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Neuroscience

Massive Pontinenblutung durch Doppelinjektion von Eigenblut

doi: 10.3791/62089 Published: May 29, 2021
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Etablierung eines massiven pontinen Blutungsmodells bei einer Ratte durch doppelte Injektion von Eigenblut.

Abstract

Wir bieten ein Protokoll, um ein massives pontines Blutungsmodell bei einer Ratte zu etablieren. Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 Gramm wurden in dieser Studie verwendet. Einhundert Mikroliter Eigenblut wurden aus der Schwanzvene entnommen und stereotrisch in die Pons injiziert. Der Injektionsprozess wurde in 2 Schritte unterteilt: Zuerst wurden 10 μL Blut an eine bestimmte Stelle injiziert, anteroposteriore Position (AP) -9,0 mm; seitlich (Lat) 0 mm; vertikal (Vert) -9,2 mm, gefolgt von einer zweiten Injektion des Restblutes bei AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm im 20-Minuten-Takt. Der Balance-Beam-Test, der Gliedmaßen-Einstufungstest und der modifizierte Voestch-Neuroscore wurden zur Beurteilung der neurologischen Funktion verwendet. Die Magnetresonanztomographie (MRT) wurde verwendet, um das Blutungsvolumen in vivo zu beurteilen. Die Symptome dieses Modells entsprachen Patienten mit massiven pontinischen Blutungen.

Introduction

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Intrazerebrale Blutungen machen ein Fünftel der Schlaganfallpatienten aus. Die Prognose der intrazerebralen Blutung hängt von der Geschwindigkeit, dem Volumen und dem Ort der Blutung ab1,2. Im Vergleich zur Vorderhirnblutung weist die Hirnstammblutung eine höhere Mortalität und Morbiditätauf 3. Etwa 40% der Hirnstammblutungen treten in den Pons4auf. Die Ätiologie und Pathophysiologie der pontinen Blutung sind ganz anders und weniger untersucht als die Vorderhirnblutung5.

Es gibt zwei Arten von pontinischen Blutungstiermodellen. Eines ist das spontane Blutungsmodell, das durch Infusion von bakterieller Kollagenase in den Pons6,7,8induziert wird. Der größte Vorteil dieses Modells ist, dass die Blutung spontan ist. Kollagenase kann jedoch nur ein kleines Volumen an pontinischen Blutungen induzieren. Außerdem kann Kollagenase andere Verletzungen des Gehirns verursachen. Das andere Modell wird durch stereotaktische Injektion von Eigenblut in die Pons9induziert. Der Vorteil dieses Modells ist, dass es mit einer hohen Erfolgsquote einfach zu meistern ist. Theoretisch könnten Forscher jedes Blutvolumen an jede Stelle von Pons injizieren. Aufgrund der Rückleckage durch den Nadelweg ist das eingespritzte Volumen jedoch begrenzt. Vor kurzem wurde die Doppelinjektionsmethode gefördert, um die Rückleckage9zu reduzieren. Diese Methode injiziert Eigenblut zweimal mit einem 20-minutenigen Intervall zwischen den Injektionen. Die Doppelinjektionsmethode wird angewendet, um leichte (30 μL) und moderate (60 μL) Pontinblutungen, aber keine massiven Pontinblutungen zu induzieren. In der Klinik hat die Mehrheit der Pontinblutungspatienten mit schlechter Prognose massive Blutungen (mehr als 10 ml).

In der vorherigen Studie haben wir ein Protokoll zur Verfügung gestellt, um ein pontinisches ischämisches Schlaganfallmodell bei Ratten10zu etablieren. In dieser Studie modifizieren wir die bestehende Dual-Injektionsmethode und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um massive Pontinblutungen bei einer Ratte durch doppelte Injektion von 100 μL Eigenblut an zwei verschiedenen Stellen in den Pons zu induzieren.

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Protocol

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Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Second Affiliated Hospital der Guangzhou Medical University überprüft und genehmigt. Ratten wurden vom Animal Center der Southern Medical University zur Verfügung gestellt. Der experimentelle Entwurf ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Tiere und Instrumente

  1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250 ± 10 g.
  2. Beherbergen Sie die Ratten mindestens 7 Tage vor der Operation unter kontrollierten Umgebungsbedingungen mit einer Umgebungstemperatur von 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65% und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12/12 Stunden.
  3. Stellen Sie Nahrung und Wasser unbegrenzt zur Verfügung.
  4. Bereiten Sie die Instrumente vor (Abbildung 2A-E).

