Summary
Nous présentons un protocole pour établir un modèle massif d’hémorragie de pontine chez un rat par l’intermédiaire de la double injection du sang autologous.
Abstract
Nous fournissons un protocole pour établir un modèle massif d’hémorragie pontine chez un rat. Des rats pesant environ 250 grammes ont été utilisés dans cette étude. Cent microlitres de sang autologous ont été pris de la veine de queue et stereotaxically injectés dans le pont. Le processus d’injection a été divisé en 2 étapes: Premièrement, 10 μL de sang ont été injectés dans un endroit spécifique, en position antéropostérieure (AP) -9,0 mm; latéral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9,2 mm, suivi d’une deuxième injection du sang résiduel situé à AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm avec un intervalle de 20 minutes. L’essai de faisceau d’équilibre, l’essai de placement de membre, et le neuroscore modifié de Voestch ont été utilisés pour évaluer la fonction neurologique. La formation image de résonance magnétique (MRI) a été employée pour évaluer le volume de l’hémorragie in vivo. Les symptômes de ce modèle étaient en ligne avec des patients présentant l’hémorragie massive de pontine.
Introduction
L’hémorragie intracérébrale représente un cinquième des patients ayant subi un AVC. Le pronostic de l’hémorragie intracérébrale dépend de la vitesse, du volume et de l’emplacement du saignement1,2. Par rapport à l’hémorragie du cerveau avant, l’hémorragie du tronc cérébral a une mortalité et une morbidité plus élevées3. Environ 40% de l’hémorragie du tronc cérébral se produit dans le pont4. L’étiologie et la physiopathologie de l’hémorragie pontine sont assez différentes et moins étudiées que l’hémorragie du cerveau avant5.
Il existe deux types de modèles animaux d’hémorragie pontine. L’un est le modèle d’hémorragie spontanée induite par infusion de collagénase bactérienne dans le pont6,7,8. Le plus grand avantage de ce modèle est que le saignement est spontané. Cependant, la collagénase ne peut induire qu’un petit volume d’hémorragie pontine. En outre, la collagénase pourrait causer d’autres blessures au cerveau. L’autre modèle est induit par injection stéréotaxique de sang autologue dans le pont9. L’avantage de ce modèle est qu’il est facile à maîtriser avec un taux de réussite élevé. Théoriquement, les chercheurs pourraient injecter n’importe quel volume de sang dans n’importe quel endroit du pont. Cependant, en raison de la fuite arrière par la voie de l’aiguille, le volume injecté est limité. Récemment, la méthode de double injection a été promue pour réduire la fuite arrière9. Cette méthode injecte du sang autologue deux fois avec un intervalle de 20 minutes entre les injections. La méthode à double injection est appliquée pour provoquer une hémorragie légère (30 μL) et modérée (60 μL) des pontines, mais pas une hémorragie pontine massive. En clinique, la majorité des patients atteints d’hémorragie pontine au pronostic sombre ont une hémorragie massive (plus de 10 ml).
Dans l’étude précédente, nous avons fourni un protocole pour établir un modèle d’AVC ischémique pontin chez le rat10. Dans cette étude, nous modifions la méthode existante de double injection et fournissons un protocole détaillé pour induire une hémorragie pontine massive chez un rat par double injection de sang autologue de 100 μL à deux endroits différents dans le pont.
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Protocol
Le protocole a été examiné et approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du deuxième hôpital affilié de l’Université médicale de Guangzhou. Des rats ont été fournis par le centre animal de l’université médicale du Sud. Le plan expérimental est illustré à la figure 1.
1. Animal et instruments
- Utilisez des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 8 semaines pesant 250 ± 10 g.
- Loger les rats pendant au moins 7 jours avant la chirurgie dans des conditions environnementales contrôlées avec une température ambiante de 25 °C, une humidité relative de 65 % et un cycle lumière-obscurité de 12/12 h.
- Fournir de la nourriture et de l’eau sans limite.
- Préparer les instruments(Figure 2A-E).
2. Injectez le sang dans le pont
- Peser à nouveau les rats 3 jours avant la chirurgie pour sélectionner des rats avec un poids corporel approprié pour les expériences.
- Pendant les 3 jours avant la modélisation, entraînez les rats à marcher sur le faisceau d’équilibre 3 fois par jour pour s’assurer que les rats normaux pourraient passer le faisceau d’équilibre sans pause.
- Préchauffer le coussin chauffant à 37 °C avant l’anesthésie.
- Fixez un microdrill au support sur le cadre stéréotaxique.
