Summary
Presentiamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un ratto attraverso la doppia iniezione di sangue autologo.
Abstract
Forniamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un topo. In questo studio sono stati utilizzati ratti del peso di circa 250 grammi. Cento microlitri di sangue autologo sono stati prelevati dalla vena della coda e iniettati stereotassicamente nei pons. Il processo di iniezione è stato diviso in 2 fasi: in primo luogo, 10 μL di sangue sono stati iniettati in una posizione specifica, posizione anteroposterior (AP) -9,0 mm; laterale (Lat) 0 mm; verticale (Vert) -9,2 mm, seguito da una seconda iniezione del sangue residuo situato ad AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm con un intervallo di 20 minuti. Il test del fascio di equilibrio, il test di posizionamento degli arti e il neuroscore Voestch modificato sono stati utilizzati per valutare la funzione neurologica. La risonanza magnetica (MRI) è stata utilizzata per valutare il volume di emorragia in vivo. I sintomi di questo modello erano in linea con i pazienti con massiccia emorragia pontina.
Introduction
L'emorragia intracerebrale rappresenta un quinto dei pazienti con ictus. La prognosi dell'emorragia intracerebrale dipende dalla velocità, dal volume e dalla posizione del sanguinamento1,2. Rispetto all'emorragia delencefalo, l'emorragia del tronco encefalico ha una mortalità e una morbilitàpiù elevate 3. Circa il 40% dell'emorragia del tronco encefalico si verifica nei pons4. L'eziologia e la fisiopatologia dell'emorragia pontina sono molto diverse e meno studiate dell'emorragia di prebrain5.
Esistono due tipi di modelli animali di emorragia pontina. Uno è il modello di emorragia spontanea indotto dall'infusione di collagenasi batterica nei pons6,7,8. Il più grande vantaggio di questo modello è che il sanguinamento è spontaneo. Tuttavia, la collagenasi può indurre solo un piccolo volume di emorragia pontina. Inoltre, la collagenasi potrebbe causare altre lesioni al cervello. L'altro modello è indotto dall'iniezione stereotassica di sangue autologo nei pons9. Il vantaggio di questo modello è che è facile da padroneggiare con un alto tasso di successo. Teoricamente, i ricercatori potrebbero iniettare qualsiasi volume di sangue in qualsiasi posizione di pons. Tuttavia, a causa della perdita posteriore attraverso il percorso dell'ago, il volume iniettato è limitato. Recentemente, il metodo a doppia iniezione è stato promosso per ridurre la perdita di schiena9. Questo metodo inietta sangue autologo due volte con un intervallo di 20 minuti tra le iniezioni. Il metodo a doppia iniezione viene applicato per indurre un'emorragia pontina lieve (30 μL) e moderata (60 μL) ma non massiccia emorragia pontina. In clinica, la maggior parte dei pazienti con emorragia pontina con prognosi infausta ha un'emorragia massiccia (più di 10 mL).
Nello studio precedente, abbiamo fornito un protocollo per stabilire un modello di ictus ischemico pontino nel ratto10. In questo studio, modifichiamo il metodo di doppia iniezione esistente e forniamo un protocollo dettagliato per indurre un'emorragia pontina massiccia in un ratto con doppia iniezione di sangue autologo da 100 μL in due diverse posizioni nei pons.
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Protocol
Il protocollo è stato rivisto e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del secondo ospedale affiliato dell'Università medica di Guangzhou. I ratti sono stati forniti dall'Animal Center della Southern Medical University. Il progetto sperimentale è illustrato nella figura 1.
1. Animali e strumenti
- Utilizzare ratti Sprague-Dawley maschi di 8 settimane del peso di 250 ± 10 g.
- Ospitare i ratti per almeno 7 giorni prima dell'intervento chirurgico in condizioni ambientali controllate con una temperatura ambiente di 25 °C, umidità relativa del 65% e un ciclo luce-buio di 12/12 ore.
- Fornire cibo e acqua senza limiti.
- Preparare gli strumenti(figura 2A-E).
2. Iniettare il sangue nei pons
- Pesare di nuovo i ratti 3 giorni prima dell'intervento chirurgico per selezionare ratti con un peso corporeo adatto per gli esperimenti.
- Durante i 3 giorni prima della modellazione, addestrare i ratti a camminare sulla trave di bilanciamento 3 volte al giorno per garantire che i ratti normali possano passare il fascio di equilibrio senza pausa.
- Preriscaldare la pastiglia di riscaldamento a 37 °C prima dell'anestesia.
