Summary
אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל דימום פונטין מסיבי בחולדה באמצעות הזרקה כפולה של דם אוטולוגי.
Abstract
אנו מספקים פרוטוקול להקמת מודל דימום פונטין מסיבי בחולדה. חולדות במשקל של כ 250 גרם שימשו במחקר זה. מאה מיקרוליטרים של דם אוטולוגי נלקחו מווריד הזנב והוזרקו באופן סטראוטקסי לתוך הפוני. תהליך ההזרקה חולק לשני שלבים: ראשית, 10 μL של דם הוזרק למקום מסוים, מיקום anteroposterior (AP) -9.0 מ"מ; לרוחב (לאט) 0 מ"מ; אנכי (Vert) -9.2 מ"מ, ואחריו זריקה שנייה של שאריות הדם הממוקם ב AP -9.0 מ"מ; לאט 0 מ"מ; ורט -9.0 מ"מ עם מרווח זמן של 20 דקות. בדיקת קרן האיזון, בדיקת מיקום הגפיים, ונויקור ווסטץ' שונה שימשו להערכת תפקוד נוירולוגי. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) שימשה להערכת נפח הדימום ב vivo. הסימפטומים של מודל זה היו בקנה אחד עם חולים עם דימום פונטין מסיבי.
Introduction
דימום תוך-מוחי מהווה חמישית מחולי השבץ. הפרוגנוזה של דימום תוך-מוחי תלויה במהירות, בנפח ובמיקום הדימום1,2. בהשוואה לדימום המוחי, דימום גזע המוח יש תמותה גבוהה יותר ותחלואה3. כ -40% מדמם גזע המוח מתרחשת בפונים4. האטיולוגיה והפתופיזיולוגיה של דימום פונטין הם שונים למדי ופחות למד מאשר דימום forebrain5.
ישנם שני סוגים של מודלים של בעלי חיים דימום פונטין. אחד הוא מודל דימום ספונטני המושרה על ידי עירוי של קולגנאז חיידקי ב pons6,7,8. היתרון הגדול ביותר של מודל זה הוא שהדימום הוא ספונטני. עם זאת, קולגנאז יכול רק לגרום נפח קטן של דימום פונטין. חוץ מזה, קולגנאז עלול לגרום לפציעות אחרות במוח. המודל השני הוא המושרה על ידי הזרקה סטריאוטיפית של דם אוטולוגי לתוך pons9. היתרון של מודל זה הוא שקל לשלוט עם אחוזי הצלחה גבוהים. תיאורטית, חוקרים יכולים להזריק כל נפח של דם לכל מיקום של פונס. עם זאת, בשל הדליפה האחורית דרך מסלול המחט, נפח מוזרק מוגבל. לאחרונה, שיטת ההזרקה הכפולה קודמה כדי להפחית את דליפת הגב9. שיטה זו מזריקה דם אוטולוגי פעמיים עם מרווח של 20 דקות בין הזריקות. שיטת ההזרקה הכפולה מוחלת כדי לגרום לדימום פונטין מתון (30 μL) ומתון (60 μL) אך לא דימום פונטין מסיבי. במרפאה, רוב חולי דימום פונטין עם פרוגנוזה ירודה יש דימום מסיבי (יותר מ 10 מ"ל).
במחקר הקודם, סיפקנו פרוטוקול להקים מודל שבץ איסכמי פונטין בחולדה10. במחקר זה, אנו משנים את שיטת ההזרקה הכפולה הקיימת, ומספקים פרוטוקול מפורט כדי לגרום לדימום פונטין מסיבי בחולדה על ידי הזרקה כפולה של 100 μL דם אוטולוגי בשני מקומות שונים pons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים השני המסונפת של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו. חולדות סופקו על ידי מרכז החיות של האוניברסיטה הרפואית הדרומית. העיצוב הניסיוני מוצג באיור 1.
1. בעלי חיים וכלי נגינה
- השתמש בחולדות Sprague-Dawley זכר בן 8 שבועות במשקל 250 ± 10 גרם.
- בית החולדות לפחות 7 ימים לפני הניתוח בתנאים סביבתיים מבוקרים עם טמפרטורת סביבה של 25 °C (65 °F), לחות יחסית של 65%, ומחזור 12/12 שעות כהה בהיר.
- לספק מזון ומים ללא הגבלה.
- הכינו את המכשירים (איור 2A-E).
2. להזריק את הדם ב pons
- לשקול את החולדות שוב 3 ימים לפני הניתוח כדי לבחור חולדות עם משקל גוף מתאים לניסויים.
- במהלך 3 ימים לפני דוגמנות, לאמן את החולדות ללכת על קרן איזון 3 פעמים ביום כדי להבטיח חולדות נורמלי יכול לעבור את קרן האיזון ללא הפסקה.
- מחממים את כרית החימום ל 37 מעלות צלזיוס לפני ההרדמה.
- חבר מיקרודריל למחזיק במסגרת הסטראוטקסית.
