Summary
포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.
Abstract
포유류 뇌의 적절한 개발은 신경 줄기 세포 증식 및 다른 신경 세포 유형으로 분화의 미세한 균형에 의존한다. 이 균형은 전사, 전사 후 및 번역을 포함하여 여러 수준에서 미세 조정되는 유전자 발현에 의해 엄격하게 제어됩니다. 이와 관련하여, 증거의 성장 몸은 신경 줄기 세포 운명 결정 조정에 번역 규제의 중요한 역할을 강조. 다일부 분획은 글로벌 및 개별 유전자 수준에서 mRNA 번역 상태의 평가를 위한 강력한 도구입니다. 여기에서, 우리는 발전마우스 대뇌 피질에서 세포의 번역 효율성을 평가하기 위하여 사내 polysome 프로파일링 파이프라인을 제시합니다. 우리는 자당 그라데이션 준비, 조직 용해, 초원심 분리 및 mRNA 번역 상태의 분획 기반 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
포유류 뇌의 발달 동안 신경 줄기 세포가 증식하고 분화하여 뉴런과 신경교1,2를 생성한다. 이 과정의 섭동은 많은 신경 발달 장애3,4에서볼 수 있듯이 뇌 구조 및 기능의 변경으로 이어질 수 있습니다. 신경 줄기 세포의 적절한 행동은 특정 유전자5의오케스트레이션된 발현을 요구한다. 이들 유전자의 후성유전학 및 전사적 대조가 집중적으로 연구되고 있는 반면, 최근 연구 결과에 따르면 다른 수준에서 유전자 조절은 신경줄기 세포 증식 및 분화6,7,8,9,10의조정에 기여한다는 것을 시사한다. 따라서, 번역 제어 프로그램을 해결 크게 신경 줄기 세포 운명 결정 및 뇌 개발의 기본 메커니즘의 우리의 이해를 향상 시킬 것 이다.
다른 강점을 가진 3개의 주요 기술은 리보솜 프로파일링, 리보솜 친화성 정화(TRAP) 및 다일부 프로파일링을 번역하는 것을 포함하여 mRNA의 번역 상태를 평가하기 위하여 널리 적용되었습니다. 리보솜 프로파일링은 RNA 시퀀싱을 사용하여 리보솜 보호 mRNA 단편을 결정하며, 각 성적증명서에 리보솜을 번역하는 리보솜의 수와 위치를 전 세계적으로 분석하여 성적증명서풍부(11)와비교하여 번역률을 간접적으로 추론할 수 있다. TRAP은 에피토프 태그리보솜 단백질을 활용하여 리보솜 바운드 mRNAs12를포획한다. 태그가 지정된 리보실 단백질이 유전적 접근법을 사용하여 특정 세포 유형으로 발현될 수 있다는 점을 감안할 때 TRAP은 세포 유형별 방식으로 번역을 분석할 수 있게 한다. 이에 비해, 자당 밀도 그라데이션 분획을 사용하여 리보솜(무거운 다각형)에 의해 능동적으로 번역되는 부분으로부터 자유롭고 제대로 번역되지 않은 부분(가벼운 모노좀)을 분리하는 다일부 프로파일링은 mRNA13에대한 리보솜 밀도를 직접 측정한다. 이 기술이 제공하는 한 가지 장점은 관심있는 특정 mRNA의 번역뿐만 아니라 게놈 전체 트랜스 라토메 분석14의번역을 연구하는 다재 다능함입니다.
이 논문에서, 우리는 개발 마우스 대뇌 피질을 분석하기 위해 다성 프로파일링의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 당사는 홈어셈블 시스템을 사용하여 자당 밀도 그라데이션을 준비하고 다운스트림 응용 프로그램에 대한 분수를 수집합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 다른 유형의 조직 및 유기체를 분석하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 사용은 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 감독되었습니다. 실험에 사용되는 CD1 마우스는 상용 벤더로부터 구입하였다.
