
- Montieren Sie den rechten Winkel von 1,5" auf 6 mm Pfostenklemme (C3) mit dem Pfosten (C2) und dem optischen Pfosten der Mini-Serie (C4).
- Verwenden Sie die Setschraube am optischen Pfosten (C4), um eine kleine V-Klemme (C5) als Rohrhalter zu verbinden.
- Legen Sie ein Zentrifugenrohr in den Rohrhalter und passen Sie den Winkel an, um es vertikal zu machen. Markieren Sie die Position des Rohres und montieren Sie den Sockelpfostenhalter (C6) auf dem Basis-Breadboard (C1), um das Rohr zu stützen.
- Auf der anderen Seite des Steckbretts (A1) befestigen Sie ihn mit der Setschraube des 12,7 mm Aluminiumpfostens (D1) und verbinden Sie einen optischen Pfosten der Mini-Serie (D3) mit einer rechtwinkligen Pfostenklemme (D2).
- Schließen Sie die Miniatur-V-Klemme (D4) mit stumpfer Endnadel (D5) an den Pfosten (D3) an. Passen Sie den Winkel der Klemme an, um die Nadel vertikal einzustellen, und passen Sie die Länge der Post an, um sicherzustellen, dass die Nadel dem Zentrifugenrohr entspricht.
- Schließen Sie den Aktuator (B1) an den Schrittmotortreiber (E1) an und verwenden Sie die UNO R3 Controller Platine und das Joystick-Modul aus dem UNO Starter kit (E2), um den Aktuator zu steuern. Ein Netzadapter (z.B. 9-24 V AC/DC einstellbarer Netzadapter) kann verwendet werden, um den Motor separat anzutreiben.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe (F) neben die Gradientenherstellungsstation und schließen Sie die Spritze mit der Nadel an.
- Steuern Sie die Rohrhalterstufe nach oben und unten mit dem Joystick.
| Komponente | Artikel |
| B1 | Linearer Stufenantrieb |
| E1 | Stepper-Motortreiber |
| E2 | UNO-Projekt Super Starter Kit |
| A1 | Steckbrett |
| A2 | Vertikale Halterung |
| B2 | Schlanke rechtwinklige Halterung |
| C1 | Mini-Serie Brotbrett |
| C5 | Kleine V-Klemme |
| D4 | Miniatur-V-Klemme |
| C2 | 12,7 mm Aluminiumpfosten |
| C4, D3 | Optischer Pfosten der Mini-Serie |
| D1 | 12,7 mm Aluminiumpfosten |
| C3, D2 | Rechtwinklige Pfostenklemme mit einer Postklemme von 1,5 mm bis 6 mm |
| C6 | Sockelhalter basisder Sockelhalter der Mini-Serie |
| D5 | Blunt-Endnadel |
| F | Spritzenpumpe |
Tabelle 3: Gradientenherstellung von Systemkomponenten.
10. Fraktionierung und Erkennung der Systembaugruppe (Abbildung 2).
- Verwenden Sie eine normale Rundbacken-Burette-Klemme, um das Optikmodul des UV-Monitors am Rohrpiercer zu montieren. Befestigen Sie ein Ende des Schlauches (1 cm lang und 0,56 mm Innendurchmesser) am Anschluss des Rohrpiercers und das andere Ende am Fluid-In-Anschluss des Optikmoduls. Schließen Sie den Fluid Out-Anschluss an den Fraktionator an.
- Schließen Sie das Optikmodul mit der Steuereinheit des UV-Monitors gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers an.
- Verwenden Sie ein Breakout-Kabel, um die Signalausgangsbuchse mit dem Digitalwandler am Boden und analogen Eingangsanschlüssen zu verbinden, so das Herstellerhandbuch.
- Schließen Sie den Digitalkonverter über ein normales USB-Kabel an einen Laptop an und zeichnen Sie die konvertierten digitalen Signale mithilfe der Datenerfassungssoftware auf.
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Representative Results
Als Demonstration wurde das kortikale Lysat, das 75 g RNA (gepoolt aus 8 Embryonen) enthält, durch den Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt. Spitzen der UV-Absorption bei 254 nm identifizierten Fraktionen, die die 40S-Untereinheit, 60S-Untereinheit, 80S-Monosomen und Polysomen enthalten (Abbildung 4A). Die Analyse der Fraktionen nach Western Blot für die große ribosomale Untereinheit randalierte Rpl10 in der 60S-Untereinheit (Fraktion 3), Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Fraktionen 5-12) (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu wurden die zytoplasmatischen Proteine Gapdh und Csde1 nicht mit Ribosomen assoziiert, sondern in Fraktionen angereichert, die freie RNA (Fraktion 1) enthielten (Abbildung 4B). In Übereinstimmung mit der Trennung von Proteinen in verschiedenen Fraktionen fanden wir heraus, dass gapdh und sox2 mRNAs in den Fraktionen, die schwere Polysomen enthalten (mehr als drei Ribosomen in den Fraktionen 7-12), hoch angereichert waren, was darauf hindeutet, dass Gapdh und sox2 mRNAs effizient in den sich entwickelnden Kortex übersetzt werden (Abbildung 4C,D). Im Gegensatz dazu wurden rpl7 und rpl34 mRNAs in der Fraktion angereichert, die Monosomen enthält, was auf eine verdrängte Übersetzung hindeutet (Abbildung 4E,F)16. Diese Ergebnisse bestätigten unser Polysomenfraktionierungsprotokoll.