2. Injizieren Sie das Blut in die Pons

  1. Wiegen Sie die Ratten 3 Tage vor der Operation erneut, um Ratten mit geeignetem Körpergewicht für die Experimente auszuwählen.
  2. Trainieren Sie die Ratten während der 3 Tage vor der Modellierung, 3 Mal pro Tag auf dem Schwebebalken zu laufen, um sicherzustellen, dass normale Ratten den Schwebebalken ohne Pause passieren können.
  3. Heizkissen vor der Betäubung auf 37 °C vorheizen.
  4. Befestigen Sie einen Mikrobohrer am Halter des stereotaktischen Rahmens.
  5. Injizieren Sie den Ratten 50 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin intraperitoneal. Warten Sie, bis keine Zehenquetschreaktion mehr vorliegt.
  6. Transportieren Sie die Ratte in Bauchlage in den stereotaxischen Rahmen. Legen Sie die Ohrbügel über den Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Befestigen Sie den Schädel in einer horizontalen Position, um eine Verzerrung der Injektion zu vermeiden (Abbildung 2F).
  7. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch Isofluran (97,5% Sauerstoff und 2,5% Isofluran) durch einen stereotaxischen Nasenkegel mit Ein- und Auslassöffnung.
  8. Verwenden Sie Augensalbe, um die Hornhaut feucht zu halten.
  9. Rasieren Sie die Haare über dem Schädel mit einem Mikrorasierer.
  10. Zeichnen Sie eine 3 cm große Mittellinie mit einem Markerstift im Schädel von der Linie des beidseitigen seitlichen Canthus bis 0,5 cm hinter der hinteren Fontanelle, wie in Abbildung 2Fdargestellt.
  11. Tragen Sie das chirurgische Entojodin-Peeling kreisförmig auf, beginnend in der Mitte der markierten Mittellinie und nach außen drehend.
  12. Legen Sie den chirurgischen Vorhang ein.
  13. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell entlang der markierten Mittellinie.
  14. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um potenzielles Blut zu entfernen.
  15. Legen Sie ein Stück Pinzette auf jede Seite der Kopfhautklappe, um den Schädel freizulegen (Abbildung 2G).
  16. Tauchen Sie einen Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe aus dem Schädelknochen, um zu vermeiden, dass sich das Bindegewebe im Mikrobohrer verfängt.
  17. Markieren Sie den zentralen Punkt der Bregma über einen Markerstift als Ursprungspunkt.
  18. Führen Sie eine Kraniotomie (1 mm Durchmesser) mit einem Mikrobohrer bei AP-9,0 mm, Lat 0 mm durch(Abbildung 1B und Tabelle 1). Gehen Sie vorsichtig vor, da sich dieser Punkt sehr nahe am Veninus befindet (Abbildung 2G).
  19. Entfernen Sie den Mikrobohrer aus dem stereotaktischen Rahmen.
  20. Setzen Sie eine 100 μL Hamilton Spritze in den stereotaxischen Halter ein (Abbildung 2K). Schalten Sie den Schalter der Injektionspumpe ein, klicken Sie auf die Schaltfläche Schnelle Inhalation, saugen Sie Heparinlösung (12500 U verdünnt in 100 ml Kochsalzlösung) auf 100 μL und lassen Sie sie dann vollständig abtropfen, um eine zu schnelle Blutgerinnung zu verhindern.
  21. Tragen Sie Chlorhexidin und 75% Alkohol chirurgisches Peeling auf den ganzen Schwanz von der Wurzel bis zur Spitze mindestens 3 Mal auf, um die Haut zu desinfizieren, die Geilheit zu erweichen und die Schwanzvene zu erweitern, um die Erfolgsrate der Injektion zu erhöhen.
  22. Befestigen Sie eine Kopfhautakupunktur an einer 1 ml Spritze.
  23. Führen Sie die Kopfhautakupunktur in eine seitliche Schwanzvene 3 cm von der Schwanzspitze entfernt ein und nehmen Sie 150 μL Blut (Abbildung 2H).
  24. Entfernen Sie die Kopfhautakupunktur aus der 1 ml Spritze.
  25. Übertragen Sie das Blut in eine Röhre (Abbildung 2I).
    HINWEIS: Übertragen Sie schnell, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
  26. Wechseln Sie die OP-Handschuhe.
  27. Wählen Sie den Auszahlungsmodus, stellen Sie die Lautstärke auf 100 μL ein, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 200 μL/min ein, klicken Sie auf die RUN-Taste, saugen Sie 100 μL Blut in die Hamilton-Spritze (Abbildung 2J).
  28. Wählen Sie den Infuse-Modus und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 1 μL/min ein.
  29. Schieben Sie die Spritze vor, bis die Spitze 9,2 mm unter der Oberfläche des Gehirns liegt (Abbildung 1C und Abbildung 2L).
  30. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, injizieren Sie die ersten 10 μL Blut mit einer Geschwindigkeit von 1 μL/min (Tabelle 1).
  31. Stoppen Sie die Injektion und lassen Sie die Spritze für 20 Minuten in Position, um zu verhindern, dass Blut in den Subarachnoidalraum fließt.
  32. Ziehen Sie die Spritze zurück, bis die Spitze 9,0 mm unter der Oberfläche des Gehirns ankommt.
  33. Starten Sie die Injektion mit der gleichen Geschwindigkeit von 1 μL/min neu, bis das Restblut vollständig injiziert wurde.
  34. Lassen Sie die Spritze 10 Minuten in Position, um einen Blutrückfluss zu vermeiden.
  35. Entfernen Sie die Spritze langsam aus dem Gehirn.
  36. Verwenden Sie Knochenzement, um das Kraniotomieloch zu bedecken.
  37. Wenn der Zement trocknet, nähen Sie die Wunde mit 4-0 Polyamid-Nahtfilament. Nach dem Nähen von 3 oder 4 Stichen 2-1-1 Standard-chirurgische Knoten binden.
  38. Um eine Infektion zu verhindern, injizieren Sie der Ratte Penicillin (0,25 ml, 80 IE verdünnt in 4 ml Kochsalzlösung) intraperitoneal.
  39. Injizieren Sie die Ratten subkutan mit Butorphanoltartrat (2,5 mg/kg) und wiederholen Sie die Injektion alle 2 Stunden zur Linderung postoperativer Schmerzen bis 24 Stunden nach der Operation.
  40. Beobachten Sie die Ratte alle 15 Minuten, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat. Bringen Sie es mit einem Heizkissen unter dem Käfig in den ursprünglichen Käfig zurück. Gewähren Sie der Ratte freien Zugang zu Nahrung und Wasser bis zum Opfer.

3. Verhaltenstests

HINWEIS: Führen Sie Verhaltenstests an Tag 1, Tag 3, Tag 7 und Tag 14 nach der Modellierung durch, einschließlich des Balance-Beam-Tests, des Gliedmaßen-Einstufungstests und des modifizierten Voetsch-Neuroscores.