- Injecter aux rats 50 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale. Attendez qu’il n’y ait pas de réponse pincement des toteils.
- Transporter le rat dans le cadre stéréotaxique en position couchée. Placez les barres d’oreille au-dessus du conduit auditif pour fixer la tête. Fixez le crâne en position horizontale pour éviter l’inclinaison de l’injection(Figure 2F).
- Maintenir l’anesthésie par isoflurane (97,5% d’oxygène et 2,5% d’isoflurane) à travers un cône de nez stéréotaxique avec un orifice d’entrée et de sortie.
- Utilisez une pommade pour les yeux pour garder la cornée humide.
- Rasez les cheveux au-dessus du crâne avec un micro rasoir.
- Dessinez une ligne médiane de 3 cm avec un stylo marqueur dans le crâne à partir de la ligne du canthus latéral bilatéral à 0,5 cm derrière la fontanelle postérieure, comme le montre la figure 2F.
- Appliquez le gommage chirurgical Entoiodine de manière circulaire, en commençant au milieu de la ligne médiane marquée et en tournant vers l’extérieur.
- Placez le rideau chirurgical.
- Faites une incision avec un scalpel le long de la ligne médiane marquée.
- Utilisez un coton-tige pour enlever tout sang potentiel.
- Placez un morceau de pince de chaque côté du lambeau du cuir chevelu pour exposer le crâne(figure 2G).
- Trempez un coton-tige dans une solution saline à 0,9% et retirez doucement les tissus conjonctifs de l’os du crâne pour éviter que les tissus conjonctifs ne se latrapent dans le microdrill.
- Marquez le point central du bregma comme point d’origine à l’moyen d’un stylo marqueur.
- Effectuer une craniotomie (1 mm de diamètre) à l’aide d’un microdrill à AP-9,0 mm, Lat 0 mm(Figure 1B et Tableau 1). Procédez prudemment car ce point est très proche du sinus veineux (Figure 2G).
- Retirez le microdrill du cadre stéréotaxique.
- Mettez une seringue Hamilton de 100 μL dans le support stéréotaxique(figure 2K). Allumez l’interrupteur de la pompe d’injection, cliquez sur le bouton Rapid Inhalation, aspirez la solution d’héparine (12500 U diluée dans 100 mL de solution saline) à 100 μL, puis égouttez-la complètement pour éviter la coagulation du sang trop rapidement.
- Appliquez de la chlorhexidine et un gommage chirurgical à 75% d’alcool sur toute la queue, de la racine à la pointe, au moins 3 fois pour désinfecter la peau, adoucir l’excité et dilater la veine caudale pour augmenter le taux de réussite de l’injection.
- Fixez une acupuncture du cuir chevelu à une seringue de 1 mL.
- Insérez l’acupuncture du cuir chevelu dans une veine latérale de la queue à 3 cm de l’extrémité de la queue et prenez 150 μL de sang(figure 2H).
- Retirez l’acupuncture du cuir chevelu de la seringue de 1 mL.
- Transférer le sang dans un tube (Figure 2I).
REMARQUE: Transférer rapidement pour éviter la coagulation du sang. - Changez les gants chirurgicaux.
- Choisissez le mode retrait, réglez le volume sur 100 μL, réglez la vitesse à 200 μL/min, cliquez sur le bouton EXÉCUTER, aspirez 100 μL de sang dans la seringue Hamilton(Figure 2J).
- Choisissez le mode Infuse, réglez la vitesse à 1 μL/min.
- Avancez la seringue jusqu’à ce que la pointe atteigne 9,2 mm sous la surface du cerveau(figure 1C et figure 2L).
- Cliquez sur le bouton Exécuter, injectez les 10 premiers μL de sang à une vitesse de 1 μL/min(tableau 1).
- Arrêtez l’injection et laissez la seringue en position pendant 20 minutes pour empêcher le sang de s’écouler dans l’espace sous-arachnoïdien.
- Rétractez la seringue jusqu’à ce que la pointe arrive à 9,0 mm sous la surface du cerveau.
- Relancer l’injection à la même vitesse de 1 μL/min jusqu’à ce que le sang résiduel ait été injecté complètement.
- Laissez la seringue en position pendant 10 minutes pour éviter le refoulement sanguin.
- Retirez la seringue du cerveau lentement.
- Utilisez du ciment osseux pour couvrir le trou de craniotomie.
- Lorsque le ciment sèche, suturez la plaie avec un filament de suture polyamide 4-0. Après avoir cousé 3 ou 4 stiches, attachez les nœuds chirurgicaux standard 2-1-1.
