Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में अनुवाद का विश्लेषण

Published: May 22, 2021 doi: 10.3791/62088
Automatic Translation
1,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

Summary

स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के लिए अनुवाद के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के उचित नियंत्रण की आवश्यकता होती है। यहां, हम विकासशील मस्तिष्क में mRNAs की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए एक आसान-से-इकट्ठा सुक्रोज ढाल बनाने और अंश मंच के साथ एक पॉलीसोम प्रोफाइलिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं।

Abstract

स्तनधारी मस्तिष्क का उचित विकास तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकारों में भेदभाव के ठीक संतुलन पर निर्भर करता है। यह संतुलन जीन अभिव्यक्ति द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है जो ट्रांसक्रिप्शन, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद सहित कई स्तरों पर ठीक-ठाक है। इस संबंध में, साक्ष्य का एक बढ़ता हुआ निकाय तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णयों के समन्वय में अनुवादात्मक नियमन की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डालता है । पॉलीसोम अंश वैश्विक और व्यक्तिगत जीन दोनों स्तरों पर एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के आकलन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स से कोशिकाओं में ट्रांसलेशनल दक्षता का आकलन करने के लिए एक इन-हाउस पॉलीसोम प्रोफाइलिंग पाइपलाइन पेश करते हैं। हम एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के सुक्रोज रेडिएंट तैयारी, टिश्यू लाइसिस, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन और आंशिक-आधारित विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के दौरान, तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं न्यूरॉन्स और ग्लिया1,2 उत्पन्न करने के लिए पैदा होती हैं और अंतर करती हैं। इस प्रक्रिया के क्षोभ मस्तिष्क की संरचना और कार्य में परिवर्तन का कारण बन सकता है, जैसा कि कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों मेंदेखा जाता है 3,4। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उचित व्यवहार के लिए विशिष्ट जीन5की आर्केस्ट्रा अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है । जबकि इन जीनों के एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण का गहनता से अध्ययन किया गया है, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि अन्य स्तरों पर जीन विनियमन भी तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और भेदभाव 6 ,7,8,9,10के समन्वय में योगदान देता है । इस प्रकार, अनुवाद नियंत्रण कार्यक्रमों को संबोधित बहुत तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णय और मस्तिष्क के विकास अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ अग्रिम होगा ।

विभिन्न शक्तियों के साथ तीन मुख्य तकनीकों को व्यापक रूप से एमआरएनए की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए लागू किया गया है, जिसमें राइबोसोम प्रोफाइलिंग, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) और पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का अनुवाद शामिल है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों को निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है, जिससे प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स का अनुवाद करने की संख्या और स्थान के वैश्विक विश्लेषण को अप्रत्यक्ष रूप से अनुवाद दर का अनुमान लगाने की अनुमति मिलती है, जिसकी तुलना ट्रांसलेशन दर को ट्रांसक्रिप्ट बहुतायतसे 11से किया जाता है। ट्रैप राइबोसोम-बाउंड mRNAs12पर कब्जा करने के लिए epitope-टैग रिबोसोमल प्रोटीन का लाभ लेता है । यह देखते हुए कि टैग किए गए राइबोसोमल प्रोटीन को आनुवंशिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विशिष्ट सेल प्रकारों में व्यक्त किया जा सकता है, ट्रैप सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से अनुवाद के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसकी तुलना में, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग, जो रिबोसोम्स (भारी पॉलीसोम्स) द्वारा सक्रिय रूप से अनुवादित लोगों से मुक्त और खराब अनुवादित हिस्से (लाइटर मोनोसोम्स) को अलग करने के लिए सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग करता है, mRNA13पर राइबोसोम घनत्व का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। इस तकनीक का एक लाभ रुचि के विशिष्ट एमआरएनए के अनुवाद के साथ-साथ जीनोम-वाइड ट्रांसलिरोम विश्लेषण14का अध्ययन करना इसकी बहुमुखी प्रतिभा है।

इस पेपर में, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स का विश्लेषण करने के लिए पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सुक्रोज घनत्व ढाल तैयार करने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अंश एकत्र करने के लिए घर-इकट्ठे प्रणाली का उपयोग करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऊतकों और जीवों का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु उपयोग कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा निगरानी की गई थी । प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए गए सीडी 1 चूहों को वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया था।

1. समाधान की तैयारी

नोट आरएनए क्षरण को रोकने के लिए, स्प्रे वर्कबेंच और RNase परिषना समाधान के साथ सभी उपकरण। प्रयोग के लिए RNase-मुक्त सुझावों का उपयोग किया जाता है। सभी समाधान RNase मुक्त पानी में तैयार कर रहे हैं।

