Summary
התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.
Abstract
ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.
Introduction
במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים5. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול6,7,8,9,10. לפיכך, התייחסות לתוכניות הבקרה התרגומיות תקדם מאוד את הבנתנו את המנגנונים שבבסיס החלטת גורל תאי הגזע העצביים והתפתחות המוח.
שלוש טכניקות עיקריות עם עוצמות שונות יושמו באופן נרחב כדי להעריך את המצב התרגומי של mRNA, כולל פרופיל ריבוזום, תרגום טיהור זיקה ריבוזום (TRAP) ופרופיל פוליזום. פרופיל ריבוזום משתמש ברצף RNA כדי לקבוע שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזום, ומאפשר ניתוח גלובלי של מספר ומיקום של תרגום ריבוזומים על כל תעתיק כדי להסיק בעקיפין את שיעור התרגום על ידי השוואתו לשפעתעתיק 11. TRAP מנצלת חלבונים ריבוזומליים מתויגים באפיטופ כדי ללכוד mRNAs12הקשורים לריבוזום . בהתחשב בכך שהחלבונים הריבוזומליים המתויגים יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ספציפיים באמצעות גישות גנטיות, TRAP מאפשרת ניתוח של תרגום באופן ספציפי לסוג התא. לשם השוואה, פרופיל פוליזום, המשתמש בשבר שיפוע בצפיפות סוכרוז כדי להפריד חלק חופשי ותורגם בצורה גרועה (מונוזומים קלים יותר) מאלה המתורגמים באופן פעיל על ידי ריבוזומים (פוליזומים כבדים יותר), מספק מדידה ישירה של צפיפות הריבוזום ב- mRNA13. יתרון אחד טכניקה זו מציעה היא צדדיות שלה ללמוד את התרגום של mRNA ספציפי של עניין, כמו גם ניתוח תרגום רחב הגנום14.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של פרופיל פוליזום כדי לנתח את קליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו משתמשים במערכת ביתית כדי להכין מעברי צבע של צפיפות סוכרוז ולאסוף שברים עבור יישומים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי לנתח סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השימוש בבעלי חיים היה בפיקוח הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי. עכברי CD1 ששימשו לניסוי נרכשו מספק מסחרי.
1. הכנת פתרונות
הערה כדי למנוע השפלה RNA, לרסס שולחן עבודה וכל הציוד עם פתרון טיהור RNase. טיפים ללא RNase משמשים לניסוי. כל הפתרונות מוכנים במים נטולי RNase.
- הכן פתרון מלאי ציקלוהקסימיד (100 מ"ג / מ"ל) ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
- הכן פתרון מלאי סוכרוז 2.2 M על ידי הוספת 75.3 גרם של סוכרוז למים ללא RNase ומעלה את עוצמת הקול ל 100 מ"ל (להכנת שיפוע ~ 16). הפתרון יכול להישמר ב -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.
- הכן 10x פתרון מלח (1 M NaCl; 200 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2).
- הכן 60% (w / v) פתרון מרדף סוכרוז, המכיל 30 גרם של סוכרוז, 5 מ"ל של 10x פתרון מלח העליון את נפח עד 50 מ"ל עם מים ללא RNase.
- באופן אופציונלי, להוסיף גרגר של כחול ברומופנול או כ 5 μL של 1% כחול ברומופנול במים ללא RNase לפתרון המרדף. 1.6. יש לאחסן פתרונות ב-4 מעלות צלזיוס.
2. הכנת שיפוע סוכרוז
הערה: דיוק בהכנת מעברי צבע סוכרוז הוא קריטי בהשגת תוצאות עקביות לשחזור.
- כדי להכין שישה שיפוע סוכרוז 10-50%, לדלל 2.2 M פתרון סוכרוז כמו בטבלה 1.
| פתרון סוכרוז | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 מ' סוכרוז | 2 מ"ל | 4 מ"ל | 6 מ"ל | 8 מ"ל | 10 מ"ל |
| תמיסת מלח פי 10 | 1.5 מ"ל | 1.5 מ"ל | 1.5 מ"ל | 1.5 מ"ל | 1.5 מ"ל |
| ציקלוהקסימיד | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| מים | 11.5 מ"ל | 9.5 מ"ל | 7.5 מ"ל | 5.5 מ"ל | 3.5 מ"ל |
| נפח כולל | 15 מ"ל | 15 מ"ל | 15 מ"ל | 15 מ"ל | 15 מ"ל |
טבלה 1: דילול סוכרוז להכנות של שיפוע סוכרוז.