- Pour prévenir l’infection, injecter au rat de la pénicilline (0,25 mL, 80 UI dilués dans une solution saline de 4 mL) par voie intrapéritonéale.
- Injectez aux rats par voie sous-cutanée du tartrate de butorphanol (2,5 mg/kg) et répétez l’injection toutes les 2 heures pour soulager la douleur postopératoire jusqu’à 24 heures après la chirurgie.
- Observez le rat toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement de l’anesthésie. Retournez-le à la cage d’origine, avec un coussin chauffant sous la cage. Fournir au rat un accès gratuit à la nourriture et à l’eau jusqu’au sacrifice.
3. Tests comportementaux
REMARQUE: Effectuez des tests comportementaux le jour 1, le jour 3, le jour 7 et le jour 14 après la modélisation, y compris le test de faisceau d’équilibre, le test de placement des membres et le neuroscore Voetsch modifié.
- Essai du faisceaud’équilibrage 11.
REMARQUE: Il s’agit d’un test spécifiquement pour examiner la fonction sensorimotrice de l’arrière-train.- Préparation de l’appareil pour s’assurer que la poutre (3 cm de large × 70 cm de long) se trouve à 20 cm au-dessus du sol.
- Mettez une boîte sombre à l’arrière de la poutre avec une entrée étroite.
- Placez un générateur de bruit blanc et une source de lumière vive, qui sont utilisés pour motiver le rat à traverser le faisceau et à entrer dans la boîte de but, à la tête du faisceau.
- Arrêtez le bruit et la lumière lorsque l’animal entre dans la boîte à buts. Enregistrez la latence de la tête à la boîte de but (en secondes) et la performance de l’arrière-train lors de la traversée du faisceau.
- Enregistrez le score de performance comme suit: 0, équilibre avec une posture stable; 1, poignées côté de poutre; 2, blottit la poutre avec 1 aile postérieure tombant; 3, blottit la poutre avec 2 membres tombant, ou tournant autour de la poutre pendant plus de 60 s; 4, tente de s’équilibrer sur la poutre >40 s, mais tombe; 5, tente de s’équilibrer sur la poutre >20 s, mais tombe; et 6, tombe, sans tentative d’équilibre ou d’équilibrage sur la poutre <20 s.
- Test de placement des membres
REMARQUE: Le test de placement des membres examine 3 stimuli indépendants de la vision, du toucher et de la proprioception avec 6 paramètres, pour évaluer la fonction sensorimotrice du rat. Le score total de fonction neurologique s’est étendue de 0 à 12. Avant le test, le rat doit être habitué à la manipulation.- Tenez le rat par le dos et placez-le sur la table lentement à partir d’une hauteur de 10 cm. Normalement, le rat étirerait les membres antérieurs et les plaçait sur la table.
- Prenez le rat par le dos et maintenez-le face au bord de la table. La réaction des membres antérieurs est observée. Un rat normal placerait les membres antérieurs sur la table.
- Laissez le rat saisir le bord de la table. Un rat normal utiliserait le menton pour empêcher les poils du nez et du nez de toucher le bord de la table.
- Mettez le rat sur la table, poussez le rat avec une légère pression latérale derrière l’épaule du rat vers le bord de la table et observez le placement des membres antérieurs et des membres postérieurs. Un rat normal saisirait le bord avec ses membres antérieurs et ses membres postérieurs.
- Placez le rat sur la table avec le visage vers le bord et poussez-le doucement de l’arrière vers le bord. Un rat normal saisirait le bord avec ses membres antérieurs.
- Placez le rat sur la table avec son dos au bord et poussez-le par l’arrière jusqu’au bord de la table. Observez la réaction des postérieurs. Un rat normal saisirait le bord avec ses pattes postérieures.
- Évaluer l’emplacement des membres antérieurs ou postérieurs sur le bord de la table. Enregistrez les scores comme suit: 0, aucun placement; 1, placement inachevé et/ou retardé; 2, placement immédiat et complet.
- Le neuroscore de Voetsch modifié8
REMARQUE: Le neuroscore de Voetsch modifié est un score d’échelle vertebrobasilar de la capacité sensorimotrice, contenant 14 paramètres: mouvement de la tête, activité, audition, réflexe de douleur, réflexe cornéen, proprioception, sensation du cou, exploration, encerclement, sensation de torse axial, mouvement des membres 4, mouvement des membres antérieurs, escalade et marche de faisceau. Le score pour chaque paramètre varie de 0 (déficit neurologique complet) à 3 (aucun déficit neurologique). Le score total de la fonction neurologique varie de 0 à 42.- Placez le rat sur la table (50 cm de long × 35 cm de large) et laissez-le se déplacer pendant cinq minutes. Observer le mouvement spontané de sa tête: se déplace dans toutes les dimensions, 3; préfère un côté, 2; seul mouvement à 1 côté, 1; fléchi au côté unilatéral, 0.