  1. डीएमएसओ में साइक्लोहेक्सीमाइड स्टॉक सॉल्यूशन (100 मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. RNase-मुक्त पानी के लिए सुक्रोज के 75.3 ग्राम जोड़कर 2.2 एम सुक्रोज स्टॉक समाधान तैयार करें और वॉल्यूम को 100 एमएल (~ 16 ढाल तैयारी के लिए) तक टॉपिंग करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  3. 10x नमक समाधान (1 एम एनएसीएल; 200 mM Tris-HCl, पीएच 7.5; 50 mM MgCl2)तैयार करें।
  4. 60% (w/v) सुक्रोज चेस समाधान तैयार करें, जिसमें 30 ग्राम सुक्रोज, 10x नमक समाधान के 5 एमएल और RNase-मुक्त पानी के साथ 50 मिलीएल तक की मात्रा ऊपर है।
  5. वैकल्पिक रूप से, चेस समाधान के लिए आरएनएसई-मुक्त पानी में ब्रोमोफेनॉल नीले या लगभग 5 माइक्रोन 1% ब्रोमोफेनॉल नीले रंग का एक धब्बा जोड़ें। 1.6. 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर करें।

2. सुक्रोज रेडिएंट की तैयारी

नोट: सुक्रोज ग्रेडिएंट्स की तैयारी में सटीकता लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है।

  1. छह 10-50% सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करने के लिए, तालिका 1में 2.2 एम सुक्रोज समाधान को पतला करें।
सुक्रोज समाधान 10% 20% 30% 40% 50%
2.2 एम सुक्रोज 2 एमएल 4 एमएल 6 एमएल 8 एमएल 10 एमएल
10X नमक समाधान 1.5 एमएल 1.5 एमएल 1.5 एमएल 1.5 एमएल 1.5 एमएल
साइक्लोहेक्सीमाइड 15 माइक्रोन 15 माइक्रोन 15 माइक्रोन 15 माइक्रोन 15 माइक्रोन
पानी 11.5 एमएल 9.5 एमएल 7.5 एमएल 5.5 एमएल 3.5 एमएल
कुल मात्रा 15 एमएल 15 एमएल 15 एमएल 15 एमएल 15 एमएल

तालिका 1: सुक्रोज ग्रेडिएंट्स की तैयारी के लिए सुक्रोज कमजोर पड़ने।

नोट: अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के दौरान वजन को संतुलित करने के लिए हमेशा दो के गुणकों में सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करें।

  1. RNase विसंदूषण समाधान के साथ धातु कुंद अंत सुई पोंछें। संक्षेप में RNase मुक्त पानी का उपयोग कर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब, ट्यूबिंग और सिरिंज कुल्ला । हवा-ट्यूबों को इस तरह सूखा दें कि पानी की कोई बूंद ट्यूबों में नहीं रहती है क्योंकि कोई भी शेष पानी सुक्रोज एकाग्रता को बदल देगा।
  2. क्लैंप होल्डर पर मेटल सुई और मोटराइज्ड स्टेज पर सेंट्रलाइज ट्यूब रखें। लगातार ढाल तैयार करने के लिए, एक घर-इकट्ठे प्रणाली का उपयोग किया गया था जिसमें अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब और सुक्रोज समाधान इंजेक्ट करने के लिए एक सिरिंज पंप को पकड़ने के लिए एक मोटराइज्ड चरण शामिल है(चित्रा 1,विवरण के लिए चरण 9 देखें)।
  3. 10% सुक्रोज (छह ढाल के लिए पर्याप्त) के ~ 16 एमएल के साथ 30 एमएल सिरिंज भरें, इसे सिरिंज पंप पर रखें और इसे सुई से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज, ट्यूबिंग और सुई में हवा के बुलबुले नहीं हैं। किसी भी अवशिष्ट समाधान को दूर करने के लिए सुई से टिप पोंछें।
  4. मोटराइज्ड स्टेज को इस तरह से आगे बढ़ाएं कि सुई की नोक नीचे की नली के केंद्र को छू जाए।
  5. 2.3 एमएल की मात्रा के लिए 2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप सेट करें।
  6. 10% सुक्रोज समाधान के 2.3 एमएल वितरण के बाद, मोटरचालित चरण को नीचे ले जाएं और सभी छह ग्रेडिएंट के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  7. ट्यूबों के नीचे 20% सुक्रोज समाधान जोड़ने के लिए 2.4-2.7 चरण दोहराएं, इसके बाद 30%, 40% और 50% सुक्रोज समाधान इसी तरह।
  8. रेडिएंट तैयार करने के बाद पैराफिन फिल्म का इस्तेमाल करते हुए अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब को सील कर दें।
  9. ट्यूबों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें ताकि विभिन्न सुक्रोज परतें एक सतत ढाल देने के लिए एक साथ फैलती हैं।