  1. Balance-Beam-Test11.
    HINWEIS: Dies ist ein Test speziell zur Untersuchung der sensomotorischen Funktion der Hinterbeine.
    1. Vorbereitet die Vorrichtung, um sicherzustellen, dass der Balken (3 cm breit × 70 cm lang) 20 cm über dem Boden liegt.
    2. Legen Sie eine dunkle Box am hinteren Ende des Balkens mit einem schmalen Eingang.
    3. Platzieren Sie einen weißen Rauschgenerator und eine helle Lichtquelle, die verwendet werden, um die Ratte zu motivieren, den Strahl zu durchqueren und in den Zielkasten einzudringen, am Kopfende des Strahls.
    4. Stoppen Sie das Geräusch und Licht, wenn das Tier die Zielbox betritt. Zeichnen Sie die Latenz vom Kopfende bis zur Zielbox (in Sekunden) und die Leistung der Hinterbeine beim Durchlaufen des Balkens auf.
    5. Notieren Sie die Leistungsbewertung wie folgt: 0, Gleichgewichte mit gleichmäßiger Haltung; 1, greift Seite des Balkens; 2, kuschelt den Balken mit 1 Abfällt der Hinterbeine; 3, kuschelt den Balken mit 2 gliedmaßen, die abfallen, oder dreht sich um den Balken für mehr als 60 s; 4, versucht, auf Balken >40 s zu balancieren, fällt aber ab; 5, versucht, auf Balken >20 s zu balancieren, fällt aber ab; und 6, fällt ab, ohne zu versuchen, auf Balken <20 s zu balancieren oder zu balancieren.
  2. Gliedmaßen-Einstufungstest
    HINWEIS: Der Gliedmaßen-Einstufungstest untersucht 3 unabhängige Reize des Sehens, der Berührung und der Propriozeption mit 6 Parametern, um die sensomotorische Funktion der Ratte zu bewerten. Der Gesamtwert der neurologischen Funktion lag zwischen 0 und 12. Vor dem Test sollte die Ratte an die Handhabung gewöhnt sein.
    1. Halten Sie die Ratte am Rücken und legen Sie sie langsam aus einer Höhe von 10 cm auf den Tisch. Normalerweise würde die Ratte die Vordergliedmaßen strecken und auf den Tisch legen.
    2. Schnappen Sie sich die Ratte am Rücken und halten Sie sie zur Tischkante. Die Reaktion der Vordergliedmaßen wird beobachtet. Eine normale Ratte würde die Vordergliedmaßen auf den Tisch legen.
    3. Lassen Sie die Ratte die Tischkante greifen. Eine normale Ratte würde das Kinn verwenden, um zu verhindern, dass die Nasen- und Nasenhaare den Tischrand berühren.
    4. Legen Sie die Ratte auf den Tisch, drücken Sie die Ratte mit einem sanften seitlichen Druck hinter die Schulter der Ratte zum Rand des Tisches und beobachten Sie die Platzierung der Vorder- und Hinterbeine. Eine normale Ratte würde den Rand mit ihren Vorder- und Hinterbeinen greifen.
    5. Legen Sie die Ratte auf den Tisch mit dem Gesicht zum Rand hin und drücken Sie sie vorsichtig von hinten an den Rand. Eine normale Ratte würde den Rand mit ihren Vordergliedmaßen greifen.
    6. Legen Sie die Ratte mit dem Rücken zum Rand auf den Tisch und schieben Sie sie mit dem Rücken an den Rand des Tisches. Beobachten Sie die Reaktion der Hinterbeine. Eine normale Ratte würde den Rand mit ihren Hinterbeinen greifen.
    7. Beurteilen Sie die Platzierung der Vorder- oder Hinterbeine am Tischrand. Notieren Sie die Punktzahlen wie folgt: 0, keine Platzierung; 1, unvollendete und/oder verspätete Platzierung; 2, sofortige, vollständige Platzierung.
  3. Der modifizierte Voetsch-Neuroscore8
    HINWEIS: Der modifizierte Voetsch-Neuroscore ist ein vertebrobasilarer Skalenscore der sensomotorischen Fähigkeit, der 14 Parameter enthält: Kopfbewegung, Aktivität, Hören, Schmerzreflex, Hornhautreflex, Propriozeption, Nackengefühl, Erkundung, Kreisen, axiales Rumpfgefühl, 4-Gliedmaßen-Bewegung, Vordergliedmaßenbewegung, Klettern und Strahlgang. Der Score für jeden Parameter reicht von 0 (vollständiges neurologisches Defizit) bis 3 (kein neurologisches Defizit). Der Gesamtwert für neurologische Funktionen liegt zwischen 0 und 42.
    1. Legen Sie die Ratte auf den Tisch (50 cm lang × 35 cm breit) und lassen Sie sie fünf Minuten lang bewegen. Beobachten Sie die spontane Bewegung seines Kopfes: Bewegt sich in allen Dimensionen, 3; bevorzugt eine Seite, 2; nur Bewegung auf 1 Seite, 1; gebeugt zur einseitigen Seite, 0.
    2. Legen Sie die Ratte auf den Tisch (50 cm lang × 35 cm breit) und lassen Sie sie fünf Minuten lang bewegen. Aktivität ist definiert als: vollständig reaktionsschnell, 3; mäßig ansprechbar, 2; minimal reaktionsschnell, 1; Koma, 0.
    3. Beobachten Sie die kraniocaudale Kreisung: dreht sich bilateral, 3; bevorzugt 1 Seite, 2; nur zu 1 Seite, 1; fiel auf 1 Seite, 0.
    4. Bewerten Sie die Vordergliedmaßenbewegung: gleiche und bilaterale Bewegung, 3; leichte Asymmetrie, 2; große Asymmetrie, 1; Parese, 0.
    5. Bewerten Sie die 4-Gliedmaßen-Bewegung: gleiche und bilaterale Bewegung, 3; leichte Asymmetrie, 2; große Asymmetrie, 1; Parese, 0.
    6. Wenn die Ratte stationär ist, führen Sie eine Ohrklemmung durch, um die Ohrmuscheln zu stimulieren und den Schmerzreflex zu testen: bewegt sich schnell und symmetrisch vom Reiz weg, 3; entfernt sich langsam oder asymmetrisch vom Reiz, 2; zeigt etwas Bewegung als Reaktion auf Schmerzen, 1; keine Reaktion, 0.
    7. Wenn die Ratte stationär ist, machen Sie ein Geräusch auf beiden Seiten des Körpers der Ratte, um das Gehör zu testen: Finger reiben, 3; Fingerschnippen, 2; lautes Klatschen, 1 und kein Erschrecken, 0.
    8. Um die Propriozeption zu überprüfen, berühren Sie die Vibrissae der Ratte auf beiden Seiten mit einem stumpfen Stock und beobachten Sie ihre Reaktion auf den Reiz: reagieren Sie bei Berührung, 3; verminderte Reaktion auf einer Seite, 2; auf beiden Seiten vermindert, 1; abwesend, 0.
    9. Um das axiale Rumpfgefühl zu bewerten, legen Sie einen stumpfen Stock auf beide Seiten des Rattenkörpers und beobachten Sie seine Reaktion auf den Reiz: lebhafte und symmetrische Reaktion auf Reize, 3; leicht verminderte oder asymmetrische Reaktion, 2; stark verminderte und asymmetrische Reaktion, 1 und keine Reaktion, 0.
    10. Um den Hornhautreflex zu testen, halten Sie die Ratte und berühren Sie schnell die Hornhaut auf beiden Seiten mit einem Wattestäbchen: Beide Augen schließen sich schnell, 3; verminderter Reflex auf einer Seite, 2; auf beiden Seiten vermindert, 1; abwesend, 0.
    11. Um das Gefühl des Halses zu überprüfen, halten Sie die Ratte und verwenden Sie einen stumpfen Stock, um den Hals zu berühren: reagiert aktiv auf Berührung, 3; langsame Reaktion auf Berührung, 2; stark verminderte Reaktion, 1; keine Reaktion, 0.
    12. Um die Erkundung zu beobachten, verwenden Sie eine helle dunkle Box.
      HINWEIS: Zwei Drittel der Box sollten offen und beleuchtet sein, während der Rest bedeckt und dunkel ist. Eine 7 cm große Tür verbindet die beiden Fächer.
    13. Legen Sie die Ratte für 5 Minuten in das helle Fach und dann für weitere 5 Minuten in das dunkle Fach, lassen Sie sie sich bewegen und zeichnen Sie die Aktivitäten der Ratte auf. Wenn 4 Gliedmaßen in einem Raum platziert sind, nehmen Sie es als Eingang auf. Notieren Sie die Ergebnisse wie folgt: erreicht die hellen und dunklen Fächer aktiv, 3; erreicht 1 Fach, 2; bewegt sich langsam erst nach dem Reiz, 1; und keine Bewegung, 0.
    14. Um die Steigfähigkeit zu überprüfen, platzieren Sie die Ratte am Boden einer 20 cm breiten, 70 cm langen Ebene mit einem Winkel von 30 Grad zum horizontalen Boden. Rekordergebnisse wie folgt: in der Lage, an die Spitze zu klettern, 3; beeinträchtigtes Klettern, 2; stationärer Griff, 1; und fällt sofort, 0.
    15. Um den Strahlgang zu untersuchen, legen Sie die Ratte auf ein Ende eines 3 cm breiten, 70 cm langen Balkens, der 20 cm über dem Boden liegt, und notieren Sie folgende Ergebnisse: erforscht den gesamten Strahl, 3; erforscht einen Teil des Strahls, 2; etwas Bewegung und Stürze, 1; keine Bewegung, 0.
    16. Berechnen Sie die Punkte.

