Summary
Vi præsenterer en protokol til at etablere en massiv pontin blødning model i en rotte via dobbelt injektion af autologt blod.
Abstract
Vi leverer en protokol til at etablere en massiv pontin blødning model i en rotte. Rotter, der vejer omkring 250 gram, blev brugt i denne undersøgelse. Et hundrede mikroliter autologt blod blev taget fra halen vene og stereotaxically injiceres i pons. Injektionsprocessen blev opdelt i 2 trin: For det første blev 10 μL blod sprøjtet ind på et bestemt sted, anteroposterior position (AP) -9,0 mm; sideværts (lat) 0 mm; lodret (Vert) -9,2 mm efterfulgt af en anden injektion af restblodet placeret ved AP -9,0 mm Lat 0 mm; Vert -9,0 mm med et interval på 20 minutter. Balancestråletesten, lemmernes placeringstest og den modificerede Voestch-neuroscore blev brugt til at evaluere neurologisk funktion. Magnetic Resonance Imaging (MRI) blev brugt til at vurdere mængden af blødning in vivo. Symptomerne på denne model var i overensstemmelse med patienter med massiv pontinblødning.
Introduction
Intracerebral blødning tegner sig for en femtedel af slagtilfælde patienter. Prognosen for intracerebral blødning afhænger af hastigheden, volumenet og placeringen af blødning1,2. Sammenlignet med forhjernen blødning, hjernestammen blødning har højere dødelighed og sygelighed3. Omkring 40% af hjernestammeblødning forekommer i pons4. Den etiologi og patofysiologi af pontin blødning er helt anderledes og mindre undersøgt end forebrain blødning5.
Der er to slags pontinblødning dyremodeller. Den ene er spontan blødning model induceret ved infusion af bakteriel kollagen i pons6,7,8. Den største fordel ved denne model er, at blødningen er spontan. Kollagen kan dog kun fremkalde en lille mængde pontinblødning. Desuden kan kollagen forårsage andre skader på hjernen. Den anden model er induceret af stereotaktisk injektion af autologt blod i pons9. Fordelen ved denne model er, at det er let at mestre med en høj succesrate. Teoretisk set kunne forskere injicere enhver mængde blod i ethvert sted af pons. På grund af ryglækagen gennem nålevejen er det injicerede volumen dog begrænset. For nylig er dobbeltinjektionsmetoden blevet fremmet for at reducere ryglækagen9. Denne metode injicerer autologt blod to gange med et interval på 20 minutter mellem injektionerne. Dobbeltinjektionsmetoden anvendes til at fremkalde mild (30 μL) og moderat (60 μL) pontinblødning, men ikke massiv pontinblødning. I klinikken har størstedelen af pontinblødningspatienter med dårlig prognose massiv blødning (mere end 10 mL).
I den foregående undersøgelse leverede vi en protokol til at etablere en pontinisk iskæmisk slagtilfældemodel hos rotte10. I denne undersøgelse ændrer vi den eksisterende dobbelte injektionsmetode og giver en detaljeret protokol til at fremkalde massiv pontinblødning hos en rotte ved dobbelt injektion af 100 μL autologt blod to forskellige steder i ponerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev gennemgået og godkendt af institutional Animal Care and Use Committee på det andet tilknyttede hospital i Guangzhou Medical University. Rotter blev leveret af Animal Center i Southern Medical University. Det eksperimentelle design er vist i figur 1.
1. Dyr og instrumenter
- Brug 8 uger gamle mandlige Sprague-Dawley rotter, der vejer 250 ± 10 g.
- Rotterne anbringes i mindst 7 dage før operationen under kontrollerede miljøforhold med en omgivelsestemperatur på 25 °C, en relativ luftfugtighed på 65 % og en lysmørke cyklus på 12/12 timer.
- Giv mad og vand uden grænse.
- Forbered instrumenterne(figur 2A-E).
2. Injicere blodet i pons
- Afveje rotterne igen 3 dage før operationen for at vælge rotter med passende kropsvægt til forsøgene.
- I løbet af de 3 dage før modellering, træne rotterne til at gå på balance stråle 3 gange om dagen for at sikre normale rotter kunne passere balancestrålen uden pause.