1. 솔루션 준비
참고 RNA 분해를 방지하기 위해, 작업 벤치 및 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 장비를 스프레이합니다. RNase 가 없는 팁은 실험에 사용됩니다. 모든 솔루션은 RNase가 없는 물로 준비됩니다.
- DMSO에서 사이클로헨증 재고 용액(100 mg/mL)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
- RNase 가 없는 물에 75.3 g의 자당을 추가하고 부피를 100 mL로 토핑하여 2.2 M 자당 스톡 솔루션을 준비하십시오 (~16 그라데이션 준비용). 용액은 장기 저장을 위해 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.
- 10x 염액(M NaCl 1개, 200m Tris-HCl, pH 7.5; 50m MgCl2)을준비한다.
- 자당 30g, 소금 용액 5mL를 함유한 60%(w/v) 자당 추적 용액을 준비하고 RNase 가 없는 물로 최대 50mL의 부피를 얹습니다.
- 선택적으로, 메모페놀 블루 또는 약 5 μL의 1% 브로모페놀 블루를 RNase 없는 물에 추가하여 추격 용액에 넣습니다. 1.6. 4 °C에서 솔루션을 저장합니다.
2. 자당 그라데이션 준비
참고: 자당 그라데이션을 준비하는 정확도는 일관되고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.
- 6개의 10-50% 자당 그라데이션을 준비하려면 표 1과같이 2.2M 자당 용액을 희석한다.
| 수크로오스 솔루션 | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M 자당 | 2 mL | 4 mL | 6 mL | 8 mL | 10mL |
| 10X 염액 | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL | 1.5 mL |
| 사이클로헤시미드 | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| 물 | 11.5 mL | 9.5 mL | 7.5 mL | 5.5 mL | 3.5 mL |
| 총 볼륨 | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL |
표 1: 자당 그라데이션의 준비를 위한 자당 희석.
참고: 항상 2개의 배수로 자당 그라데이션을 준비하여 초원심 분리 시 무게의 균형을 유지합니다.
- RNase 오염 제거 용액으로 금속 무딘 엔드 바늘을 닦아냅니다. RNase가 없는 물을 사용하여 초원심분리기 튜브, 튜브 및 주사기를 간략하게 헹구십시오. 남은 물이 자당 농도를 변화시킬 수 있기 때문에 튜브에 물 방울이 남아 있지 않을 정도로 튜브를 공기 건조시하십시오.
- 금속 바늘을 클램프 홀더와 원심분리관에 전동 스테이지에 놓습니다. 그라데이션을 일관되게 준비하기 위해, 초원심분리기 튜브와 주사기 펌프를 보유하기 위해 전동 단계를 포함하는 홈 조립 시스템이 사용되었습니다(그림1,자세한 내용은 9단계 참조).
- 30mL 주사기를 10% 자당10%의 ~16mL로 채우고(6개의 그라데이션에 충분), 주사기 펌프에 놓고 바늘에 연결합니다. 주사기, 튜브 및 바늘에 기포가 없는지 확인하십시오. 바늘에서 팁을 닦아 잔류 용액을 제거합니다.
- 바늘 끝이 하단에 튜브의 중심에 닿을 수 있도록 전동 스테이지를 위로 이동합니다.
- 주사기 펌프를 2.3mL의 부피에 대해 2mL/분의 유량으로 설정합니다.
- 10% 자당 용액의 2.3mL을 분배한 후, 전동 스테이지를 아래로 이동하고 6개의 그라데이션 모두에 대한 공정을 반복합니다.
- 반복 단계 2.4-2.7 튜브의 바닥에 20 % 자당 솔루션을 추가하고 30 %, 40 % 및 50 % 자당 솔루션이 유사하게 뒤따릅니다.
- 그라데이션을 준비한 후 파라핀 필름을 사용하여 초원심분리기 튜브를 밀봉하십시오.
- 튜브를 4°C로 하룻밤 동안 두어 서로 다른 자당 층이 함께 확산되어 연속그라데이션을 제공합니다.