- Placez le rat sur la table (50 cm de long × 35 cm de large) et laissez-le se déplacer pendant cinq minutes. L’activité est définie comme suit : entièrement réactive, 3; modérément réactif, 2; minimalement réactif, 1; coma, 0.
- Observer l’encerclement craniocaudal: tourne bilatéralement, 3; préfère 1 côté, 2; seulement à 1 côté, 1; tombé à 1 côté, 0.
- Évaluer le mouvement des membres antérieurs : mouvement égal et bilatéral, 3; légère asymétrie, 2; grande asymétrie, 1; parésie, 0.
- Évaluer le mouvement à 4 membres: mouvement égal et bilatéral, 3; légère asymétrie, 2; grande asymétrie, 1; parésie, 0.
- Lorsque le rat est stationnaire, effectuez un pincement de l’oreille pour stimuler les oreillettes et tester le réflexe de la douleur: s’éloigne rapidement et symétriquement du stimulus, 3; s’éloigne lentement ou asymétriquement du stimulus, 2; montre un certain mouvement en réponse à la douleur, 1; pas de réaction, 0.
- Lorsque le rat est à l’arrêt, faire un bruit de chaque côté du corps du rat pour tester l’audition: frottement des doigts, 3; claquement de doigts, 2; applaudissements forts, 1 et pas surprenant, 0.
- Pour vérifier la proprioception, touchez les vibrisses du rat des deux côtés respectivement avec un bâton émoussé et observez sa réponse au stimulus: réagissez au toucher, 3; diminution de la réaction d’un côté, 2; diminué des deux côtés, 1; absent, 0.
- Pour évaluer la sensation axiale du torse, placez un bâton émoussé de chaque côté du corps du rat et observez sa réponse au stimulus: réaction vive et symétrique aux stimuli, 3; réaction légèrement diminuée ou asymétrique, 2; réaction fortement diminuée et asymétrique, 1 et aucune réaction, 0.
- Pour tester le réflexe cornéen, tenez le rat et touchez rapidement la cornée des deux côtés avec un coton-tige: les deux yeux se ferment rapidement, 3; réflexe diminué d’un côté, 2; diminué des deux côtés, 1; absent, 0.
- Pour vérifier la sensation du cou, tenez le rat et utilisez un bâton émoussé pour toucher le cou: réagit au toucher activement, 3; réaction lente au toucher, 2; réaction grandement diminuée, 1 ; pas de réaction, 0.
- Pour observer l’exploration, utilisez une boîte sombre claire.
REMARQUE: Les deux tiers de la boîte doivent être ouverts et éclairés, tandis que le reste est couvert et sombre. Une porte de 7 cm relie les deux compartiments. - Placez le rat dans le compartiment lumineux pendant 5 min, puis le compartiment sombre pendant encore 5 min, laissez-le se déplacer et enregistrez les activités du rat. Lorsque 4 membres sont placés dans une pièce, enregistrez-le comme entrée. Enregistrer les scores comme suit: atteint activement les compartiments clair et sombre, 3; atteint 1 compartiment, 2; se déplace lentement seulement après le stimulus, 1; et pas de mouvement, 0.
- Pour vérifier la capacité d’escalade, placez le rat au bas d’un plan de 20 cm de large et 70 cm de long avec un angle de 30 degrés par rapport au sol horizontal. Record de scores comme suit: capable de grimper au sommet, 3; escalade altérée, 2; poignée stationnaire, 1; et tombe immédiatement, 0.
- Pour examiner la marche du faisceau, placez le rat à une extrémité d’un faisceau de 3 cm de large et 70 cm de long qui se trouve à 20 cm au-dessus du sol, enregistrez les scores suivants: explore l’ensemble du faisceau, 3; explore une partie de la poutre, 2; un peu de mouvement et de chutes, 1; pas de mouvement, 0.
- Calculez les points.
4. Confirmation de l’hémorragie par IRM
- Effectuez l’IRM à 24 h après la chirurgie.
- Anesthésier le rat avec de l’isoflurane (5% pour l’induction, 1% - 1,5% pour l’entretien).
- Fixez la tête du rat dans la bobine du réseau cérébral du rat combinée à une bobine de volume en transmission uniquement.