- Forvarm varmepuden til 37 °C før anæstesi.
- Sæt en mikrodrill på holderen på den stereotaxiske ramme.
- Rotterne injiceres med 50 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin intraperitonealt. Vent, indtil der ikke er nogen tå-knivspids svar.
- Transporter rotten ind i den stereotaxiske ramme i en udsat position. Sæt ørestængerne over øregangen for at sikre hovedet. Ret kraniet i vandret position for at undgå skævvridning af injektionen (Figur 2F).
- Ansesi ved isofluran (97,5% ilt og 2,5% isofluran) gennem en stereotaxisk næsekegler med indløbs- og udløbsport.
- Brug øjensæbning til at holde hornhinden fugtig.
- Barber håret over kraniet med en mikro barbermaskine.
- Tegn en 3 cm midterlinje med en tuschpen i kraniet fra linjen i den bilaterale laterale canthus til 0,5 cm bag den bageste fontanelle, som vist i figur 2F.
- Påfør Entoiodin kirurgisk krat på en cirkulær måde, der starter i midten af den markerede midterlinje og roterer udad.
- Placer den kirurgiske drapering.
- Lav et snit med en skalpel langs den markerede midterlinje.
- Brug en vatpind til at fjerne eventuelt blod.
- Placer et stykke pincet på hver side af hovedbunden flappen til at udsætte kraniet(Figur 2G).
- Dyp en vatpind i 0,9% saltvand og forsigtigt fjerne bindevæv fra kraniet knoglen for at undgå bindevæv bliver fanget i mikrodrill.
- Marker bregmaens centrale punkt som udgangspunkt via en tuschpen.
- Der udføres en kraniotomi (1 mm i diameter) ved hjælp af en mikrodrill ved AP-9,0 mm, Lat 0 mm(figur 1B og tabel 1). Fortsæt forsigtigt, fordi dette punkt er meget tæt på venøs sinus (Figur 2G).
- Fjern mikrodrillen fra den stereotaxiske ramme.
- Sæt en 100 μL Hamilton sprøjte i den stereotaxiske holder (Figur 2K). Tænd for indsprøjtningspumpekontakten, klik på rapid inhalationsknappen, aspirat heparinopløsningen (12500 U fortyndet i 100 ml saltvand) til 100 μL og dræn den derefter helt for at forhindre, at blodet størknes for hurtigt.
- Påfør chlorhexidin og 75% alkohol kirurgisk krat til hele halen fra rod til spids mindst 3 gange for at desinficere huden, blødgøre horniness, og udvide halen venen for at øge succesraten for injektion.
- Fastgør en hovedbund akupunktur til en 1 mL sprøjte.
- Indsættes hovedbundsåbningen i en lateral haleåre 3 cm fra halespidsen, og der skal tages 150 μL blod (Figur 2H).
- Fjern hovedbundsåbningen fra 1 mL sprøjten.
- Blodet overføres til et rør (figur 2I).
BEMÆRK: Overfør hurtigt for at forhindre blodpropper. - Skift de kirurgiske handsker.
- Vælg Træk-tilstand, indstil lydstyrken til 100 μL, indstil hastigheden til 200 μL/min,klik på knappen RUN, indsug 100 μL blod i Hamiltonsprøjten (Figur 2J).
- Vælg Infuse-tilstand, indstil hastigheden til 1 μL/min.
- Fremryk sprøjten, indtil spidsen når 9,2 mm under hjernens overflade (Figur 1C og Figur 2L).
- Klik på knappen Kør, injicer de første 10 μL blod med en hastighed på 1 μL/min.
- Stop injektionen, og lad sprøjten være på plads i 20 minutter for at forhindre blodet i at strømme ind i det subarachnoide rum.
- Træk sprøjten tilbage, indtil spidsen ankommer 9,0 mm under hjernens overflade.
- Injektionen skal genoptages med samme hastighed på 1 μL/min., indtil restblodet er blevet injiceret fuldstændigt.
- Lad sprøjten være på plads i 10 minutter for at undgå tilbagestrømning af blod.
- Fjern sprøjten langsomt fra hjernen.
- Brug knoglecement til at dække kraniehullet.