3. 조직 해부
참고: 임신한 마우스는 5%의 이소플루란을 가진 마취에 선행된 자궁 경관 탈구에 의해 안락사되었습니다.
- 12일째에 CD1 마우스 배아를 수집하거나 필요에 따라 다른 시점을 수집하고, 세포 생존가능성을 유지하기 위해 얼음에 얼음처럼 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 함유한 Ø 10cm 플레이트에 배아를 놓습니다.
- 해부 범위하에서, 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 Ø 6cm 판으로 1개의 태아를 전송합니다.
- 21-23 G 바늘을 사용하여 약 45° 각도로 눈을 관통하여 머리의 위치를 고정하고 힘을 적용하여 바늘이 플레이트에 고정되었는지 확인합니다(도2A).
- 5번 포셉을 사용하여 가운데에서 측면으로 피부와 두개골을 제거합니다.
- 후각 전구를 잘라 서 수막을 제거 하려면 집게를 사용 하 여 피질 조직을 노출.3.6.곡면 집게를 사용 하 여 얼음에 신경 물질 매체의 2-3 mL로 피질 조직을 잘라(그림 2B). 필요에 따라 다른 태아에서 피질 조직을 풀. 8-10 개의 배아에서 조직은 일반적으로 ~200 μg 총 RNA를 제공합니다.
4. 셀 리시스
- 조직 해부의 날에, 표 2에설명된 대로 신선한 세포 리시스 버퍼를 준비한다.
| 용액 | 최종 농도 | 음량 |
| 트리스-HCl (pH 7.5) | 20mM | 100 μL |
| KCl | 100mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| 트리톤 X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| 디옥시콜레이트 나트륨 | 0.5% (/v) | 500 μL |
| 디티오스레이톨 (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| 사이클로헤시미드 | 100 μg/mL | 5 μL |
| RNase 무료 물 | 최대 5mL의 탑 | |
| 합계 | 5 mL | 5 mL |
표 2: 다형성 용해 버퍼 준비.
참고: 프로테아제와 인산염 억제제를 곁들인 용해 완충제를 보충합니다.
- 100 μg/mL의 최종 농도에 해부 된 조직을 가진 신경 물질 배지에 사이클로헨시미드를 추가하고 10 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 사이클로헤시미드는 번역 신장을 차단하므로 리보솜런오프 15를방지합니다.
- 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안 4°C에서 5분 동안, 상체를 폐기합니다.
- 100 μg/mL 사이클로헤시미드로 보충된 얼음-차가운 인산염 완충식염(PBS)으로 조직을 두 번 세척합니다.
- RNase 억제제 4μL로 보충된 셀 리시스 버퍼 500 μL을 추가합니다. 파이펫은 분해 완충제에서 조직을 다시 중단합니다. 인슐린 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 lyse하십시오.
- 2-3분마다 간단한 소용돌이로 10분 동안 얼음에 티슈를 배양합니다.
참고: 조직 분해를 방지하기 위해 모든 단계의 조직 리시스가 얼음 위에 수행되도록 하십시오. - 4°C에서 5분 동안 2,000 x g의 원심분리기.
- 얼음에 새로운 원심 분리튜브에 상체를 전송합니다.
- 4°C에서 5분 동안 ~13,000 x g의 원심분리기.
- 얼음에 새로운 원심 분리튜브에 상체를 전송합니다.
- UV-Vis 분광광계를 사용하여 조직 용액의 RNA 농도를 측정합니다.
참고: 여러 샘플이 실험에 포함된 경우 변형을 최소화하기 위해 추가 셀 리시스 버퍼로 샘플을 동일한 농도로 희석합니다.
5. 샘플 로딩 및 초원심 분리
- 4°C에서 초원심분리로및 스윙 버킷을 미리 식히고 초원심분리기의 온도를 4°C로 설정한다.
- 조직의 20 μL을 총 RNA 입력으로 보관하십시오.
- 수크로오스 그라데이션 의 상단에 적재 샘플(50-300 μg RNA)을 초음파 심분리기 튜브의 벽에 천천히 분배합니다.
