Summary
We presenteren een protocol om een enorm pontine bloedingsmodel in een rat vast te stellen via dubbele injectie van autoloog bloed.
Abstract
We bieden een protocol om een enorm pontine bloedingsmodel in een rat vast te stellen. Ratten met een gewicht van ongeveer 250 gram werden in deze studie gebruikt. Honderd microliters autologe bloed werd uit de staartader gehaald en stereotaxisch in de pons geïnjecteerd. Het injectieproces was verdeeld in 2 stappen: Eerst werd 10 μL bloed geïnjecteerd op een specifieke locatie, anteroposterior positie (AP) -9,0 mm; zijdelings (Lat) 0 mm; verticaal (Vert) -9,2 mm, gevolgd door een tweede injectie van het resterende bloed bij AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm met een interval van 20 minuten. De balansstraaltest, ledemaatplaatsingstest en de gemodificeerde Voestch-neuroscore werden gebruikt om de neurologische functie te evalueren. Magnetic Resonance Imaging (MRI) werd gebruikt om het volume van de bloeding in vivo te beoordelen. De symptomen van dit model waren in lijn met patiënten met een enorme pontinebloeding.
Introduction
Intracerebrale bloeding is goed voor een vijfde van de beroertepatiënten. De prognose van de intracerebrale bloeding hangt af van de snelheid, het volume en de locatie van de bloeding1,2. In vergelijking met de forebrain bloeding, de hersenstam bloeding heeft een hogere mortaliteit en morbiditeit3. Ongeveer 40% van de hersenstambloeding komt voor bij de pons4. De etiologie en pathofysiologie van pontinebloeding zijn heel anders en minder bestudeerd dan voorhersenenbloeding5.
Er zijn twee soorten pontine bloeding dierlijke modellen. Een daarvan is spontane bloeding model geïnduceerd door infusie van bacteriële collagenase in de pons6,7,8. Het grootste voordeel van dit model is dat het bloeden spontaan is. Collagenase kan echter slechts een klein volume pontinebloeding veroorzaken. Trouwens, collagenase kan andere verwondingen aan de hersenen veroorzaken. Het andere model wordt geïnduceerd door stereotactische injectie van autologe bloed in de pons9. Het voordeel van dit model is dat het gemakkelijk te beheersen is met een hoog slagingspercentage. Theoretisch kunnen onderzoekers elk volume bloed injecteren in elke locatie van pons. Vanwege de teruglekkage door de naaldroute is het geïnjecteerde volume echter beperkt. Onlangs is de methode met dubbele injectie bevorderd om de ruglekkage te verminderen9. Deze methode injecteert autologe bloed twee keer met een interval van 20 minuten tussen de injecties. De methode met dubbele injectie wordt toegepast om een milde (30 μL) en matige (60 μL) pontinebloeding te veroorzaken, maar geen massale pontinebloeding. In de kliniek hebben de meeste pontinebloedingpatiënten met een slechte prognose een enorme bloeding (meer dan 10 ml).
In de vorige studie hebben we een protocol verstrekt om een pontine ischemisch beroertemodel vast te stellen bij rat10. In deze studie wijzigen we de bestaande dubbele injectiemethode en bieden we een gedetailleerd protocol om een massale pontinebloeding bij een rat te veroorzaken door dubbele injectie van 100 μL autologe bloed op twee verschillende locaties in de pons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Tweede Aangesloten Ziekenhuis van guangzhou Medical University. Ratten werden geleverd door het Animal Center van de Southern Medical University. Het experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 1.
1. Dier en instrumenten
- Gebruik 8 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 250 ± 10 g.
- Huisvest de ratten ten minste 7 dagen vóór de operatie onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden met een omgevingstemperatuur van 25 °C, een relatieve vochtigheid van 65% en een licht-donkercyclus van 12/12 uur.
- Zorg voor voedsel en water zonder limiet.
- Bereid de instrumenten voor (figuur 2A-E).
2. Injecteer het bloed in de pons
- Weeg de ratten opnieuw 3 dagen voor de operatie om ratten met een geschikt lichaamsgewicht voor de experimenten te selecteren.
- Train de ratten gedurende de 3 dagen voor het modelleren om 3 keer per dag op balansbalk te lopen om ervoor te zorgen dat normale ratten de balansbalk zonder pauze kunnen passeren.
- Verwarm het verwarmingskussen voor op 37 °C voor anesthesie.
- Bevestig een microdrill aan de houder op het stereotaxic frame.
- Injecteer de ratten intraperitoneaal met 50 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine. Wacht tot er geen teenknijpreactie is.