- להזריק את החולדות עם קטמין 50 מ"ג /ק"ג ו 5 מ"ג / קילוגרם xylazine תוך-פירו-יטון. המתן עד שלא תהיה תגובת צביטה של בוהן.
- להעביר את החולדה לתוך מסגרת סטראוטקסית במצב נוטה. שים את מוטות האוזן מעל תעלת האוזן כדי לאבטח את הראש. תקן את הגולגולת במצב אופקי כדי למנוע הטיית ההזרקה (איור 2F).
- לשמור על הרדמה על ידי isoflurane (97.5% חמצן ו 2.5% isoflurane) באמצעות חרוט האף סטראוטקסי עם כניסת יציאת שקע.
- השתמש משחת עיניים כדי לשמור על הקרנית לחה.
- לגלח את השיער מעל הגולגולת עם מכונת גילוח מיקרו.
- ציירו קו אמצע בגודל 3 ס"מ עם עט סימון בגולגולת מקו הקנטוס הדו-צדדי לרוחב עד 0.5 ס"מ מאחורי הפונטנל האחורי, כפי שמוצג באיור 2F.
- החל Entoiodine כירורגי לשפשף בצורה מעגלית, החל באמצע קו אמצע מסומן מסתובב כלפי חוץ.
- מניחים את הווילון הכירורגי.
- בצע חתך עם אזמל לאורך קו האמצע המסומן.
- השתמש ספוגית כותנה כדי להסיר כל דם פוטנציאלי.
- מניחים חתיכת מלקחיים על כל צד של דש הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת (איור 2G).
- טובלים ספוגית כותנה ב-0.9% מלוחים ומסירים בעדינות את רקמות החיבור מעצם הגולגולת כדי למנוע מרקמות החיבור להיתפס במיקרו-דrill.
- סמן את הנקודה המרכזית של ה bregma כנקודת המוצא באמצעות עט סמן.
- בצעו גולגולת (קוטר 1 מ"מ) באמצעות מיקרו-דריל ב-AP-9.0 מ"מ, לאט 0 מ"מ(איור 1B וטבלה 1). המשיכו בזהירות מכיוון שנקודה זו קרובה מאוד לסינוס הוורידי(איור 2G).
- הסר את המיקרו-דיל מהמסגרת הסטראוטקסית.
- שים מזרק המילטון 100 μL לתוך מחזיק סטראוטקסי (איור 2K). הפעל את מתג משאבת ההזרקה, לחץ על כפתור שאיפה מהירה, פתרון הפרין שאיפה (12500 U מדולל ב 100 מ"ל של מלוחים) כדי 100 μL ולאחר מכן לנקז אותו לחלוטין כדי למנוע קרישת דם מהר מדי.
- החל chlorhexidine ו 75% אלכוהול כירורגי לשפשף את הזנב כולו מהשורש כדי להטות לפחות 3 פעמים כדי לחטא את העור, לרכך את החרמנות, ולהגדיל את וריד הזנב כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הזרקה.
- חבר דיקור קרקפת למזרק 1 מ"ל.
- הכנס את דיקור הקרקפת לווריד זנב לרוחב 3 ס"מ מקצה הזנב וקח 150 μL של דם (איור 2H).
- הסר את דיקור הקרקפת מהמזרק 1 מ"ל.
- מעבירים את הדם לצינור (איור 2I).
הערה: העבר במהירות כדי למנוע קרישת דם. - תחליף את הכפפות הכירורגיות.
- בחר מצב משיכה, הגדר את עוצמת הקול ל- 100 μL, הגדר את המהירות ב- 200 μL/min, לחץ על לחצן RUN, שאף 100 μL של דם למזרק המילטון (איור 2J).
- בחר מצב החדרה, הגדר את המהירות ב- μL אחד לדקה.
- קדם את המזרק עד שהקצה יגיע ל-9.2 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח(איור 1C ואיור 2L).
- לחץ על כפתור הפעלה, להזריק את הראשון 10 μL של דם במהירות של 1 μL / min (טבלה 1).
- לעצור את הזריקה ולהשאיר את המזרק בעמדה במשך 20 דקות כדי למנוע דם לזרום לתוך החלל התת-קרקעי.
- לסגת המזרק עד הקצה מגיע ב 9.0 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח.
- הזרקה מחדש באותה מהירות של 1 μL / min עד הדם שיורית הוזרק לחלוטין.
- השאירו את המזרק בעמדה במשך 10 דקות, כדי למנוע זרימת דם.
- הסר את המזרק מהמוח לאט.
- השתמש מלט עצם כדי לכסות את החור craniotomy.
- כאשר המלט מתייבש, לתפור את הפצע עם 4-0 תפר פוליאמיד חוטים. לאחר תפירה 3 או 4 stiches, לקשור 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
- כדי למנוע זיהום, להזריק את החולדה עם פניצילין (0.25 מ"ל, 80 יחב"ל מדולל ב 4 מלוחים מ"ל) תוך-אופן.