- Attaccare un microdrill al supporto sul telaio stereotassico.
- Iniettare ai ratti 50 mg/kg di chetamina e 5 mg/kg di xiazina per via intraperitoneale. Attendere che non vi sia risposta con le dita dei dita dei dita dei dita dei dito.
- Trasportare il ratto nel telaio stereotassico in una posizione soggetta. Metti le barre dell'orecchio sopra il condotto uditivo per fissare la testa. Fissare il cranio in posizione orizzontale per evitare lo sgattaio di inclinazione dell'iniezione (Figura 2F).
- Mantenere l'anestesia per isoflurane (97,5% di ossigeno e 2,5% di isoflurane) attraverso un cono stereotassico con una porta di ingresso e uscita.
- Usa un unguento per gli occhi per mantenere la cornea umida.
- Radere i capelli sopra il cranio con un micro rasoio.
- Disegnare una linea media di 3 cm con una pennarello nel cranio dalla linea del canto laterale bilaterale a 0,5 cm dietro le fontanelle posteriori, come mostrato nella figura 2F.
- Applicare lo scrub chirurgico entoiodina in modo circolare, partendo dal centro della linea media marcata e ruotando verso l'esterno.
- Posizionare il drappo chirurgico.
- Fai un'incisione con un bisturi lungo la linea mediana marcata.
- Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere qualsiasi potenziale sangue.
- Posizionare un pezzo di forcep su ciascun lato del lembo del cuoio capelluto per esporre il cranio (Figura 2G).
- Immergere un batuffolo di cotone nello 0,9% di soluzione salina e rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dall'osso crano per evitare che i tessuti connettivi si catturino nel microdrill.
- Contrassegnare il punto centrale del bregma come punto di origine tramite una penna marcatore.
- Eseguire una craniotomia (1 mm di diametro) utilizzando un microdrill a AP-9,0 mm, Lat 0 mm(figura 1B e tabella 1). Procedere con attenzione perché questo punto è molto vicino al seno venoso (Figura 2G).
- Rimuovere il microdrill dal telaio stereotassico.
- Mettere una siringa Hamilton da 100 μL nel supporto stereotassico (Figura 2K). Accendere l'interruttore della pompa di iniezione, fare clic sul pulsante Di inalazione rapida, aspirare la soluzione di eparina (12500 U diluita in 100 mL di soluzione salina) a 100 μL e quindi scolarla completamente per evitare la coagulazione del sangue troppo velocemente.
- Applicare la clorexidina e lo scrub chirurgico al 75% di alcol su tutta la coda dalla radice alla punta almeno 3 volte per disinfettare la pelle, ammorbidire l'horniness e dilatare la vena della coda per aumentare il tasso di successo dell'iniezione.
- Attaccare un'agopuntura del cuoio capelluto a una siringa da 1 ml.
- Inserire l'agopuntura del cuoio capelluto in una vena laterale della coda a 3 cm dalla punta della coda e assumere 150 μL di sangue (Figura 2H).
- Rimuovere l'agopuntura del cuoio capelluto dalla siringa da 1 ml.
- Trasferire il sangue in un tubo(figura 2I).
NOTA: Trasferire rapidamente per evitare la coagulazione del sangue. - Cambia i guanti chirurgici.
- Scegliere modalità ritiro, impostare il volume su 100 μL, impostare la velocità a 200 μL/min, fare clic sul pulsante RUN, aspirare 100 μL di sangue nella siringa Hamilton (Figura 2J).
- Scegliete la modalità Infuso, impostate la velocità a 1 μL/min.
- Far avanzare la siringa fino a raggiungere i 9,2 mm sotto la superficie del cervello(Figura 1C e Figura 2L).
- Fare clic sul pulsante Esegui, iniettare i primi 10 μL di sangue ad una velocità di 1 μL/min(Tabella 1).
- Interrompere l'iniezione e lasciare la siringa in posizione per 20 minuti per evitare che il sangue flui nello spazio subaracnoideo.
- Ritrarre la siringa fino a quando la punta arriva a 9,0 mm sotto la superficie del cervello.
- Riavviare l'iniezione alla stessa velocità di 1 μL/min fino a quando il sangue residuo non è stato iniettato completamente.
- Lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso di sangue.
- Rimuovere lentamente la siringa dal cervello.
- Utilizzare cemento osseo per coprire il foro craniotomico.
- Quando il cemento si asciuga, suturare la ferita con 4-0 filamento di sutura di poliammide. Dopo aver cucito 3 o 4 stiches, legare 2-1-1 nodi chirurgici standard.
