Summary
Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.
Abstract
Memeli beyninin doğru gelişimi, nöral kök hücre çoğalması ve farklı nöral hücre tiplerine farklılaşmanın ince bir dengesine dayanır. Bu denge, transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri dahil olmak üzere birden fazla düzeyde ince ayarlı gen ekspresyonu ile sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bu bağlamda, büyüyen bir kanıt kütlesi, nöral kök hücre kader kararlarının koordinasyonunda çeviri düzenlemesinin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Polizom fraksiyonasyonu, mRNA çeviri durumunun hem küresel hem de bireysel gen düzeylerinde değerlendirilmesi için güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan fare serebral korteksinden hücrelerde çevirisel verimliliği değerlendirmek için şirket içi bir polisome profilleme boru hattı sunuyoruz. Sükroz gradyan hazırlama, doku lizisi, ultrasantrifüjasyon ve mRNA çeviri durumunun fraksiyonasyona dayalı analizi için protokolleri açıklıyoruz.
Introduction
Memeli beyninin gelişimi sırasında, sinirsel kök hücreler nöronlar oluşturmak için çoğalır ve farklılaşır ve glia1,2 . Bu sürecin pertürbasyonu, birçok nörogelişimsel bozuklukta görüldüğü gibi beyin yapısında ve işlevinde değişikliklere yol açabilir3,4. Nöral kök hücrelerin uygun davranışı, belirli genlerin düzenlenmiş ifadesini gerektirir5. Bu genlerin epigenetik ve transkripsiyonel kontrolü yoğun olarak çalışılmış olsa da, son bulgular diğer seviyelerde gen düzenlemesinin nöral kök hücre çoğalması ve farklılaşması 6 ,7, 8,9,10koordinasyonuna da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle, çevirisel kontrol programlarını ele almak, nöral kök hücre kader kararının ve beyin gelişiminin altında kalan mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde ilerletecektir.
Ribozom profilleme, ribozom benzeşim saflaştırma (TRAP) ve polisome profilleme dahil olmak üzere mRNA'nın çeviri durumunu değerlendirmek için farklı güçlere sahip üç ana teknik yaygın olarak uygulanmıştır. Ribozom profilleme, ribozom korumalı mRNA parçalarını belirlemek için RNA dizilimini kullanır ve her transkriptteki ribozomların çeviri sayısının ve konumunun küresel analizinin, transkript bolluğu ile karşılaştırarak dolaylı olarak çeviri oranını çıkarabilmesini sağlar11. TRAP, ribozomlara bağlı mRNA'ları yakalamak için epitop etiketli ribozomal proteinlerden yararlanır12. Etiketli ribozomal proteinlerin genetik yaklaşımlar kullanılarak belirli hücre tiplerinde ifade edilebildiği göz önüne alındığında TRAP, çevirinin hücre tipine özgü bir şekilde analiz edilmesine izin verir. Buna karşılık, serbest ve kötü çevrilmiş kısmı (daha hafif monosomes) ribozomlar (daha ağır poliomlar) tarafından aktif olarak çevrilenlerden ayırmak için sakkaroz yoğunluğu gradyan fraksiyonunu kullanan polisome profilleme, mRNA13üzerinde ribozom yoğunluğunun doğrudan ölçümünü sağlar. Bu tekniğin sunduğu avantajlardan biri, belirli bir mRNA'nın çevirisini ve genom çapında translatom analizini incelemek için çok yönlülüğüdür14.
Bu yazıda, gelişmekte olan fare serebral korteksini analiz etmek için ayrıntılı bir polisome profilleme protokolünü açıklıyoruz. Sakkaroz yoğunluk gradyanları hazırlamak ve aşağı akış uygulamaları için fraksiyonları toplamak için ev yapımı bir sistem kullanıyoruz. Burada sunulan protokol, diğer doku ve organizma türlerini analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan kullanımı Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından denetlendi. Deney için kullanılan CD1 fareleri ticari satıcıdan satın alındı.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT RNA bozulmasını önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile tezgahı ve tüm ekipmanları püskürtün. Deney için RNase içermeyen ipuçları kullanılır. Tüm çözümler RNase içermeyen suda hazırlanır.