- Transporteer de rat in een gevoelige positie in het stereotaxic frame. Plaats de oorstangen boven de gehoorgang om het hoofd vast te zetten. Bevestig de schedel in een horizontale positie om scheeftrekken van de injectie te voorkomen (Figuur 2F).
- Onderhoud anesthesie door isofluraan (97,5% zuurstof en 2,5% isofluraan) via een stereotaxische neuskegel met een inlaat- en uitlaatpoort.
- Gebruik oogzalf om het hoornvlies vochtig te houden.
- Scheer het haar boven de schedel met een micro scheerapparaat.
- Teken een middellijn van 3 cm met een markeerstift in de schedel van de lijn van de bilaterale laterale canthus tot 0,5 cm achter de achterste fontanelle, zoals weergegeven in figuur 2F.
- Breng Entoiodine chirurgische scrub aan op een cirkelvormige manier, beginnend in het midden van de gemarkeerde middenlijn en naar buiten draaiend.
- Plaats het chirurgische laken.
- Maak een incisie met een scalpel langs de gemarkeerde middellijn.
- Gebruik een wattenstaafje om mogelijk bloed te verwijderen.
- Plaats een stuk tang aan elke kant van de hoofdhuidflap om de schedel bloot te leggen (Afbeelding 2G).
- Dompel een wattenstaafje in 0,9% zoutoplossing en verwijder voorzichtig de bindweefsels van het schedelbot om te voorkomen dat het bindweefsel vast komt te zitten in de microdrill.
- Markeer het centrale punt van de bregma als het oorsprongspunt via een markeerpen.
- Voer een craniotomie (1 mm in diameter) uit met behulp van een microdrill bij AP-9,0 mm, Lat 0 mm (figuur 1B en tabel 1). Ga voorzichtig te werk, want dit punt ligt zeer dicht bij de veneuze sinus (Figuur 2G).
- Verwijder de microdrill uit het stereotaxic frame.
- Plaats een 100 μL Hamilton spuit in de stereotaxic houder (Figuur 2K). Schakel de schakelaar van de injectiepomp in, klik op de knop Snelle inademing, aspireer heparineoplossing (12500 U verdund in 100 ml zoutoplossing) tot 100 μL en laat deze vervolgens volledig uitlekken om te voorkomen dat het bloed te snel stolt.
- Breng chloorhexidine en 75% alcoholchirurgische scrub aan op de hele staart van wortel tot punt ten minste 3 keer om de huid te desinfecteren, de geilheid te verzachten en de staartader te verwijden om het succespercentage van de injectie te verhogen.
- Bevestig een hoofdhuidacupunctuur aan een spuit van 1 ml.
- Steek de hoofdhuidacupunctuur in een laterale staartader op 3 cm van de staartpunt en neem 150 μL bloed (figuur 2H).
- Verwijder de hoofdhuidacupunctuur uit de spuit van 1 ml.
- Breng het bloed over in een buisje (figuur 2I).
OPMERKING: Breng snel over om bloedstolling te voorkomen. - Verwissel de chirurgische handschoenen.
- Kies De terugtrekmodus, stel het volume in op 100 μL, stel de snelheid in op 200 μL/min, klik op de RUN-knop, aspireer 100 μL bloed in de Hamilton-spuit (figuur 2J).
- Kies de infuse-modus, stel de snelheid in op 1 μL/min.
- Schuif de spuit vooruit tot de punt 9,2 mm onder het hersenoppervlak bereikt (figuur 1C en figuur 2L).
- Klik op de knop Uitvoeren, injecteer de eerste 10 μL bloed met een snelheid van 1 μL/min (Tabel 1).
- Stop de injectie en laat de spuit 20 minuten op zijn plaats om te voorkomen dat bloed in de subarachnoïdale ruimte stroomt.
- Trek de spuit terug tot de punt 9,0 mm onder het oppervlak van de hersenen komt.
- Start de injectie opnieuw met dezelfde snelheid van 1 μL/min totdat het resterende bloed volledig is geïnjecteerd.
- Laat de spuit 10 minuten op zijn plaats staan om terugstroming van het bloed te voorkomen.
- Verwijder de spuit langzaam uit de hersenen.
- Gebruik botcement om het craniotomiegat te bedekken.
- Wanneer het cement droogt, hecht de wond met 4-0 polyamide hechtdraad. Na het naaien van 3 of 4 stiches, bind 2-1-1 standaard chirurgische knopen.