3. ऊतक विच्छेदन

नोट: गर्भवती चूहों को 5% आइसोफ्लाणे के साथ संज्ञाहरण से पहले गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से इच्छामृत्यु दी गई थी।

  1. भ्रूण दिन 12 पर CD1 माउस भ्रूण ले लीजिए, या अन्य समय बिंदुओं के रूप में की जरूरत है, और एक Ø 10 सेमी बर्फ पर बर्फ से युक्त 10 सेमी की थाली में भ्रूण जगह-ठंडा है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) बर्फ पर सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए ।
  2. विच्छेदन दायरे के तहत, एक भ्रूण को बर्फ-ठंडे एचबीएसएस युक्त क्र 6 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  3. लगभग 45 डिग्री कोण पर आंखों के माध्यम से मर्मज्ञ द्वारा सिर की स्थिति को ठीक करने के लिए 21-23 जी सुइयों का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए बल लागू करें कि सुई प्लेट(चित्रा 2 ए)पर तय की गई है।
  4. त्वचा और खोपड़ी को हटाने के लिए नंबर 5 संदंश का उपयोग करें, बीच से पक्षों के लिए ।
  5. घ्राण बल्बों को काटने और कॉर्टिकल ऊतकों को बेनकाब करने के लिए मेनिंग्स को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। 3.6. कॉर्टिकल ऊतकों को बर्फ पर न्यूरोबेसल माध्यम के 2-3 एमएल में काटने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें(चित्रा 2B)। जरूरत के अनुसार विभिन्न भ्रूणों से पूल कॉर्टिकल ऊतक। 8-10 भ्रूण से ऊतक आमतौर पर ~ 200 माइक्रोन कुल आरएनए देते हैं।

4. सेल लाइसिस

  1. ऊतक विच्छेदन के दिन, तालिका 2में वर्णित ताजा सेल लाइसिस बफर तैयार करें।
विलयन अंतिम एकाग्रता आयतन
ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5) 20 एमएमएम 100 माइक्रोल
केसीएल 100 एमएमएम 250 माइक्रोल
एमजीसीएल2 5 एमएमएम 25 माइक्रोन
ट्राइटन एक्स-100 1% (v/v) 500 माइक्रोल
सोडियम डिऑक्सीकोटलेट 0.5% (w/v) 500 माइक्रोल
डिइयॉटरेटोल (डीटीटी) 1 mm 5 माइक्रोन
साइक्लोहेक्सीमाइड 100 माइक्रोग्राम/एमएल 5 माइक्रोन
RNase मुफ्त पानी 5 एमएल तक टॉप करें
कुल 5 एमएल 5 एमएल

तालिका 2: पॉलीसोम लाइसिस बफर की तैयारी।

नोट: प्रोटीज और फॉस्फेटेस अवरोधकों के साथ पूरक लाइसिस बफर।

  1. 100 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए विच्छेदित ऊतकों के साथ न्यूरोबेसल माध्यम में साइक्लोहेक्सीमाइड जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। साइक्लोहेक्सीमाइड अनुवाद विस्तार को रोकता है और इसलिए, राइबोसोम रन-ऑफ 15को रोकता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  3. ऊतकों को दो बार बर्फ से धोएं-ठंडे फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) १०० μg/mL साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ पूरक ।
  4. RNase अवरोधक के 4 माइक्रोन के साथ पूरक सेल लाइसिस बफर के 500 μL जोड़ें। लिसिस बफर में ऊतक को फिर से व्यतीपित करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे। ऊतक को धीरे-धीरे लेज़ करने के लिए इंसुलिन सुई का उपयोग करें।
  5. हर 2-3 मिनट में संक्षिप्त भंवर के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊतक क्षरण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि ऊतक लाइसिस के सभी कदम बर्फ पर किए जाते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  7. बर्फ पर एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सुपरनेट स्थानांतरित करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ~ 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  9. बर्फ पर एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सुपरनेट स्थानांतरित करें।
  10. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके टिश्यू में आरएनए एकाग्रता को मापें।
    नोट: यदि प्रयोग में कई नमूने शामिल हैं, तो नमूनों को भिन्नता को कम करने के लिए अतिरिक्त सेल लाइसिस बफर के साथ एक ही एकाग्रता में पतला करें।