- Per prevenire l'infezione, iniettare il ratto con penicillina (0,25 mL, 80 UI diluiti in 4 mL salini) per via intraperitoneale.
- Iniettare i ratti per via sottocutanea con tartrato di Butorphanol (2,5 mg/kg) e ripetere l'iniezione ogni 2 ore per alleviare il dolore postoperatorio fino a 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Osservare il topo ogni 15 minuti fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia. Riportarlo nella gabbia originale, con una pastiglia di riscaldamento sotto la gabbia. Fornire al topo libero accesso a cibo e acqua fino al sacrificio.
3. Test comportamentali
NOTA: Esegui test comportamentali il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7 e il giorno 14 dopo la modellazione, incluso il test del fascio di bilanciamento, il test di posizionamento degli arti e il neuroscore Voetsch modificato.
- Prova del fasciodi bilanciamento 11.
NOTA: Questo è un test specifico per esaminare la funzione sensorimotoria dell'arto posteriore.- Preparato l'apparecchio per garantire che la trave (larga 3 cm × lunga 70 cm) sia di 20 cm sopra il pavimento.
- Metti una scatola scura nella parte posteriore della trave con un ingresso stretto.
- Posizionare un generatore di rumore bianco e una sorgente luminosa, che vengono utilizzati per motivare il topo ad attraversare il fascio ed entrare nella scatola degli obiettivi, all'estremità della testa del fascio.
- Fermare il rumore e la luce quando l'animale entra nella scatola degli obiettivi. Registrare la latenza dall'estremità della testa alla casella obiettivo (in secondi) e le prestazioni dell'ostacolo durante l'attraversamento della trave.
- Registrare il punteggio delle prestazioni come segue: 0, saldi con postura costante; 1, impugnature laterali della trave; 2, coccola la trave con 1 arto posteriore che cade; 3, coccola la trave con 2 arti che cadono o girano intorno alla trave per più di 60 s; 4, tenta di bilanciare sulla trave >40 s, ma cade; 5, tenta di bilanciare sulla trave >20 s, ma cade; e 6, cade, senza alcun tentativo di bilanciamento o bilanciamento su travi <20 s.
- Test di posizionamento degli arti
NOTA: Il test di posizionamento degli arti esamina 3 stimoli indipendenti di visione, tatto e propriocezione con 6 parametri, per valutare la funzione sensorimotoria del ratto. Il punteggio totale della funzione neurologica variava da 0 a 12. Prima della prova, il ratto deve essere abituato alla manipolazione.- Tenere il topo sul retro e posizionarlo lentamente sul tavolo da un'altezza di 10 cm. Normalmente, il topo allungava gli arti anteriori e li posizionava sul tavolo.
- Afferra il topo sul retro e tienilo di fronte al bordo del tavolo. Si osserva la reazione degli arti anteriori. Un topo normale avrebbe posto gli arti anteriori sul tavolo.
- Lascia che il topo afferra il bordo del tavolo. Un topo normale userebbe il mento per impedire al naso e ai peli del naso di toccare il bordo del tavolo.
- Mettere il topo sul tavolo, spingere il topo con una leggera pressione laterale dietro la spalla del topo verso il bordo del tavolo e osservare il posizionamento degli arti anteriori e posteriori. Un topo normale afferra il bordo con gli arti anteriori e gli arti posteriori.
- Posizionare il topo sul tavolo con la faccia verso il bordo e spingerlo delicatamente dal retro al bordo. Un topo normale afferra il bordo con gli arti anteriori.
- Posizionare il topo sul tavolo con la schiena sul bordo e spingerlo di nuovo sul bordo del tavolo. Osservare la reazione degli arti posteriori. Un topo normale afferra il bordo con i suoi arti posteriori.
- Valutare il posizionamento degli arti anteriori o posteriori sul bordo della tabella. Registrare i punteggi come segue: 0, nessun posizionamento; 1, posizionamento incompiuto e/o ritardato; 2, posizionamento immediato e completo.
- Il neuroscore Voetsch modificato8
NOTA: Il neuroscore Voetsch modificato è un punteggio in scala vertebrobasilar di abilità sensorimotoria, contenente 14 parametri: movimento della testa, attività, udito, riflesso del dolore, riflesso corneale, propriocezione, sensazione del collo, esplorazione, circling, sensazione del busto assiale, movimento a 4 arti, movimento dell'arto anteriore, arrampicata e passeggiata del fascio. Il punteggio per ogni parametro varia da 0 (deficit neurologico completo) a 3 (nessun deficit neurologico). Il punteggio totale della funzione neurologica varia da 0 a 42.- Posizionare il topo sul tavolo (lungo 50 cm × largo 35 cm) e lasciare che si muova per cinque minuti. Osserva il movimento spontaneo della sua testa: si muove in tutte le dimensioni, 3; preferisce un lato, 2; solo movimento su 1 lato, 1; flesso sul lato unilaterale, 0.