4. Blutungsbestätigung durch MRT

  1. Führen Sie den MRT-Scan 24 Stunden nach der Operation durch.
  2. Betäuben Sie die Ratte mit Isofluran (5% für die Induktion, 1% - 1,5% für die Erhaltung).
  3. Befestigen Sie den Kopf der Ratte in der Rattenhirn-Array-Spule in Kombination mit einer reinen Sendevolumenspule.
  4. Legen Sie die Spule zusammen mit der Ratte in den MRT-Scanner. Befestigen Sie die Ratte in der Wiege über den Zahn und die Ohrbügel.
  5. Verwenden Sie einen geschlossenen Thermomantel, um die Körpertemperatur der Ratte während der MRT-Scans bei 37 ± 0,5 °C zu halten.
  6. Führen Sie eine Pilotsequenz durch, um die korrekte Geometrie sicherzustellen.
  7. Wenden Sie eine Fast-Spin-Echosequenz an, um T2-gewichtete Scans zu sammeln. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Echozeit (TE), 132 ms; Wiederholungszeit (TR), 2.500 ms; Akquisitionsmatrix, 148 × 148; Sichtfeld, 100 mm × 100 mm; 12 Scheiben; 1,5 mm dick.
  8. Bringen Sie die Ratte in den Käfig zurück.

5. Blutungsbestätigung durch grobe Anatomie

HINWEIS: Opfern Sie die Ratten zum angegebenen Zeitpunkt, 24 h und 14 d nach der Operation (Abbildung 1D).