- Om infectie te voorkomen, injecteert u de rat met penicilline (0,25 ml, 80 IE verdund in 4 ml zoutoplossing) intraperitoneaal.
- Injecteer de ratten subcutaan met Butorphanol tartraat (2,5 mg/kg) en herhaal de injectie elke 2 uur om postoperatieve pijn te verlichten tot 24 uur na de operatie.
- Observeer de rat elke 15 minuten totdat hij volledig herstelt van anesthesie. Breng het terug naar de originele kooi, met een verwarmingskussen onder de kooi. Geef de rat gratis toegang tot voedsel en water tot het offer.
3. Gedragstests
OPMERKING: Voer gedragstests uit op dag 1, dag 3, dag 7 en dag 14 na het modelleren, inclusief de balansbalktest, de plaatsingstest voor ledematen en de aangepaste Voetsch-neuroscore.
- Balansbalktest11.
OPMERKING: Dit is een test specifiek voor het onderzoeken van de sensorimotorische functie van de achterpoot.- Bereidde het apparaat voor om ervoor te zorgen dat de balk (3 cm breed × 70 cm lang) zich 20 cm boven de vloer bevindt.
- Plaats een donkere doos aan de achterkant van de balk met een smalle ingang.
- Plaats een witte ruisgenerator en een heldere lichtbron, die worden gebruikt om de rat te motiveren om de straal te doorkruisen en de doelbox in te voeren, aan het hoofdeinde van de balk.
- Stop het geluid en het licht wanneer het dier het doelvak binnenkomt. Registreer de latentie van het hoofdeinde naar het doelvak (in seconden) en de prestaties van hindlimb tijdens het doorkruisen van de balk.
- Noteer de prestatiescore als volgt: 0, balansen met een stabiele houding; 1, grijpt kant van straal; 2, knuffelt de balk met 1 achterbeen eraf vallen; 3, knuffelt de balk met 2 ledematen die eraf vallen of meer dan 60 s rond de balk draaien; 4, pogingen om te balanceren op balk >40 s, maar valt af; 5, pogingen om te balanceren op balk >20 s, maar valt af; en 6, valt af, zonder poging om te balanceren of balanceren op balk <20 s.
- Plaatsingstest voor ledematen
OPMERKING: De ledemaatplaatsingstest onderzoekt 3 onafhankelijke stimuli van zicht, aanraking en proprioceptie met 6 parameters om de sensorimotorische functie van rat te evalueren. De totale neurologische functiescore varieerde van 0 tot 12. Vóór de test moet de rat gewend zijn aan het hanteren.- Houd de rat aan de achterkant en leg hem langzaam op tafel vanaf een hoogte van 10 cm. Normaal gesproken zou de rat voorpoten uitrekken en op tafel leggen.
- Pak de rat bij de achterkant en houd hem tegenover de rand van de tafel. De reactie van voorpoten wordt waargenomen. Een normale rat zou de voorpoten op tafel leggen.
- Laat de rat de rand van de tafel vastpakken. Een normale rat zou de kin gebruiken om te voorkomen dat het neus- en neushaar de tafelrand raakt.
- Leg de rat op tafel, duw de rat met een zachte zijdelingse druk achter de schouder van de rat naar de rand van de tafel en observeer de plaatsing van de voorpoten en achterpoten. Een normale rat zou de rand grijpen met zijn voorpoten en achterpoten.
- Plaats de rat op de tafel met het gezicht naar de rand en duw hem voorzichtig van de rug naar de rand. Een normale rat zou de rand grijpen met zijn voorpoten.
- Plaats de rat met zijn rug naar de rand op de tafel en duw hem met de rug naar de rand van de tafel. Let op de reactie van de achterpoten. Een normale rat zou de rand met zijn achterpoten vastpakken.
- Beoordeel de plaatsing van de voorpoten of achterpoten aan de tafelrand. Noteer de scores als volgt: 0, geen plaatsing; 1, onvoltooide en/of vertraagde plaatsing; 2, onmiddellijke, volledige plaatsing.
- De aangepaste Voetsch neuroscore8
OPMERKING: De gemodificeerde Voetsch neuroscore is een vertebrobasilaire schaalscore van sensorimotorisch vermogen, met 14 parameters: hoofdbeweging, activiteit, gehoor, pijnreflex, hoornvliesreflex, proprioceptie, neksensatie, exploratie, cirkelen, axiale torsosensatie, 4-ledige beweging, voorpotenbeweging, klimmen en balkwandeling. De score voor elke parameter varieert van 0 (volledig neurologisch tekort) tot 3 (geen neurologisch tekort). De totale neurologische functiescore varieert van 0 tot 42.- Leg de rat op tafel (50 cm lang × 35 cm breed) en laat hem vijf minuten bewegen. Observeer de spontane beweging van zijn hoofd: beweegt in alle dimensies, 3; geeft de voorkeur aan één kant, 2; alleen beweging naar 1 kant, 1; naar eenzijdige zijde, 0.