- 울트라 센드리후어 튜브를 스윙 버킷에 부드럽게 놓습니다. 정반대의 모든 버킷이 균형을 이루도록 합니다.
- 로터에 스윙 버킷을 로드합니다. 초원심분리기를 4°C에서 190,000xg(~39,000rpm)로 90분 간 설정합니다.
- 원심 분리 후 그라데이션을 얼음위에 부드럽게 놓습니다.
6. 분획 및 샘플 수집
참고: 홈 조립 분획, 기록 및 수집 시스템은 그라데이션에서 샘플을 분석하고 수집하는 데 사용됩니다(그림3,장치 구성 요소 참조).
- 튜브 피어서에 빈 초원심분리기 튜브를 놓고 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.
- UV 모니터를 켜고 디지털 신호 녹음 소프트웨어를 엽니다.
- 30mL 주사기를 60% 자당 추적 용액의 25mL로 채웁니다. 체이스 용액이 빈 튜브를 채우고 254 nm UV 모니터를 통과하여 검출을 위한 기준선을 설정하도록 주사기를 부드럽게 누릅니다.
- UV 모니터에서 자동 0을 눌러 감지 기준을 등록합니다. 녹화를 시작하려면 소프트웨어에서 재생을 누릅니다.
- 시스템이 기준선을 설정하면 소프트웨어에서 레코딩을 일시 중지하고 추적 솔루션을 철회합니다. 시스템에 잔류 추적 솔루션이 남아 있지 않은지 확인합니다.
참고: RNase 가 없는 물로 시스템을 헹구어 이전 실행에서 남은 잔류 자당 용액을 제거합니다. - 하나의 샘플 튜브를 튜브 피어서에 로드합니다. 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.
- 소프트웨어에서 녹음을 시작합니다. 주사기 펌프(25mL의 부피의 경우 1mL/분의 유량)와 분획 수집기를 시작하여 다일부 분획을 수집합니다. 분수기 설정을 30초로 설정합니다.
참고: 각 실행 전에 주사기를 부드럽게 눌러 주사기나 튜브에 기포가 없는지 확인하여 체이스 용액이 바늘을 통해 지속적으로 흐르도록 합니다. - 분획 수집기는 분획 수집기(각 500μL)로 분획을 수집합니다.
- 분획은 즉시 처리되거나 -80°C로 저장할 수 있습니다.
- 분수 수집 후, RNase가없는 물로 시스템을 헹구어 남은 자당을 제거합니다.
7. RNA 추출
- 각 분수에, 루시파라제 mRNA 스파이크 인 컨트롤의 10 ng를 추가합니다.
- 각 분획에 3권의 구니듐 하이드로콜라이드 기반 상업용 RNA 격리 시약을 추가합니다.
- 15 초 동안 잠시 소용돌이.
- 7.2에 사용된 용액과 호환되는 RNA 추출 키트를 사용하여 RNA를 추출한다.
8. 역 전사 및 실시간 PCR
- UV-Vis 분광광계를 사용하여 RNA의 농도를 측정합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따르면, cDNA 합성 키트를 사용하여 전사를 반전 하는 대상 RNA.
- 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 gapdh mRNA의 다각체 분포를 예로 들 수 있습니다. qPCR은 qPCR 검출 시스템과 qPCR 마스터믹스 시약을 사용하여 수행되었으며, 다음 사이클링 조건과 함께 10분 동안 95°C, 15s에 대한 95°C의 40사이클, 30대 60°C, 40대 72°C, 60s에 95°C를 기록했다.
- 증폭 플롯에서 임계값 주기(Ct) 값을 가져오고 ΔΔCt 방법을 사용하여 접이식 변화를 계산하는 데 사용됩니다.
9. 수크로오스 그라데이션 만들기 시스템 조립
참고: 자당 그라데이션메이커(그림 1)의각 구성 요소(표 3에설명된 대로)를 조립하는 단계를 따릅니다.
- 기본 브레드보드(A1)에 두 개의 수직 브래킷(A2)을 장착합니다.
- 두 개의 슬림한 직각 브래킷(B2)을 사용하여 선형 스테이지 액추에이터를 기본 브레드보드(A1)에 장착합니다.
- Ø12.7 mm 알루미늄 포스트(C2)의 세트크루를 사용하여 튜브 홀더의 스탠드로 튜브 홀더 베이스 브레드보드(C1)에 고정합니다.
- 직각 Ø1/2"를 Ø6mm 포스트 클램프(C3)에 포스트(C2) 및 미니 시리즈 광학 포스트(C4)로 조립합니다.
- 광학 포스트(C4)의 세트크루를 사용하여 작은 V 클램프(C5)를 튜브 홀더로 연결합니다.
- 원심분리기 튜브를 튜브 홀더에 넣고 각도를 조정하여 수직으로 만듭니다. 튜브의 위치를 표시하고 튜브를 지원하기 위해 기본 브레드 보드 (C1)에 받침대 포스트 홀더 (C6)를 장착합니다.
- 브레드보드(A1)의 반대편에는 Ø12.7mm 알루미늄 포스트(D1)의 세트크루를 사용하여 직각 Ø1/2"를 Ø6 mm 포스트 클램프(D2)에 사용하여 미니 시리즈 광학 포스트(D3)를 연결합니다.
- 미니어처 V 클램프(D4)를 무딘 엔드 바늘(D5)과 연결하여 포스트(D3)에 연결합니다. 클램프의 각도를 조정하여 바늘을 수직으로 설정하고, 바늘이 원심분리기 튜브를 충족하는지 확인하기 위해 포스트 의 길이를 조정한다.
- 액추에이터(B1)를 스테퍼 모터 드라이버(E1)에 연결하고 UNO 스타터 키트(E2)의 UNO R3 컨트롤러 보드및 조이스틱 모듈을 사용하여 액추에이터를 제어합니다. 전원 어댑터(예: 9-24 V AC/DC 조절 가능 전원 어댑터)를 사용하여 모터를 별도로 구동할 수 있습니다.
- 그라데이션 메이킹 스테이션 옆에 주사기 펌프(F)를 놓고 주사기를 바늘과 연결합니다.
- 조이스틱을 사용하여 튜브 홀더 스테이지를 위아래로 제어합니다.
| 구성 요소 | 항목 |
| B1 | 선형 단계 액추에이터 |
| E1 | 스테퍼 모터 드라이버 |
| E2 | UNO 프로젝트 슈퍼 스타터 키트 |
| A1 | 브레드보드 |
| A2 | 수직 브래킷 |
| B2 | 슬림한 직각 브래킷 |
| C1 | 미니 시리즈 브레드보드 |
| C5 | 소형 V 클램프 |
| D4 | 미니어처 V 클램프 |
| C2 | Ø12.7 mm 알루미늄 포스트 |
| C4, D3 | 미니 시리즈 광학 포스트 |
| D1 | Ø12.7 mm 알루미늄 포스트 |
| C3, D2 | 직각 Ø1/2"~ Ø6 mm 포스트 클램프 |
| C6 | 미니 시리즈 받침대 포스트 홀더 베이스 |
| D5 | 무딘 엔드 바늘 |
| F | 주사기 펌프 |
표 3: 그라데이션 만들기 시스템 구성 요소.
10. 시스템 어셈블리를 분수 및 감지(그림 2).
- 일반 둥근 턱 버렛 클램프를 사용하여 튜브 피어서에 UV 모니터의 광학 모듈을 장착합니다. 튜브의 한쪽 끝(길이 1cm 및 0.56mm 내부 직경)을 튜브 피어서의 커넥터에 연결하고 다른 쪽 끝은 광학 모듈의 유체 인 포트에 부착합니다. 유체 아웃 포트를 분수기에 연결합니다.
- 제조 업체의 설명서에 따라 UV 모니터의 제어 장치와 광학 모듈을 연결합니다.
- 제조업체매뉴얼에 따르면 브레이크아웃 케이블을 사용하여 신호 출력 소켓을 지상의 디지털 컨버터및 아날로그 입력 연결에 연결합니다.
- 일반 USB 케이블을 사용하여 디지털 컨버터를 랩톱에 연결하고 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 변환된 디지털 신호를 기록합니다.
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Representative Results
데모로서, 75 μg RNA를 포함하는 피질 용액(8개의 배아로부터 풀링)은 자당 그라데이션에 의해 12개의 분획으로 분리되었다. 254nm에서 UV 흡광도의 피크는 40S 서브유닛, 60S 서브유닛, 80S 단조및 다일부(도4A)를포함하는 분획을 확인하였다. 큰 리보솜 서브유닛에 대한 서쪽 블롯에 의한 분획의 분석은, Rpl10은 60S 하위 유닛(분획 3), 단음(분수 4) 및 다일부(분획 5-12)(도4B)에서그 존재를 보였다. 대조적으로, 세포질 단백질 Gapdh 및 Csde1은 리보솜과 연관되지 않았지만 자유 RNA (분획 1)를 포함하는 분수에서 농축되었다(도 4B). 다른 분획에서 단백질의 분리와 일치, 우리는 gapdh와 sox2 mRNAs가 높은 무거운 폴리좀을 포함하는 분획에서 풍부했다는 것을 발견 (분획에서 3 개 이상의 리보솜 이상 7-12), gapdh및 sox2 mRNAs는 개발 피질에서 효율적으로 번역되는 것을 시사(도 4C,D). 대조적으로, rpl7 및 rpl34 mRNAs는 단량체를 포함하는 분획에서 풍부하게 되었다, 억압된 번역을 건의하는(도 4E,F)16. 이러한 결과는 다일부 분별 프로토콜의 유효성을 검사했습니다.
도 1: 자당 그라데이션 준비를 위한 설정. (A)선형 스테이지 액추에이터, 전동 단계의 튜브 홀더, 스테이지 컨트롤러 세트, 바늘 홀더에 장착된 금속 무딘 엔드 바늘, 바늘에 연결된 주사기가 장착된 자동 주사기 펌프로 구성된 홈 조립 자당 분해분해소(표 3참조). (B)자당그라데이션을 준비하기 위해 초원심분리기 튜브를 튜브 홀더에 배치한다. Sucrose 용액은 주사기 펌프를 사용하여 무딘 엔드 바늘을 통해 분배됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 발달 마우스 배아로부터 피질 조직의 해부. (A)21G-23G 바늘을 사용하여 Ø 6cm 플레이트에 고정된 E12.5 CD1 배아를 보여주는 영상. (B)피부, 두개골 및 수막제거 후 해부된 피질을 보여주는 이미지(흰색 파선표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분획, 기록 및 샘플 수집을 위한 설정. 자동 주사기 펌프, 튜브 피어서, 분수 수집기 및 UV 변환기가 있는 UV 모니터로 구성된 홈 조립 분획, 기록 및 샘플 수집 시스템을 묘사한 이미지는 UV 흡광도의 지속적인 모니터링을 위해 노트북에 연결된 디지털 컨버터를 장착합니다. 데이터 수집은 상용 데이터 수집 소프트웨어에 의해 처리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 개발 마우스 피질의 다일부 프로파일링 분석. (A)UV 흡광도는 자유 RNA(분획 1), 40S 서브유닛(분획 2), 60S 하위 유닛(분수 3), 80S 단종(분수 4) 및 폴리좀(분획 5-12)을 포함하는 분획을 나타낸다. 8개의 배아로부터 풀로 풀려진 75μg 총 RNA가 사용되었다. (B)분획에서 Gapdh, Rpl10 및 Csde1 단백질의 분포를 보여주는 서양 얼룩. qPCR 분석은 갭드(C), 삭스2(D), rpl7(E) 및 rpl34(F) mRNAs의 분획 분포를 보여 주어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다각형 프로파일링은 단일 유전자 및 게놈 전체 수준14 모두에서 번역 상태를 평가하는 데 일반적으로 사용되는 강력한 기술이다. 이 보고서에서는 홈어셈블 플랫폼과 개발 중인 마우스 피질을 분석하기 위한 응용 프로그램을 사용하여 다형성 프로파일링 프로토콜을 제시합니다. 이 비용 효율적인 플랫폼은 견고하고 재현 가능한 자당 그라데이션과 고감도의 다형성 프로파일링을 쉽게 조립하고 생성할 수 있습니다.
일관되고 좋은 품질의 자당 그라데이션의 준비는 재현 가능한 다형성 프로파일링결과(17)를얻는 데 중요하다는 점에 유의할 가치가 있다. 그라데이션 준비 중 10-50% 자당 솔루션의 부피의 변화는 다운스트림 분석에서 다각성 피크의 변화와 결과의 불일치를 야기할 수 있습니다. 더욱이, 바늘의 삽입 및 제거 도중 그라데이션을 방해하는 것은 그라데이션 준비의 불일치에 기여할 수 있었다. 다른 접근 방식 및 상용 장치에 비해 당사의 홈메이드 그라데이션 제조 시스템은 전동 단계를 사용하여 준비 중 그라데이션의 교란을 줄이고 주사기 펌프를 사용하여 자당 솔루션을 정확하게 분배하여 그라데이션 준비를 위한 저렴하고 간단한 솔루션을 제공합니다.
개발 중인 마우스 피질에 존재하는 다이성 프로파일링 플랫폼 및 프로토콜을 적용하여, 리보솜 단백질 Rpl10 및 세포질 단백질 Gapdh 및 Csde1이 올바른 분획으로 분포되었다는 것을 발견했습니다. 더욱이, 고도로 번역된 gapdh 및 sox2 mRNAs는 다각체 분획으로 풍부하게 되었고, 번역적으로 억압된 rpl34 및 rpl7 mRNAs는 우리의 플랫폼과 프로토콜을 검증하는 폴리좀의 농축을 적게 보여주었습니다. 유사한 접근법으로, 개발 피질에 있는 그밖 유전자의 번역 상태는 실시간 PCR에 의해 개별적으로 결정될 수 있습니다. 참고, 다형성 프로파일링은 게놈 전체 수준에서 개발 중인 뇌의 번역 상태를 분석하는 데 사용되었습니다. 이와 관련하여, 폴리좀을 함유한 분획을 결합하고 추출된 RNA는 깊은 시퀀싱을 사용하여 분석될 수 있다. 여기에 존재하는 플랫폼과 프로토콜은 다른 세포 유형과 조직을 사용하여 반원자 연구에 맞게 적응하고 더 최적화 될 수 있습니다. 실험 조건(예를 들어, <50 μg RNA)에 의해 제한된 피질 조직의 가용성을 고려할 때, 프로토콜의 추가 최적화는 실험의 효율성 과 재현성을 더욱 높일 수 있다.
다각형 프로파일링은 개발 피질에서 mRNA의 번역 상태에 대한 통찰력을 제공하지만, 다른 신경 세포 유형이 존재하는 후 발달 단계에서 특정 세포 유형을 분석하는 데 한계가 있습니다. 이 질문을 해결하기 위해, 다성 프로파일링은 조직 특정프로모터(11)에따라 발현된 에피토프 태그리보솜 단백질의 풀다운에 의해 TRAP과 통합될 수 있다.
결론적으로, 우리가 자당 그라데이션 만들기 및 분획을 위해 여기에서 보고하는 플랫폼 및 프로토콜은 두뇌 발달의 맥락에서 다각성 프로파일링 실험및 그밖 생물학 문맥에 있는 경제적인 해결책을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN/04246-2018에서 G.Y.에)에 의해 지원되었습니다. G.Y.는 캐나다 연구 위원장입니다. S.K.는 미틱스 글로벌잉크 대학원 펠로우십과 ACHRI 대학원 학생 장학금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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