5. नमूना लोडिंग और अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन

  1. अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन रोटर और स्विंग बाल्टी को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल करें और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  2. कुल आरएनए इनपुट के रूप में टिश्यू के 20 माइक्रोन रखें।
  3. अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों की दीवारों पर धीरे-धीरे लिस्टे को वितरित करके सुक्रोज ग्रेडिएंट्स के शीर्ष पर नमूने (बराबर मात्रा के साथ 50-300 माइक्रोन आरएनए) लोड करें।
  4. धीरे-धीरे अल्ट्रासेंट्राइज ट्यूब्स को स्विंग बाल्टी में रखें। सुनिश्चित करें कि सभी बिलकुल विपरीत बाल्टी संतुलित हैं।
  5. रोटर पर झूले बाल्टी लोड करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज को 90 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 190,000 x ग्राम (~ 39,000 आरपीएम) पर सेट करें।
  6. अपकेंद्रित्र के बाद धीरे-धीरे ढाल को बर्फ पर रखें।

6. अंश और नमूना संग्रह

नोट: एक घर इकट्ठा आंशिक, रिकॉर्डिंग और संग्रह प्रणाली विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है और ढाल से नमूनेइकट्ठा (चित्रा 3,डिवाइस घटकों को देखें) ।

  1. ट्यूब पियर्सर पर एक खाली अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें और धीरे-धीरे नीचे से सुई के साथ ट्यूब में प्रवेश करें।
  2. यूवी मॉनिटर पर स्विच करें, और डिजिटल सिग्नल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
  3. 60% सुक्रोज चेस समाधान के 25 एमएल के साथ 30 एमएल सिरिंज भरें। धीरे से सिरिंज को इस तरह दबाएं कि चेस समाधान खाली ट्यूब को भरता है और पता लगाने के लिए बेसलाइन सेट करने के लिए 254 एनएम यूवी मॉनिटर के माध्यम से जाता है।
  4. पता लगाने के लिए एक बेसलाइन रजिस्टर करने के लिए यूवी-मॉनिटर पर ऑटो-जीरो दबाें। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर पर प्रेस खेलते हैं।
  5. एक बार सिस्टम एक बेसलाइन स्थापित करता है, सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्डिंग को रोकें और चेस समाधान को वापस लें। सुनिश्चित करें कि कोई अवशिष्ट चेस समाधान प्रणाली में रहता है।
    नोट: पिछले रन से शेष अवशिष्ट सुक्रोज समाधानों को हटाने के लिए RNase-मुक्त पानी के साथ सिस्टम कुल्ला।
  6. ट्यूब पियर्सर के लिए एक नमूना ट्यूब लोड करें। धीरे-धीरे नीचे से सुई के साथ ट्यूब में प्रवेश करें।
  7. सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्डिंग शुरू करें। सिरिंज पंप (25 एमएल की मात्रा के लिए 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर) और पॉलीकुछ अंश एकत्र करने के लिए अंश कलेक्टर शुरू करें। 30 एस के लिए आंशिक सेटिंग्स सेट करें।
    नोट: प्रत्येक रन से पहले, सिरिंज या ट्यूबिंग में कोई हवा बुलबुले धीरे सिरिंज दबाने के लिए पीछा समाधान सुई के माध्यम से लगातार प्रवाह सुनिश्चित करें ।
  8. अंश कलेक्टर का उपयोग करके अंशों को 1.5 एमएल ट्यूब (500 माइक्रोन प्रत्येक) में एकत्र करें।
  9. अंशों को तुरंत संसाधित किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  10. अंश संग्रह के बाद, किसी भी अवशेष सुक्रोज को हटाने के लिए RNase-मुक्त पानी के साथ सिस्टम कुल्ला।

7. आरएनए की निकासी

  1. प्रत्येक अंश में, 10 एनजी लूसिफ़ेरेस एमआरएनए स्पाइक-इन कंट्रोल जोड़ें।
  2. प्रत्येक अंश में ग्वानिडियम हाइड्रोचोलराइड आधारित वाणिज्यिक आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट की तीन मात्रा जोड़ें।
  3. भंवर संक्षेप में 15 एस के लिए ।
  4. 7.2 में उपयोग किए जाने वाले समाधान के साथ संगत आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके आरएनए निकालें।

8. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और रियल टाइम पीसीआर

  1. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की एकाग्रता को मापें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके प्रतिलेखन को रिवर्स करने के लिए विषय आरएनए।
  3. एक उदाहरण के रूप में गपध एमआरएनए के पॉलीसोमल वितरण की जांच करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करें। क्यूपीसीआर को क्यूपीसीआर डिटेक्शन सिस्टम और क्यूपीसीआर मास्टरमिक्स रीएजेंट का उपयोग करके किया गया था, जिसमें निम्नलिखित साइकिलिंग की स्थिति: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, फिर 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 40 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 60 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
  4. प्रवर्धन भूखंडों से थ्रेसहोल्ड चक्र (सीटी) मूल्य प्राप्त करें और इसका उपयोग आवश्यक विधि का उपयोग करके गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए किया जाता है।