הערה: הכן תמיד מעברי צבע של סוכרוז בכפולות של שניים כדי לאזן משקל במהלך ultracentrifugation.
- לנגב את מחט קצה קהה מתכת עם פתרון טיהור RNase. יש לשטוף בקצרה את צינורות האולטרה-סנטריפוגה, הצינור והמזרק באמצעות מים נטולי RNase. לייבש את האוויר את הצינורות כך שלא נותרה טיפת מים בצינורות כמו כל המים הנותרים ישנה את ריכוז סוכרוז.
- מניחים את מחט המתכת על מחזיק המהדק ועל צינור הצנטריפוגה על הבמה הממונעת. להכנת מעברי צבע באופן עקבי, נעשה שימוש במערכת ביתית המכילה שלב ממונע להחזקת צינור האולטרה-סנטריפוגה ומשאבת מזרק להזרקת פתרונות סוכרוז(איור 1, ראה שלב 9 לפרטים).
- מלא מזרק 30 מ"ל עם ~ 16 מ"ל של 10% סוכרוז (מספיק עבור שישה מעברי צבע), למקם אותו על משאבת המזרק ולחבר אותו המחט. ודא שאין בועות אוויר במזרק, בצינורות ובמחט. לנגב את הקצה את המחט כדי להסיר כל פתרון שיורית.
- הזז את השלב הממונע למעלה כך שקצה המחט נוגע במרכז הצינור בתחתית.
- הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 2 מ"ל / דקה עבור נפח של 2.3 מ"ל.
- לאחר חלוקת 2.3 מ"ל של 10% פתרון סוכרוז, לרדת בשלב הממונע ולחזור על התהליך עבור כל ששת שיפוע.
- חזור על שלבים 2.4-2.7 כדי להוסיף 20% פתרון סוכרוז לתחתית הצינורות, ואחריו 30%, 40% ו 50% פתרונות סוכרוז באופן דומה.
- לאחר הכנת השיפוע, לאטום את הצינור ultracentrifuge באמצעות סרט פרפין.
- השאירו את הצינורות לילה ב 4 מעלות צלזיוס, כך שכבות סוכרוז שונים להתפזר יחד כדי לתת שיפוע מתמשך.
3. ניתוח רקמות
הערה: עכברים בהריון היו מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם קדמו הרדמה עם 5% isoflurane.
- לאסוף עוברי עכבר CD1 ביום העוברי 12, או נקודות זמן אחרות לפי הצורך, ומניחים עוברים בצלחת Ø 10 ס"מ המכילה קר כקרח האנק של מאוזן מלח פתרון (HBSS) על הקרח כדי לשמור על הכדאיות של התא.
- תחת טווח הניתוח, להעביר עובר אחד לצלחת Ø 6 ס"מ המכיל HBSS קר כקרח.
- השתמש במחטים של 21-23 G כדי לתקן את מיקום הראש על-ידי חדירה דרך העיניים בזווית של כ-45° והפעל כוח כדי לוודא שהמחטים קבועות על הצלחת(איור 2A).
- השתמש No.5 מלקחיים כדי להסיר עור וגולגולת, מהאמצע לצדדים.
- השתמש במלקחיים כדי לחתוך את נורות הריח ולהסיר את קרום המוח כדי לחשוף את רקמות קליפת המוח.3.6.Use מלקחיים מעוגלים כדי לחתוך את רקמות קליפת המוח לתוך 2-3 מ"ל של מדיום נוירובאסלי על קרח (איור 2B). רקמות קליפת המוח של הבריכה מעוברים שונים לפי הצורך. רקמות מ 8-10 עוברים בדרך כלל לתת ~ 200 מיקרוגרם הכולל RNA.
4. תמוגה תאית
- ביום של ניתוח רקמות, להכין מאגר תמוגה תא טרי כמתואר בטבלה 2.
| תמיסה | ריכוז סופי | נפח |
| טריס-HCl (עמ' 7.5) | 20 מ"מ | 100 μL |
| KCl | 100 מ"ר | 250 μL |
| MgCl2 | 5 מ"מ | 25 μL |
| טריטון X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| נתרן דוקסיכולאט | 0.5% (עם/v) | 500 μL |
| דיתיותריטול (DTT) | 1 מ"מ | 5 μL |
| ציקלוהקסימיד | 100 מיקרוגרם/ מ"ל | 5 μL |
| מים ללא RNase | עד 5 מ"ל | |
| סך | 5 מ"ל | 5 מ"ל |
טבלה 2: הכנת מאגר תמוגה פוליזום.