  1. Betäuben Sie die Ratte mit 5% Isofluran bis zum Verlust des Bewusstseins. Dann einschläfern Sie es mit Kohlendioxid (CO2)(20-30% des Volumens des Käfigs pro Minute).
  2. Bestätigen Sie den Tod mit den folgenden Anzeichen: kein Brustauf- und -fallen, kein tastbarer Herzschlag, keine Reaktion auf Zehenklemmen, schlechte Schleimhautfarbe, Farbveränderung oder Deckkraft in den Augen.
  3. Führen Sie eine zervikale Dislokation durch.
  4. Sichern Sie die Ratte, indem Sie die Pfoten auf einer sterilen Plattform abklopfen. Erstellen Sie einen Mittellinienschnitt aus dem Gebärmutterhals, um das Hypogastrium Thorax und Leber auszusetzen. Machen Sie einen seitlichen Schnitt vom oberen Sternalrand entlang des Schlüsselbeins ganz links und einen weiteren seitlichen Schnitt vom Xiphoid entlang des Zwerchfells ganz links, um das Herz freizulegen. Heben Sie die Brustkorbklappe an und befestigen Sie sie mit einem Stift an der Plattform.
  5. Verbinden Sie das Ende einer Nadel (27 G) mit einer Perfusionspumpe, die 4 °C Kochsalzlösung enthält. Zuerst die Nadelspitze entlang des linken Randes des linken Ventrikels in das Herz vordringen, um das Eindringen in den Vorhof zu vermeiden. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein, um sicherzustellen, dass sich die Spitze im linken Ventrikel befindet, und schneiden Sie dann im rechten Vorhof ab.
  6. Schalten Sie die Perfusionspumpe aus, wenn die aus dem rechten Vorhof abgelassene Flüssigkeit farblos wird und die Leber weiß wird. Dieses Verfahren benötigt ca. 100 ml 4 °C Kochsalzlösung.
  7. Enthaupten Sie die Ratte und ernten Sie das ganze Gehirn mit Schere und Zette. Entfernen Sie Feuchtigkeit von der Gehirnoberfläche mit Löschpapier.
  8. Halten Sie das gesamte Gehirn für 1 min bei -80 °C.
    HINWEIS: Dieser Schritt könnte übersprungen werden, wenn das Gehirn geschnitten werden kann, ohne einzufrieren.
  9. Legen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben in die koronale Rattenhirnmatrix.
  10. Führen Sie eine 0,21 mm dicke Edelstahlklinge entsprechend dem Loch in der Oberfläche des Gehirns in das Blutungszentrum ein.
  11. Führen Sie im Abstand von 2 mm andere Klingen in das Gehirn ein.
  12. Tauchen Sie die Hirnschnitte für 24 h bei 4 °C in 10 ml 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung. Spülen Sie sie mit 0,01 mmol/L phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab.
  13. Organisieren Sie die Abschnitte von rostral bis kaudal und stellen Sie sie ab.

6. Paraffinschnitt und Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung

  1. Fixieren Sie das Gehirn mit 4% igen PFA-Lösung für mindestens 24 h bei Raumtemperatur. Das Volumen von PFA sollte das 5-10-fache des Gehirnvolumens sein.
  2. Schneiden Sie das Gehirn aus dem Blutungszentrum über Klinge und koronale Rattenhirnmatrix in zwei Stücke.
  3. Machen Sie paraffineingebettete Gewebeblöcke.
  4. Schneiden Sie den paraffineingebetteten Gewebeblock koronal in 40 μm dicken Gleitern auf einem Mikrotom, schneiden Sie 4 Abschnitte nacheinander, ausgehend vom Blutungszentrum, und treiben Sie sie in einem 40 °C Wasserbad.
  5. Montieren Sie die 40 μm-Abschnitte (insgesamt 8 Dias für ein Gehirn) auf saubere Glasobjektträger und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft.
  6. Die Dias bei 56 °C 1 h backen.
  7. 3 min in Xylol waschen, 3 mal.
  8. Tauchen Sie Abschnitte 30 mal in 100% Ethanol, 30 weitere Male in 100% Ethanol, 30 mal in 95% Ethanol und 30 weitere Male in 95% Ethanol.
  9. Im Leitungswasser abspülen, bis es klar ist.
  10. Tauchen Sie die Abschnitte für ca. 10 minuten in Hämatoxylin ein.
  11. Im Leitungswasser abspülen, bis es klar ist.
  12. Tauchen Sie Abschnitte für 30 s in Eosinflecken.
  13. Trocknungsschieber mit 3-4 Dips 95% Ethanol, 3-4 Dips in 100% Ethanol, 100% Ethanol für 1 Minute und 10 Dips in 100% Ethanol + Xylol (1:1).
  14. Reinigen Sie die Abschnitte mit Xylol für 1 min, 2 mal.
  15. Montage mit nicht wässrigem Montagemedium und einem Abdeckrlip.
  16. Trocknen Sie die Abschnitte in der Luft über Nacht bei Raumtemperatur und reinigen Sie sie dann.

7. Statistiken

  1. Verwenden Sie GraphPad Prism 6.0, um den t-Test des Schülers oder den Mann Whitney U-Test zu berechnen.
    HINWEIS: Alle Daten sollten als Mittelwert ± SE ausgedrückt werden. Unterschiede zwischen zwei Gruppen werden mit einem zweiseitigen Student's t-Test oder Mann Whitney U-Test bestimmt. P<0,05 ist als statistische Signifikanz definiert.