- Når cementen tørrer, sutur såret med 4-0 polyamid sutur filament. Efter syning 3 eller 4 stiches, binde 2-1-1 standard kirurgiske knob.
- For at forhindre infektion injiceres rotten med penicillin (0,25 mL, 80 IE fortyndet i 4 mL saltvand) intraperitonealt.
- Rotterne injiceres subkutant med Butorphanol tartrat (2,5 mg/kg), og injektionen gentages hver anden time for at lindre postoperativ smerte indtil 24 timer efter operationen.
- Overhold rotten hvert 15. minut, indtil den kommer sig helt fra anæstesi. Sæt den tilbage til det oprindelige bur med en varmepude under buret. Giv rotten fri adgang til mad og vand, indtil de ofres.
3. Adfærdstest
BEMÆRK: Udfør adfærdstest på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 efter modellering, herunder balancestråletesten, lemmernes placeringstest og den modificerede Voetsch-neuroscore.
- Balancestråletest11.
BEMÆRK: Dette er en test specielt til undersøgelse af baglimbernes sensorimotoriske funktion.- Apparatet er fremstillet således, at strålen (3 cm bred × 70 cm lang) er 20 cm over gulvet.
- Sæt en mørk kasse i bagenden af strålen med en smal indgang.
- Placer en hvid støjgenerator og en lyskilde, som bruges til at motivere rotten til at krydse strålen og komme ind i målboksen i hovedenden af strålen.
- Stop støj og lys, når dyret kommer ind i målboksen. Optag latenstid fra hoved ende til målboksen (i sekunder) og udførelsen af hindlimb under gennemkører strålen.
- Registrer præstationsscoren som følger: 0, saldi med stabil kropsholdning; 1, greb side af strålen; 2, putter strålen med 1 bagben falder af; 3, putter strålen med 2 lemmer falder af, eller spinding omkring strålen i mere end 60 s; 4, forsøg på at balancere på stråle > 40 s, men falder af; 5, forsøg på at balancere på stråle >20 s, men falder af; og 6, falder af, uden forsøg på at balancere eller balancere på stråle <20 s.
- Prøve for placering af lemmer
BEMÆRK: I lemmernes placeringstest undersøges 3 uafhængige stimuli af syn, berøring og proprioception med 6 parametre for at evaluere rottens sensorimotoriske funktion. Den samlede neurologiske funktion score varierede fra 0 til 12. Før testen skal rotter vænnes til håndtering.- Hold rotten bagpå og læg den langsomt på bordet fra en højde på 10 cm. Normalt ville rotten strække forben og placere dem på bordet.
- Grib rotten bagpå og hold den mod kanten af bordet. Reaktionen af forben observeres. En normal rotte ville placere forbenene på bordet.
- Lad rotten gribe fat i kanten af bordet. En normal rotte ville bruge hagen til at forhindre næse- og næsehåret i at røre ved bordkanten.
- Sæt rotten på bordet, skub rotten med et blidt lateralt tryk bag rottens skulder mod kanten af bordet, og observere placeringen af forbenene og bagbenene. En normal rotte ville gribe kanten med sine forben og bagben.
- Placer rotten på bordet med ansigtet mod kanten, og skub den forsigtigt fra bagsiden til kanten. En normal rotte ville gribe kanten med sine forben.
- Placer rotten på bordet med ryggen mod kanten og skub den bagpå til kanten af bordet. Overhold reaktionen fra bagbenene. En normal rotte ville gribe kanten med sine bagben.
- Vurder placeringen af forbenene eller bagbenene til bordkanten. Registrer resultaterne på følgende måde: 0, ingen placering; 1, uafsluttet og/eller forsinket placering 2, øjeblikkelig, fuldstændig placering.
- Den modificerede Voetsch neuroscore8
BEMÆRK: Den modificerede Voetsch neuroscore er en vertebrobasilar skala score af sensorimotorisk evne, der indeholder 14 parametre: hoved bevægelse, aktivitet, hørelse, smerte refleks, hornhinde refleks, proprioception, hals sensation, udforskning, kredser, aksial torso sensation, 4-lemmers bevægelse, forben bevægelse, klatring, og stråle gang. Scoren for hver parameter varierer fra 0 (komplet neurologisk underskud) til 3 (ingen neurologisk underskud). Den samlede neurologiske funktion score varierer fra 0 til 42.- Placer rotten på bordet (50 cm lang × 35 cm bred) og lad den bevæge sig rundt i fem minutter. Overhold den spontane bevægelse af hovedet: bevæger sig i alle dimensioner, 3; foretrækker den ene side, 2; kun bevægelse til 1 side, 1; bøjet til ensidig side, 0.