- Leg de rat op tafel (50 cm lang × 35 cm breed) en laat hem vijf minuten bewegen. Activiteit wordt gedefinieerd als: volledig responsief, 3; matig responsief, 2; minimaal responsief, 1; coma, 0.
- Observeer de craniocaudal cirkelen: draait bilateraal, 3; geeft de voorkeur aan 1 kant, 2; slechts aan 1 kant, 1; gevallen tot 1 kant, 0.
- Evalueer de voorpotenbeweging: gelijke en bilaterale beweging, 3; lichte asymmetrie, 2; grote asymmetrie, 1; parese, 0.
- Evalueer de beweging met 4 ledematen: gelijke en bilaterale beweging, 3; lichte asymmetrie, 2; grote asymmetrie, 1; parese, 0.
- Wanneer de rat stilstaat, voer dan een oorknepein uit om de oorschelp te stimuleren en test de pijnreflex: beweegt snel en symmetrisch weg van stimulus, 3; beweegt langzaam of asymmetrisch weg van stimulus, 2; vertoont enige beweging als reactie op pijn, 1; geen reactie, 0.
- Wanneer de rat stilstaat, maak dan een geluid aan weerszijden van het lichaam van de rat om het gehoor te testen: vingers wrijven, 3; vingerknip, 2; luid klappen, 1 en geen schrik, 0.
- Om de proprioceptie te controleren, raakt u de vibrissae van de rat aan beide zijden aan met een stompe stok en observeert u de reactie op de stimulus: reageer bij aanraking, 3; verminderde reactie aan één kant, 2; aan beide zijden verminderd, 1; afwezig, 0.
- Om het axiale gevoel van de romp te evalueren, plaatst u een stompe stok aan weerszijden van het lichaam van de rat en observeert u de reactie op de stimulus: stevige en symmetrische reactie op stimuli, 3; licht verminderde of asymmetrische reactie, 2; sterk verminderde en asymmetrische reactie, 1 en geen reactie, 0.
- Om de hoornvliesreflex te testen, houdt u de rat vast en raakt u het hoornvlies aan beide zijden snel aan met een wattenstaafje: beide ogen sluiten snel, 3; verminderde reflex aan één kant, 2; aan beide zijden verminderd, 1; afwezig, 0.
- Om het gevoel van de nek te controleren, houdt u de rat vast en gebruikt u een stompe stok om de nek aan te raken: reageert actief op aanraking, 3; trage reactie op aanraking, 2; sterk verminderde reactie, 1; geen reactie, 0.
- Gebruik een licht donkere doos om verkenning te observeren.
OPMERKING: Tweederde van de doos moet open en verlicht zijn, terwijl de rest bedekt en donker is. Een deur van 7 cm verbindt de twee compartimenten. - Plaats de rat 5 minuten in het lichtcompartiment en vervolgens nog eens 5 minuten in het donkere compartiment, laat hem bewegen en registreer de activiteiten van de rat. Wanneer 4 ledematen in één kamer worden geplaatst, neem het dan op als een ingang. Noteer scores als volgt: bereikt de lichte en donkere compartimenten actief, 3; bereikt 1 compartiment, 2; beweegt langzaam alleen na stimulus, 1; en geen beweging, 0.
- Om het klimvermogen te controleren, plaatst u de rat op de bodem van een 20 cm breed, 70 cm lang vlak met een hoek van 30 graden ten opzichte van de horizontale grond. Recordscores als volgt: in staat om naar de top te klimmen, 3; verminderd klimmen, 2; stationaire grip, 1; en valt onmiddellijk, 0.
- Om de balkwandeling te onderzoeken, plaatst u de rat aan het ene uiteinde van een 3 cm brede, 70 cm lange balk die 20 cm boven de grond ligt, noteer scores als volgt: verkent de hele balk, 3; verkent een deel van de balk, 2; enige beweging en dalingen, 1; geen beweging, 0.
- Bereken de punten.
4. Bevestiging van een bloeding door MRI
- Voer de MRI-scan uit om 24 uur na de operatie.
- Verdoof de rat met isofluraan (5% voor inductie, 1%- 1,5% voor onderhoud).