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Representative Results

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Insgesamt wurden 25 Tiere verwendet, 3 für die Kontrolle, 6 für 30 μL, 6 für 60 μL und 10 für 100 μL Blutinjektionen. Eine Ratte, die eine 100 μL Injektion von Eigenblut (1/10) erhielt, starb innerhalb von 24 Stunden nach der Operation.

Verhaltenstests wurden an Tag 1, Tag 3, Tag 7 und Tag 14 nach der Operation durchgeführt. Die Ergebnisse für die Kontrollgruppe und die Blutinjektionsgruppen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation sind in Tabelle 2 dargestellt. Die pontine Blutung verursachte neurologische Defizite wie verminderten Hornhautreflex und Kreisen (Abbildung 3B,C). Die Injektion von 100 μL Blut induzierte auch die Myotonie (Abbildung 3A). Die Ergebnisse des Balance-Beam-Tests, des Gliedmaßen-Einstufungstests und des modifizierten Voetsch-Neuroscores zeigten, dass die neurologische Funktion mit zunehmendem Volumen der Pontinblutung verringert wurde.

Die MRT-Abtastung wurde 24 Stunden nach der Operation durchgeführt (Abbildung 4). In den Blutinjektionsgruppen wurden auf T2-Sequenz Blutungen als Hypointense-Rand mit einem iso- bis leicht hyperintensiven Kern im basilaren Teil der Pons nachgewiesen. Es wurden keine Blutungen durch MRT in anderen Hirnarea festgestellt (Abbildung 4). Das Blutungsvolumen wurde erhöht, als das Injektionsvolumen von Eigenblut zunahm.

Dann wurden Ratten nach 24 Stunden und Tag 14 nach der Operation separat geopfert, und 2 mm dicke Abschnitte wurden gemacht (Abbildung 4). Blutungen wurden in der Umgebung der Injektionsstelle festgestellt und verteilten sich in der Basis von Pons. Es gab leichte Ödeme um die Blutung in der 100 μL Blutinjektionsgruppe.

Einige der Ratten wurden 3 Tage nach der Operation geopfert und paraffinschnitten, um HE-Färbungen durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass in den Blutinjektionsgruppen Entzündungszellen in der Periblutungszone angereichert waren (Abbildung 5C und F). Das Hämoglobin bleibt in intakten roten Blutkörperchen enthalten (Abbildung 5D und G).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Diagramme des pontinen Blutungsmodells. (A) Autologe Blutentnahme aus der Schwanzvene. (B) Das schematische Diagramm der Bohrposition. (C) Die schematischen Diagramme des Injektionsortes. (D) Versuchsplanung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Instrumente und Verfahren der Operation. (A) Anästhesiegerät. (B) Chirurgische Instrumente. (C) Mikrodrill. (D) Mikroeinspritzpumpe. e) Stereotaxische Apparatur. (F) Eine Linie, die in der Mitte des Schädels markiert ist. (G) Gelber Pfeil zeigt auf die Bohrposition. (H) Drainage von Blut aus der Schwanzvene. (I) Das Blut wird in die Eppendorf-Röhre überführen. (J) Saugen Sie das Blut in die Hamilton-Spritze ab. (K) Schieben Sie die Hamilton-Spritze durch das Schädelloch. (L) Injektionsprozess von Eigenblut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse von Verhaltenstests. (A) Myotonie bei einer Ratte injizierte 100 μL Eigenblut. (B) Verminderter Hornhautreflex auf der rechten Seite bei einer Ratte, der 60 μL Eigenblut injiziert wurden. (C) Verminderter Hornhautreflex in den beidseitigen Seiten bei einer Ratte, der 100 μL Eigenblut injiziert wurden. (D) Eine Ratte erhielt 60 μL Eigenblut, das auf der kontralateralen Seite der Läsion eingekreist war. (E) Ergebnisse der Schwebebalkenprüfung. (F) Ergebnisse des modifizierten Voetsch-Neuroscores. (G) Ergebnisse des Einstufungstests für Gliedmaßen. Linie bedeutet signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der MRT-Abtastung und der Grobanatomie. Die MRT-Untersuchung (Upper) wurde 24 h nach pontinischer Blutung durchgeführt, dann wurden die Ratten geopfert und in 2 mm Gehirnabschnitte geschnitten (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der HE-Färbung. Gehirne wurden von den Ratten entnommen, die 100 μL Blut 3 d nach der Operation injizierten. (A) Der gesamte Gehirnabschnitt. Niedrige Felder aus (B) dem normalen pontinischen Bereich, (C) Periläsionszone und (D) Blutungskern. Hohe Felder aus (E) normalem pontinischem Bereich, (F) Periläsionszone und (G) Blutungskern. Der Maßstabsbalken betrug 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Repräsentative Ergebnisse der Bruttoanatomie am 14. Tag nach der Operation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. 

Leicht mäßig massiv
Gesamtvolumen 30 μL 60 μL 100 μL
Erste Injektion
Stereotaktische Koordinaten AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm
Volumen 10 μL 10 μL 10 μL
Geschwindigkeit 1 μL/min 1 μL/min 1 μL/min
Intervallzeit 20 Min. 20 Min. 20 Min.
Zweite Injektion
Stereotaktische Koordinaten AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm
Volumen 20 μL 50 μL 90 μL
Geschwindigkeit 1 μL/min 1 μL/min 1 μL/min
Vor dem Entzug der Nadel 10 Min. 10 Min. 10 Min.
AP: anteroposteriore Position
Lat: seitlich
Vert: vertikal

Tabelle 1: Injektion von Eigenblut.