- Placer rotten på bordet (50 cm lang × 35 cm bred) og lad den bevæge sig rundt i fem minutter. Aktivitet defineres som: fuldt responsiv, 3; moderat responsiv, 2; minimalt lydhør, 1; koma, 0.
- Overhold kraniocaudal kredser: vender bilateralt, 3; foretrækker 1 side, 2; kun til 1 side, 1; faldet til 1 side, 0.
- Vurder forbensbevægelsen: lige og bilateral bevægelse, 3; mindre asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; parese, 0.
- Vurder 4-lemmers bevægelsen: lige og bilateral bevægelse, 3; mindre asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; parese, 0.
- Når rotten holder stille, skal du udføre en øreklemme for at stimulere auriklerne og teste smerterefleksen: bevæger sig hurtigt og symmetrisk fra stimulus, 3; bevæger sig langsomt eller asymmetrisk væk fra stimulus, 2; viser en vis bevægelse som reaktion på smerte, 1; ingen reaktion, 0.
- Når rotten holder stille, skal du støje på hver side af rottens krop for at teste hørelsen: fingre gnider, 3; knips af fingre, 2; højt klapper, 1 og ingen overraskende, 0.
- For at kontrollere proprioceptionen skal du røre ved rottens vibrissae på begge sider med henholdsvis en stump pind og observere dens reaktion på stimulus: reagere ved berøring, 3; mindsket reaktion på den ene side, 2; mindsket på begge sider, 1; fraværende, 0.
- For at evaluere torsoens aksiale fornemmelse skal du placere en stump pind på hver side af rottens krop og observere dens reaktion på stimulus: livlig og symmetrisk reaktion på stimuli, 3; en let formindsket eller asymmetrisk reaktion, 2; stærkt formindsket og asymmetrisk reaktion, 1 og ingen reaktion, 0.
- For at teste hornhinderefleksen skal du holde rotten og hurtigt røre ved hornhinden på begge sider med en bomuldspinne: begge øjne lukker hurtigt, 3; formindsket refleks på den ene side, 2; mindsket på begge sider, 1; fraværende, 0.
- For at kontrollere følelsen af nakken skal du holde rotten og bruge en stump pind til at røre ved nakken: reagerer på at røre aktivt, 3; langsom reaktion på berøring, 2; stærkt formindsket reaktion, 1; ingen reaktion, 0.
- For at observere udforskning skal du bruge en lys mørk boks.
BEMÆRK: To tredjedele af kassen skal være åben og tændt, mens resten af den er overdækket og mørk. En 7 cm dør forbinder de to rum. - Placer rotten i lysrummet i 5 minutter og derefter det mørke rum i yderligere 5 minutter, lad det bevæge sig rundt og registrere rottens aktiviteter. Når 4 lemmer er placeret i et rum, skal du registrere det som en indgang. Optag scorer som følger: når de lyse og mørke rum aktivt, 3; når 1 rum, 2; bevæger sig langsomt først efter stimulus, 1; og ingen bevægelse, 0.
- For at kontrollere klatreevnen skal du placere rotten i bunden af et 20 cm bredt, 70 cm langt plan med en 30-graders vinkel på den vandrette jord. Optag scorer som følger: i stand til at klatre til toppen, 3; nedsat klatring, 2; stationært greb, 1; og falder straks, 0.
- For at undersøge bjælkevandringen skal du sætte rotten i den ene ende af en 3 cm bred, 70 cm lang stråle, der er 20 cm over jorden, optage scores som følger: udforsker hele strålen, 3; udforsker en del af strålen, 2; bevægelse og fald, 1; ingen bevægelse, 0.
- Beregn pointene.
4. Blødning bekræftelse af MRI
- Udfør MR-scanningen med 24 timer efter operationen.