- להזריק את החולדות תת עורית עם טרטרט Butorphanol (2.5 מ"ג / קילוגרם) ולחזור על הזריקה כל 2 שעות להקלה על כאב לאחר הניתוח עד 24 שעות לאחר הניתוח.
- שימו לב לחולדה כל 15 דקות עד שהיא מתאוששת לחלוטין מהרדמה. החזירו אותו לכלוב המקורי, עם כרית חימום מתחת לכלוב. ספק לחולדה גישה חופשית למזון ומים עד להקרבה.
3. בדיקות התנהגותיות
הערה: בצע בדיקות התנהגותיות ביום 1, יום 3, יום 7 ויום 14 לאחר דוגמנות, כולל בדיקת קרן האיזון, בדיקת מיקום הגפיים ונויקור Voetsch שונה.
- בדיקת קרן איזון11.
הערה: זהו מבחן במיוחד לבדיקת הפונקציה sensorimotor של hindlimb.- הכין את המנגנון כדי להבטיח כי הקרן (3 ס"מ רוחב × 70 ס"מ) הוא 20 ס"מ מעל הרצפה.
- שים קופסה כהה בקצה האחורי של הקרן עם כניסה צרה.
- מניחים מחולל רעש לבן ומקור אור בהיר, אשר משמשים כדי להניע את החולדה לחצות את הקרן ולהיכנס לתיבת המטרה, בקצה הראש של הקרן.
- עצרו את הרעש והאור כאשר החיה נכנסת לתיבת המטרה. רשום את ההשהיה מקצה הראש לתיבת המטרה (בשניות) ואת הביצועים של hindlimb במהלך חציית הקרן.
- רשום את ניקוד הביצועים כדלקמן: 0, מאזן עם יציבה יציבה; 1, צד אחיזה של קרן; 2, מתכרבל הקורה עם 1 hindlimb נופל; 3, מתכרבל הקרן עם 2 גפיים נופלים, או מסתובב סביב הקרן במשך יותר מ 60 s; 4, מנסה לאזן על קרן >40 s, אבל נופל; 5, מנסה לאזן על קרן >20 s, אבל נופל; ו 6, נופל, ללא ניסיון לאזן או איזון על קרן <20 s.
- בדיקת מיקום גפיים
הערה: מבחן מיקום הגפיים בוחן 3 גירויים עצמאיים של ראייה, מגע, ו proprioception עם 6 פרמטרים, כדי להעריך את הפונקציה sensorimotor של חולדה. הציון הכולל של הפונקציה הנוירולוגית נע בין 0 ל-12. לפני הבדיקה, חולדה צריכה להיות רגילה לטיפול.- החזיקו את החולדה מאחור והניחו אותה על השולחן באיטיות מגובה של 10 ס"מ. בדרך כלל, החולדה הייתה למתוח forelimbs ומניח אותם על השולחן.
- תפוס את החולדה מאחור והחזק אותה מול קצה השולחן. התגובה של forelimbs הוא ציין. חולדה רגילה הייתה מניחה את הנוזלים על השולחן.
- תן לחולדה לתפוס את קצה השולחן. חולדה רגילה תשתמש בסנטר כדי למנוע משיער האף והאף לגעת בקצה השולחן.
- שים את החולדה על השולחן, לדחוף את החולדה עם לחץ לרוחב עדין מאחורי כתפו של החולדה לכיוון קצה השולחן, ולהתבונן במיקום של forelimbs ו hindlimbs. חולדה רגילה הייתה תופסת את הקצה עם הרגליים הקדמות וההינדלימבים שלה.
- מניחים את החולדה על השולחן עם הפנים לכיוון הקצה, בעדינות לדחוף אותו מהגב לקצה. חולדה רגילה תתפוס את הקצה עם הקצוות שלה.
- מניחים את החולדה על השולחן עם הגב לקצה ולדחוף אותו על ידי הגב לקצה השולחן. שימו לב לתגובה של ההינדסים. חולדה רגילה תתפוס את הקצה עם ההינדסיות האחוריות שלו.
- להעריך את המיקום של forelimbs או hindlimbs לקצה השולחן. רשום את הציונים באופן הבא: 0, ללא מיקום; 1, מיקום לא גמור ו/או מושהה; 2, מיקום מיידי, מלא.
- מדע המוח שונה Voetsch8
הערה: מדע המוח Voetsch שונה הוא ציון סולם vertebrobasilar של יכולת sensorimotor, המכיל 14 פרמטרים: תנועת ראש, פעילות, שמיעה, רפלקס כאב, רפלקס הקרנית, proprioception, תחושה בצוואר, חקירה, חג, תחושת פלג גוף עליון צירי, תנועה 4-limb, תנועה forelimb, טיפוס, והליכה קרן. הציון עבור כל פרמטר נע בין 0 (גירעון נוירולוגי מלא) ל -3 (ללא גירעון נוירולוגי). הציון הכולל של הפונקציה הנוירולוגית נע בין 0 ל-42.- מניחים את החולדה על השולחן (50 ס"מ אורך × 35 ס"מ רוחב) ולאפשר לו לנוע במשך חמש דקות. התבונן בתנועה הספונטנית של ראשו: נע בכל הממדים, 3; מעדיף צד אחד, 2; רק תנועה לצד אחד, 1; מכופף לצד חד צדדי, 0.