Rattenzahl Tag 1 Tag 3 Tag 7 Tag 14
Der modifizierte Voetsch-Neuroscore
30 μL-1 33 34 38 41
30 μL-2 30 35 37 41
30 μL-3 34 37 40 42
60 μL-4 27 30 36 38
60 μL-5 23 28 34 39
60 μL-6 26 29 35 39
100 μL-7 16 25 31 36
100 μL-8 13 22 29 37
100 μL-9 14 21 26 36
Sham-10 41 42 42 42
Sham-11 42 42 42 42
Sham-12 42 42 42 42
Balance-Beam-Test
30 μL-1 1 0 0 0
30 μL-2 1 1 0 0
30 μL-3 2 1 0 0
60 μL-4 3 2 0 0
60 μL-5 4 2 0 0
60 μL-6 3 2 1 0
100 μL-7 5 4 3 1
100 μL-8 5 4 2 1
100 μL-9 4 4 2 1
Sham-10 0 0 0 0
Sham-11 0 0 0 0
Sham-12 0 0 0 0
Gliedmaßen-Einstufungstest
30 μL-1 11 12 12 12
30 μL-2 10 11 12 12
30 μL-3 10 11 12 12
60 μL-4 9 11 12 12
60 μL-5 8 9 9 11
60 μL-6 8 9 10 11
100 μL-7 4 5 9 11
100 μL-8 3 4 8 10
100 μL-9 2 4 7 8
Sham-10 11 12 12 12
Sham-11 12 12 12 12
Sham-12 12 12 12 12

Tabelle 2: Ergebnisse von Verhaltenstests.

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Discussion

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In der vorliegenden Studie haben wir ein Protokoll zur Verfügung gestellt, um ein massives pontines Blutungsrattenmodell zu generieren. Dieses Modell kann für die Erforschung des pathophysiologischen Mechanismus und der Prognose massiver pontiner Blutungen verwendet werden.

Während des gesamten Experiments wurden 25 Ratten verwendet, von denen nur eine starb. Die Überprüfung der MRT, der groben Anatomie und der HE-Färbung zeigte, dass diese Methode eine sehr niedrige Sterblichkeitsrate und eine hohe Erfolgsrate aufwies. Um ein massives pontines Blutungsmodell zu etablieren, müssen zwei Probleme gelöst werden, das injizierte Eigenblut neigt dazu, in den Subarachnoidalraum zu gelangen und entlang des Nadeltraktes zum vierten Ventrikel zurückzufließen. Das bestehende Doppelinjektions-moderat (insgesamt 60 μL Eigenblut) Pontinblutungsmodell löste das erste Problem, kaum Blut floss in den Subarachnoidalraum. Es gab jedoch immer noch eine kleine Menge Blutrückfluss. In der vorliegenden Studie wurden mehrere Strategien angewendet, um die bestehende Doppelinjektionsmethode so zu optimieren, dass es möglich ist, eine größere Menge von 100 μL Eigenblut ohne Rückfluss zu injizieren. Zunächst wurden zwei verschiedene Injektionsstellen anstelle von einem verwendet. Zweitens wurde Heparin verwendet, um die Spritze mit minimalem Rest zu spülen, um die Dosierung zu reduzieren, um das Blut nur vor der Koagulation während des Injektionsprozesses zu schützen, aber nicht genug, um Leckage und Rückfluss nach der Injektion zu fördern. Drittens war die Injektionszeit lang und die Injektionsgeschwindigkeit war langsam, 1 μL/min. Darüber hinaus wurde beim ersten Mal nur eine kleine Menge Eigenblut injiziert, während die zweite Injektion 20 Minuten später durchgeführt wurde. Danach wurde die Nadel erst nach 10 Minuten zurückgezogen, und dieser Vorgang wurde extrem langsam durchgeführt. Mit dieser Methode floss bei den Ratten, die mit 30 μL oder 60 μL Eigenblut injiziert wurden, kaum Blut in den Subarachnoidalraum oder den vierten Ventrikel, aber es gab immer noch eine kleine Menge Rückfluss in den Ratten, die mit 100 μL injiziert wurden.

Verhaltenstests wurden an Tag 1, Tag 3, Tag 7 und Tag 14 nach der Modellierung durchgeführt, einschließlich Balance-Beam-Test, Gliedmaßen-Einstufungstest und dem modifizierten Voetsch-Neuroscore. Am ersten Tag nach der Operation zeigten fast alle Ratten in den Blutinjektionsgruppen ein kreisendes Verhalten (d. H. Links- oder Rechtsdrehen), begleitet vom Verschwinden des einseitigen oder bilateralen Hornhautreflexes. Obwohl Eigenblut in die Mittellinie des Pontins injiziert wurde, war es auf den beiden Seiten des Gehirns ungleichmäßig verteilt. Dies schien der Grund für die unterschiedliche Leistung in Verhaltenstests zu sein. Die Aktivitäten und Reaktionen der Ratten, die 30 μL oder 60 μL Eigenblut injizierten, verlangsamten sich näher an den Normalwert. Bei den Ratten, die 100 μL Blut injizierten, waren die sensomotorischen Funktionen signifikant geschwächt und die Reaktion war schlecht. Muskelsteifigkeit trat bei einigen Ratten im Ruhezustand auf. An Tag 1, Tag 3 und Tag 7 gab es offensichtliche Unterschiede zwischen Ratten, die 30 μL, 60 μL oder 100 μL Eigenblut injizierten, und den Ratten in der Kontrollgruppe im modifizierten Voetsch-Neuroscore. Im Balance-Beam-Test und im Gliedmaßen-Place-Test gab es zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede zwischen den Ratten, die 30 μL oder 60 μL Blut injizierten, und den Ratten in der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse des Balance-Beam-Tests und des Gliedmaßen-Platzierungstests bei Ratten, denen 100 μL Eigenblut injiziert wurden, unterschieden sich jedoch signifikant von der Kontrollgruppe an Tag 1 und Tag 3. Der mögliche Grund könnte sein, dass es im Balance Beam Test und im Limb Placement Test weniger Auswertungspunkte im Vergleich zum modifizierten Voetsch Neuroscore gibt, die nicht empfindlich genug sind, um subtile neurologische Defizite zu entdecken. Es ist unangemessen, diese beiden Methoden zu verwenden, um das Verhalten in Blutungsmodellen mit leichten Symptomen zu bewerten, aber sie sind im massiven pontinen Blutungsmodell anwendbar. Insgesamt erwies sich der modifizierte Voetsch-Neuroscore als besser geeignet, um die neurologischen Funktionen in verschiedenen pontinen Blutungsmodellen umfassend und genau zu beurteilen.

Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode. Basierend auf der vorherigen Doppelinjektionsmethode wurde die zweite Injektionsstelle geändert und die Dosierung von Heparin angepasst, um die Leckage und den Rückfluss im milden (30 μL) und moderaten (60 μL) Pontinblutungsmodell zu vermeiden. Selbst im massiven (100 μL) Pontinblutungsmodell war der Rückfluss sehr begrenzt und trat nur bei einer kleinen Anzahl von Ratten auf. Diese Methode kann leicht mit einer hohen Erfolgsrate und einer niedrigen Sterberate durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die experimentelle Pontinblutung über einen langen Zeitraum, mindestens 14 Tage nach der Modellierung, beobachtet werden, was der Untersuchung der gesamten Krankheitsentwicklung und der Auswirkungen von Behandlungen förderlich ist. Der größte Fortschritt dieses Modells bestand darin, dass es die Symptome von Patienten mit pontinen Blutungen nachahmte. Klinisch führt eine massive pontine Blutung zu schweren neurologischen Defiziten, während frühere pontine Blutungsmodelle nur ein relativ kleines hämorrhagisches Volumen mit leichten Symptomen entwickelten. Die massive Pontinblutung in diesem Modell verteilt sich in den beidseitigen Pons, was bei der Blutungsverteilung bei pontinischen Blutungspatienten ähnlich ist. In früheren experimentellen pontinischen Blutungsmodellen befand sich die Blutung nur in den einseitigen Pons9.

Es gibt jedoch auch einige Einschränkungen dieser Methode. Erstens wurden pontine Blutungen in dieser Studie durch die Injektion von Blut verursacht, das während des Übergangs teilweise heparinisiert wurde, was die Blutgerinnung oder sogar die Homöostase in den umliegenden Pons beeinflussen könnte. Zweitens erfordert dieses Modell spezielle Ausrüstung, wie stereotaxische Geräte und Einspritzpumpen. Drittens kann dieses Modell spontane Blutungen nicht nachahmen.

Zusammenfassend lieferte diese Studie eine Methode, um ein experimentelles akutes massives pontinisches Blutungsmodell bei der Ratte zu erstellen, das neue mechanische und therapeutische Forschung auf diesem Gebiet fördern könnte.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie wurde finanziell unterstützt von der National Science Foundation of China (81471181 und 81870933) und dem Opening Lab Program der Guangzhou Medical University (0506308) nach Y Jiang sowie von der National Science Foundation of China (81701471) und dem Scientific Program der Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) nach Z Qiu und von der National Science Foundation of China (81501009) nach L Wu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100ml Saline solution Guangdong yixiang 191222201 C1 Preparing heparin diluent
100μl Microinjector Shanghai Gaoge Injection of autologous blood
1ml Syringe Jiangsu Zhiyu 20191014 Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol Shandong Lierkang Disinfection of rat tail
Adhesive tape Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Animal anesthesia system RWD R510-31S-6 Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Blades Shanghai Feiying 74-C For gross anatomy
Bone cement Shanghai Xinshiji 20180306 Surgicl instruments
Brain tank Shenzhen LEIYEA For gross anatomy
Butorphanol tartrate Jiangsu Hengrui For pain management
Electric cranial drill Nanjing  Darwin biotechnology 20180090018 Making a burr hole on the skull
EP tube Nantong Surui Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream Yunnan pharmacy Eyes protection
HE dye liquor Solarbio G1120 For HE staining
Heating pad Dangerous Jungle JR01 Keeping warm
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmacal Company 190701 Preparing heparin diluent
IndoPhors Guoyao of China Sterilization
Isoflurane RWD 20080701 Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box Jiangsu Saiangsi For neurological deficit scores
Micro-injection pump Baoding Leifu TFD03-01-C Injection of autologous blood
MRI system Philips Confirmation of infarction in vivo
Needle holder Shanghai Jinzhong J32020 Surgicl instruments
Penicilin Guoyao of China Infection Prevention
Q-tips Jiangxi Songhe Surgicl instruments
Scalp heedle Jiangxi Hongda 20200313 Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel Shanghai Kaiyuan 170902 Surgicl instruments
Shearing scissors Shanghai Jinzhong Y00040 Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus RWD 900-00001-00 for surgical positioning
Surgical towel Xinxiang Huakangweicai 20070601 Surgicl instruments
Suture needle Shanghai Jinzhong Surgicl instruments
Suture scissors Shanghai Jinzhong J25041 Surgicl instruments
Tissue holding forcepts Shanghai Jinzhong J31080 Surgicl instruments

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References

  1. Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89, (8), 820-829 (2017).
  2. Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25, (5), 1102-1109 (2016).
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Massive Pontinenblutung durch Doppelinjektion von Eigenblut
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Cite this Article

Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).More

Tang, X., Wu, L., Luo, M., Qiu, Z., Jiang, Y. Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood. J. Vis. Exp. (171), e62089, doi:10.3791/62089 (2021).

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