9. सुक्रोज रेडिएंट मेकिंग सिस्टम असेंबली

नोट: प्रत्येक घटक को इकट्ठा करने के लिए चरणों का पालन करें (जैसा कि सुक्रोज ढाल निर्माता(चित्रा 1)के तालिका 3में वर्णित है।

  1. आधार ब्रेडबोर्ड (A1) पर दो ऊर्ध्वाधर कोष्ठक (A2) माउंट।
  2. आधार ब्रेडबोर्ड (A1) के लिए रैखिक स्टेज एक्ट्यूएटर माउंट करने के लिए दो स्लिम राइट-एंगल कोष्ठक (B2) का उपयोग करें।
  3. ट्यूब धारक के लिए एक स्टैंड के रूप में ट्यूब धारक आधार ब्रेडबोर्ड (C1) पर इसे ठीक करने के लिए Ø12.7 मिमी एल्यूमीनियम पोस्ट (C2) पर सेटक्रू का उपयोग करें।
  4. पोस्ट (C2) और मिनी-सीरीज ऑप्टिकल पोस्ट (C4) के साथ Ø6 मिमी पोस्ट क्लैंप (C3) के लिए सही कोण Ø1/2 "इकट्ठा करें।
  5. ट्यूब धारक के रूप में एक छोटे से वी-क्लैंप (C5) को जोड़ने के लिए ऑप्टिकल पोस्ट (C4) पर सेटक्रू का उपयोग करें।
  6. ट्यूब होल्डर में एक सेंट्रलाइज ट्यूब लगाएं और एंगल को वर्टिकल बनाने के लिए एडजस्ट करें। ट्यूब की स्थिति को चिह्नित करें और ट्यूब का समर्थन करने के लिए बेस ब्रेडबोर्ड (C1) पर आसन पोस्ट होल्डर (C6) को माउंट करें।
  7. ब्रेडबोर्ड (A1) के दूसरी तरफ, इसे ठीक करने के लिए Ø12.7 मिमी एल्यूमीनियम पोस्ट (D1) के सेटक्रू का उपयोग करें और एक मिनी-सीरीज ऑप्टिकल पोस्ट (D3) को Ø6 मिमी पोस्ट क्लैंप (D2) से सही कोण का उपयोग करके कनेक्ट करें।
  8. लघु वी-क्लैंप (D4) को कुंद-अंत सुई (D5) के साथ पोस्ट (D3) से कनेक्ट करें। सुई ऊर्ध्वाधर सेट करने के लिए क्लैंप के कोण को समायोजित करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए पोस्ट की लंबाई को समायोजित करें कि सुई अपकेंद्रित्र ट्यूब से मिलती है।
  9. एक्ट्यूएटर (बी 1) को स्टेपर मोटर ड्राइवर (E1) से कनेक्ट करें और ऐक्टिवेटर को नियंत्रित करने के लिए यूएनओ आर3 कंट्रोलर बोर्ड और यूएनओ स्टार्टर किट (E2) से जॉयस्टिक मॉड्यूल का उपयोग करें। मोटर को अलग से चलाने के लिए पावर अडैप्टर (जैसे, 9-24 वी एसी/डीसी एडजस्टेबल पावर एडाप्टर) का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  10. रेडिएंट बनाने वाले स्टेशन के बगल में सिरिंज पंप (एफ) रखें और सिरिंज को सुई से कनेक्ट करें।
  11. जॉयस्टिक का उपयोग करके ट्यूब धारक चरण को ऊपर और नीचे नियंत्रित करें।
घटक समाचार
B1 लीनियर स्टेज एक्ट्यूएटर
E1 स्टेपर मोटर ड्राइवर
E2 यूएनओ परियोजना सुपर स्टार्टर किट
A1 ब्रेडबोर्ड
A2 वर्टिकल ब्रैकेट
B2 स्लिम राइट-एंगल ब्रैकेट
C1 मिनी-सीरीज ब्रेडबोर्ड
C5 छोटे वी-क्लैंप
D4 लघु वी क्लैंप
C2 Ø12.7 मिमी एल्यूमीनियम पोस्ट
C4, D3 मिनी-सीरीज ऑप्टिकल पोस्ट
D1 Ø12.7 मिमी एल्यूमीनियम पोस्ट
C3, D2 राइट-एंगल Ø1/2 "Ø6 मिमी पोस्ट क्लैंप के लिए"
C6 मिनी श्रृंखला आसन पोस्ट धारक आधार
D5 कुंद अंत सुई
स्‍त्री-विषयक सिरिंज पंप