- DMSO'da sikloeximide stok çözeltisi (100 mg/mL) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
- RNase içermeyen suya 75,3 g sakkaroz ekleyerek ve hacmi 100 mL'ye yükselterek 2,2 M sakkaroz stok çözeltisi hazırlayın (~16 gradyan hazırlığı için). Çözelti uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.
- 10x tuz çözeltisi hazırlayın (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2).
- 30 g sakkaroz, 5 mL 10x tuz çözeltisi içeren% 60 (w/ v) sakkaroz kovalama çözeltisi hazırlayın ve hacmi RNase içermeyen su ile 50 mL'ye kadar üst üste yerleştirin.
- İsteğe bağlı olarak, kovalama çözümüne RNase içermeyen suda bromofenol mavisi veya yaklaşık 5 μL% 1 bromofenol mavisi ekleyin. 1.6. Çözümleri 4 °C'de saklayın.
2. Sakkaroz gradyanının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanlarının hazırlanmasında doğruluk, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede kritik öneme sahiptir.
- Altı adet % 10-50 sakkaroz gradyan hazırlamak için, Tablo 1'deolduğu gibi 2,2 M sakkaroz çözeltisini seyreltin.
| Sakkaroz çözeltisi | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M sakaroz | 2 mL | 4 mL | 6 mL | 8 mL | 10 mL |
| 10X tuz çözeltisi | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL | 1,5 mL |
| Cycloheximide | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Su | 11,5 mL | 9,5 mL | 7,5 mL | 5,5 mL | 3,5 mL |
| Toplam birim | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL | 15 mL |
Tablo 1: Sakkaroz gradyanlarının preparatları için sakkaroz seyreltmeleri.
NOT: Ultrasantrifüjleme sırasında ağırlığı dengelemek için her zaman sakkaroz gradyanlarını iki kat olarak hazırlayın.
- Metal künt uç iğnesini RNase dekontaminasyon çözeltisi ile silin. Ultracentrifuge tüplerini, boruları ve şırınnayı RNase içermeyen su kullanarak kısaca durulayın. Tüpleri, kalan su sakkaroz konsantrasyonu değiştireceği için tüplerde su damlası kalmayacak şekilde havayla kurutun.
- Metal iğneyi kelepçe tutucusuna ve santrifüj tüpünü motorlu sahneye yerleştirin. Degradeleri tutarlı bir şekilde hazırlamak için, ultrasantrifüj tüpünü tutmak için motorlu bir aşama ve sakkaroz çözeltilerini enjekte etmek için bir şırıngar pompası içeren ev yapımı bir sistem kullanılmıştır (Şekil 1, ayrıntılar için adım 9'a bakın).
- 30 mL'lik bir şırıngayı ~16 mL%10 sakkarozla doldurun (altı gradyan için yeterlidir), şırınga pompasına yerleştirin ve iğneye bağlayın. Şırınga, tüp ve iğnede hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Kalan çözeltiyi çıkarmak için iğnenin ucunu silin.
- Motorlu sahneyi, iğnenin ucu alttaki tüpün ortasına değdirene kadar yukarı taşıyın.
- Şırınd pompasını 2,3 mL hacim için 2 mL/dk akış hızına ayarlayın.
- % 10 sakkaroz çözeltisinin 2,3 mL'sini dağıttıktan sonra, motorlu aşamadan aşağı hareket edin ve altı degradenin tümü için işlemi tekrarlayın.
- Tüplerin altına% 20 sakkaroz çözeltisi eklemek için 2.4-2.7 adımlarını tekrarlayın, ardından% 30, % 40 ve% 50 sakkaroz çözeltileri benzer şekilde.