- Bedøve rotten med isoflurane (5% for induktion, 1%- 1,5% for vedligeholdelse).
- Fastgør rottens hoved i rottehjernesystemets spole kombineret med en rumfangsspole, der kun kan overføres.
- Placer spolen sammen med rotten i MR-scanneren. Fastgør rotten i holderen via tand- og ørestængerne.
- Brug en termisk jakke med lukket kredsløb til at holde rottens kropstemperatur ved 37 ± 0,5 °C under MR-scanning.
- Udfør en pilotsekvens for at sikre korrekt geometri.
- Påfør en hurtig-spin ekko sekvens til at indsamle T2-vægtede scanninger. Angiv parametrene på følgende måde: echo time (TE), 132 ms; gentagelsestid (TR), 2.500 ms; anskaffelsesmatrix, 148 × 148; synsfelt, 100 mm × 100 mm 12 skiver; 1,5 mm tyk.
- Sæt rotten tilbage i buret.
5. Blødning bekræftelse af grov anatomi
BEMÆRK: Ofre rotterne på det angivne tidspunkt, 24 timer og 14 d efter operationen (Figur 1D).
- Bedøve rotten med 5% isoflurane indtil tab af bevidsthed. Derefter aflives det med kuldioxid (CO2)(20-30% af burets volumen i minuttet).
- Bekræft døden ved hjælp af følgende tegn: ingen bryst stiger og falder, ingen håndgribelig hjerterytme, ingen reaktion på tå knivspids, dårlig slimhinde farve, farveændring, eller uigennemsigtighed i øjnene.
- Udfør cervikal dislokation.
- Fastgør rotten ved at tape poterne på en steril platform. Opret et midterlinjeindsnit fra livmoderhalsen for at udsætte hypogastriumet for brystkasse og lever. Lav et lateralt snit fra den øverste brystkant langs kravebenet længst til venstre og et andet lateralt snit fra xiphoid langs mellemgulvet til venstre for at udsætte hjertet. Løft brystkasseflappen og fastgør den til platformen med en nål.
- Tilslut enden af en nål (27 G) til en perfusionspumpe, der indeholder 4 °C saltvand. Fremryk nålespidsen ind i hjertet langs venstre kant af venstre hjertekammer for at undgå at komme ind i atriet. Tænd perfusionspumpen for at sikre, at spidsen er i venstre ventrikel, og lav derefter et snit i højre atrium.
- Sluk perfusionspumpen, når væsken drænet ud af højre atrium bliver farveløs og leveren bliver hvid. Denne procedure kræver ca. 100 mL saltvand på 4 °C.
- Halshugge rotten og høste hele hjernen ved hjælp af saks og pincet. Fjern fugt fra hjernens overflade med blotting papir.
- Hold hele hjernen ved -80 °C i 1 min.
BEMÆRK: Dette trin kan springes over, hvis hjernen kan skæres uden frysning. - Læg hjernen i koronar rotte hjerne matrix med dorsal side op.
- Sæt et 0,21 mm tykt blad i rustfrit stål ind i blødningscentret i henhold til hullet i hjernens overflade.
- Sæt andre knive ind i hjernen med et interval på 2 mm.
- Hjernesektionerne nedsænkes i 10 ml 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 24 timer ved 4 °C. Skyl dem med 0,01 mmol/L fosfat buffered saltvand (PBS).
- Organiser sektionerne fra rostral til kaudale og billede dem.
6. Paraffinsektion og hematoxylin og eosin (HE) farvning
- Ret hjernen med 4% PFA-opløsning i mindst 24 timer ved stuetemperatur. Mængden af PFA skal være 5-10 gange hjernevolumen.
- Skær hjernen fra blødningscentret i to stykker via klinge- og koronarrodehjernematrix.
- Lav paraffin-indlejrede vævsblokke.
- Paraffinindskydet vævsblok i 40 μm tykkelse glider på en mikrotome, skær 4 sektioner i træk, startende fra blødningscentret, og flyd dem i et 40 °C vandbad.
- 40 μm sektionerne (8 lysbilleder i alt for en hjerne) monteres på rene glasrutsjebaner og lufttørres natten over ved stuetemperatur.
- Bag rutsjebanerne ved 56 °C i 1 time.