הערה: תוספת מאגר תמוגה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
- הוסף ציקלוהקסימיד למדיום הנוירובאסלי עם רקמות מנותח לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ציקלוהקסימיד חוסם התארכות תרגום, ולכן מונע ריצת ריבוזום 15.
- צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולזרוק את supernatant.
- לשטוף את הרקמות פעמיים עם מלח קר כקרח פוספט אגירה (PBS) בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוהקסימיד.
- הוסף 500 μL של מאגר תמוגה התא בתוספת 4 μL של מעכב RNase. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשבית את הרקמה במאגר תמוגה. השתמש במחט אינסולין בעדינות lyse הרקמה.
- דגירה את הרקמות על הקרח במשך 10 דקות עם מערבולת קצרה כל 2-3 דקות.
הערה: כדי למנוע השפלה של רקמות, ודא כי כל השלבים של תמוגה רקמה מתבצעים על קרח. - צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח.
- צנטריפוגה ב ~ 13,000 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח.
- למדוד את ריכוז RNA ברקמה lysate באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
הערה: אם דגימות מרובות כלולות בניסוי, לדלל דגימות לאותו ריכוז עם מאגר תמוגה תא נוסף כדי למזער את השונות.
5. טעינה דגימה אולטרה צנטריפוגה
- מצננים מראש את רוטור האולטרה-צנטריפוגה ואת דליי הנדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ומגדירים את הטמפרטורה של האולטרה-סנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
- שמור 20 μL של lysate הרקמה כמו קלט RNA הכולל.
- לטעון דגימות (50-300 מיקרוגרם RNA עם נפח שווה) על החלק העליון של שיפוע סוכרוז על ידי חלוקת לאט את lysate לקירות של צינורות ultracentrifuge.
- מניחים בעדינות את צינורות האולטרה-צנטריפוגה בדלי הנדנדה. ודא שכל הדליים ההפוכים מבחינה דיאמטרית מאוזנים.
- טען את דליי הנדנדה על הרוטור. הגדר את ultracentrifuge ל 190,000 x g (~ 39,000 סל"ד) ב 4 °C (70 °F) במשך 90 דקות.
- מניחים בעדינות את השיפוע על קרח לאחר צנטריפוגה.
6. שבר ואיסוף לדוגמה
הערה: מערכת ניתוק, הקלטה ואיסוף ביתית משמשת לניתוח ואיסוף דגימות מהמדרגיים(איור 3, ראה רכיבי התקן).
- מניחים צינור אולטרה צנטריפוגה ריק על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.
- הפעל את צג UV ופתח את תוכנת הקלטת האותות הדיגיטלית.
- מלא מזרק 30 מ"ל עם 25 מ"ל של 60% פתרון מרדף סוכרוז. לחץ בעדינות על המזרק כך שתמיסת המרדף תמלא את הצינור הריק ותעבור דרך צג UV של 254 ננומטר כדי להגדיר את הבסיס לגילוי.
- לחץ על אפס אוטומטי בצג UV כדי לרשום תוכנית בסיסית לזיהוי. לחץ על הפעל בתוכנה כדי להתחיל בהקלטה.
- ברגע שהמערכת קובעת בסיס, השהה את ההקלטה על התוכנה וחזור בו מפתרון המרדף. ודא שלא נשאר פתרון מרדף שיורית במערכת.
הערה: יש לשטוף את המערכת במים נטולי RNase כדי להסיר שאריות של פתרונות סוכרוז שנותרו מההפעלה הקודמת. - טען צינור דגימה אחד לפיקר הצינור. בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.
- התחל להקליט בתוכנה. הפעל את משאבת המזרק (קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה עבור נפח של 25 מ"ל) ואת אספן השברים כדי לאסוף שברים פוליזומים. הגדר הגדרות שבר ל- 30 שניות.
הערה: לפני כל ריצה, ודא שאין בועות אוויר במזרק או בצינורות על ידי לחיצה עדינה על המזרק כדי לאפשר לפתרון המרדף לזרום ברציפות דרך המחט. - לאסוף את השברים לתוך 1.5 צינורות מ"ל (500 μL כל אחד) באמצעות אספן שבר.