- Degradenin hazırlanmasından sonra, ultracentrifuge tüpünü bir parafin filmi kullanarak kapatın.
- Tüpleri 4 °C'de bir gece bırakın, böyle şekilde farklı sakkaroz katmanları birlikte yayılarak sürekli bir gradyan verin.
3. Doku diseksiyonu
NOT: Gebe fareler% 5 izofluran ile anesteziden önce servikal çıkık ile ötenaziye tabi edildi.
- Embriyonik 12. günde veya gerektiğinde diğer zaman noktalarında CD1 fare embriyolarını toplayın ve hücre canlılığını korumak için embriyoları buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren Ø 10 cm'lik bir tabağa yerleştirin.
- Diseksiyon kapsamı altında, bir embriyoyu buz gibi HBSS içeren Ø 6 cm'lik bir plakaya aktarın.
- Yaklaşık 45° açıyla gözlerden geçerek başın konumunu sabitlemek için 21-23 G iğneler kullanın ve iğnelerin plakaya sabit olduğundan emin olmak için kuvvet uygulayın (Şekil 2A).
- Deriyi ve kafatasını ortadan yanlara çıkarmak için No.5 tokmak kullanın.
- Koku ampullerini kesmek ve kortikal dokuları ortaya çıkarmak için menenjileri çıkarmak içinps kullanın.3.6.Kortikal dokuları buz üzerinde 2-3 mL nörobakal ortama kesmek için kavisli önksezi kullanın(Şekil 2B). Gerektiğinde farklı embriyolardan kortikal dokuları havuza edin. 8-10 embriyodan dokular genellikle ~200 μg toplam RNA verir.
4. Hücre lizisi
- Doku diseksiyonu gününde, Tablo 2'de açıklandığı gibi taze hücre liziz tamponu hazırlayın.
| çözüm | Son konsantrasyon | hacim |
| Tris-HCl (pH 7.5) | 20 mM | 100 μL |
| Kartal | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Triton X-100 | %1 (v/v) | 500 μL |
| Sodyum deoksikolat | %0,5 (w/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| Cycloheximide | 100 μg/mL | 5 μL |
| RNase ücretsiz su | 5 mL'ye kadar yükleme | |
| toplam | 5 mL | 5 mL |
Tablo 2: Polizom liziz tamponunun hazırlanması.
NOT: Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye lizis tamponu.
- 100 μg/mL'lik son konsantrasyona parçalanmış dokularla nörobakal ortama sikloeximide ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Cycloheximide çeviri uzamasını engeller ve bu nedenle ribozom çalıştırmasını önler 15.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
- Dokuları 100 μg/mL sikloeximid ile desteklenmiş buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
- 4 μL RNaz inhibitörü ile desteklenmiş 500 μL hücre liziz tamponu ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı lizis tamponunda dokuyu yeniden dirsindirmek için. Dokuyu hafifçe imsilmek için bir insülin iğnesi kullanın.
- Her 2-3 dakikada bir kısa girdap ile buzdaki dokuları 10 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Doku bozulmasını önlemek için doku lizizinin tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesini sağlayın. - 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca ~13.000 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- UV-Vis spektrofotometresi kullanarak doku lysate'deki RNA konsantrasyonunu ölçün.
NOT: Deneye birden fazla örnek dahil edilirse, varyasyonu en aza indirmek için örnekleri ekstra hücre liziz tamponu ile aynı konsantrasyonda seyreltin.
5. Örnek yükleme ve ultrasantrifüjleme
- Ultracentrifugation rotorunu ve salıncak kovalarını 4 °C'de önceden soğutun ve ultrasantrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
- Toplam RNA girişi olarak doku lysate 20 μL tutun.
- Numuneleri (eşit hacimli 50-300 μg RNA) sakkaroz gradyanlarının üstüne, lisatı ultracentrifuge tüplerinin duvarlarına yavaşça dağıtarak yükleyin.
- Ultracentrifuge tüplerini salıncak kovasına hafifçe yerleştirin. Tüm çapraz zıt kovaların dengeli olduğundan emin olun.