तालिका 3: ग्रेडिएंट बनाने प्रणाली घटक।

10. आंशिक और पता लगाने प्रणाली विधानसभा(चित्रा 2)।

  1. ट्यूब पियर्सर पर यूवी मॉनिटर के प्रकाशिकी मॉड्यूल माउंट करने के लिए एक नियमित रूप से गोल जबड़े बुर्ज क्लैंप का उपयोग करें। ट्यूब पियर्सर के कनेक्टर के लिए ट्यूबिंग (1 सेमी लंबा और 0.56 मिमी आंतरिक व्यास) का एक छोर और प्रकाशिकी मॉड्यूल के बंदरगाह में तरल पदार्थ के दूसरे छोर को संलग्न करें। फ्लूइड आउट पोर्ट को फ्रैक्शनेटर से कनेक्ट करें।
  2. निर्माता के मैनुअल के अनुसार यूवी मॉनिटर की नियंत्रण इकाई के साथ प्रकाशिकी मॉड्यूल कनेक्ट करें।
  3. निर्माता के मैनुअल के अनुसार, सिग्नल आउटपुट सॉकेट को जमीन पर डिजिटल कनवर्टर और एनालॉग इनपुट कनेक्शन से जोड़ने के लिए ब्रेकआउट केबल का उपयोग करें।
  4. नियमित यूएसबी केबल का उपयोग करके डिजिटल कनवर्टर को लैपटॉप से कनेक्ट करें, और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिवर्तित डिजिटल संकेतों को रिकॉर्ड करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक प्रदर्शन के रूप में, 75 माइक्रोन आरएनए (8 भ्रूण से पूल) युक्त कॉर्टिकल लिसेट को सुक्रोज ढाल द्वारा 12 अंशों में अलग किया गया था। 254 एनएम पर यूवी अवशोषण की चोटियों ने 40S सबयूनिट, 60S सबयूनिट, 80S मोनोसोम और पॉलीसोम्स(चित्रा 4A)वाले अंशों की पहचान की। बड़े राइबोसोमल सबयूनिट के लिए पश्चिमी दाग द्वारा अंशों का विश्लेषण, Rpl10 ने 60 के दशक के सबयूनिट (अंश 3), मोनोसोम (अंश 4) और पॉलीसोम्स (अंश 5-12)(चित्रा 4B)में अपनी उपस्थिति दिखाई। इसके विपरीत, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन गप्प और सीएसडी1 राइबोसोम्स से जुड़े नहीं थे, लेकिन मुफ्त आरएनए (अंश 1)(चित्रा 4B)वाले अंशों में समृद्ध थे। विभिन्न अंशों में प्रोटीन के पृथक्करण के अनुरूप, हमने पाया कि गध और sox2 mRNAs भारी पॉलीसोम्स (अंशों 7-12 में तीन से अधिक राइबोसोम) वाले अंशों में अत्यधिक समृद्ध थे, यह सुझाव देते हुए कि गध और sox2 mRNAs का विकासशील प्रांतस्था(चित्रा 4C,D)में कुशलतापूर्वक अनुवाद किया जाता है। इसके विपरीत, rpl7 और rpl34 mRNAs मोनोसोम युक्त अंश में समृद्ध थे, दमित अनुवाद का सुझाव(चित्रा 4E,एफ)16। इन परिणामों ने हमारे पॉलीसोम फ्रैक्शन प्रोटोकॉल को मान्य किया।