- Zet het hoofd van de rat vast in de arrayspoel van de rattenhersenen in combinatie met een volumespoel die alleen wordt verzonden.
- Plaats de spoel samen met de rat in de MRI-scanner. Zet de rat vast in de wieg via de tand- en oorstangen.
- Gebruik een thermische mantel met gesloten circuit om de lichaamstemperatuur van de rat tijdens MRI-scans op 37 ± 0,5 °C te houden.
- Voer een pilotsequentie uit om de juiste geometrie te garanderen.
- Pas een snelle echosequentie toe om T2-gewogen scans te verzamelen. Stel de parameters als volgt in: echotijd (TE), 132 ms; herhalingstijd (TR), 2.500 ms; acquisitiematrix, 148 × 148; gezichtsveld, 100 mm × 100 mm; 12 plakjes; 1,5 mm dik.
- Breng de rat terug naar de kooi.
5. Bloeding bevestiging door grove anatomie
OPMERKING: Offer de ratten op het aangewezen tijdstip, 24 uur en 14 d na de operatie (Figuur 1D).
- Verdoof de rat met 5% isofluraan tot bewustzijnsverlies. Euthanaseer het vervolgens met kooldioxide (CO2) (20-30% van het volume van de kooi per minuut).
- Bevestig de dood met behulp van de volgende tekenen: geen opkomen en vallen van de borstkas, geen voelbare hartslag, geen reactie op teenknijpen, slechte slijmvlieskleur, kleurverandering of dekking in de ogen.
- Voer cervicale dislocatie uit.
- Zet de rat vast door de poten op een steriel platform te tappen. Maak een middellijnincisie van de baarmoederhals om het hypogastrium bloot te stellen aan thorax en lever. Maak een laterale incisie van de bovenste sternale rand langs het sleutelbeen helemaal links en een andere laterale snede van de xiphoid langs het middenrif naar uiterst links, om het hart bloot te leggen. Til de ribbenkastklep op en bevestig deze met een pin aan het platform.
- Sluit het uiteinde van een naald (27 G) aan op een perfusiepomp met een zoutoplossing van 4 °C. Schuif de naaldpunt in het hart langs de linkerrand van de linkerventrikel om te voorkomen dat u het atrium binnengaat. Schakel de perfusiepomp in om ervoor te zorgen dat de punt zich in de linkerventrikel bevindt en maak vervolgens een snede in het rechter atrium.
- Schakel de perfusiepomp uit wanneer de vloeistof die uit het rechter atrium wordt afgevoerd kleurloos wordt en de lever wit wordt. Deze procedure heeft ongeveer 100 ml zoutoplossing van 4 °C nodig.
- Onthoofd de rat en oogst de hele hersenen met behulp van een schaar en tang. Verwijder vocht van het hersenoppervlak met vloeipapier.
- Houd de hele hersenen 1 minuut op -80 °C.
OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen als de hersenen kunnen worden doorgesneden zonder te bevriezen. - Leg de hersenen in de coronale rattenhersenmatrix met de ruggegeden naar boven.
- Steek een 0,21 mm dik roestvrijstalen mes in het bloedingscentrum volgens het gat in het oppervlak van de hersenen.
- Steek andere messen in de hersenen met een interval van 2 mm.
- Dompel de hersensecties gedurende 24 uur bij 4 °C onder in 10 ml 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing. Spoel ze af met 0,01 mmol/L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Organiseer de secties van rostral naar caudal en beeld ze in.
6. Paraffinesectie en hematoxyline en eosine (HE) kleuring
- Fixeer de hersenen met 4% PFA-oplossing gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur. Het volume van PFA moet 5-10 keer het hersenvolume zijn.
- Snijd de hersenen van het bloedingscentrum in twee stukken via mes en coronale rattenhersenmatrix.
- Maak paraffine-ingebedde weefselblokken.
- Sectie het met paraffine ingebedde weefselblok coronally in dia's met een dikte van 40 μm op een microtome, snijd 4 secties achter elkaar, beginnend bij het bloedingscentrum, en drijf ze in een waterbad van 40 °C.
- Monteer de secties van 40 μm (in totaal 8 dia's voor één brein) op schone glazen dia's en droog ze 's nachts op kamertemperatuur.
- Bak de dia's 1 uur op 56 °C.
- Was gedurende 3 minuten in xyleen, 3 keer.
- Dompel secties 30 keer in 100% ethanol, 30 keer meer in 100% ethanol, 30 keer in 95% ethanol en 30 keer meer in 95% ethanol.