- Salıncak kovalarını rotora yükleyin. Ultrasantrifüjü 90 dakika boyunca 4 °C'de 190.000 x g (~39.000 rpm) olarak ayarlayın.
- Santrifüjlemeden sonra degradeleri yavaşça buza yerleştirin.
6. Fraksiyonasyon ve örnek toplama
NOT: Analiz ve degradelerden numune toplamak için ev yapımı kesirleme, kayıt ve toplama sistemi kullanılır (Şekil 3, bkz. Cihaz bileşenleri).
- Tüp delicisine boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin.
- UV monitörünü açın ve dijital sinyal kayıt yazılımını açın.
- 30 mL'lik bir şırınnayı % 60 sakkaroz kovalama çözümünün 25 mL'si ile doldurun. Şırındağa yavaşça bastırın, böylece kovalama çözeltisi boş tüpü doldurur ve algılama için taban çizgisini ayarlamak için 254 nm UV monitöründen geçer.
- Algılama için bir taban çizgisi kaydetmek için UV monitöründe otomatik sıfıra basın. Kayda başlamak için yazılım üzerinde oynat tuşuna basın.
- Sistem bir taban çizgisi oluşturduktan sonra, yazılımdaki kaydı duraklatın ve chase çözümünü geri alın. Sistemde artık chase çözümü kalmadığından emin olun.
NOT: Önceki çalıştırmadan kalan artık sakkaroz çözeltilerini çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın. - Tüp delicisine bir örnek tüp yükleyin. Alttan iğne ile tüpe hafifçe nüfuz edin.
- Yazılıma kaydetmeye başlayın. Şırınd pompasını (25 mL hacim için 1 mL/ dk akış hızı) ve kesir toplayıcıyı polisome fraksiyonları toplamak için başlatın. Kesirleyici ayarlarını 30 s olarak ayarlayın.
NOT: Her çalıştırmadan önce, kovalamaca çözeltisinin iğneden sürekli akmasını sağlamak için şırıngaya hafifçe bastırarak şırıngada veya boruda hava kabarcıkları olmadığından emin olun. - Kesirleri bir kesir toplayıcı kullanarak 1,5 mL tüpler (her biri 500 μL) halinde toplayın.
- Kesirler hemen işlenebilir veya -80 °C'de saklanabilir.
- Fraksiyon toplamadan sonra, herhangi bir kalıntı sakkarozunu çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın.
7. RNA'nın Çıkarılması
- Her kesir için 10 ng luciferaz mRNA çivili kontrol ekleyin.
- Her kesir için üç hacim guanidiyum hidrokalrid bazlı ticari RNA izolasyon reaktifi ekleyin.
- Vortex kısaca 15 sn.
- 7.2'de kullanılan çözelti ile uyumlu bir RNA çıkarma kiti kullanarak RNA çıkarın.
8. Ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR
- UV-Vis spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
- Üreticinin protokolüne göre RNA'yı bir cDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyona tabi edin.
- Örnek olarak gapdh mRNA'nın polizomal dağılımını incelemek için nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) kullanın. qPCR, aşağıdaki bisiklet koşullarına sahip bir qPCR algılama sistemi ve bir qPCR mastermix reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi: 10 dakika için 95 °C, daha sonra 15 s için 95 °C 40 döngü, 30 s için 60 °C, 40 s için 72 °C, ardından 60 s için 95 °C.
- Amplifikasyon çizimlerinden Eşik döngüsü (Ct) değerleri elde edin ve ΔΔCt yöntemini kullanarak kat değişimini hesaplamak için kullanılır.
9. Sakkaroz gradyan yapma sistemi montajı
NOT: Sakkaroz degrade makinesinin her bileşenini (Tablo 3'teaçıklandığı gibi) birleştirmek için adımları izleyin (Şekil 1).
- Temel ekmek tahtasına (A1) iki dikey braket (A2) takın.