- מניחים את החולדה על השולחן (50 ס"מ אורך × 35 ס"מ רוחב) ולאפשר לו לנוע במשך חמש דקות. הפעילות מוגדרת כ: מגיבה במלואה, 3; מגיב בינוני, 2; תגובה מינימלית, 1; תרדמת, 0.
- שימו לב להקפות הקרניוקודל: פונה דו-צדדית, 3; מעדיף צד אחד, 2; רק לצד אחד, 1; נפל לצד אחד, 0.
- להעריך את התנועה forelimbs: תנועה שווה דו-צדדית, 3; אסימטריה קלה, 2; אסימטריה גדולה, 1; פארסיס, 0.
- להעריך את התנועה 4-גפיים: תנועה שווה דו-צדדית, 3; אסימטריה קלה, 2; אסימטריה גדולה, 1; פארסיס, 0.
- כאשר החולדה נייחת, בצע קמצוץ באוזן כדי לעורר את auricles ולבדוק את רפלקס הכאב: מתרחק במהירות וסימטרית מגירוי, 3; מתרחק לאט או באופן א-סימטרי מגירוי, 2; מראה תנועה מסוימת בתגובה לכאב, 1; אין תגובה, 0.
- כאשר החולדה נייחת, לעשות רעש משני צדי הגוף של החולדה כדי לבדוק שמיעה: אצבעות שפשוף, 3; הצמדת אצבעות, 2; מחיאות כפיים חזקות, 1 ולא מבהיל, 0.
- כדי לבדוק את proprioception, לגעת vibrissae של החולדה משני הצדדים בהתאמה עם מקל קהה להתבונן בתגובתה לגירוי: להגיב במגע, 3; תגובה מופחתת בצד אחד, 2; פחתה משני הצדדים, 1; נעדר, 0.
- כדי להעריך את תחושת ציר פלג הגוף העליון, מניחים מקל קהה משני צדי גופו של החולדה ומתבוננים בתגובתו לגירוי: תגובה מהירה וסימטרית לגירויים, 3; תגובה מעט פחתה או א-סימטרית, 2; תגובה מופחתת מאוד וא-סימטרית, 1 וללא תגובה, 0.
- כדי לבדוק את רפלקס הקרנית, להחזיק את החולדה ולגעת במהירות הקרנית משני הצדדים עם ספוגית כותנה: שתי העיניים לעצום במהירות, 3; רפלקס מופחת בצד אחד, 2; פחתה משני הצדדים, 1; נעדר, 0.
- כדי לבדוק את התחושה של הצוואר, להחזיק את החולדה ולהשתמש במקל קהה לגעת בצוואר: מגיב למגע פעיל, 3; תגובה איטית למגע, 2; תגובה מופחתת מאוד, 1; אין תגובה, 0.
- כדי להתבונן בחקירה, השתמש בקופסה כהה בהירה.
הערה: שני שלישים מהקופסה צריכים להיות פתוחים ומוארים, בעוד השאר מכוסה וחשוך. דלת 7 ס"מ מחברת בין שני התאים. - מניחים את החולדה בתא האור במשך 5 דקות ולאחר מכן את התא הכהה במשך 5 דקות נוספות, לאפשר לו לנוע ולתעד את פעילות החולדה. כאשר 4 גפיים ממוקמות בחדר אחד, רשום אותו ככניסה. תוצאות שיא כדלקמן: מגיע לתאים בהירים וכהים באופן פעיל, 3; מגיע לתא אחד, 2; נע לאט רק לאחר גירוי, 1; ובלי תנועה, 0.
- כדי לבדוק את יכולת הטיפוס, הניחו את החולדה בתחתית מישור ברוחב 20 ס"מ ובאורך 70 ס"מ עם זווית של 30 מעלות לקרקע האופקית. תוצאות שיא כדלקמן: מסוגל לטפס לפסגה, 3; טיפוס לקוי, 2; אחיזה נייחת, 1; ונופל מיד, 0.
- כדי לבחון את ההליכה קרן, לשים את החולדה בקצה אחד של קרן 3 ס"מ רוחב, 70 ס"מ אורך אשר 20 ס"מ מעל הקרקע, שיא ציונים כדלקמן: בוחן את הקרן כולה, 3; חוקר חלק מהקרן, 2; קצת תנועה ונפילות, 1; אין תנועה, 0.
- חשב את הנקודות.
4. אישור דימום על ידי MRI
- בצע את סריקת ה-MRI במהירות של 24 שעות לאחר הניתוח.
- יש למרדים את החולדה עם isoflurane (5% לאנדוקציה, 1%-1.5% לתחזוקה).
- אבטחו את ראש החולדה בסליל מערך המוח של החולדה בשילוב עם סליל נפח משדר בלבד.