- ניתן לעבד את השברים באופן מיידי או לאחסן אותם ב- -80 °C (60 °F).
- לאחר איסוף שברים, יש לשטוף את המערכת במים נטולי RNase כדי להסיר כל שאריות סוכרוז.
7. מיצוי רנ"א
- לכל שבר, להוסיף 10 ng של לוציפראז mRNA ספייק בשליטה.
- הוסף שלושה כרכים של גואנידיום הידרוכולריד מבוסס מסחרי בידוד RNA מגיב לכל שבר.
- וורטקס לזמן קצר במשך 15 שניות.
- לחלץ RNA באמצעות ערכת מיצוי RNA תואם את הפתרון המשמש 7.2.
8. שעתוק הפוך PCR בזמן אמת
- למדוד את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
- RNA נושא להפוך שעתוק באמצעות ערכת סינתזה cDNA, על פי פרוטוקול היצרן.
- השתמש PCR בזמן אמת כמותי (qPCR) כדי לבחון את ההתפלגות הפוליסומלית של mRNA gapdh כדוגמה. qPCR בוצע באמצעות מערכת זיהוי qPCR ריאגנט mastermix qPCR, עם תנאי האופניים הבאים: 95 °C (75 °F) במשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C (65 °F) עבור 15 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 s, 72 °C (72 °F) עבור 40 s, ואחריו 95 °C (60 °F) עבור 60 s.
- השג ערכי מחזור סף (Ct) מהחלקות ההגברה ושימש לחישוב שינוי קיפול באמצעות שיטת ΔΔCt.
9. סוקרוז הדרגתי ביצוע הרכבת המערכת
הערה: בצע את השלבים להרכבת כל רכיב (כמתואר בטבלה 3)של יצרנית מעבר הצבע סוכרוז (איור 1).
- הכן שני סוגריים אנכיים (A2) על לוח הלחם הבסיסי (A1).
- השתמש בשני סוגריים דקים בזווית ישרה (B2) כדי לטעון את מפעיל השלב הליניארי ללוח הלחם הבסיסי (A1).
- השתמש ב- 12.7 מ"מ אלומיניום (C2) כדי לתקן אותו על לוח הלחם הבסיסי של מחזיק הצינור (C1) כמעמד למחזיק הצינור.
- להרכיב את הזווית הימנית Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק (C3) עם הפוסט (C2) ואת הפוסט האופטי מיני סדרה (C4).
- השתמש ב- setscrew בעמדה האופטית (C4) כדי לחבר מהדק V קטן (C5) כמחזיק הצינור.
- שים צינור צנטריפוגה במחזיק הצינור ולהתאים את הזווית כדי להפוך אותו אנכי. סמנו את מיקום הצינור והרכיבו את מחזיק עמוד הכן (C6) על לוח הלחם הבסיסי (C1) כדי לתמוך בצינור.
- בצד השני של לוח הלחם (A1), השתמש בערכות של עמוד האלומיניום Ø12.7 מ"מ (D1) כדי לתקן אותו ולחבר פוסט אופטי מסדרה קטנה (D3) באמצעות זווית ישרה Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק (D2).
- חבר את המהדק V המיניאטורי (D4) עם מחט קהה קצה (D5) להודעה (D3). להתאים את הזווית של המהדק כדי להגדיר את המחט אנכית, ולהתאים את אורך ההודעה כדי להבטיח את המחט פוגש את הצינור צנטריפוגה.
- חבר את המפעיל (B1) לנהג מנוע הצעד (E1) והשתמש בלוח הבקר של UNO R3 ובמודול הג'ויסטיק מערכת המתנע של UNO (E2) כדי לשלוט במפעיל. מתאם הספק (למשל, מתאם הספק מתכוונן 9-24 V AC/DC) יכול לשמש להנעת המנוע בנפרד.
- מניחים את משאבת המזרק (F) ליד תחנת הכנת השיפוע ומחברים את המזרק עם המחט.