- Doğrusal kademeli aktüatörü temel ekmek tahtasına (A1) monte etmek için iki ince dik açılı braket (B2) kullanın.
- Ø12,7 mm alüminyum direk (C2) üzerindeki set vidasını tüp tutucu taban ekmek tahtasına (C1) sabitlemek için tüp tutucu için bir stand olarak kullanın.
- Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm posta kelepçesini (C3) post (C2) ve mini serisi optik direk (C4) ile monte edin.
- Tüp tutucu olarak küçük bir V kelepçesi (C5) bağlamak için optik direkteki (C4) set vidasını kullanın.
- Tüp tutucusuna bir santrifüj tüpü koyun ve dikey hale getirmek için açıyı ayarlayın. Tüpün konumunu işaretleyin ve tüpü desteklemek için kaide posta tutucusunu (C6) temel ekmek tahtasına (C1) monte edin.
- Ekmek tahtasının (A1) diğer tarafında, düzeltmek için Ø12,7 mm alüminyum direğin (D1) set vidasını kullanın ve dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm post clamp (D2) kullanarak mini seri optik direği (D3) bağlayın.
- Minyatür V kelepçesini (D4) künt uçlu iğne (D5) ile direğe (D3) bağlayın. İğneyi dikey olarak ayarlamak için kelepçenin açısını ayarlayın ve iğnenin santrifüj tüpüyle buluştuğundan emin olmak için direğin uzunluğunu ayarlayın.
- Aktüatörü (B1) step motor sürücüsüne (E1) bağlayın ve aktüatörü kontrol etmek için UNO R3 kontrol panosunu ve UNO marş kitinin (E2) joystick modülünü kullanın. Motoru ayrı ayrı sürmek için bir güç adaptörü (örneğin, 9-24 V AC/DC ayarlanabilir güç adaptörü) kullanılabilir.
- Şırınga pompasını (F) gradyan yapma istasyonunun yanına yerleştirin ve şırıngayı iğneye bağlayın.
- Kumanda çubuğunu kullanarak tüp tutucu aşamasını yukarı ve aşağı kontrol edin.
| parça | madde |
| B1 | Doğrusal sahne aktüatörü |
| E1 | Step motor sürücüsü |
| E2 | UNO projesi süper başlangıç kiti |
| A1 | Ekmek tahtası |
| A2 | Dikey köşeli ayraç |
| B2 | İnce dik açılı braket |
| C1 | Mini seri ekmek tahtası |
| C5 | Küçük V kelepçesi |
| D4 | Minyatür V kelepçesi |
| C2 | Ø12.7 mm alüminyum direk |
| C4, D3 | Mini serisi optik direk |
| D1 | Ø12.7 mm alüminyum direk |
| C3, D2 | Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm direk kelepçesi |
| C6 | Mini seri kaide direği tutucu tabanı |
| D5 | Künt uç iğnesi |
| F | Şırınd pompası |
Tablo 3: Degrade yapma sistemi bileşenleri.
10. Kesirleme ve sistem montajının algılanıyor (Şekil 2).
- UV monitörün optik modülünü tüp deliiciye monte etmek için normal yuvarlak çeneli burette kelepçe kullanın. Borunun bir ucunu (1 cm uzunluğunda ve 0,56 mm iç çap) tüp delicinin bağlantı elemanına, diğer ucunu ise optik modülün Akışkan Giriş portine takın. Fluid Out bağlantı noktasını kesirleyiciye bağlayın.
- Optik modülü, üreticinin el kitabına göre UV monitörün kontrol ünitesine bağlayın.
- Üretici kılavuzuna göre, sinyal çıkış soketini yerdeki dijital dönüştürücüye ve analog giriş bağlantılarına bağlamak için bir koparma kablosu kullanın.