- Posizionare il topo sul tavolo (lungo 50 cm × largo 35 cm) e lasciare che si muova per cinque minuti. L'attività è definita come: pienamente reattiva, 3; moderatamente reattivo, 2; minimamente reattivo, 1; coma, 0.
- Osservare il cerchio craniocaudale: gira bilateralmente, 3; preferisce 1 lato, 2; solo su 1 lato, 1; caduto da 1 lato, 0.
- Valutare il movimento degli arti anteriori: movimento uguale e bilaterale, 3; leggera asimmetria, 2; grande asimmetria, 1; paresi, 0.
- Valutare il movimento a 4 arti: movimento uguale e bilaterale, 3; leggera asimmetria, 2; grande asimmetria, 1; paresi, 0.
- Quando il topo è fermo, eseguire un pizzico all'orecchio per stimolare i padiglioni auricolari e testare il riflesso del dolore: si allontana rapidamente e simmetricamente dallo stimolo, 3; si allontana lentamente o asimmetricamente dallo stimolo, 2; mostra un certo movimento in risposta al dolore, 1; nessuna reazione, 0.
- Quando il ratto è fermo, fare rumore su entrambi i lati del corpo del topo per testare l'udito: sfregamento delle dita, 3; schiocco di dita, 2; forte applausi, 1 e non sorprendente, 0.
- Per controllare la propriocezione, toccare le vibrisse del ratto su entrambi i lati rispettivamente con un bastone smussato e osservare la sua risposta allo stimolo: reagire al tatto, 3; reazione diminuita da un lato, 2; diminuito su entrambi i lati, 1; assente, 0.
- Per valutare la sensazione assiale del busto, posizionare un bastone smussato su entrambi i lati del corpo del ratto e osservare la sua risposta allo stimolo: reazione vivace e simmetrica agli stimoli, 3; reazione leggermente diminuita o asimmetrica, 2; reazione fortemente diminuita e asimmetrica, 1 e nessuna reazione, 0.
- Per testare il riflesso corneale, tenere il topo e toccare rapidamente la cornea su entrambi i lati con un batuffolo di cotone: entrambi gli occhi si chiudono rapidamente, 3; riflesso diminuito da un lato, 2; diminuito su entrambi i lati, 1; assente, 0.
- Per controllare la sensazione del collo, tenere il topo e usare un bastone smussato per toccare il collo: reagisce al tatto attivamente, 3; reazione lenta al tatto, 2; reazione notevolmente diminuita, 1; nessuna reazione, 0.
- Per osservare l'esplorazione, utilizzare una scatola scura chiaro.
NOTA: Due terzi della scatola dovrebbero essere aperti e illuminati, mentre il resto è coperto e scuro. Una porta da 7 cm collega i due scomparti. - Posizionare il topo nel vano luce per 5 minuti e quindi lo scomparto scuro per altri 5 minuti, consentirgli di muoversi e registrare le attività del topo. Quando 4 arti sono collocati in una stanza, registralo come ingresso. Registra i punteggi come segue: raggiunge attivamente i compartimenti chiaro e scuro, 3; raggiunge 1 compartimento, 2; si muove lentamente solo dopo lo stimolo, 1; e nessun movimento, 0.
- Per controllare l'abilità di arrampicata, posizionare il topo sul fondo di un piano largo 20 cm e lungo 70 cm con un angolo di 30 gradi rispetto al terreno orizzontale. Record di punteggi come segue: in grado di salire in cima, 3; arrampicata compromessa, 2; presa stazionaria, 1; e cade immediatamente, 0.
- Per esaminare la passeggiata del fascio, metti il topo su un'estremità di una trave larga 3 cm, lunga 70 cm che si trova a 20 cm dal suolo, registra i punteggi come segue: esplora l'intera trave, 3; esplora parte della trave, 2; qualche movimento e cadute, 1; nessun movimento, 0.
- Calcola i punti.
4. Conferma emorragica da parte della risonanza prima
- Eseguire la risonanza magnetica alle 24 ore post-intervento chirurgico.
- Anestetizzare il ratto con isoflurane (5% per l'induzione, 1%- 1,5% per la manutenzione).