- Spoel af in leidingwater tot het helder is.
- Dompel de secties ongeveer 10 minuten onder in Hematoxylin.
- Spoel af in het kraanwater tot het helder is.
- Dompel secties 30 s onder in eosinevlek.
- Dehydrateer dia's met 3-4 dips 95% ethanol, 3-4 dips in 100% ethanol, 100% Ethanol gedurende 1 minuut en 10 dips in 100% ethanol + xyleen (1:1).
- Reinig secties met xyleen gedurende 1 min, 2 keer.
- Monteer met een niet-waterig montagemedium en een afdeklip.
- Droog de secties in de lucht 's nachts op kamertemperatuur en saneer ze vervolgens.
7. Statistieken
- Gebruik GraphPad Prism 6.0 om de t-test van de student of de Mann Whitney U-test te berekenen.
OPMERKING: Alle gegevens moeten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SE. Verschillen tussen twee groepen worden bepaald met een tweezijdige Student's t-test of Mann Whitney U-test. P<0.05 wordt gedefinieerd als statistische significantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden 25 dieren gebruikt, 3 voor controle, 6 voor 30 μL, 6 voor 60 μL en 10 voor 100 μL bloedinjecties. Een rat die een injectie van 100 μL autologe bloed (1/10) kreeg, stierf binnen 24 uur na de operatie.
Gedragstests werden uitgevoerd op dag 1, dag 3, dag 7 en dag 14 na de operatie. De scores voor de controlegroep en bloedinjectiegroepen op verschillende tijdspunten na de operatie zijn weergegeven in tabel 2. De pontinebloeding veroorzaakte neurologische tekorten zoals verminderde hoornvliesreflex en cirkelen (figuur 3B,C). Injectie van 100 μL bloed veroorzaakte ook de myotonie (Figuur 3A). De resultaten van de evenwichtsstraaltest, de plaatsingstest van de ledematen en de aangepaste Voetsch-neuroscore onthulden dat de neurologische functie afnam naarmate het volume van de pontinebloeding toenam.
Mri-scans werden 24 uur na de operatie uitgevoerd (figuur 4). In de bloedinjectiegroepen, op T2-sequentie, werd een bloeding gedetecteerd als een hypointense rand met een iso- tot licht hyperintense kern in het basilaire deel van de pons. Er werd geen bloeding ontdekt door MRI in andere hersengebieden (Figuur 4). Het volume van de bloeding werd verhoogd naarmate het injectievolume van autoloog bloed toenam.
Vervolgens werden ratten geofferd op 24 uur en dag 14 na de operatie, afzonderlijk, en 2 mm dikke secties werden gemaakt (figuur 4). Er werd een bloeding ontdekt rond de injectieplaats en verspreid in de basis van pons. Er was licht oedeem rond de bloeding in de 100 μL bloedinjectiegroep.
Sommige ratten werden 3 dagen na de operatie opgeofferd en geparaffine-gesectied om HE-vlekken te maken. De resultaten toonden aan dat in de bloedinjectiegroepen ontstekingscellen verrijkt in de peri-bloedingszone (figuur 5C en F). Het hemoglobine blijft in intacte rode bloedcellen(figuur 5D en G).