- Vask i 3 min i xylen, 3 gange.
- Dyp sektioner 30 gange i 100% ethanol, 30 gange mere i 100% ethanol, 30 gange i 95% ethanol og 30 gange mere i 95% ethanol.
- Skyl i vand fra hanen, indtil det er klart.
- Fordyb sektionerne i Hematoxylin i ca. 10 min.
- Skyl i vand fra hanen, indtil det er klart.
- Fordyb sektioner i eosin pletten i 30 s.
- Dehydrat dias med 3-4 dips 95% ethanol, 3-4 dips i 100% ethanol, 100% Ethanol i 1 minut, og 10 dips i 100% ethanol + xylen (1:1).
- Rengør sektioner med xylen i 1 minut, 2 gange.
- Monter ved hjælp af ikke-vandigt monteringsmedium og en coverlip.
- Tør sektionerne i luften natten over ved stuetemperatur, og afgræn dem derefter.
7. Statistik
- Brug GraphPad Prism 6.0 til at beregne Student's t-test eller Mann Whitney U test.
BEMÆRK: Alle data skal udtrykkes som middel ± SE. Forskelle mellem to grupper bestemmes med en tosidet Student's t-test eller Mann Whitney U test. P<0,05 defineres som statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev anvendt i alt 25 dyr, 3 til kontrol, 6 til 30 μL, 6 for 60 μL og 10 for 100 μL blodindsprøjtninger. En rotte, der fik en 100 μL injektion af autologt blod (1/10), døde inden for 24 timer efter operationen.
Adfærdstest blev udført på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 efter operationen. Resultaterne for kontrolgruppen og blodinjektionsgrupper på forskellige tidspunkter efter operationen er vist i tabel 2. Den pontinblødning forårsagede neurologiske underskud som formindsket hornhinderefleks og kredser (Figur 3B,C). Injektion af 100 μL blod fremkaldte også myotonien (Figur 3A). Resultaterne af balancestråletesten, lemmernes placeringstest og den modificerede Voetsch-neuroscore afslørede, at den neurologiske funktion blev reduceret, da mængden af pontinblødning steg.
MR-scanning blev udført 24 timer efter operationen (Figur 4). I blodinjektionsgrupperne blev blødning på T2-sekvensen påvist som en hypointensekant med en iso- til lidt hyperintense kerne i basilardelen af ponerne. Der blev ikke påvist blødning ved MRi i andre hjerneområder (figur 4). Blødningsmængden blev øget, efterhånden som injektionsvolumenet af autologt blod steg.
Derefter blev rotter ofret efter 24 timer, og dag 14 efter operationen blev der hver for sig foretaget 2 mm tykke sektioner (figur 4). Blødning blev opdaget omkring injektionsstedet og distribueret i bunden af pons. Der var let ødem omkring blødningen i 100 μL blodinjektionsgruppen.
Nogle af rotterne blev ofret 3 dage efter operationen og paraffin-sektion til at gøre HAN farvning. Resultaterne viste, at i blodinjektionsgrupperne blev inflammatoriske celler beriget i peri-blødningszonen (Figur 5C og F). Hæmoglobinet forbliver indeholdt i intakte røde blodlegemer (Figur 5D og G).