Abbildung 1: Aufbau zur Herstellung vonSaccharosegradienten. (A) Hausmontierter Saccharosegradientenmacher bestehend aus einem linearen Stufenantrieb, einem Rohrhalter auf der motorisierten Bühne, einem Stufenreglersatz, einer auf einem Nadelhalter montierten Metall-Stumpfnadel und einer automatisierten Spritzenpumpe mit einer an die Nadel angeschlossenen Spritze (siehe Tabelle 3). (B) Zur Herstellung des Saccharosegradienten wird das Ultrazentrifugenrohr in den Rohrhalter gelegt. Saccharoselösungen werden über die stumpfe Nadel mit einer Spritzenpumpe abgegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zerlegung des kortikalen Gewebes vom Entwicklungsmaus-Embryo. (A) Bild zeigt einen E12.5 CD1-Embryo, der mit 21G-23G-Nadeln an einer Platte von 6 cm befestigt ist. (B) Bild, das den sezierten Kortex nach Entfernung der Haut, des Schädels und der Hirnhäute zeigt (mit weißen gestrichelten Linien markiert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Setup für Fraktionierung, Aufzeichnung und Probensammlung. Bild, das das selbst montierte Fraktionierungs-, Aufzeichnungs- und Probenentnahmesystem aus einer automatisierten Spritzenpumpe, einem Rohrpiercer, einem Fraktionskollektor und einem UV-Monitor mit einem digitalen Konverter darstellt, der an einen Laptop angeschlossen ist, zur kontinuierlichen Überwachung der UV-Absorption. Die Datenerfassung erfolgt über die kommerzielle Datenerfassungssoftware. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Polysomen-Profiling-Analyse des sich entwickelnden Mauskortex. (A) UV-Absorption zeigt Fraktionen, die freie RNA (Fraktion 1), 40S-Untereinheit (Fraktion 2), 60S-Untereinheit (Fraktion 3), 80S-Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Fraktion 5-12) enthalten. Es wurde eine Gesamt-RNA von 8 Embryonen verwendet. (B) Westliche Flecken, die die Verteilungen von Gapdh-, Rpl10- und Csde1-Proteinen in Fraktionen zeigen. qPCR-Analyse, die die Verteilung von gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) und rpl34 (F) mRNAs in Brüchen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen14 zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mit hoher Empfindlichkeit erzeugen.
Es ist erwähnenswert, dass die Herstellung von konsistenten und qualitativ hochwertigen SaccharoseGradienten ist entscheidend, um reproduzierbare Polysome-Profiling-Ergebnisse zu erhalten17. Veränderungen des Volumens von 10-50% Saccharoselösungen während der Gradientenvorbereitung könnten die Verschiebung der Polysomenspitzen und inkonsistente Ergebnisse in der nachgelagerten Analyse verursachen. Darüber hinaus könnte eine Störung des Gradienten beim Einsetzen und Entfernen der Nadel zur Inkonsistenz der Gradientenvorbereitung beitragen. Im Vergleich zu anderen Ansätzen und kommerziellen Geräten nutzte unser selbstgebautes Gradientenbausystem eine motorisierte Stufe, um Störungen von Steigungen während der Vorbereitung zu reduzieren, und eine Spritzenpumpe zur präzisen Abgabe von Saccharoselösungen, die eine kostengünstige und einfache Lösung für die Gradientenvorbereitung bietet.
Unter Anwendung der hier vorhandenen Polysomen-Profiling-Plattform und des Protokolls auf den sich entwickelnden Mauskortex fanden wir heraus, dass das ribosomale Protein Rpl10 und die zytoplasmatischen Proteine Gapdh und Csde1 in den richtigen Fraktionen verteilt waren. Darüber hinaus wurden die hochübersetzten gapdh- und sox2-mRNAs in polysomalen Fraktionen angereichert, während translationell unterdrückte rpl34- und rpl7-mRNAs weniger Anreicherung in Polysomen zeigten, die unsere Plattform und unser Protokoll validieren. Bei einem ähnlichen Ansatz kann der Translationsstatus anderer Gene im sich entwickelnden Kortex individuell durch Echtzeit-PCR bestimmt werden. Bemerkenswert ist, dass Polysomenprofilierung verwendet wurde, um den Translationsstatus im sich entwickelnden Gehirn auf genomweiter Ebene zu analysieren. In diesem Zusammenhang können Polysomenenthaltende kombiniert und extrahierte RNA mittels tiefer Sequenzierung analysiert werden. Die hier vorhandene Plattform und das Protokoll können angepasst und weiter optimiert werden, um translatomare Studien mit anderen Zelltypen und Geweben anzupassen. Unter Berücksichtigung der Verfügbarkeit von kortikalen Geweben, die durch experimentelle Bedingungen begrenzt sind (z. B. <50 g RNA), kann eine zusätzliche Optimierung des Protokolls zu einer weiteren Steigerung der Effizienz und Reproduzierbarkeit der Experimente führen.
Während Polysomenprofiling Einblicke in den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Kortex bietet, hat es Einschränkungen, bestimmte Zelltypen in späteren Entwicklungsstadien zu analysieren, wenn verschiedene neuronale Zelltypen vorhanden sind. Um diese Frage zu beantworten, kann Polysomenprofiling mit TRAP durch Pull-down von Epitop mit ribosomalem Protein unter einem gewebespezifischen Promotor11exprimiert integriert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Plattform und das Protokoll, über die wir hier für saccharose Gradientenherstellung und Fraktionierung berichten, eine wirtschaftliche Lösung für Polysomen-Profiling-Experimente im Kontext der Hirnentwicklung sowie anderer biologischer Kontexte bieten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 bis G.Y.) finanziert. G.Y. ist ein Canada Research Chair. S.K. wurde vom Mitacs Globalink Graduate Fellowship und dem ACHRI Graduate Student Scholarship finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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