- Placez la bobine avec le rat dans le scanner IRM. Fixez le rat dans le berceau via les barres dentaires et auriculaires.
- Utilisez une enveloppe thermique en circuit fermé pour maintenir la température corporelle du rat à 37 ± 0,5 °C pendant l’IRM.
- Effectuez une séquence pilote pour garantir une géométrie correcte.
- Appliquez une séquence d’écho à rotation rapide pour collecter les balayages pondérés en T2. Définissez les paramètres comme suit : temps d’écho (TE), 132 ms ; temps de répétition (TR), 2 500 ms; matrice d’acquisition, 148 × 148; champ de vision, 100 mm × 100 mm; 12 tranches; 1,5 mm d’épaisseur.
- Retournez le rat à la cage.
5. Confirmation de l’hémorragie par anatomie brute
REMARQUE: Sacrifiez les rats au point de temps désigné, 24 h et 14 d après la chirurgie (Figure 1D).
- Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane jusqu’à perte de conscience. Ensuite, euthanasiez-le avec du dioxyde de carbone (CO2)(20-30% du volume de la cage par minute).
- Confirmez la mort en utilisant les signes suivants: pas de poitrine montante et tombante, pas de battement de cœur palpable, pas de réponse au pincement des orteils, mauvaise couleur de la muqueuse, changement de couleur ou opacité dans les yeux.
- Effectuer une luxation cervicale.
- Fixez le rat en tapant les pattes sur une plate-forme stérile. Créer une incision médiane du col de l’utérus pour exposer l’hypogastre au thorax et au foie. Faire une incision latérale de la marge sternale supérieure le long de la clavicule à l’extrême gauche et une autre coupe latérale du xiphoïde le long du diaphragme à l’extrême gauche, pour exposer le cœur. Soulevez le rabat de nervure et fixez-le à la plate-forme avec une goupille.
- Raccorder l’extrémité d’une aiguille (27 G) à une pompe de perfusion contenant une solution saline à 4 °C. Avancez la pointe de l’aiguille dans le cœur le long du bord gauche du ventricule gauche pour éviter d’entrer dans l’oreillette. Allumez la pompe de perfusion pour vous assurer que la pointe est dans le ventricule gauche, puis faites une coupure dans l’oreillette droite.
- Éteignez la pompe de perfusion lorsque le liquide évacué de l’oreillette droite devient incolore et que le foie devient blanc. Cette procédure nécessite une solution saline d’environ 100 mL à 4 °C.
- Décapitez le rat et récoltez tout le cerveau à l’aide de ciseaux et de pinces. Retirez toute humidité de la surface du cerveau avec du papier buvard.
- Maintenir tout le cerveau à -80 °C pendant 1 min.
REMARQUE: Cette étape pourrait être ignorée si le cerveau peut être coupé sans gel. - Posez le cerveau dans la matrice cérébrale du rat coronal avec le côté dorsal vers le haut.
- Insérez une lame en acier inoxydable de 0,21 mm d’épaisseur dans le centre d’hémorragie en fonction du trou à la surface du cerveau.
- Insérez d’autres lames dans le cerveau à un intervalle de 2 mm.
- Immerger les sections cérébrales dans 10 mL de solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 24 h à 4 °C. Rincez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,01 mmol/L.
- Organisez les sections du rostral à la caudale et imagez-les.
6. Section de paraffine et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)
- Fixer le cerveau avec une solution de PFA à 4% pendant au moins 24 h à température ambiante. Le volume de PFA devrait être 5-10 fois le volume du cerveau.
- Couper le cerveau du centre de l’hémorragie en deux morceaux via la lame et la matrice cérébrale du rat coronal.
- Faire des blocs de tissu incorporés à la paraffine.
- Sectionz le bloc tissulaire incorporé à la paraffine de manière coronale dans des lames d’épaisseur de 40 μm sur un microtome, coupez 4 sections successivement, à partir du centre d’hémorragie, et faites-les flotter dans un bain-marie à 40 °C.
- Montez les sections de 40 μm (8 lames au total pour un cerveau) sur des lames de verre propres et séchez à l’air pendant la nuit à température ambiante.
- Cuire les lames à 56 °C pendant 1 h.
- Laver pendant 3 min au xylène, 3 fois.
- Trempez les sections 30 fois dans de l’éthanol à 100 %, 30 fois de plus dans de l’éthanol à 100 %, 30 fois dans de l’éthanol à 95 % et 30 fois de plus dans de l’éthanol à 95 %.
- Rincer à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’il soit clair.