- מניחים את הסליל יחד עם החולדה בסורק MRI. אבטחו את החולדה בתוך העריסה דרך השן וסורגי האוזניים.
- השתמש ז'קט תרמי במעגל סגור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה ב 37 ± 0 °C (60 °F) במהלך סריקת MRI.
- בצע רצף פיילוט כדי להבטיח גיאומטריה נכונה.
- החל רצף הד מהיר כדי לאסוף סריקות משוקלל T2. הגדר את הפרמטרים באופן הבא: זמן הד (TE), 132 אלפיות שניה; זמן חזרה (TR), 2,500 אלפיות השנייה; מטריצת רכישה, 148 × 148; שדה הראייה, 100 מ"מ × 100 מ"מ; 12 פרוסות; בעובי 1.5 מ"מ.
- תחזיר את החולדה לכלוב.
5. אישור דימום על ידי אנטומיה ברוטו
הערה: להקריב את החולדות בנקודת הזמן המיועדת, 24 שעות ו-14 ד' לאחר הניתוח (איור 1D).
- הרדמה החולדה עם 5% isoflurane עד אובדן הכרה. לאחר מכן, המתת חסד עם פחמן דו חמצני (CO2) (20-30% מנפח הכלוב לדקה).
- אשר את המוות באמצעות הסימנים הבאים: אין חזה עולה ויורד, אין פעימות לב מוחשיות, אין תגובה לצביטת בוהן, צבע רירית לקוי, שינוי צבע או אטימות בעיניים.
- בצע נקע בצוואר הרחם.
- אבטח את החולדה על ידי הדבקת כפות הרגליים על פלטפורמה סטרילית. צור חתך קו האמצע מצוואר הרחם כדי לחשוף את ההיפוגסטרום לבית החזה והכבד. בצע חתך רוחבי משולי החזה העליונים לאורך עצם הבריח שמאלה הרחוקה וחתך רוחבי נוסף מן xiphoid לאורך הסרעפת לשמאל הרחוק, כדי לחשוף את הלב. הרם את דש בית החזה ותקן אותו לפלטפורמה עם סיכה.
- לחבר את הקצה של מחט (27 G) למשאבת זלוף המכיל 4 מעלות צלזיוס מלוחים. לקדם את קצה המחט לתוך הלב לאורך הקצה השמאלי של החדר השמאלי, כדי למנוע כניסה אטריום. הפעל את משאבת הזעה כדי להבטיח את הקצה הוא בחדר השמאלי, ולאחר מכן לבצע חתך באטריום הימני.
- מכבים את משאבת הזעה כאשר הנוזל מנוקז מהאטריום הימני הופך חסר צבע והכבד הופך ללבן. הליך זה צריך בערך 100 מ"ל 4 °C (70 °F) מלוחים.
- ערפו את ראש החולדה וקצרו את כל המוח בעזרת מספריים ומלקחיים. הסר כל לחות מפני השטח של המוח עם נייר סופג.
- שמור על המוח כולו ב -80 מעלות צלזיוס למשך דקה.
הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם ניתן לחתוך את המוח ללא הקפאה. - הנח את המוח לתוך מטריצת המוח של החולדה הקרונלית כשצד הגב למעלה.
- הכנס להב נירוסטה בעובי 0.21 מ"מ למרכז הדימום בהתאם לחור בפני השטח של המוח.
- הכנס להבים אחרים לתוך המוח במרווח של 2 מ"מ.
- לטבול את חלקי המוח ב 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון עבור 24 שעות ב 4 °C (69 °F). לשטוף אותם עם 0.01 mmol / L פוספט אגירה מלוחים (PBS).
- ארגן את המקטעים מ rostral כדי caudal ותדמית אותם.
6. סעיף פרפין והמטוקסילין ואאוסין (HE) מכתימים
- לתקן את המוח עם 4% פתרון PFA לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר. הנפח של PFA צריך להיות 5-10 פעמים של נפח המוח.
- חותכים את המוח ממרכז הדימום לשתי חתיכות באמצעות להב ומטריצת מוח של חולדת קורנל.
- הפוך בלוקים רקמה משובצת פרפין.
- מחלקים את הרקמה משובצת הפרפין חוסמים את קורנלי במגלשות עובי של 40 מיקרומטר על מיקרוטום, חותכים 4 חלקים ברצף, החל ממרכז הדימום, ומציפים אותם באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.
- הר את 40 μm סעיפים (8 שקופיות בסך הכל עבור מוח אחד) על שקופיות זכוכית נקייה אוויר יבש לילה בטמפרטורת החדר.
- אופים את השקופיות ב 56 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
- לשטוף במשך 3 דקות בקסילין, 3 פעמים.
- טבילה סעיפים 30 פעמים ב 100% אתנול, 30 פעמים נוספות ב 100% אתנול, 30 פעמים ב 95% אתנול, ו 30 פעמים נוספות ב 95% אתנול.
- יש לשטוף במי ברז עד לניקוי.