Figuur 1: Schematische diagrammen van pontinebloedingsmodel. (A) Autologe bloedafname uit staartader. (B) Het schematische schema van de boorlocatie. (C) De schematische schema's van de injectieplaats. D) Experimenteel ontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Instrumenten en procedure van chirurgie. (A) Anesthesiemachine. B) Chirurgische instrumenten. C) Microdrill. (D) Micro-injectiepomp. (E) Stereotaxic-apparaat. (F) Een lijn gemarkeerd in het midden van de schedel. (G) Gele pijl wijst naar boorlocatie. H) Afvoer van bloed uit de staartader. (I) Breng het bloed over in eppendorfbuis. (J) Aspireer het bloed in hamilton spuit. (K) Schuif de Hamilton-spuit door het schedelgat. (L) Injectieproces van autoloog bloed. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van gedragstests. (A) Myotonie bij een rat injecteerde 100 μL autoloog bloed. (B) Verminderde hoornvliesreflex aan de rechterkant bij een rat die 60 μL autoloog bloed heeft geïnjecteerd. C) Verminderde hoornvliesreflex in de bilaterale zijden bij een rat die 100 μL autoloog bloed heeft geïnjecteerd. (D) Een rat kreeg 60 μL autoloog bloed dat naar de contralaterale kant van de laesie was gecirkeld. E) Resultaten van de balansbalktest. (F) Resultaten van de aangepaste Voetsch neuroscore. (G) Resultaten van de test voor de plaatsing van ledematen. Lijn betekent een significant verschil tussen de twee groepen (blz. < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van MRI-scans en grove anatomie. De MRI-scan (Upper) werd 24 uur na een pontinebloedingsoperatie uitgevoerd, waarna de ratten werden opgeofferd en in hersensecties van 2 mm (onder) werden gesneden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van HE-kleuring. Hersenen werden geoogst van de ratten geïnjecteerd 100 μL bloed 3 d na de operatie. (A) De hele hersensectie. Lage velden van (B) het normale pontinegebied, (C) perilaesiezone en (D) bloedingskern. Hoge velden uit (E) normaal pontinegebied, (F) perilaesiezone en (G) bloedingskern. Schaalbalk was 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur S1: Representatieve resultaten van de grove anatomie op dag 14 na de operatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Redelijk | gematigd | massief | |
| Totaal volume | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Eerste injectie | |||
| Stereotactische coördinaten | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| snelheid | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Intervaltijd | 20 min | 20 min | 20 min |
| Tweede injectie | |||
| Stereotactische coördinaten | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| snelheid | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Vóór het terugtrekken van de naald | 10 min | 10 min | 10 min |
| AP: anteroposterior positie | |||
| Lat: zijdelings | |||
| Vert: verticaal | |||
Tabel 1: Injectie van autoloog bloed.
| Rat-nummer | Dag 1 | Dag 3 | Dag 7 | Dag 14 |
| De aangepaste Voetsch neuroscore | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Schijn-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Schijn-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Schijn-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Balansbalktest | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Schijn-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Schijn-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Schijn-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Plaatsingstest voor ledematen | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Schijn-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Schijn-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Schijn-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabel 2: Resultaten van gedragstests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we een protocol verstrekt om een enorm pontinebloedingsratmodel te genereren. Dit model kan worden gebruikt voor het onderzoek naar het pathofysiologische mechanisme en de prognose van een massale pontinebloeding.
Tijdens het experiment werden 25 ratten gebruikt, waarvan er slechts één stierf. De verificatie van MRI, grove anatomie en de HE-kleuring gaven aan dat deze methode een zeer laag sterftecijfer en een hoog slagingspercentage had. Om een enorm pontinebloedingsmodel vast te stellen, moeten twee problemen worden opgelost, het geïnjecteerde autologe bloed heeft de neiging om in de subarachnoïde ruimte te lekken en terug te stromen naar de vierde ventrikel langs het naaldkanaal. Het bestaande matige subarachnoïdale model met dubbele injectie (in totaal 60 μL autologe bloeding) loste het eerste probleem op, nauwelijks bloed stroomde in de subarachnoïdale ruimte. Er was echter nog steeds een kleine hoeveelheid bloed terugstroom. In deze studie werden verschillende strategieën toegepast om de bestaande dubbele injectiemethode te optimaliseren om het mogelijk te maken om een grotere hoeveelheid autologe bloed van 100 μL te injecteren zonder terugstroom. Ten eerste werden twee verschillende injectievlekken gebruikt in plaats van één. Ten tweede werd heparine gebruikt om de spuit met minimale resten door te spoelen om de dosering te verlagen, om het bloed alleen te beschermen tegen stolling tijdens het injectieproces, maar niet genoeg om lekkage en terugstroming na de injectie te bevorderen. Ten derde was de injectietijd lang en was de injectiesnelheid traag, 1 μL/min. Bovendien werd de eerste keer slechts een kleine hoeveelheid autoloog bloed geïnjecteerd, terwijl de tweede injectie 20 minuten later werd uitgevoerd. Daarna werd de naald pas na 10 minuten teruggetrokken en werd deze procedure extreem langzaam uitgevoerd. Met behulp van deze methode stroomde er nauwelijks bloed in de subarachnoïdale ruimte of vierde ventrikel bij de ratten geïnjecteerd met 30 μL of 60 μL autoloog bloed, maar er was nog steeds een kleine hoeveelheid terugstroom in de ratten geïnjecteerd met 100 μL. Het verlengen van de tijd voordat de naald werd verwijderd, kon dit probleem oplossen.