- Fissare la testa del topo nella bobina dell'array cerebrale del ratto combinata con una bobina di volume solo trasmi trasmettere.
- Posizionare la bobina insieme al topo nello scanner mri. Fissare il topo all'interno della culla tramite il dente e le barre dell'orecchio.
- Utilizzare una giacca termica a circuito chiuso per mantenere la temperatura corporea del ratto a 37 ± 0,5 °C durante la scansione della risonanza prima.
- Eseguire una sequenza pilota per garantire la geometria corretta.
- Applicare una sequenza di eco a rotazione rapida per raccogliere scansioni ponderate T2. Impostare i parametri come segue: tempo di eco (TE), 132 ms; tempo di ripetizione (TR), 2.500 ms; matrice di acquisizione, 148 × 148; campo visivo, 100 mm × 100 mm; 12 fette; 1,5 mm di spessore.
- Riportare il topo nella gabbia.
5. Conferma emorragica per anatomia grossolana
NOTA: Sacrificare i ratti nel punto di tempo designato, 24 ore e 14 d dopo l'intervento chirurgico (Figura 1D).
- Anestetizza il topo con il 5% di isoflurane fino alla perdita di coscienza. Quindi, eutanasiarlo con anidride carbonica (CO2) (20-30% del volume della gabbia al minuto).
- Conferma la morte usando i seguenti segni: nessun torace che si alza e cade, nessun battito cardiaco palpabile, nessuna risposta al dito del dito, cattivo colore della mucosa, cambiamento di colore o opacità negli occhi.
- Eseguire la lussazione cervicale.
- Fissare il topo toccando le zampe su una piattaforma sterile. Creare un'incisione della linea mediana dalla cervice per esporre l'ipogastrio al torace e al fegato. Fai un'incisione laterale dal margine sternale superiore lungo la clavicola all'estrema sinistra e un altro taglio laterale dallo xifoide lungo il diaframma all'estrema sinistra, per esporre il cuore. Sollevare il lembo della gabbia toracica e fissarlo alla piattaforma con un perno.
- Collegare l'estremità di un ago (27 G) a una pompa perfusione contenente 4 °C salina. Avanzare la punta dell'ago nel cuore lungo il bordo sinistro del ventricolo sinistro per evitare di entrare nell'atrio. Accendere la pompa di perfusione per assicurarsi che la punta sia nel ventricolo sinistro, quindi effettuare un taglio nell'atrio destro.
- Spegnere la pompa di perfusione quando il liquido scaricato dall'atrio destro diventa incolore e il fegato diventa bianco. Questa procedura richiede circa 100 mL 4 °C salina.
- Decapitare il topo e raccogliere l'intero cervello usando forbici e forcep. Rimuovere l'umidità dalla superficie cerebrale con carta assorbente.
- Mantenere l'intero cervello a -80 °C per 1 minuto.
NOTA: Questo passaggio potrebbe essere saltato se il cervello può essere tagliato senza congelamento. - Metti il cervello nella matrice cerebrale coronale del ratto con il lato dorsale verso l'alto.
- Inserire una lama in acciaio inossidabile spessa 0,21 mm nel centro emorragico in base al foro nella superficie del cervello.
- Inserire altre lame nel cervello ad un intervallo di 2 mm.
- Immergere le sezioni cerebrali in 10 mL di soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% per 24 ore a 4 °C. Sciacquarli con soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 mmol/L (PBS).
- Organizza le sezioni da rostrali a caudali e immaginile.
6. Sezione di paraffina e colorazione ematossilina ed eosina (HE)
- Fissare il cervello con soluzione di PFA al 4% per almeno 24 ore a temperatura ambiente. Il volume di PFA dovrebbe essere 5-10 volte il volume cerebrale.
- Tagliare il cervello dal centro emorragico in due pezzi tramite lama e matrice cerebrale coronale del ratto.
- Crea blocchi di tessuto incorporati nella paraffina.
- Sessare il blocco di tessuto incorporato nella paraffina coronally in 40 μm di spessore scivola su un microtomo, tagliare 4 sezioni in successione, a partire dal centro emorragico, e galleggiarle in un bagno d'acqua a 40 °C.
- Montare le sezioni di 40 μm (8 scivoli in totale per un cervello) su vetri puliti e asciugare l'aria durante la notte a temperatura ambiente.
- Cuocere le diapositive a 56 °C per 1 h.
- Lavare per 3 minuti in xilene, 3 volte.
- Immergere le sezioni 30 volte in etanolo al 100%, 30 volte in più in etanolo al 100%, 30 volte nel 95% di etanolo e 30 volte in etanolo al 95%.