- לטבול את החלקים בהמטוקסילין במשך כ 10 דקות.
- שוטפים במי הברז עד שהם צלולים.
- לטבול קטעים בכתם אאוסין במשך 30 s.
- לייבש שקופיות עם 3-4 מטבלים 95% אתנול, 3-4 מטבלים 100% אתנול, 100% אתנול במשך 1 דקה, ו 10 מטבלים 100% אתנול + xylene (1:1).
- נקה חלקים עם קסילן במשך דקה, 2 פעמים.
- הרכבה באמצעות מדיום הרכבה לא מימי וכיסוי.
- יבש את החלקים באוויר לילה בטמפרטורת החדר, ואז סן אותם.
7. סטטיסטיקה
- השתמש GraphPad פריזמה 6.0 כדי לחשב את מבחן t של התלמיד או מאן ויטני U מבחן.
הערה: כל הנתונים צריכים לבוא לידי ביטוי כמשמעותי ± SE. ההבדלים בין שתי קבוצות נקבעים עם מבחן t של סטודנט דו-זנבי או מבחן מאן ויטני U. P<0.05 מוגדר כמשמעות סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בסך הכל 25 בעלי חיים שימשו, 3 לשליטה, 6 עבור 30 μL, 6 עבור 60 μL, ו 10 עבור 100 זריקות דם μL. חולדה אחת שקיבלה הזרקת 100 μL של דם אוטולוגי (1/10) מתה תוך 24 שעות לאחר הניתוח.
בדיקות התנהגותיות נערכו ביום 1, יום 3, יום 7 ויום 14 לאחר הניתוח. הציונים עבור קבוצת הביקורת וקבוצות הזרקת הדם בנקודות זמן שונות לאחר הניתוח מוצגים בטבלה 2. דימום הפונטין גרם לגירעונות נוירולוגיים כמו רפלקס קרנית מופחת וחיובים(איור 3B,C). הזרקה של 100 μL דם גם גרמה מיוטוניה(איור 3A). תוצאות בדיקת קרן האיזון, בדיקת מיקום הגפיים ונויקור Voetsch ששונו גילו כי התפקוד הנוירולוגי ירד ככל שנפח הדימום של פונטין גדל.
סריקת MRI בוצעה 24 שעות לאחר הניתוח (איור 4). בקבוצות הזרקת הדם, ברצף T2, דימום זוהה כחפת hypointense עם ליבת iso- כדי מעט hyperintense בחלק הבזילארי של pons. לא זוהה דימום על ידי MRI באזורים אחרים במוח (איור 4). נפח הדימום גדל ככל שנפח ההזרקה של דם אוטולוגי גדל.
לאחר מכן הוקרבו חולדות ב-24 שעות וביום ה-14 לאחר הניתוח, בנפרד, ובוצעו קטעים בעובי 2 מ"מ (איור 4). דימום זוהה סביב אתר ההזרקה והפצה בבסיס של פונס. הייתה בצקת קלה סביב הדימום בקבוצת הזרקת הדם 100 μL.
חלק מהחולדות הוקרבו 3 ימים לאחר הניתוח פרפין-חתך לעשות מכתים HE. התוצאות הראו כי בקבוצות הזרקת הדם, תאים דלקתיים מועשרים באזור הדימום פרי (איור 5C ו- F). המוגלובין נשאר כלול בתוך תאי דם אדומים שלמים (איור 5D ו- G).
איור 1: דיאגרמות סכמטיות של מודל דימום פונטין. (ב) הדיאגרמה הסכימטית של מיקום הסתעפות. (ג) הדיאגרמות השרטוטיות של מיקום ההזרקה. (ד) עיצוב ניסיוני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מכשירים והליך של ניתוח. (א) מכונת הרדמה. (ב) מכשירים כירורגיים. (ג) מיקרודריל. (ד) משאבת הזרקה זעירה. (ה) מנגנון סטראוטקסי. (ו) קו המסומן באמצע הגולגולת. (ז) נקודות חץ צהובות למיקום הסתעפות. (ח) ניקוז דם מווריד הזנב. (I) להעביר את הדם לצינור אפנדורף. (J) לשאוף את הדם לתוך מזרק המילטון. (K) לקדם את מזרק המילטון דרך חור הגולגולת. (L) תהליך הזרקה של דם אוטולוגי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של בדיקות התנהגותיות. (A) מיוטוניה בחולדה מוזרקת 100 μL של דם אוטולוגי. (B) רפלקס קרן מופחת בצד ימין בחולדה מוזרק 60 μL של דם אוטולוגי. (ג) רפלקס קרנית מופחת בצדדים הדו-צדדיים בחולדה מוזרק 100 μL של דם אוטולוגי. (ד) חולדה קיבלה 60 μL של דם אוטולוגי מוקף בצד הנגדי של הנגע. (ה) תוצאות בדיקת קרן איזון. (ו) תוצאות של מדע המוח שונה Voetsch. (ז) תוצאות בדיקת מיקום הגפיים. קו פירושו הבדל משמעותי בין שתי הקבוצות (p < 0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של סריקת MRI ואנטומיה ברוטו. סריקת ה- MRI (Upper) בוצעה 24 שעות לאחר ניתוח דימום פונטין, ואז החולדות הוקרבו ונחתכו לחלקי מוח של 2 מ"מ (תחתון). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של מכתים HE. המוחות נקצרו מהחולדות הזריקו 100 μL של דם 3 d לאחר הניתוח. (א) כל החלק במוח. שדות נמוכים מ-(B) אזור הפונטין הרגיל, (C) אזור פרי-נגע וליבת דימום (D). שדות גבוהים מאזור פונטין רגיל (E), אזור פרי-נגע (F) וליבת דימום (G). סרגל קנה המידה היה 100 מיקרומטר.