- שלוט בשלב מחזיק הצינור למעלה ולמטה באמצעות מוט ההיגוי.
| רכיב | פריט |
| B1 | מפעיל שלב ליניארי |
| E1 | נהג מנוע צעד |
| E2 | ערכת סטרטר סופר פרויקט UNO |
| A1 (1) | לוח לחם |
| A2 | סוגר מרובע אנכי |
| B2 | סוגר דק בזווית ישרה |
| C1 | לוח לחם מיני-סדרה |
| C5 | מהדק V קטן |
| D4 | מהדק V מיניאטורי |
| C2 | עמדת אלומיניום Ø12.7 מ"מ |
| C4, D3 | פוסט אופטי מסדרה מיני |
| D1 | עמדת אלומיניום Ø12.7 מ"מ |
| C3, D2 | זווית ישרה Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק |
| C6 | בסיס מחזיק פוסטים של סדרה מצומצמת |
| D5 | מחט קצה קהה |
| פ | משאבת מזרק |
טבלה 3: מעבר צבע ליצירת רכיבי מערכת.
10. מיון וזיהוי הרכבה של המערכת (איור 2).
- השתמש במהדק בורט לסת עגול רגיל כדי להרכיב את מודול האופטיקה של צג UV על מדקר הצינור. חבר קצה אחד של הצינור (1 ס"מ אורך ו 0.56 מ"מ קוטר פנימי) לחיבור של מדקר הצינור ואת הקצה השני לנוזל ביציאה של מודול אופטיקה. חבר את יציאת Fluid Out לשבר.
- חבר את מודול האופטיקה עם יחידת הבקרה של צג UV על פי המדריך של היצרן.
- השתמש בכבל פריצה כדי לחבר את שקע יציאת האות לממיר הדיגיטלי בבסיס וחיבורי קלט אנלוגיים, בהתאם למדריך היצרן.
- חבר את הממיר הדיגיטלי למחשב נישא באמצעות כבל USB רגיל והקלט את האותות הדיגיטליים המומרים באמצעות תוכנה לרכישת נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כהדגמה, ליסט קליפת המוח המכיל 75 מיקרוגרם RNA (מאוגד מ 8 עוברים) הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל 12 שברים. פסגות ספיגת UV ב-254 ננומטר זיהו שברים המכילים את יחידת המשנה 40S, יחידת משנה של 60S, מונוזום 80S ופוליזומים(איור 4A). ניתוח שברים לפי כתם מערבי עבור יחידת המשנה ריבוזומה גדולה, Rpl10 הראה את נוכחותו ב subunit 60S (שבר 3), מונוזום (שבר 4) ו polysomes (שברים 5-12) (איור 4B). לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים Gapdh ו-Csde1 לא היו קשורים לריבוזומים אלא הועשרו בשברים המכילים רנ"א חופשי (שבריר 1)(איור 4B). בהתאם להפרדת חלבונים בשברים שונים, מצאנו כי gapdh ו- sox2 mRNAs היו מועשרים מאוד בשברים המכילים פוליזומים כבדים (יותר משלושה ריבוזומים בשברים 7-12), מה שמרמז על כך ש- gapdh ו- sox2 mRNAs מתורגמים ביעילות בקליפת המוח המתפתחת(איור 4C, D). לעומת זאת, rpl7 ו- rpl34 mRNAs הועשרו בשבר המכיל מונוזומים, מה שמרמז על תרגום מודחק (איור 4E, F)16. תוצאות אלו אימתו את פרוטוקול השבר הפוליזום שלנו.
איור 1: התקנה להכנת שיפוע סוכרוז. (A) יצרנית שיפוע סוכרוז ביתית המורכבת ממפעיל שלב ליניארי, מחזיק צינור על הבמה הממונעת, ערכת בקר במה, מחט מתכת קהה-קצה המותקנת על מחזיק מחט ומשאבת מזרק אוטומטית עם מזרק המחובר למחט (ראה טבלה 3). (B) כדי להכין את שיפוע סוכרוז, הצינור ultracentrifuge ממוקם במחזיק הצינור. פתרונות סוכרוז מחולקים דרך המחט הקהה באמצעות משאבת מזרק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח של רקמות קליפת המוח מעובר עכבר הפיתוח. (A) תמונה המציגה עובר E12.5 CD1 קבוע לצלחת Ø 6 ס"מ באמצעות מחטי 21G-23G. (B) תמונה המציגה את קליפת המוח המנותחת לאחר הסרת העור, הגולגולת וקרומי המוח (מסומן בקווים מקווקווים לבנים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התקנה לשבר, הקלטה ואיסוף לדוגמה. תמונה המתארת את מערכת השבר, ההקלטה והאיסוף לדוגמה המורכבת ממשאבת מזרק אוטומטית, מדקר צינור, אספן שברים וצג UV עם ממיר דיגיטלי המחובר למחשב נייד לניטור רציף של ספיגת UV. רכישת נתונים מטופלת על-ידי תוכנת רכישת הנתונים המסחרית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח פרופיל פוליזום של קליפת העכבר המתפתחת. (A) ספיגת UV המציגה שברים המכילים RNA חופשי (שבר 1), יחידת משנה של 40S (שבר 2), יחידת משנה של 60S (שבר 3), מונוזומים של 80S (שבר 4) ופוליזומים (שבר 5-12). 75 מיקרוגרם הכולל RNA במאגר מ 8 עוברים שימש. (B)כתמים מערביים המציגים את ההפצות של חלבוני Gapdh, Rpl10 ו- Csde1 בשברים. ניתוח qPCR המציג את ההתפלגות של gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) ו- rpl34 (F) mRNAs בשברים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות14 . בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן לשחזור ופרופיל פוליזום ברגישות גבוהה.
ראוי לציין כי הכנת שיפוע סוכרוז עקבי ואיכותי היא קריטית כדי להשיג תוצאות פרופיל פוליזום לשחזור17. שינויים בנפח של 10-50% פתרונות סוכרוז במהלך הכנת שיפוע עלול לגרום לשינוי של פסגות פוליזום וחוסר עקביות של תוצאות בניתוח במורד הזרם. יתר על כן, הפרעה הדרגתית במהלך החדרה והסרה של המחט יכול לתרום חוסר עקביות של הכנה הדרגתית. בהשוואה לגישות ומכשירים מסחריים אחרים, מערכת ייצור השיפוע הביתית שלנו השתמשה בשלב ממונע כדי להפחית הפרעות של מעברי צבע במהלך ההכנה ומשאבת מזרק כדי לוותר במדויק על פתרונות סוכרוז, המציע פתרון זול ופשוט להכנת שיפוע.
החלת פלטפורמת פרופיל פוליזום ופרוטוקול נוכח כאן קליפת העכבר המתפתחת, מצאנו כי החלבון ריבוזומלי Rpl10 וחלבונים ציטופלסמיים Gapdh ו Csde1 הופצו בשברים הנכונים. יתר על כן, gapdh מתורגם מאוד ו sox2 mRNAs הועשרו שברים פוליזומליים, בעוד rpl34 מודחק תרגום ו rpl7 mRNAs הראו פחות העשרה בפוליזומים, אשר מאמתים את הפלטפורמה והפרוטוקול שלנו. עם גישה דומה, המצב התרגומי של גנים אחרים בקליפת המוח המתפתחת יכול להיקבע בנפרד על ידי PCR בזמן אמת. שימו לב, פרופיל פוליזום שימש לניתוח מצב תרגום במוח המתפתח ברמה הגנומית כולה. בהקשר זה, שברים המכילים פוליזומים ניתן לשלב ולחלץ RNA ניתן לנתח באמצעות רצף עמוק. הפלטפורמה והפרוטוקול הקיימים כאן יכולים להיות מותאמים וממוטבים עוד יותר כדי להתאים למחקרים טרנסלטומיים באמצעות סוגי תאים ורקמות אחרים. בהתחשב בזמינות של רקמות קליפת המוח מוגבל על ידי תנאים ניסיוניים (למשל, <50 מיקרוגרם RNA), אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול עשוי לספק עליות נוספות היעילות ואת הרבייה של הניסויים.
בעוד פרופיל פוליזום מספק תובנות על המצב התרגומי של mRNAs בקליפת המוח המתפתחת, יש לו מגבלות לנתח סוגי תאים ספציפיים בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר, כאשר קיימים סוגי תאים עצביים שונים. כדי לענות על שאלה זו, פרופיל פוליזום יכול להיות משולב עם TRAP על ידי משיכת למטה של חלבון ריבוזומלי מתויג epitope לידי ביטוי תחת מקדם ספציפי רקמה11.
לסיכום, הפלטפורמה והפרוטוקול שאנו מדווחים כאן על יצירת שיפוע סוכרוז ושברים מספקים פתרון חסכוני לניסויי פרופיל פוליזום בהקשר של התפתחות המוח, כמו גם בהקשרים ביולוגיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN/04246-2018 ל- G.Y.). G.Y. הוא קתדרת מחקר בקנדה. S.K. מומן על ידי מלגת בוגרי Mitacs Globalink ומלגת סטודנטים לתארים מתקדמים של ACHRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