- Dijital dönüştürücüyü normal bir USB kablosu kullanarak bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve veri toplama yazılımını kullanarak dönüştürülen dijital sinyalleri kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir gösteri olarak, 75 μg RNA (8 embriyodan havuza) içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı tarafından 12 fraksiyona ayrıldı. 254 nm'deki UV emicilik zirveleri, 40S alt birliğini, 60S alt birliğini, 80S monozomunu ve polizomlarını içeren fraksiyonları tanımladı (Şekil 4A). Büyük ribozomal alt bira için batı lekesi ile fraksiyonların analizi, Rpl10 60S alt birliği (fraksiyon 3), monozom (fraksiyon 4) ve polisomes (fraksiyonlar 5-12) (Şekil 4B)varlığını gösterdi. Buna karşılık, Sitoplazmik proteinler Gapdh ve Csde1 ribozomlarla ilişkili değildi, ancak serbest RNA (fraksiyon 1) içeren fraksiyonlarda zenginleştirilmiştir (Şekil 4B). Proteinlerin farklı fraksiyonlarda ayrılmasıyla tutarlı olarak, gapdh ve sox2 mRNA'ların ağır poliomlar içeren fraksiyonlarda (fraksiyon 7-12'de üçten fazla ribozom) yüksek oranda zenginleştiğini gördük, bu da gapdh ve sox2 mRNA'ların gelişmekte olan kortekste verimli bir şekilde çevrildiğini düşündürdü (Şekil 4C,D). Buna karşılık, rpl7 ve rpl34 mRNA'lar monozom içeren fraksiyonda zenginleştirildi, bastırılmış çeviri önerildi (Şekil 4E,F)16. Bu sonuçlar polisome fraksiyonasyon protokolümüzü doğruladı.
Şekil 1: Sakkaroz gradyan hazırlaması için kurulum. (A) Doğrusal bir sahne aktüatörü, motorlu sahnede bir tüp tutucu, bir sahne kontrol seti, bir iğne tutucuya monte edilmiş metal bir künt uçlu iğne ve iğneye bağlı şırıngalı otomatik bir şırınga pompası içeren ev yapımı sakkaroz gradyan makinesi (bkz. Tablo 3). (B) Sakkaroz gradyanını hazırlamak için, ultrasantrifüj tüpü tüp tutucuya yerleştirilir. Sakkaroz çözeltileri bir şırınga pompası kullanılarak künt uçlu iğneden dağıtılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kortikal dokuların gelişim fare embriyosundan diseksiyonu. (A) 21G-23G iğneleri kullanılarak Ø 6 cm plakaya sabitlenmiş bir E12.5 CD1 embriyosunun görüntü. (B) Deri, kafatası ve menenjitlerin çıkarılmasından sonra parçalanmış korteksi gösteren görüntü (beyaz kesik çizgilerle işaretlenmiştir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kesirli, kayıt ve örnek toplama için kurulum. UV emicinin sürekli izlenmesi için otomatik şırınna pompası, tüp delicisi, kesir toplayıcı ve dizüstü bilgisayara bağlı dijital dönüştürücülü UV monitörden oluşan ev yapımı fraksiyonasyon, kayıt ve numune toplama sistemini gösteren görüntü. Veri toplama, ticari veri toplama yazılımı tarafından sınanıyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gelişmekte olan fare korteksinin polisome profilleme analizi. (A) Serbest RNA (fraksiyon 1), 40S alt birliği (fraksiyon 2), 60S alt birliği (fraksiyon 3), 80S monosomes (fraksiyon 4) ve polisomes (fraksiyon 5-12) içeren fraksiyonları gösteren UV emiciliği. 8 embriyodan 75 μg toplam RNA kullanıldı. (B) Gapdh, Rpl10 ve Csde1 proteinlerinin fraksiyonlar halinde dağılımlarını gösteren batı lekeleri. gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) ve rpl34 (F) mRNA'ların kesirler halinde dağılımını gösteren qPCR analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polisome profilleme, çeviri durumunu hem tek gen hem de genom çapında değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir tekniktir14 . Bu raporda, ev yapımı bir platform ve gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için uygulamasını kullanarak polisome profilleme protokolü sunuyoruz. Bu uygun maliyetli platformun montajı ve yüksek hassasiyete sahip sağlam, tekrarlanabilir sakkaroz gradyanları ve polisome profilleme üretilmesi kolaydır.