Figur 1:Skematiske diagrammer over pontinblødningsmodellen. (B) Det skematiske diagram over boreplacering. (C) De skematiske diagrammer over injektionsstedet. (D) Eksperimentelt design. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Instrumenter og procedurer for kirurgi. (B) Kirurgiske instrumenter. (C) Mikrodrill. (D) Mikroinjektionspumpe. (E) Stereotaxic apparater. (F) En linje markeret i midten af kraniet. (G) Gul pil peger på borestedet. (H) Dræning af blod fra halen vene. (I) Overfør blodet til Eppendorf-røret. (J) Indsug blodet i Hamilton sprøjten. (K) Før Hamiltonsprøjten gennem kraniehullet. (L) Injektionsproces af autologt blod. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater af adfærdstest. (B) Formindsket hornhinderefleks i højre side i en rotte, der injiceres 60 μL autologt blod. (C) Formindsket hornhinderefleks i de bilaterale sider hos en rotte, der blev injiceret 100 μL autologt blod. (D) En rotte modtog 60 μL autologt blod i ring til den kontralaterale side af læsionen. (E) Resultater af balancestråletest. (F) Resultater af den modificerede Voetsch neuroscore. (G) Resultater af lemmernes placeringstest. Linje betyder betydelig forskel mellem de to grupper (p < 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af MR-scanning og grov anatomi. MR-scanningen (Øvre) blev udført 24 timer efter pontinblødningskirurgi, så blev rotterne ofret og skåret i 2 mm hjernesektioner (Nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative resultater af farvningen af hede. Hjerner blev høstet fra rotterne injiceret 100 μL blod 3 d efter operationen. (A) Hele hjernen sektion. Lave felter fra (B) det normale pontinområde, (C) peri-læsionszone og (D) blødningskerne. Høje felter fra (E) normalt pontinområde, (F) peri-læsionszone og (G) blødningskerne. Skalalinjen var 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Repræsentative resultater af grov anatomi på dag 14 efter operationen. Klik her for at hente denne fil.
| Mild | moderat | massiv | |
| Samlet volumen | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Første injektion | |||
| Stereotaktiske koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| lydstyrke | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| fart | 1 μL/min. | 1 μL/min. | 1 μL/min. |
| Intervaltid | 20 min. | 20 min. | 20 min. |
| Anden injektion | |||
| Stereotaktiske koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| lydstyrke | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| fart | 1 μL/min. | 1 μL/min. | 1 μL/min. |
| Før udtagning af nålen | 10 min. | 10 min. | 10 min. |
| AP: anteroposterior position | |||
| Lat: lateral | |||
| Vert: lodret | |||
Tabel 1: Injektion af autologt blod.
| Rottenummer | Dag 1 | Dag 3 | Dag 7 | Dag 14 |
| Den modificerede Voetsch neuroscore | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Test af balancestråle | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prøve for placering af lemmer | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabel 2: Resultater af adfærdstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse, gav vi en protokol til at generere en massiv pontin blødning rotte model. Denne model kan bruges til forskning i patofysiologisk mekanisme og prognose for massiv pontinblødning.
Under hele eksperimentet blev der brugt 25 rotter, hvoraf kun en døde. Kontrollen af MRI, brutto anatomi, og HE farvning viste, at denne metode havde en meget lav dødelighed og en høj succesrate. For at etablere massiv pontinblødningsmodel skal to problemer løses, det injicerede autologe blod har tendens til at lække ind i subarachnoidrummet og strømme tilbage til den fjerde ventrikel langs nålekanalen. Den eksisterende dobbeltinjektionsmodern (60 μL autologt blod i alt) pontinblødningsmodel løste det første problem, næsten intet blod strømmede ind i subarachnoidrummet. Der var dog stadig en lille mængde blodtilstrømning. I denne undersøgelse blev der anvendt flere strategier til at optimere den eksisterende dobbeltinjektionsmetode for at gøre det muligt at injicere en større mængde 100 μL autologt blod uden tilbageløb. For det første blev der anvendt to forskellige injektionspladser i stedet for et. For det andet blev heparin brugt til at skylle sprøjten med minimal rest for at reducere doseringen for kun at beskytte blodet mod koagulering under injektionsprocessen, men ikke nok til at fremme lækage og tilbagestrømning efter injektionen. For det tredje var injektionstiden lang, og injektionshastigheden var langsom, 1 μL/min. Desuden blev kun en lille mængde autologt blod injiceret første gang, mens den anden injektion blev udført 20 minutter senere. Derefter blev nålen først trukket tilbage efter 10 minutter, og denne procedure blev udført ekstremt langsomt. Ved hjælp af denne metode var der næsten intet blod, der strømmede ind i det subarachnoide rum eller fjerde hjertekammer i rotterne injiceret med 30 μL eller 60 μL autologt blod, men der var stadig en lille mængde tilbagestrømning hos rotterne injiceret med 100 μL. Forlængelse af tiden før fjernelse af nålen kunne løse dette problem.