- Risciacquare in acqua del rubinetto fino a quando non è limpido.
- Immergere le sezioni in ematossilina per circa 10 minuti.
- Risciacquare nell'acqua del rubinetto fino a quando non è limpido.
- Immergere le sezioni nella macchia di eosina per 30 s.
- Vetrini disidratati con 3-4 tuffo 95% etanolo, 3-4 immersioni in etanolo al 100%, etanolo al 100% per 1 minuto e 10 tuffo in etanolo al 100% + xilene (1:1).
- Pulire le sezioni con xilene per 1 minuto e 2 volte.
- Montare utilizzando un supporto di montaggio non acquoso e un copripasci.
- Asciugare le sezioni nell'aria durante la notte a temperatura ambiente, quindi san loro.
7. Statistiche
- Usa GraphPad Prism 6.0 per calcolare il test t dello studente o il test Mann Whitney U.
NOTA: Tutti i dati devono essere espressi come ± SE. Le differenze tra due gruppi sono determinate con un test t di uno studente a due code o un test Mann Whitney U. P<0,05 è definito come significatività statistica.
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Representative Results
Sono stati utilizzati complessivamente 25 animali, 3 per il controllo, 6 per 30 μL, 6 per 60 μL e 10 per 100 μL di iniezioni di sangue. Un topo che ha ricevuto un'iniezione di 100 μL di sangue autologo (1/10) è morto entro 24 ore dall'intervento chirurgico.
I test comportamentali sono stati condotti il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7 e il giorno 14 dopo l'intervento chirurgico. I punteggi per il gruppo di controllo e i gruppi di iniezione del sangue su diversi punti di tempo dopo l'intervento chirurgico sono presentati nella tabella 2. L'emorragia pontina ha causato deficit neurologici come il riflesso corneale diminuito e il cerchio(Figura 3B,C). L'iniezione di sangue di 100 μL ha anche indotto la miotonia (Figura 3A). I risultati del test del fascio di equilibrio, del test di posizionamento degli arti e del neuroscore Voetsch modificato hanno rivelato che la funzione neurologica è diminuita con l'aumento del volume dell'emorragia pontina.
La risonanza testurica è stata eseguita 24 ore dopo l'intervento chirurgico (Figura 4). Nei gruppi di iniezione di sangue, sulla sequenza T2, l'emorragia è stata rilevata come un bordo di ipointense con un nucleo iso- o leggermente iperintense nella parte basilare dei pons. Non è stata rilevata emorragia da mri in altre aree cerebrali(figura 4). Il volume di emorragia è stato aumentato con l'aumento del volume di iniezione del sangue autologo.
Quindi i ratti sono stati sacrificati a 24 ore e il giorno 14 dopo l'intervento chirurgico, separatamente, e sono state realizzate sezioni spesse 2 mm(Figura 4). È stata rilevata un'emorragia che circonda il sito di iniezione e si distribuisce nella base dei pon. C'è stato un leggero edema intorno all'emorragia nel gruppo di iniezione di sangue da 100 μL.
Alcuni ratti sono stati sacrificati 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e sessati con paraffina per fare la colorazione HE. I risultati hanno mostrato che nei gruppi di iniezione di sangue, le cellule infiammatorie arricchite nella zona peri-emorragica (Figura 5C e F). L'emoglobina rimane contenuta all'interno di globuli rossiintatti ( Figura 5D e G).