איור S1: תוצאות מייצגות של אנטומיה ברוטו ביום ה-14 לאחר הניתוח. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| מתון | מתון | מסיבי | |
| נפח כולל | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| זריקה ראשונה | |||
| קואורדינטות סטראוטקטיות | AP -9.0 מ"מ; לאט 0; ורט -9.2 מ"מ | ||
| נפח | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| מהירות | μL אחד / דקה | μL אחד / דקה | μL אחד / דקה |
| זמן מרווח זמן | 20 דקות | 20 דקות | 20 דקות |
| זריקה שנייה | |||
| קואורדינטות סטראוטקטיות | AP -9.0 מ"מ; לאט 0; ורט -9.2 מ"מ | AP -9.0 מ"מ; לאט 0; ורט -9.0 מ"מ | |
| נפח | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| מהירות | μL אחד / דקה | μL אחד / דקה | μL אחד / דקה |
| לפני נסיגת המחט | 10 דקות | 10 דקות | 10 דקות |
| AP: תנוחת אנטרופוסטריור | |||
| לאט: לרוחב | |||
| ורט: אנכי | |||
טבלה 1: הזרקת דם אוטולוגי.
| מספר עכברוש | יום 1 | יום 3 | יום 7 | היום ה-14 |
| מדע המוח שונה Voetsch | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| שאם-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| שאם-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| שאם-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| בדיקת קרן איזון | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| שאם-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| שאם-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| שאם-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| בדיקת מיקום גפיים | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| שאם-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| שאם-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| שאם-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
טבלה 2: תוצאות של בדיקות התנהגותיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי, סיפקנו פרוטוקול כדי ליצור מודל עכברוש דימום פונטין מסיבי. מודל זה יכול לשמש למחקר על המנגנון הפתופיזיולוגי והאבחנה של דימום פונטין מסיבי.
במהלך הניסוי נעשה שימוש ב-25 חולדות, שרק אחת מהן מתה. אימות ה-MRI, האנטומיה הגולמית והכתמת ה-HE הצביעו על כך ששיטה זו הייתה בעלת שיעור תמותה נמוך מאוד ושיעור הצלחה גבוה. כדי להקים מודל דימום פונטין מסיבי, שתי בעיות חייב להיפתר, הדם האוטובולוגי מוזרק נוטה לדלוף לתוך החלל התת-עורי ולזרום בחזרה לחדר הרביעי לאורך דרכי המחט. המודל הקיים של הזרקה כפולה מתון (60 μL דם אוטולוגי בסך הכל) מודל דימום פונטין פתר את הבעיה הראשונה, בקושי כל דם זרם לתוך החלל התת-קרקעי. עם זאת, עדיין הייתה כמות קטנה של זרימת דם חזרה. במחקר הנוכחי, מספר אסטרטגיות יושמו כדי לייעל את שיטת ההזרקה הכפולה הקיימת כדי לאפשר להזריק כמות גדולה יותר של 100 μL דם אוטולוגי ללא זרימה חוזרת. ראשית, שני מקומות הזרקה שונים במקום אחד הועסקו. שנית, הפרין שימש כדי לשטוף את המזרק עם שאריות מינימליות כדי להפחית את המינון, על מנת להגן רק על הדם מפני קרישה במהלך תהליך ההזרקה, אבל לא מספיק כדי לקדם דליפה וזרימת בחזרה לאחר ההזרקה. שלישית, זמן ההזרקה היה ארוך ומהירות ההזרקה הייתה איטית, 1 μL / min. יתר על כן, רק כמות קטנה של דם אוטולוגי הוזרק בפעם הראשונה, בעוד הזריקה השנייה בוצעה 20 דקות מאוחר יותר. לאחר מכן, המחט נסוגה רק לאחר 10 דקות, והליך זה נערך לאט מאוד. בשיטה זו, בקושי היה כל דם זורם לתוך החלל subarachnoid או החדר הרביעי בחולדות מוזרק עם 30 μL או 60 μL של דם אוטולוגי, אבל עדיין היה כמות קטנה של זרימה אחורית בחולדות מוזרק עם 100 μL. הארכת הזמן לפני הסרת המחט יכול לפתור את הבעיה.