Adfærdstest blev udført på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 efter modellering, herunder balancestråletest, lemmer placeringstest og den modificerede Voetsch neuroscore. På den første dag efter operationen viste næsten alle rotterne i blodinjektionsgrupperne cirkling adfærd (dvs. dreje til venstre eller højre), ledsaget af forsvinden af ensidig eller bilateral hornhinderefleks. Selv om autologt blod blev injiceret i midten af pontinen, var det ujævnt fordelt i de to sider af hjernen. Dette syntes at være årsagen til de forskellige præstationer i adfærdsmæssige tests. Rotternes aktiviteter og reaktioner indsprøjtede 30 μL eller 60 μL autologt blod, der var aftaget tættere på det normale. Hos rotterne, der blev injiceret 100 μL blod, blev de sensorimotoriske funktioner svækket betydeligt, og reaktionen var dårlig. Muskelstivhed dukkede op i nogle rotter i hviletilstand. På dag 1, dag 3 og dag 7 var der åbenlyse forskelle mellem rotter injiceret 30 μL, 60 μL eller 100 μL autologt blod og rotterne i kontrolgruppen i den modificerede Voetsch neuroscore. I testen for balancestråler og lemmernes sted var der ingen signifikante forskelle mellem de injicerede rotter 30 μL eller 60 μL blod og rotterne i kontrolgruppen på noget tidspunkt. Resultaterne af balancestråletesten og lemmernes placeringstest hos rotter, der blev injiceret 100 μL autologt blod, var imidlertid væsentligt forskellige sammenlignet med kontrolgruppen på dag 1 og dag 3. Den mulige årsag kan være, at der er færre evalueringspunkter i balancestråletesten og lemmernes placeringstest sammenlignet med den modificerede Voetsch-neuroscore, som ikke er følsomme nok til at opdage subtile neurologiske underskud. Det er uhensigtsmæssigt at bruge disse to metoder til at evaluere adfærd i blødningsmodeller med milde symptomer, men de er anvendelige i den massive pontinblødningsmodel. Samlet set viste den modificerede Voetsch neuroscore sig at være mere egnet til omfattende og præcis vurdering af de neurologiske funktioner i forskellige pontinblødningsmodeller.
Der er flere fordele ved denne metode. Baseret på den tidligere dobbeltinjektionsmetode blev det andet injektionssted ændret, og dosis af heparin blev justeret for at undgå lækage og tilbagestrømning i den milde (30 μL) og moderate (60 μL) pontinblødningsmodel. Selv i den massive (100 μL) pontinblødningsmodel var tilbagestrømningen meget begrænset og forekom kun hos et lille antal rotter. Denne metode kan nemt udføres med en høj succesrate og en lav dødelighed. Desuden kan den eksperimentelle pontinblødning observeres i en lang periode, mindst 14 dage efter modellering, hvilket er befordrende for at undersøge hele sygdomsudviklingen og virkningerne af behandlinger. Det største fremskridt i denne model var, at det efterlignede symptomerne på patienter med pontinblødning. Klinisk, massive pontin blødning resulterer i alvorlige neurologiske underskud, mens tidligere pontin blødning modeller kun udviklet relativt lille hæmoragisk volumen med milde symptomer. Den massive pontin blødning i denne model distribueres i de bilaterale pons, hvilket svarer til blødning distribution i pontin blødning patienter. I tidligere eksperimentelle pontinblødningsmodeller placerede blødningsblødning kun i de ensidige pons9.
Der er dog også nogle begrænsninger ved denne metode. For det første var pontinblødning i denne undersøgelse forårsaget af injektion af blod, delvist hepariniseret under overgangen, hvilket kan påvirke blodkoagulationen eller endda homøostase i de omkringliggende poner. For det andet kræver denne model specielt udstyr, såsom stereotaxic apparatur og injektionspumpe. For det tredje kan denne model ikke efterligne spontan blødning.
Afslutningsvis gav denne undersøgelse en metode til at skabe en eksperimentel akut massiv pontinblødningsmodel i rotten, som kunne fremme ny mekanisk og terapeutisk forskning på dette område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af National Science Foundation of China (81471181 og 81870933) og Opening Lab Program of Guangzhou Medical University (0506308) til Y Jiang og af National Science Foundation of China (81701471) og Scientific Program of Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) til Z Qiu og af National Science Foundation of China (81501009) til L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