- Plongez les sections dans l’hématoxyline pendant environ 10 min.
- Rincer à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’il soit clair.
- Immerger les sections dans la tache d’éosine pendant 30 s.
- Déshydrater les lames avec 3-4 trempettes 95% éthanol, 3-4 trempettes dans 100% éthanol, 100% éthanol pendant 1 minute, et 10 trempettes dans 100% éthanol + xylène (1:1).
- Nettoyer les sections avec du xylène pendant 1 min, 2 fois.
- Montage à l’aide d’un milieu de montage non aqueux et d’une lamelle de couverture.
- Séchez les sections dans l’air pendant la nuit à température ambiante, puis sainez-les.
7. Statistiques
- Utilisez GraphPad Prism 6.0 pour calculer le test t de Student ou le test U de Mann Whitney.
REMARQUE: Toutes les données doivent être exprimées sous forme de moyenne ± SE. Les différences entre deux groupes sont déterminées à l’aide d’un test t de Student à deux volets ou d’un test U de Mann Whitney. P<0,05 est défini comme une signification statistique.
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Representative Results
Au total, 25 animaux ont été utilisés, 3 pour des injections de sang de contrôle, 6 pour 30 μL, 6 pour 60 μL et 10 pour des injections sanguines de 100 μL. Un rat qui a reçu une injection de sang autologue de 100 μL (1/10) est décédé dans les 24 heures suivant la chirurgie.
Des tests comportementaux ont été effectués le jour 1, le jour 3, le jour 7 et le jour 14 après chirurgie. Les scores pour le groupe témoin et les groupes d’injection de sang sur différents points temporels après la chirurgie sont présentés dans le tableau 2. L’hémorragie pontine a causé des déficits neurologiques comme une diminution du réflexe cornéen et des cercles(figure 3B,C). L’injection de 100 μL de sang a également induit la myotonia(figure 3A). Les résultats de l’essai de faisceau d’équilibre, de l’essai de placement de membre, et du neuroscore modifié de Voetsch ont indiqué que la fonction neurologique a été diminuée pendant que le volume de l’hémorragie de pontine augmentait.
L’IRM a été effectuée 24 heures après la chirurgie(figure 4). Dans les groupes de sang-injection, sur l’ordre de T2, l’hémorragie a été détectée comme jante de hypointense avec un iso- au noyau légèrement de hyperintense dans la partie basilaire du pont. Aucune hémorragie n’a été détectée par IRM dans d’autres régions du cerveau(figure 4). Le volume de l’hémorragie a été augmenté pendant que le volume d’injection du sang autologous augmentait.
Ensuite, les rats ont été sacrifiés à 24 heures et le jour 14 après la chirurgie, séparément, et des sections de 2 mm d’épaisseur ont été faites (Figure 4). L’hémorragie a été détectée entourant l’emplacement d’injection et distribuant dans la base du pont. Il y avait un léger œdème autour de l’hémorragie dans le groupe d’injection sanguine de 100 μL.
Certains des rats ont été sacrifiés pendant 3 jours après chirurgie et paraffine-sectionnés pour faire IL souillant. Les résultats ont montré que dans les groupes d’injection sanguine, les cellules inflammatoires se sont enrichies dans la zone péri-hémorragie (Figure 5C et F). L’hémoglobine reste contenue dans les globules rouges intacts (Figure 5D et G).