Gedragstests werden uitgevoerd op dag 1, dag 3, dag 7 en dag 14 na het modelleren, inclusief balansstraaltest, ledemaatplaatsingstest en de aangepaste Voetsch-neuroscore. Op de eerste dag na de operatie vertoonden bijna alle ratten in de bloedinjectiegroepen cirkelgedrag (d.w.z. links of rechts draaien), vergezeld van het verdwijnen van eenzijdige of bilaterale hoornvliesreflex. Hoewel autologe bloed werd geïnjecteerd in de middellijn van de pontine, was het ongelijk verdeeld in de twee zijden van de hersenen. Dit leek de reden te zijn voor de verschillende prestaties in gedragstests. De activiteiten en reacties van de ratten injecteerden 30 μL of 60 μL autoloog bloed dat dichter bij normaal vertraagde. Bij de ratten die 100 μL bloed injecteerden, waren de sensorimotorische functies aanzienlijk verzwakt en was de respons slecht. Spierstijfheid verscheen bij sommige ratten in de rusttoestand. Op dag 1, dag 3 en dag 7 waren er duidelijke verschillen tussen ratten die 30 μL, 60 μL of 100 μL autoloog bloed injecteerden en de ratten in de controlegroep in de gemodificeerde Voetsch neuroscore. Bij de balansstraaltest en de ledemaatplaatstest waren er geen significante verschillen tussen de ratten die 30 μL of 60 μL bloed injecteerden en de ratten in de controlegroep op elk moment. De resultaten van de balansstraaltest en de plaatsingstest bij ratten die 100 μL autologe bloed injecteerden, waren echter significant verschillend in vergelijking met de controlegroep op dag 1 en dag 3. De mogelijke reden zou kunnen zijn dat er minder evaluatiepunten zijn in de balansbalktest en de ledemaatplaatsingstest in vergelijking met de gemodificeerde Voetsch-neuroscore, die niet gevoelig genoeg zijn om subtiele neurologische tekorten te ontdekken. Het is ongepast om deze twee methoden te gebruiken om gedrag te evalueren in bloedingsmodellen met milde symptomen, maar ze zijn van toepassing in het enorme pontinebloedingsmodel. Over het algemeen bleek de aangepaste Voetsch neuroscore meer geschikt voor het uitgebreid en nauwkeurig beoordelen van de neurologische functies in verschillende pontinebloedingsmodellen.
Er zijn verschillende voordelen van deze methode. Op basis van de vorige methode met dubbele injectie werd de tweede injectielocatie gewijzigd en werd de dosering van heparine aangepast om lekkage en terugstroming in het milde (30 μL) en matige (60 μL) pontinebloedingsmodel te voorkomen. Zelfs in het massieve (100 μL) pontinebloedingsmodel was de terugstroom zeer beperkt en kwam slechts bij een klein aantal ratten voor. Deze methode kan eenvoudig worden uitgevoerd met een hoog slagingspercentage en een laag sterftecijfer. Bovendien kan de experimentele pontinebloeding gedurende een lange periode worden waargenomen, ten minste 14 dagen na modellering, wat bevorderlijk is voor het onderzoeken van de volledige ontwikkeling van de ziekte en de effecten van behandelingen. De belangrijkste vooruitgang van dit model was dat het de symptomen van patiënten met pontinebloeding nabootste. Klinisch resulteert een massale pontinebloeding in ernstige neurologische tekorten, terwijl eerdere pontinebloedingsmodellen slechts een relatief klein hemorragisch volume ontwikkelden met milde symptomen. De enorme pontinebloeding in dit model verdeeld in de bilaterale pons, wat vergelijkbaar is met de bloedingsverdeling bij pontinebloedingpatiënten. In eerdere experimentele pontinebloedingsmodellen bevond de bloeding zich alleen in de unilaterale pons9.
Er zijn echter ook enkele beperkingen van deze methode. Ten eerste werd pontinebloeding in deze studie veroorzaakt door injectie van bloed, gedeeltelijk gehepariniseerd tijdens de overgang, wat de bloedstolling of zelfs homeostase in de omliggende pons zou kunnen beïnvloeden. Ten tweede vereist dit model speciale apparatuur, zoals stereotaxic-apparaten en injectiepomp. Ten derde kan dit model geen spontane bloeding nabootsen.
Concluderend, deze studie bood een methode om een experimenteel acuut massief pontinebloedingsmodel bij de rat te creëren, dat nieuw mechanisch en therapeutisch onderzoek op dit gebied zou kunnen bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze studie werd financieel ondersteund door de National Science Foundation of China (81471181 en 81870933) en het Opening Lab Program van Guangzhou Medical University (0506308) aan Y Jiang, en door de National Science Foundation of China (81701471) en het Scientific Program of Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) aan Z Qiu, en door de National Science Foundation of China (81501009) aan L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