בדיקות התנהגותיות בוצעו ביום 1, יום 3, יום 7 ויום 14 לאחר דוגמנות, כולל בדיקת קרן איזון, בדיקת מיקום גפיים, ואת המוח Voetsch שונה. ביום הראשון לאחר הניתוח, כמעט כל החולדות בקבוצות הזרקת הדם הראו התנהגות חגה (כלומר, פנייה שמאלה או ימינה), מלווה בהיעלמות של רפלקס קרן חד צדדי או דו-צדדי. למרות שדם אוטולוגי הוזרק בקו האמצע של הפונטין, הוא הופץ בצורה לא אחידה בשני צידי המוח. נראה שזו הסיבה לביצועים השונים במבחנים התנהגותיים. הפעילויות והתגובות של החולדות הזריקו 30 μL או 60 μL של דם אוטולוגי הואט קרוב יותר לנורמלי. בחולדות הזריקו 100 μL של דם, הפונקציות sensorimotor נחלשו באופן משמעותי והתגובה הייתה גרועה. קשיחות שרירים הופיעה בכמה חולדות במצב המנוחה. ביום 1, יום 3 ויום 7, היו הבדלים ברורים בין חולדות מוזרק 30 μL, 60 μL או 100 μL של דם אוטולוגי ואת החולדות בקבוצת הביקורת של המוח Voetsch שונה. במבחן קרן האיזון ומבחן מקום הגפיים, לא היו הבדלים משמעותיים בין החולדות הזריקו 30 μL או 60 μL של דם ואת החולדות בקבוצת הביקורת בכל נקודות זמן. עם זאת, התוצאות של בדיקת קרן האיזון ובדיקת מיקום הגפיים בחולדות הזריקו 100 μL של דם אוטולוגי היו שונים באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת ביום 1 וביום 3. הסיבה האפשרית יכולה להיות שיש פחות פריטי הערכה במבחן קרן האיזון ומבחן מיקום הגפיים בהשוואה לנויקור Voetsch שונה, שאינם רגישים מספיק כדי לגלות ליקויים נוירולוגיים עדינים. זה לא הולם להשתמש בשתי שיטות אלה כדי להעריך התנהגות במודלים דימום עם תסמינים קלים, אבל הם ישימים במודל דימום פונטין מסיבי. בסך הכל, מדע המוח Voetsch שונה התברר להיות מתאים יותר להערכת מקיפה ומדויקת את הפונקציות הנוירולוגיות במודלים שונים דימום פונטין.
ישנם מספר יתרונות של שיטה זו. בהתבסס על שיטת ההזרקה הכפולה הקודמת, מיקום ההזרקה השני השתנה והמינון של הפרין הותאם כדי למנוע דליפה וזרימת חזרה בדגם הדימום המתון (30 μL) והמתון (60 μL). אפילו במודל דימום הפונטין המסיבי (100 μL), הזרימה האחורית הייתה מוגבלת מאוד, והתרחשה רק במספר קטן של חולדות. שיטה זו יכולה להתבצע בקלות עם שיעור הצלחה גבוה ושיעור תמותה נמוך. יתר על כן, דימום פונטין ניסיוני ניתן לראות במהלך תקופה ארוכה, לפחות 14 ימים לאחר דוגמנות, אשר תורם לחקור את התפתחות המחלה כולה ואת ההשפעות של טיפולים. ההתקדמות העיקרית של מודל זה הייתה שהוא חיקה את הסימפטומים של חולים עם דימום פונטין. מבחינה קלינית, דימום פונטין מסיבי גורם לגירעונות נוירולוגיים חמורים, בעוד מודלים קודמים של דימום פונטין פיתחו רק נפח דימום קטן יחסית עם תסמינים קלים. דימום פונטין מסיבי במודל זה מופץ pons הדו-צדדי, אשר דומה עם התפלגות דימום בחולי דימום פונטין. במודלים ניסיוניים קודמים של דימום פונטין, הדימום ממוקם רק בפונס9החד צדדי .
עם זאת, יש גם כמה מגבלות של שיטה זו. ראשית, דימום פונטין במחקר זה נגרם על ידי הזרקת דם, הפריניזציה חלקית במהלך המעבר, אשר עשוי להשפיע על קרישת הדם או אפילו הומאוסטזיס ב pons שמסביב. שנית, דגם זה דורש ציוד מיוחד, כגון מנגנון סטראוטקסי ומשאבת הזרקה. שלישית, המודל הזה לא יכול לחקות דימום ספונטני.
לסיכום, מחקר זה סיפק שיטה ליצירת מודל דימום פונטין מסיבי אקוטי ניסיוני בחולדה, אשר יכול לקדם מחקר מכני וטיפולי חדש בתחום זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (81471181 81870933) ותוכנית המעבדה הפותחת של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו (0506308) ל- Y Jiang, ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (81701471) והתוכנית המדעית של ועדת הבריאות העירונית של גואנגג'ואו (20191A011083) ל- Z Qiu, ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (81501009) ל- L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