Figure 1: Diagrammes schématiques du modèle d’hémorragie pontine. (A) Prélèvement autologue de sang dans la veine caudale. (B) Le diagramme schématique de l’emplacement du forage. (C) Les diagrammes schématiques de l’emplacement de l’injection. D) Conception expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Instruments et procédure de chirurgie. (A) Machine d’anesthésie. B) Instruments chirurgicaux. (C) Microdrill. D) Pompe à micro-injection. E) Appareils stéréotaxiques. (F) Une ligne marquée au milieu du crâne. (G) La flèche jaune pointe vers l’emplacement du forage. (H) Drainage du sang de la veine caudale. (I) Transférer le sang dans le tube Eppendorf. (J) Aspirer le sang dans la seringue Hamilton. (K) Avancez la seringue Hamilton à travers le trou du crâne. (L) Processus d’injection de sang autologue. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Résultats représentatifs des tests comportementaux. (A) Myotonia chez un rat à qui on a injecté 100 μL de sang autologue. (B) Diminution du réflexe cornéen du côté droit chez un rat à qui on a injecté 60 μL de sang autologue. (C) Diminution du réflexe cornéen dans les côtés bilatéraux chez un rat à qui on a injecté 100 μL de sang autologue. (D) Un rat a reçu 60 μL de sang autologue encerclé vers le côté controlatéral de la lésion. E) Résultats de l’essai du faisceau d’équilibrage. (F) Résultats du neuroscore de Voetsch modifié. (G) Résultats du test de placement des membres. Ligne signifie différence significative entre les deux groupes (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Résultats représentatifs de l’IRM et de l’anatomie brute. Le balayage de MRI (supérieur) a été exécuté 24 h après chirurgie d’hémorragie de pontine, puis les rats ont été sacrifiés et coupés en sections de cerveau de 2 millimètres (bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Résultats représentatifs de la coloration HE. Des cerveaux ont été prélevés sur les rats qui ont injecté 100 μL de sang 3 j après la chirurgie. (A) Toute la section du cerveau. Bas champs de (B) le secteur normal de pontine, (C) zone de peri-lésion et (D) noyau d’hémorragie. Champs élevés de (E) secteur normal de pontine, zone de peri-lésion (F) et noyau d’hémorragie (G). La barre d’échelle était de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure S1 : Résultats représentatifs de l’anatomie brute le jour 14 après la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| Douleur légère | modéré | massif | |
| Volume total | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Première injection | |||
| Coordonnées stéréotaxiques | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| vitesse | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Intervalle de temps | 20 min | 20 min | 20 min |
| Deuxième injection | |||
| Coordonnées stéréotaxiques | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| vitesse | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Avant le retrait de l’aiguille | 10 min | 10 min | 10 min |
| AP : position antéropostérieure | |||
| Lat: latéral | |||
| Vert: vertical | |||
Tableau 1 : Injection de sang autologue.
| Nombre de rats | Jour 1 | Jour 3 | Jour 7 | Jour 14 |
| Le neuroscore de Voetsch modifié | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Essai du faisceau d’équilibrage | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Test de placement des membres | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tableau 2 : Résultats des tests comportementaux.
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Discussion
Dans la présente étude, nous avons fourni un protocole pour générer un modèle massif de rat d’hémorragie de pontine. Ce modèle peut être utilisé pour la recherche sur le mécanisme physiopathologique et le pronostic de l’hémorragie pontine massive.
Tout au long de l’expérience, 25 rats ont été utilisés, dont un seul est mort. La vérification de MRI, d’anatomie brute, et de la souillure IL a indiqué que cette méthode a eu un taux de mortalité très bas et un taux de réussite élevé. Pour établir le modèle massif d’hémorragie de pontine, deux problèmes doivent être résolus, le sang autologous injecté tend à couler dans l’espace sous-arachnoïdien et à couler de nouveau au quatrième ventricule le long de la région d’aiguille. Le modèle existant d’hémorragie pontine modérée à double injection (60 μL de sang autologue au total) a résolu le premier problème, à peine du sang a coulé dans l’espace sous-arachnoïdien. Cependant, il y avait encore une petite quantité de refoulement sanguin. Dans la présente étude, plusieurs stratégies ont été appliquées pour optimiser la méthode existante de double injection afin de permettre l’injection d’une plus grande quantité de sang autologue de 100 μL sans refoulement. Tout d’abord, deux points d’injection différents au lieu d’un ont été employés. Deuxièmement, l’héparine a été utilisée pour rincer la seringue avec un minimum de résidus pour réduire la dose, afin de protéger uniquement le sang de la coagulation pendant le processus d’injection, mais pas assez pour favoriser la fuite et le refoulement après l’injection. Troisièmement, le temps d’injection était long et la vitesse d’injection était lente, 1 μL/min. D’ailleurs, seulement une petite quantité de sang autologous a été injectée la première fois, alors que la deuxième injection était exécutée 20 minutes plus tard. Par la suite, l’aiguille n’a été retirée qu’après 10 minutes, et cette procédure a été effectuée extrêmement lentement. En utilisant cette méthode, il n’y avait pratiquement pas de sang qui coulait dans l’espace sous-arachnoïdien ou le quatrième ventricule chez les rats injectés avec 30 μL ou 60 μL de sang autologue, mais il y avait encore une petite quantité de refoulement chez les rats injectés avec 100 μL. Prolonger le temps avant de retirer l’aiguille pourrait résoudre ce problème.