Figure 1
चित्रा 1:सुक्रोज ढाल तैयारी के लिए सेटअप। (एक)घर में इकट्ठे सुक्रोज ढाल निर्माता जिसमें एक रैखिक स्टेज एक्ट्यूएटर, मोटराइज्ड स्टेज पर एक ट्यूब होल्डर, एक स्टेज कंट्रोलर सेट, एक मेटल कुंद-एंड सुई एक सुई धारक पर घुड़सवार, और सुई से जुड़े सिरिंज के साथ एक स्वचालित सिरिंज पंप (टेबल 3देखें) । (ख)सुक्रोज रेडिएंट तैयार करने के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब को ट्यूब होल्डर में रखा जाता है । सुक्रोज समाधान एक सिरिंज पंप का उपयोग कर कुंद अंत सुई के माध्यम से तिरस्कृत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:विकास माउस भ्रूण से कॉर्टिकल ऊतकों का विच्छेदन। (ए)छवि 21G-23G सुइयों का उपयोग करके ø 6 सेमी प्लेट में तय किए गए E12.5 सीडी1 भ्रूण को दिखाती है। (ख)त्वचा, खोपड़ी और मेनिंग (सफेद धराशायी रेखाओं के साथ चिह्नित) को हटाने के बाद विच्छेदित प्रांतस्था दिखाने वाली छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:आंशिक, रिकॉर्डिंग और नमूना एकत्र करने के लिए सेटअप। घर में इकट्ठे अंश, रिकॉर्डिंग और नमूना संग्रह प्रणाली को दर्शाती छवि जिसमें एक स्वचालित सिरिंज पंप, एक ट्यूब पियर्सर, एक अंश कलेक्टर और यूवी अवशोषण की सतत निगरानी के लिए लैपटॉप से जुड़े डिजिटल कनवर्टर के साथ एक यूवी मॉनिटर शामिल है। डेटा अधिग्रहण वाणिज्यिक डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा संभाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:विकासशील माउस कॉर्टेक्स का पॉलीसोम प्रोफाइलिंग विश्लेषण। (ए)यूवी अवशोषण जिसमें मुक्त आरएनए (अंश 1), 40S सबयूनिट (अंश 2), 60S सबयूनिट (अंश 3), 80S मोनोसोम (अंश 4) और पॉलीसोम्स (अंश 5-12) शामिल हैं। 8 भ्रूण से पूल किए गए 75 माइक्रोन कुल आरएनए का उपयोग किया गया था। (ख)अंशों में गप्प, आरपीएल10 और सीएसडी1 प्रोटीन के वितरण को दर्शाने वाले पश्चिमी दाग । क्यूपीसीआर विश्लेषण में अंशों में गपध (सी), सोक्स2 (डी), आरपीएल7 (ई)और आरपीएल34 (एफ)एमआरएन का वितरण दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली और शक्तिशाली तकनीक है जो एकल जीन और जीनोम-वाइड दोनों स्तरों पर ट्रांसलेशनल स्थिति का आकलन करने के लिए14 है। इस रिपोर्ट में, हम विकासशील माउस कॉर्टेक्स का विश्लेषण करने के लिए घर-इकट्ठे मंच और इसके आवेदन का उपयोग करके पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह लागत प्रभावी मंच उच्च संवेदनशीलता के साथ मजबूत, प्रजनन योग्य सुक्रोज ग्रेडिएंट और पॉलीसोम प्रोफाइलिंग को इकट्ठा करना और उत्पन्न करना आसान है।

यह ध्यान देने योग्य है कि प्रजनन योग्य पॉलीसोम प्रोफाइलिंगपरिणामप्राप्त करने के लिए सुसंगत और अच्छी गुणवत्ता वाले सुक्रोज ग्रेडिएंट की तैयारी महत्वपूर्ण है । ढाल की तैयारी के दौरान 10-50% सुक्रोज समाधानों की मात्रा में परिवर्तन पॉलीसोम चोटियों के बदलाव और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में परिणामों की असंगतता का कारण बन सकता है। इसके अलावा, प्रविष्टि और सुई को हटाने के दौरान ढाल को परेशान करने से ढाल की तैयारी की विसंगति में योगदान हो सकता है। अन्य दृष्टिकोणों और वाणिज्यिक उपकरणों की तुलना में, हमारे घर में बने ढाल बनाने की प्रणाली ने तैयारी के दौरान ढाल की अशांति को कम करने के लिए एक मोटरचालित चरण का उपयोग किया और सुक्रोज समाधानों को सही ढंग से वितरित करने के लिए एक सिरिंज पंप, जो ढाल की तैयारी के लिए एक सस्ता और सरल समाधान प्रदान करता है।

विकासशील माउस कॉर्टेक्स के लिए यहां मौजूद पॉलीसोम प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म और प्रोटोकॉल को लागू करते हुए, हमने पाया कि राइबोसोमल प्रोटीन आरपीएल10 और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन गपध और सीएसडी1 सही अंशों में वितरित किए गए थे। इसके अलावा, अत्यधिक अनुवादित गध और सोक्स 2 एमआरएएनए को पॉलीसोमल अंशों में समृद्ध किया गया था, जबकि अनुवादपूर्वक दमित आरपीएल34 और आरपीएल 7 mRNAs ने पॉलीसोम्स में कम समृद्धता दिखाई, जो हमारे मंच और प्रोटोकॉल को मान्य करती है। इसी तरह के दृष्टिकोण के साथ, विकासशील प्रांतस्था में अन्य जीनों की अनुवादात्मक स्थिति वास्तविक समय पीसीआर द्वारा व्यक्तिगत रूप से निर्धारित की जा सकती है। ध्यान दें, जीनोम-व्यापी स्तर पर विकासशील मस्तिष्क में अनुवादीय स्थिति का विश्लेषण करने के लिए पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग किया गया है। इस संबंध में, पॉलीसोम युक्त अंशों को जोड़ा जा सकता है और निकाले गए आरएनए का गहन अनुक्रमण का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। यहां मौजूद मंच और प्रोटोकॉल को अन्य सेल प्रकारों और ऊतकों का उपयोग करके अनुवादात्मक अध्ययनों के अनुरूप अनुकूलित और आगे अनुकूलित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक स्थितियों (उदाहरण के लिए, <50 माइक्रोन आरएनए) द्वारा सीमित कॉर्टिकल ऊतकों की उपलब्धता को ध्यान में रखते हुए, प्रोटोकॉल का अतिरिक्त अनुकूलन प्रयोगों की दक्षता और प्रजनन क्षमता में और वृद्धि प्रदान कर सकता है।