Tutarlı ve kaliteli sakkaroz gradyanlarının hazırlanmasının tekrarlanabilir polizom profilleme sonuçları elde etmek için kritik öneme sahip olduğunu belirtmek gerekir17. Gradyan hazırlama sırasında% 10-50 sakkaroz çözeltilerinin hacmindeki değişiklikler, polizom zirvelerinin kaymasına ve aşağı akış analizinde sonuçların tutarsızlığına neden olabilir. Ayrıca, iğnenin yerleştirilmesi ve çıkarılması sırasında degradenin rahatsızlanması, gradyan preparatının tutarsızlığına katkıda bulunabilir. Diğer yaklaşımlar ve ticari cihazlarla karşılaştırıldığında, ev yapımı gradyan yapma sistemimiz, hazırlık sırasında gradyanların bozulmasını azaltmak için motorlu bir aşama ve gradyan hazırlama için ucuz ve basit bir çözüm sunan sakkaroz çözeltilerini doğru bir şekilde dağıtmak için bir şırıngar pompası kullandı.
Burada bulunan polizom profilleme platformunu ve protokolünü gelişmekte olan fare korteksine uygulayarak, ribozomal protein Rpl10 ve sitoplazmik proteinler Gapdh ve Csde1'in doğru fraksiyonlarda dağıtıldığını gördük. Ayrıca, son derece çevrilmiş gapdh ve sox2 mRNA'lar polizomal fraksiyonlarda zenginleştirilirken, çevirisel olarak bastırılmış rpl34 ve rpl7 mRNA'lar, platformumuzu ve protokolümüzü doğrulayan polisomelerde daha az zenginleşme gösterdi. Benzer bir yaklaşımla, gelişmekte olan korteksteki diğer genlerin çevirisel durumu gerçek zamanlı PCR ile ayrı ayrı belirlenebilir. Ayrıca, gelişmekte olan beyindeki çevirisel durumu genom çapında analiz etmek için polisome profilleme kullanılmıştır. Bu bakımdan polisome içeren fraksiyonlar birleştirilerek RNA çıkarılabilir ve derin dizileme kullanılarak analiz edilebilir. Burada bulunan platform ve protokol, diğer hücre tipleri ve dokular kullanılarak translatomik çalışmalara uyacak şekilde uyarlanabilir ve daha da optimize edilebilir. Deneysel koşullarla (örneğin, <50 μg RNA) sınırlı kortikal dokuların mevcudiyeti göz önüne alındığında, protokolün ek optimizasyonu deneylerin verimliliğinde ve tekrarlanabilirliğinde daha fazla artış sağlayabilir.
Polisome profilleme, gelişmekte olan korteksteki mRNA'ların çevirisel durumu hakkında içgörüler sağlarken, farklı sinirsel hücre tipleri mevcut olduğunda, daha sonraki gelişim aşamalarında belirli hücre tiplerini analiz etmek için sınırlamalara sahiptir. Bu soruyu ele almak için, polisome profilleme, dokuya özgü bir promotör altında ifade edilen epitop etiketli ribozomal proteinin aşağı çekilmesiyle TRAP ile entegre edilebilir11.
Sonuç olarak, sakkaroz gradyan yapımı ve fraksiyonasyonu için burada rapor ettiğimiz platform ve protokol, beyin gelişimi ve diğer biyolojik bağlamlar bağlamında polizom profilleme deneylerine ekonomik bir çözüm sunun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma bir NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.) tarafından finanse edildi. G.Y. Kanada Araştırma Başkanı. S.K., Mitacs Globalink Lisansüstü Bursu ve ACHRI Lisansüstü Öğrenci Bursu tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