Des tests comportementaux ont été effectués le jour 1, le jour 3, le jour 7 et le jour 14 après modélisation, y compris l’essai de faisceau d’équilibre, l’essai de placement de membre, et le neuroscore modifié de Voetsch. Le premier jour après chirurgie, presque tous les rats dans les groupes de sang-injection ont montré le comportement d’encerclement (c.-à-d., tournant à gauche ou à droite), accompagné de la disparition du réflexe cornéen unilatéral ou bilatéral. Bien que le sang autologous ait été injecté dans le midline de la pontine, il a été inégalement distribué dans les deux côtés du cerveau. Cela semblait être la raison des performances différentes dans les tests comportementaux. Les activités et les réactions des rats injectés 30 μL ou 60 μL de sang autologue ont ralenti plus près de la normale. Chez les rats injectés 100 μL de sang, les fonctions sensorimotrices étaient significativement affaiblies et la réponse était faible. La rigidité de muscle est apparue chez quelques rats dans l’état de repos. Le jour 1, le jour 3 et le jour 7, il y avait des différences évidentes entre les rats à qui on avait injecté 30 μL, 60 μL ou 100 μL de sang autologue et les rats du groupe témoin dans le neuroscore de Voetsch modifié. Dans l’essai du faisceau d’équilibre et l’essai de la place des membres, il n’y avait aucune différence significative entre les rats injectés 30 μL ou 60 μL de sang et les rats du groupe témoin à n’importe quel moment. Cependant, les résultats du test du faisceau d’équilibre et du test de placement des membres chez des rats à qui on a injecté 100 μL de sang autologue étaient significativement différents de ceux du groupe témoin des jours 1 et 3. La raison possible pourrait être qu’il y a moins d’éléments d’évaluation dans le test du faisceau d’équilibre et le test de placement des membres par rapport au neuroscore de Voetsch modifié, qui ne sont pas assez sensibles pour découvrir des déficits neurologiques subtils. Il est inapproprié d’utiliser ces deux méthodes pour évaluer le comportement dans les modèles d’hémorragie avec des symptômes légers, mais elles sont applicables dans le modèle d’hémorragie pontine massive. Dans l’ensemble, le neuroscore de Voetsch modifié s’est avéré plus approprié pour évaluer de manière complète et précise les fonctions neurologiques dans différents modèles d’hémorragie pontine.
Cette méthode présente plusieurs avantages. D’après la méthode précédente de double injection, le deuxième emplacement d’injection a été modifié et la dose d’héparine a été ajustée pour éviter les fuites et le refoulement dans le modèle d’hémorragie pontine légère (30 μL) et modérée (60 μL). Même dans le modèle d’hémorragie pontine massive (100 μL), le refoulement était très limité et ne s’est produit que chez un petit nombre de rats. Cette méthode peut être facilement réalisée avec un taux de réussite élevé et un faible taux de mortalité. De plus, l’hémorragie pontine expérimentale peut être observée pendant une longue période, au moins 14 jours après la modélisation, ce qui est propice à l’étude de l’ensemble du développement de la maladie et des effets des traitements. L’avance principale de ce modèle était qu’il imitait les symptômes des patients présentant l’hémorragie de pontine. Médicalement, l’hémorragie massive de pontine a comme conséquence des déficits neurologiques graves, alors que les modèles précédents d’hémorragie de pontine développait seulement le volume hémorragique relativement petit avec des symptômes doux. L’hémorragie massive de pontine dans ce modèle distribuée dans le pont bilatéral, qui est semblable à la distribution d’hémorragie dans des patients d’hémorragie de pontine. Dans les modèles expérimentaux précédents d’hémorragie pontine, l’hémorragie ne se situe que dans le pont unilatéral9.
Toutefois, il existe également certaines limitations de cette méthode. Tout d’abord, l’hémorragie de pontine dans cette étude a été provoquée par l’injection du sang, partiellement héparinisé pendant la transition, qui pourrait influencer la coagulation de sang ou même l’homéostasie dans le pont environnant. Deuxièmement, ce modèle nécessite un équipement spécial, tel qu’un appareil stéréotaxique et une pompe d’injection. Troisièmement, ce modèle ne peut pas imiter l’hémorragie spontanée.
En conclusion, cette étude a fourni une méthode pour créer un modèle expérimental d’hémorragie massive aiguë de pontine chez le rat, qui pourrait favoriser de nouvelles recherches mécaniques et thérapeutiques dans ce domaine.
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Disclosures
Pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue financièrement par la National Science Foundation of China (81471181 et 81870933) et le programme d’ouverture de l’Université médicale de Guangzhou (0506308) à Y Jiang, et par la National Science Foundation of China (81701471) et le programme scientifique de la Commission municipale de la santé de Guangzhou (20191A011083) à Z Qiu, et par la National Science Foundation of China (81501009) à L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
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- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