जबकि पॉलीसोम प्रोफाइलिंग विकासशील कॉर्टेक्स में mRNAs की अनुवादात्मक स्थिति में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, बाद में विकास के चरणों में विशिष्ट सेल प्रकारों का विश्लेषण करने की सीमाएं हैं, जब विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकार मौजूद होते हैं। इस प्रश्न का समाधान करने के लिए, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग को ऊतक विशिष्ट प्रमोटर11के तहत व्यक्त किए गए एपिटोप टैग किए गए रिबोसोमल प्रोटीन के पुल-डाउन द्वारा जाल के साथ एकीकृत किया जा सकता है।

अंत में, जिस मंच और प्रोटोकॉल को हम यहां सुक्रोज रेडिएंट बनाने और अंश के लिए रिपोर्ट करते हैं, वह मस्तिष्क के विकास के साथ-साथ अन्य जैविक संदर्भों के संदर्भ में पॉलीसोम प्रोफाइलिंग प्रयोगों का किफायती समाधान प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एनएसईआरसी डिस्कवरी ग्रांट (आरजीपिन/04246-2018 से जीवाई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जीवाई एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी है । एस. के. को मितिक्स ग्लोबलिंक ग्रेजुएट फेलोशिप और अचरी ग्रेजुएट स्टूडेंट स्कॉलरशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL RNA free microtubes Axygen MCT-150-C
10 cm dish Greiner-Bio 664160
1M MgCl2 Invitrogen AM9530G
21-23G needle BD 305193
2M KCl Invitrogen AM8640G
30 mL syringe BD 302832
Blunt end needle VWR 20068-781
Breadboard Thorlabs MB2530/M
Bromophenol blue Sigma 115-39-9
CD1 mouse Charles River Laboratory
Curved tip forceps Sigma #Z168785
Cycloheximide Sigma 66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ Measurement Computing
Digital converter Measurement Computing USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit Zymo R2070
Dithiothreitol (DTT) Bio-basic 12-03-3483
DMSO Bioshop 67-68-5
Dumont No.5 forceps Sigma #F6521
Fraction collector Bio-Rad Model 2110
HBSS Wisent 311-513-CL
Linear stage actuator Rattmmotor CBX1605-100A
Luciferase control RNA Promega L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit Themo Fisher M1681
Miniature V-clamp Thorlabs VH1/M
Mini-series breadboard Thorlabs MSB7515/M
Mini-series optical post Thorlabs MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base Thorlabs MBA1
NaCl Bio-basic 7647-14-5
Neurobasal media Gibco 21103-049
Ø12.7 mm aluminum post Thorlabs TRA150/M
Parafilm Bemis PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix Quanta Bio CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Puromycin Bioshop 58-58-2
Right-angle clamp Thorlabs RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp Thorlabs RA90TR/M
Rnase AWAY Molecular BioProducts 7002
RNase free tips Frogga Bio FT10, FT200, FT1000
RNase free water Wisent 809-115-CL
RNasin Promega N2111
Slim right-angle bracket Thorlabs AB90B/M
Small V-clamp Thorlabs VC1/M
Sodium deoxycholate Sigma 302-95-4
Stepper motor driver SongHe TB6600
Sucrose Bioshop 57501
SW 41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Syringe pump Harvard Apparatus 70-4500
Triton-X-100 Bio-basic 9002-93-1
Trizol Thermofisher Scientific 15596018
Tube piercer Brandel BR-184
Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027
UNO project super starter kit Elegoo EL-KIT-003
UV monitor Bio-Rad EM-1 Econo
Vertical bracket Thorlabs VB01A/M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  3. Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
  4. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
  5. Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
  6. Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
  7. Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
  8. Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
  9. Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
  10. Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
  11. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  12. Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
  13. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
  14. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
  15. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
  16. Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
  17. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 171
पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में अनुवाद का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. … More

Kedia, S., Erickson, S. L., Yang, G. Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling. J. Vis. Exp. (171), e62088, doi:10.3791/62088 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter