Summary
El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.
Abstract
El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.
Introduction
Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren que la regulación genética a otros niveles también contribuye a la coordinación de la proliferación y diferenciación de células madre neuronales6,7,8,9,10. Por lo tanto, abordar los programas de control traslacional avanzará en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la decisión del destino de las células madre neuronales y el desarrollo del cerebro.
Se han aplicado ampliamente tres técnicas principales con diferentes fortalezas para evaluar el estado traslacional del ARNM, incluyendo la elaboración de perfiles ribosomas, la purificación de afinidad ribosoma traducible (TRAP) y el perfilado de polisomas. La elaboración de perfiles ribosomas utiliza secuenciación de ARN para determinar fragmentos de ARNM protegidos por ribosomas, lo que permite el análisis global del número y la ubicación de los ribosomas traduciendo en cada transcripción para inferir indirectamente la tasa de traducción comparándola con la abundancia de transcripción11. TRAP aprovecha las proteínas ribosomales etiquetadas con epitopos para capturar los mRNAs ribosomas unidos al ribosoma12. Dado que las proteínas ribosomales etiquetadas se pueden expresar en tipos celulares específicos utilizando enfoques genéticos, TRAP permite el análisis de la traducción de una manera específica del tipo celular. En comparación, la elaboración de perfiles de polisomas, que utiliza el fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa para separar la porción libre y mal traducida (monosomas más ligeros) de aquellos que se traducen activamente por ribosomas (polisomas más pesados), proporciona una medición directa de la densidad ribosoma en el ARNm13. Una ventaja que ofrece esta técnica es su versatilidad para estudiar la traducción de mRNA específica de interés, así como el análisis de translatome en todo el genoma14.
En este artículo, describimos un protocolo detallado de perfilado de polisoma para analizar la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Utilizamos un sistema ensamblado en casa para preparar gradientes de densidad de sacarosa y recoger fracciones para aplicaciones posteriores. El protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para analizar otros tipos de tejidos y organismos.
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Protocol
Todo el uso de animales fue supervisado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Calgary. Los ratones CD1 utilizados para el experimento fueron comprados al proveedor comercial.
1. Preparación de soluciones
NOTA Para evitar la degradación del ARN, rocíe la mesa de trabajo y todos los equipos con solución de descontaminación RNase. Los consejos sin RNase se utilizan para el experimento. Todas las soluciones se preparan en agua sin RNase.
- Preparar solución de material de cicloheximida (100 mg/ml) en DMSO y almacenar a -20 °C.
- Prepare la solución de caldo de sacarosa de 2,2 M añadiendo 75,3 g de sacarosa al agua libre de RNase y rematando el volumen a 100 ml (para una preparación de gradiente ~16). La solución se puede mantener a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
- Preparar solución de sal 10x (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2).
- Preparar solución de persecución de sacarosa del 60% (w/v), que contenga 30 g de sacarosa, 5 ml de solución de sal de 10x y cubra el volumen hasta 50 ml con agua libre de RNase.
- Opcionalmente, añadir una mota de bromophenol azul o aproximadamente 5 μL de 1% azul bromophenol en agua libre de RNase a la solución de persecución. 1.6. Almacene soluciones a 4 °C.
2. Preparación del gradiente de sacarosa
NOTA: La precisión en la preparación de gradientes de sacarosa es fundamental para obtener resultados consistentes y reproducibles.
- Para preparar seis gradientes de sacarosa del 10-50%, diluya la solución de sacarosa de 2,2 M como en la Tabla 1.
| Solución de sacarosa | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| Sacarosa de 2,2 M | 2 ml | 4 ml | 6 ml | 8 ml | 10 mL |
| Solución de sal 10 veces | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml |
| cicloheximida | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Agua | 11.5 mL | 9,5 ml | 7,5 ml | 5,5 ml | 3,5 ml |
| Volumen total | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL |
Tabla 1: Diluciones de sacarosa para preparaciones de gradientes de sacarosa.
NOTA: Prepare siempre degradados de sacarosa en múltiplos de dos para equilibrar el peso durante la ultracentrifugación.
- Limpie la aguja del extremo contundente metálico con la solución de descontaminación RNase. Enjuague brevemente los tubos ultracentrífugas, el tubo y la jeringa utilizando agua libre de RNase. Secar el aire los tubos de tal manera que no quede gota de agua en los tubos, ya que cualquier agua restante alterará la concentración de sacarosa.
- Coloque la aguja metálica en el soporte de la abrazadera y el tubo centrífuga en la etapa motorizada. Para preparar los gradientes de forma consistente, se utilizó un sistema ensamblado en casa que contiene una etapa motorizada para sostener el tubo ultracentrífuga y una bomba de jeringa para inyectar soluciones de sacarosa(Figura 1, ver paso 9 para más detalles).
- Llene una jeringa de 30 ml con ~16 ml de sacarosa al 10% (suficiente para seis gradientes), colóquela en la bomba de jeringa y conéctelo a la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa, el tubo y la aguja. Limpie la punta de la aguja para eliminar cualquier solución residual.
- Mueva la etapa motorizada hacia arriba de tal forma que la punta de la aguja toque el centro del tubo en la parte inferior.
- Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 2 ml/min para un volumen de 2,3 ml.
- Después de dispensar 2,3 ml de solución de sacarosa al 10%, baje la etapa motorizada y repita el proceso para los seis gradientes.
- Repita los pasos 2.4-2.7 para agregar una solución de sacarosa del 20% a la parte inferior de los tubos, seguida de soluciones de sacarosa del 30%, 40% y 50% de manera similar.
- Después de la preparación del gradiente, selle el tubo ultracentrífuga usando una película de parafina.
- Deje los tubos durante la noche a 4 °C de tal manera que las diferentes capas de sacarosa se difundan juntas para dar un gradiente continuo.
3. Disección de tejidos
NOTA: Los ratones embarazadas fueron eutanasiados por la dislocación cervical precedida por anestesia con un 5% de isoflurano.
- Recoge embriones de ratón CD1 en el día embrionario 12, u otros puntos de tiempo según sea necesario, y coloca embriones en una placa de Ø 10 cm que contiene la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hank helada en hielo para retener la viabilidad celular.
- Bajo el alcance de disección, transfiera un embrión a una placa de Ø 6 cm que contenga HBSS helada.
- Utilice agujas de 21-23 G para fijar la posición de la cabeza penetrando a través de los ojos en un ángulo de aproximadamente 45° y aplique fuerza para asegurarse de que las agujas estén fijas en la placa (Figura 2A).
- Utilice fórceps no.5 para eliminar la piel y el cráneo, desde el centro hasta los lados.
- Utilice fórceps para cortar las bombillas olfativas y eliminar las meninges para exponer los tejidos corticales.3.6.Use fórceps curvas para cortar los tejidos corticales en 2-3 ml de medio neurobástico sobre hielo (Figura 2B). Alarse tejidos corticales de diferentes embriones según sea necesario. Los tejidos de 8-10 embriones generalmente dan ~200 μg de ARN total.
4. Lisis celular
- El día de la disección de tejidos, prepare el amortiguador de lisis celular fresca como se describe en la Tabla 2.
| solución | Concentración final | volumen |
| Tris-HCl (pH 7.5) | 20 mM | 100 μL |
| Kcl | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Tritón X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| Desoxicolato de sodio | 0,5% (w/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (TDT) | 1 mM | 5 μL |
| cicloheximida | 100 μg/ml | 5 μL |
| RNase agua libre | Recarga hasta 5 ml | |
| total | 5 ml | 5 ml |
Tabla 2: Preparación del búfer de lisis polisoma.
NOTA: Suplementar el tampone de lisis con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
- Añadir cicloheximida al medio neurobasal con tejidos diseccionados a una concentración final de 100 μg/ml e incubar a 37 °C durante 10 min. Cicloheximida bloquea la alargamiento de la traducción y, por lo tanto, evita la escorrentía ribosoma 15.
- Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Lave los tejidos dos veces con solución salina amortiguada por fosfato frío (PBS) complementada con 100 μg/ml de cicloheximida.
- Añadir 500 μL de tampón de lisis celular complementado con 4 μL de inhibidor de la RNase. Pipeta arriba y abajo para resuspend el tejido en tampón de lisis. Utilice una aguja de insulina para liar suavemente el tejido.
- Incubar los tejidos sobre hielo durante 10 min con un breve vórtice cada 2-3 min.
NOTA: Para prevenir la degradación del tejido, asegúrese de que todos los pasos de lisis tisular se llevan a cabo en el hielo. - Centrífuga a 2.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo.
- Centrífuga a ~13,000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo.
- Mida la concentración de ARN en el tejido lisato utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
NOTA: Si se incluyen varias muestras en el experimento, diluya las muestras a la misma concentración con un búfer de lisis celular adicional para minimizar la variación.
5. Carga de muestras y ultracentrifugación
- Preenfríe el rotor de ultracentrifugación y los cubos de oscilación a 4 °C, y ajuste la temperatura de la ultracentrífuga a 4 °C.
- Mantenga 20 μL del tejido lisato como entrada total de ARN.
- Cargue muestras (ARN de 50-300 μg con un volumen igual) en la parte superior de los gradientes de sacarosa dispensando lentamente el lisato a las paredes de los tubos ultracentrífugas.
- Coloque suavemente los tubos ultracentrífugas en el cubo de oscilación. Asegúrese de que todos los cubos diametralmente opuestos estén equilibrados.
- Cargue los cubos de oscilación en el rotor. Ajuste la ultracentrífuga a 190.000 x g (~39.000 rpm) a 4 °C durante 90 min.
- Coloque suavemente los gradientes sobre hielo después de la centrifugación.
6. Fraccionamiento y recolección de muestras
NOTA: Se utiliza un sistema de fraccionamiento, grabación y recolección ensamblado en casa para el análisis y la recopilación de muestras de los degradados(Figura 3,consulte Componentes del dispositivo).
- Coloque un tubo de ultracentrífuga vacío en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.
- Encienda el monitor UV y abra el software de grabación de señal digital.
- Llene una jeringa de 30 ml con 25 ml de solución de persecución de sacarosa al 60%. Presione suavemente la jeringa de tal manera que la solución de persecución llene el tubo vacío y pase por el monitor UV de 254 nm para establecer la línea de base para su detección.
- Pulse auto-cero en el monitor UV para registrar una línea base para su detección. Pulse reproducir en el software para comenzar a grabar.
- Una vez que el sistema establece una línea base, pausa la grabación en el software y retrae la solución de persecución. Asegúrese de que no quede ninguna solución de persecución residual en el sistema.
NOTA: Enjuague el sistema con agua libre de RNase para eliminar las soluciones de sacarosa residual restantes de la ejecución anterior. - Cargue un tubo de muestra en el perforador del tubo. Penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.
- Comience a grabar en el software. Inicie la bomba de jeringa (caudal de 1 mL/min para un volumen de 25 ml) y el colector de fracción para recoger fracciones de polisoma. Establezca la configuración del fraccionarios en 30 s.
NOTA: Antes de cada carrera, asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa o en el tubo presionando suavemente la jeringa para permitir que la solución de persecución fluya continuamente a través de la aguja. - Recoger las fracciones en tubos de 1,5 ml (500 μL cada uno) utilizando un colector de fracción.
- Las fracciones se pueden procesar inmediatamente o almacenarse a -80 °C.
- Después de la recolección de fracciones, enjuague el sistema con agua libre de RNase para eliminar cualquier sacarosa remanente.
7. Extracción de ARN
- A cada fracción, agregue 10 ng de control de arnesa luciferasa.
- Agregue tres volúmenes de reactivo de aislamiento de ARN comercial basado en cloróxido de guanidium a cada fracción.
- Vórtice brevemente durante 15 s.
- Extraiga ARN utilizando un kit de extracción de ARN compatible con la solución utilizada en 7.2.
8. Transcripción inversa y PCR en tiempo real
- Mida la concentración del ARN utilizando espectrofotómetro UV-Vis.
- Someta el ARN a la transcripción inversa utilizando un kit de síntesis cDNA, según el protocolo del fabricante.
- Utilice el PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) para examinar la distribución polisomal del ARNm gapdh como ejemplo. qPCR se realizó utilizando un sistema de detección qPCR y un reactivo de mastermix qPCR, con las siguientes condiciones de ciclismo: 95 °C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 40 s, seguido de 95 °C para 60 s.
- Obtenga valores de ciclo de umbral (Ct) de las gráficas de amplificación y se utiliza para calcular el cambio de pliegue mediante el método ΔΔCt.
9. Gradiente de sacarosa haciendo montaje del sistema
NOTA: Siga los pasos para ensamblar cada componente (como se describe en la Tabla 3)del fabricante de degradado de sacarosa (Figura 1).
- Monte dos soportes verticales (A2) en la placa base (A1).
- Utilice dos soportes delgados de ángulo recto (B2) para montar el actuador de etapa lineal en la placa base (A1).
- Utilice el tornillo de fijación en el poste de aluminio de Ø12,7 mm (C2) para fijarlo en la placa base del soporte de tubo (C1) como soporte para el soporte del tubo.
- Monte la abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm (C3) con el poste (C2) y el poste óptico de la miniserie (C4).
- Utilice el tornillo de fijación en el poste óptico (C4) para conectar una pequeña abrazadera en V (C5) como soporte del tubo.
- Coloque un tubo centrífuga en el soporte del tubo y ajuste el ángulo para que sea vertical. Marque la posición del tubo y monte el soporte del poste de pedestal (C6) en la placa base (C1) para apoyar el tubo.
- Al otro lado de la placa de pan (A1), utilice el setcrew del poste de aluminio de Ø12,7 mm (D1) para fijarlo y conectar un poste óptico de miniserie (D3) utilizando una abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm (D2).
- Conecte la abrazadera en V en miniatura (D4) con aguja de extremo contundente (D5) al poste (D3). Ajuste el ángulo de la abrazadera para ajustar la aguja vertical y ajuste la longitud del poste para asegurarse de que la aguja se encuentra con el tubo centrífuga.
- Conecte el actuador (B1) al controlador de motor paso a paso (E1) y utilice la placa controladora UNO R3 y el módulo de joystick del kit de arranque UNO (E2) para controlar el actuador. Se puede utilizar un adaptador de potencia (por ejemplo, adaptador de potencia ajustable de CA/CC de 9-24 V) para conducir el motor por separado.
- Coloque la bomba de jeringa (F) junto a la estación de fabricación de gradiente y conecte la jeringa con la aguja.
- Controle la etapa del soporte del tubo hacia arriba y hacia abajo con el joystick.
| componente | artículo |
| B1 | Actuador lineal de etapa |
| E1 | Conductor de motor paso a paso |
| E2 | Kit de super-arranque del proyecto UNO |
| A1 | Protoboard |
| A2 | Soporte vertical |
| B2 | Soporte delgado de ángulo recto |
| C1 | Placa de pan de la miniserie |
| C5 | Pequeña abrazadera en V |
| D4 | Abrazadera en miniatura en V |
| C2 | Poste de aluminio de Ø12,7 mm |
| C4, D3 | Poste óptico de la miniserie |
| D1 | Poste de aluminio de Ø12,7 mm |
| C3, D2 | Abrazadera de poste de ángulo recto de Ø1/2" a Ø6 mm |
| C6 | Base de soporte de poste de pedestal de la serie mini |
| D5 | Aguja final contundente |
| F | Bomba de jeringa |
Tabla 3: Degradado que fabrica componentes del sistema.
10. Fraccionamiento y detección del conjunto del sistema (Figura 2).
- Utilice una abrazadera de bureta redonda redonda regular para montar el módulo óptico del monitor UV en el perforador del tubo. Fije un extremo del tubo (1 cm de largo y 0,56 mm de diámetro interno) al conectador del perforador de tubo y el otro extremo al puerto fluid in del módulo óptico. Conecte el puerto Fluid Out al fraccionaridor.
- Conecte el módulo óptico con la unidad de control del monitor UV según el manual del fabricante.
- Utilice un cable de ruptura para conectar la toma de salida de señal al convertidor digital en el suelo y conexiones de entrada analógicas, según el manual del fabricante.
- Conecte el convertidor digital a un ordenador portátil mediante un cable USB normal y grabe las señales digitales convertidas mediante el software de adquisición de datos.
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Representative Results
Como demostración, el lisato cortical que contenía 75 μg de ARN (agrupado de 8 embriones) fue separado por el gradiente de sacarosa en 12 fracciones. Picos de absorbancia UV a 254 nm identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S, subunidad 60S, monosoma 80S y polisomas (Figura 4A). Análisis de fracciones por mancha occidental para la gran subunidad ribosomal, Rpl10 mostró su presencia en la subunidad 60S (fracción 3), monosoma (fracción 4) y polisomas (fracciones 5-12) (Figura 4B). Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas Gapdh y Csde1 no se asociaron con ribosomas, sino que se enriquecieron en fracciones que contenían ARN libre (fracción 1) (Figura 4B). En consonancia con la separación de proteínas en diferentes fracciones, encontramos que los dirnas gapdh y sox2 estaban altamente enriquecidos en las fracciones que contenían polisomas pesados (más de tres ribosomas en fracciones 7-12), lo que sugiere que los dilaciones y sox2 mRNAs se traducen eficientemente en la corteza en desarrollo(Figura 4C,D). Por el contrario, rpl7 y rpl34 mRNAs se enriquecieron en la fracción que contiene monosomas, lo que sugiere traducción reprimida (Figura 4E, F)16. Estos resultados validaron nuestro protocolo de fraccionamiento de polisomas.
Figura 1: Configuración para la preparación del gradiente de sacarosa. (A) Fabricante de gradiente de sacarosa ensamblado en casa que consta de un actuador de etapa lineal, un soporte de tubo en el escenario motorizado, un conjunto de controlador de escenario, una aguja de extremo contundente de metal montada en un soporte de aguja y una bomba de jeringa automatizada con una jeringa conectada a la aguja (ver Tabla 3). (B) Para preparar el gradiente de sacarosa, el tubo ultracentrífuga se coloca en el soporte del tubo. Las soluciones de sacarosa se dispensan a través de la aguja de extremo contundente utilizando una bomba de jeringa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección de los tejidos corticales del embrión del ratón de desarrollo. (A) Imagen que muestra un embrión E12.5 CD1 fijado a una placa de Ø 6 cm utilizando agujas 21G-23G. (B) Imagen que muestra la corteza diseccionada después de la eliminación de la piel, el cráneo y las meninges (marcada con líneas blancas discontinuas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración para el fraccionamiento, grabación y recolección de muestras. Imagen que representa el sistema de fraccionamiento, grabación y recolección de muestras ensamblado en casa que comprende una bomba de jeringa automatizada, un perforador de tubos, un colector de fracción y un monitor UV con un convertidor digital conectado a un ordenador portátil para la monitorización continua de la absorbancia UV. La adquisición de datos es manejada por el software de adquisición de datos comerciales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de perfilado de polisoma de la corteza del ratón en desarrollo. (A) Absorbancia UV que muestra fracciones que contienen ARN libre (fracción 1), subunidad 40S (fracción 2), subunidad 60S (fracción 3), monosomas 80S (fracción 4) y polisomas (fracción 5-12). Se utilizó 75 μg de ARN total agrupado a partir de 8 embriones. B) Manchas occidentales que muestran las distribuciones de las proteínas Gapdh, Rpl10 y Csde1 en fracciones. qPCR análisis que muestra la distribución de gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) y rpl34 (F) mRNAs en fracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.
Es digno de señalar que la preparación de gradientes de sacarosa consistentes y de buena calidad es fundamental para obtener resultados reproducibles de perfilado de polisoma17. Los cambios en el volumen de soluciones de sacarosa del 10-50% durante la preparación del gradiente podrían causar el desplazamiento de los picos del polisoma y la inconsistencia de los resultados en el análisis posterior. Además, perturbar el gradiente durante la inserción y extracción de la aguja podría contribuir a la inconsistencia de la preparación del gradiente. En comparación con otros enfoques y dispositivos comerciales, nuestro sistema de fabricación de gradientes caseros utilizó una etapa motorizada para reducir la perturbación de los gradientes durante la preparación y una bomba de jeringa para dispensar con precisión soluciones de sacarosa, que ofrece una solución barata y sencilla para la preparación de gradientes.
Aplicando la plataforma de perfilado de polisomas y el protocolo presente aquí a la corteza del ratón en desarrollo, encontramos que la proteína ribosomal Rpl10 y las proteínas citoplasmáticas Gapdh y Csde1 se distribuyeron en las fracciones correctas. Además, los mRNAs gapdh y sox2 altamente traducidos se enriquecieron en fracciones polisomales, mientras que los arréderos rpl34 y rpl7 reprimidos traslacionalmente mostraron menos enriquecerse en polisomas, que validan nuestra plataforma y protocolo. Con un enfoque similar, el estado traslacional de otros genes en la corteza en desarrollo puede ser determinado individualmente por PCR en tiempo real. Cabe destacar que el perfil polisoma se ha utilizado para analizar el estado traslacional en el cerebro en desarrollo a nivel de todo el genoma. En este sentido, las fracciones que contienen polisomas se pueden combinar y extraer ARN se pueden analizar utilizando secuenciación profunda. La plataforma y el protocolo presentes aquí se pueden adaptar y optimizar aún más para adaptarse a los estudios translatómicos utilizando otros tipos celulares y tejidos. Teniendo en cuenta la disponibilidad de tejidos corticales limitados por condiciones experimentales (por ejemplo, <50 μg de ARN), la optimización adicional del protocolo puede proporcionar nuevos aumentos en la eficiencia y reproducibilidad de los experimentos.
Mientras que la generación de perfiles de polisoma proporciona información sobre el estado traslacional de los mRNAs en la corteza en desarrollo, tiene limitaciones para analizar tipos de células específicos en etapas de desarrollo posteriores, cuando hay diferentes tipos de células neuronales presentes. Para abordar esta cuestión, el perfilado de polisomas se puede integrar con TRAP mediante la extracción de proteína ribosomal etiquetada con epitopoe expresada bajo un promotor específico del tejido11.
En conclusión, la plataforma y el protocolo que informamos aquí para la fabricación de gradientes de sacarosa y el fraccionamiento proporcionan una solución económica a los experimentos de perfiles de polisomas en el contexto del desarrollo cerebral, así como otros contextos biológicos.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. es una Cátedra de Investigación de Canadá. S.K. fue financiado por Mitacs Globalink Graduate Fellowship y ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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