Figura 1: Diagrammi schematici del modello di emorragia pontina. (A) Raccolta automatica del sangue dalla vena della coda. (B) Diagramma schematico dell'ubicazione del trapano. (C) I diagrammi schematici della posizione di iniezione. (D) Progettazione sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strumenti e procedura di chirurgia. (A) Macchina per anestesia. (B) Strumenti chirurgici. (C) Microdrill. (D) Pompa a microiniezione. (E) Apparecchi stereotassici. (F) Una linea marcata al centro del cranio. (G) La freccia gialla punta alla posizione del trapano. (H) Drenaggio del sangue dalla vena della coda. (I) Trasferire il sangue nel tubo di Eppendorf. (J) Aspirare il sangue nella siringa Hamilton. (K) Far avanzare la siringa Hamilton attraverso il buco del cranio. (L) Processo di iniezione di sangue autologo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi delle prove comportamentali. (A) Miotonia in un ratto iniettato 100 μL di sangue autologo. (B) Riflesso corneale diminuito sul lato destro in un ratto iniettato 60 μL di sangue autologo. (C) Riflesso corneale diminuito nei lati bilaterali in un ratto iniettato 100 μL di sangue autologo. (D) Un ratto ha ricevuto 60 μL di sangue autologo cerchiato sul lato contralaterale della lesione. (E) Risultati della prova del fascio di bilanciamento. (F) Risultati del neuroscore Voetsch modificato. (G) Risultati della prova di posizionamento degli arti. Linea significa differenza significativa tra i due gruppi (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della scansione della risonanza prima e dell'anatomia grossolana. La risonanza testurizzazione (superiore) è stata eseguita 24 ore dopo un intervento chirurgico di emorragia pontina, quindi i ratti sono stati sacrificati e tagliati in sezioni cerebrali di 2 mm (fondo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi della colorazione he. Il cervello è stato raccolto dai ratti iniettati 100 μL di sangue 3 d dopo l'intervento chirurgico. (A) L'intera sezione cerebrale. Campi bassi da (B) l'area pontina normale, (C) zona peri-lesione e (D) nucleo emorragico. Campi alti dall'area pontina normale (E), (F) zona peri-lesione e nucleo di emorragia (G). La barra di scala era di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: Risultati rappresentativi dell'anatomia grossolana il giorno 14 dopo l'intervento chirurgico. Clicca qui per scaricare questo file.
| Lieve | moderato | massiccio | |
| Volume totale | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Prima iniezione | |||
| Coordinate stereotattiche | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| velocità | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Intervallo di tempo | 20 min | 20 min | 20 min |
| Seconda iniezione | |||
| Coordinate stereotattiche | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| velocità | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Prima del ritiro dell'ago | 10 min | 10 min | 10 min |
| AP: posizione anteropostere | |||
| Lat: laterale | |||
| Vert: verticale | |||
Tabella 1: Iniezione di sangue autologo.
| Numero ratto | Giorno 1 | Giorno 3 | Giorno 7 | Giorno 14 |
| Il neuroscore Voetsch modificato | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Prova del fascio di bilanciamento | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Test di posizionamento degli arti | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabella 2: Risultati delle prove comportamentali.
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Discussion
Nel presente studio, abbiamo fornito un protocollo per generare un massiccio modello di ratto emorragico pontino. Questo modello può essere utilizzato per la ricerca sul meccanismo fisiopatrologico e sulla prognosi di emorragia pontina massiccia.
Durante l'esperimento sono stati utilizzati 25 ratti, di cui solo uno è morto. La verifica della risonanza prima, dell'anatomia grossolana e della colorazione HE ha indicato che questo metodo aveva un tasso di mortalità molto basso e un alto tasso di successo. Per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina, due problemi devono essere risolti, il sangue autologo iniettato tende a fuoriuscire nello spazio subaracnoideo e a tornare al quarto ventricolo lungo il tratto dell'ago. L'attuale modello di emorragia pontina moderato a doppia iniezione (60 μL di sangue autologo in totale) ha risolto il primo problema, appena il sangue fluito nello spazio subaracnoideo. Tuttavia, c'era ancora una piccola quantità di riflusso di sangue. Nel presente studio, sono state applicate diverse strategie per ottimizzare il metodo di doppia iniezione esistente per consentire di iniettare una quantità maggiore di sangue autologo da 100 μL senza riflusso. In primo luogo, sono stati impiegati due diversi punti di iniezione invece di uno. In secondo luogo, l'eparina è stata utilizzata per sciacquare la siringa con un residuo minimo per ridurre il dosaggio, al fine di proteggere solo il sangue dalla coagulazione durante il processo di iniezione, ma non abbastanza per promuovere perdite e riflusso dopo l'iniezione. In terzo luogo, il tempo di iniezione è stato lungo e la velocità di iniezione è stata lenta, 1 μL / min. Inoltre, solo una piccola quantità di sangue autologo è stata iniettata la prima volta, mentre la seconda iniezione è stata eseguita 20 minuti dopo. Successivamente, l'ago è stato ritirato solo dopo 10 minuti e questa procedura è stata condotta molto lentamente. Con questo metodo, c'era appena sangue che scorreva nello spazio subaracnoideo o quarto ventricolo nei ratti iniettati con 30 μL o 60 μL di sangue autologo, ma c'era ancora una piccola quantità di riflusso nei ratti iniettati con 100 μL.
I test comportamentali sono stati eseguiti il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7 e il giorno 14 dopo la modellazione, tra cui il test del fascio di equilibrio, il test di posizionamento degli arti e il neuroscore Voetsch modificato. Il primo giorno dopo l'intervento chirurgico, quasi tutti i ratti nei gruppi di iniezione di sangue hanno mostrato un comportamento di circolazione (cioè girando a sinistra o a destra), accompagnato dalla scomparsa del riflesso corneale unilaterale o bilaterale. Sebbene il sangue autologo sia stato iniettato nella linea mediana del pontino, è stato distribuito in modo non uniforme nei due lati del cervello. Questa sembrava essere la ragione delle diverse prestazioni nei test comportamentali. Le attività e le reazioni dei ratti iniettati 30 μL o 60 μL di sangue autologo rallentavano più vicino alla normalità. Nei ratti iniettati 100 μL di sangue, le funzioni sensorimotorie erano significativamente indebolite e la risposta era scarsa. La rigidità muscolare è apparsa in alcuni ratti nello stato di riposo. Il giorno 1, giorno 3 e giorno 7, c'erano evidenti differenze tra i ratti iniettati 30 μL, 60 μL o 100 μL di sangue autologo e i ratti nel gruppo di controllo nel neuroscore Voetsch modificato. Nella prova del fascio di equilibrio e nella prova di posizione degli arti, non vi sono state differenze significative tra i ratti iniettati 30 μL o 60 μL di sangue e i ratti del gruppo di controllo in qualsiasi momento. Tuttavia, i risultati della prova del fascio di equilibrio e del test di posizionamento degli arti nei ratti iniettati 100 μL di sangue autologo erano significativamente diversi rispetto al gruppo di controllo del giorno 1 e del giorno 3. La possibile ragione potrebbe essere che ci sono meno elementi di valutazione nel test del fascio di equilibrio e nel test di posizionamento degli arti rispetto al neuroscore Voetsch modificato, che non sono abbastanza sensibili da scoprire sottili deficit neurologici. È inappropriato usare questi due metodi per valutare il comportamento nei modelli di emorragia con sintomi lievi, ma sono applicabili nel massiccio modello di emorragia pontina. Nel complesso, il neuroscore Voetsch modificato si è rivelato più adatto per valutare in modo completo e accurato le funzioni neurologiche in diversi modelli di emorragia pontina.
Ci sono diversi vantaggi di questo metodo. Sulla base del precedente metodo a doppia iniezione, la seconda posizione di iniezione è stata modificata e il dosaggio di eparina è stato regolato per evitare perdite e riflusso nel modello di emorragia pontina lieve (30 μL) e moderato (60 μL). Anche nel massiccio modello di emorragia pontina (100 μL), il riflusso era molto limitato e si verificava solo in un piccolo numero di ratti. Questo metodo può essere facilmente eseguito con un alto tasso di successo e un basso tasso di mortalità. Inoltre, l'emorragia pontina sperimentale può essere osservata durante un lungo periodo, almeno 14 giorni dopo la modellazione, che favorisce lo studio dell'intero sviluppo della malattia e degli effetti dei trattamenti. Il principale progresso di questo modello è stato che ha minato i sintomi dei pazienti con emorragia pontina. Clinicamente, l'emorragia pontina massiccia provoca gravi deficit neurologici, mentre i precedenti modelli di emorragia pontina svilupparono solo un volume emorragico relativamente piccolo con sintomi lievi. La massiccia emorragia pontina in questo modello distribuita nei pons bilaterali, che è simile alla distribuzione dell'emorragia nei pazienti con emorragia pontina. Nei precedenti modelli sperimentali di emorragia pontina, l'emorragia si trovava solo nei pons unilaterali9.
Tuttavia, ci sono anche alcune limitazioni di questo metodo. In primo luogo, l'emorragia pontina in questo studio è stata causata dall'iniezione di sangue, parzialmente eparinata durante la transizione, che potrebbe influenzare la coagulazione del sangue o persino l'omeostasi nei pons circostanti. In secondo luogo, questo modello richiede apparecchiature speciali, come l'apparato stereotassico e la pompa di iniezione. In terzo luogo, questo modello non può imitare l'emorragia spontanea.
In conclusione, questo studio ha fornito un metodo per creare un modello sperimentale di emorragia pontina acuta massiccia nel ratto, che potrebbe promuovere nuove ricerche meccaniche e terapeutiche in questo campo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Science Foundation of China (81471181 e 81870933) e dal Programma di laboratorio di apertura della Guangzhou Medical University (0506308) a Y Jiang, e dalla National Science Foundation of China (81701471) e dal Programma Scientifico della Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) a Z Qiu e dalla National Science Foundation of China (81501009) a L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
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- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
