Summary
Vi presenterer en protokoll for å etablere en massiv pontinblødningsmodell i en rotte via dobbel injeksjon av autologt blod.
Abstract
Vi tilbyr en protokoll for å etablere en massiv pontinblødningsmodell i en rotte. Rotter som veide ca 250 gram ble brukt i denne studien. Hundre mikroliter autologt blod ble tatt fra halevenen og stereotaktisk injisert i ponsene. Injeksjonsprosessen ble delt inn i 2 trinn: Først ble 10 μL blod injisert på et bestemt sted, anteroposterior posisjon (AP) -9,0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertikal (Vert) -9,2 mm, etterfulgt av en ny injeksjon av restblodet som ligger ved AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm med et intervall på 20 minutter. Balansestråletesten, lemplasseringstesten og den modifiserte Voestch-nevroscoren ble brukt til å evaluere nevrologisk funksjon. Magnetisk resonansavbildning (MR) ble brukt til å vurdere volumet av blødningsblødning in vivo. Symptomene på denne modellen var i tråd med pasienter med massiv pontinblødning.
Introduction
Intracerebral blødning står for en femtedel av slagpasienter. Prognosen for intracerebral blødning avhenger av hastigheten, volumet og plasseringen av blødning1,2. Sammenlignet med forebrain blødning, hjernestammeblødning har høyere dødelighet og sykelighet3. Omtrent 40% av hjernestammeblødningen forekommer i pons4. Etiologien og patofysiologien til pontinblødning er ganske forskjellige og mindre studert enn forebrain blødning5.
Det finnes to typer pontinblødning dyremodeller. Den ene er spontan blødningsmodell indusert ved infusjon av bakteriell kollagen i pons6,7,8. Den største fordelen med denne modellen er at blødningen er spontan. Imidlertid kan kollagenase bare indusere et lite volum pontinblødning. Dessuten kan kollagenase forårsake andre skader på hjernen. Den andre modellen er indusert ved stereotaktisk injeksjon av autologt blod i pons9. Fordelen med denne modellen er at den er lett å mestre med høy suksessrate. Teoretisk sett kan forskere injisere ethvert volum blod på et hvilket som helst sted av pons. På grunn av tilbakelekkasjen gjennom nåleruten er imidlertid det injiserte volumet begrenset. Nylig har dobbeltinjeksjonsmetoden blitt forfremmet for å redusererygglekkasjen 9. Denne metoden injiserer autologt blod to ganger med et 20-minutters intervall mellom injeksjonene. Dobbeltinjeksjonsmetoden brukes til å indusere mild (30 μL) og moderat (60 μL) pontinblødning, men ikke massiv pontinblødning. På klinikken har flertallet av pontinblødningspasienter med dårlig prognose massiv blødning (mer enn 10 ml).
I den forrige studien ga vi en protokoll for å etablere en pontin iskemisk slagmodell hos rotte10. I denne studien modifiserer vi den eksisterende doble injeksjonsmetoden, og gir en detaljert protokoll for å indusere massiv pontinblødning hos en rotte ved dobbel injeksjon av 100 μL autologt blod på to forskjellige steder i ponlene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Det andre tilknyttede sykehuset ved Guangzhou Medical University. Rotter ble levert av Animal Center of Southern Medical University. Den eksperimentelle utformingen vises i figur 1.
1. Dyr og instrumenter
- Bruk 8 uker gamle mannlige Sprague-Dawley rotter som veier 250 ± 10 g.
- Hus rottene i minst 7 dager før operasjonen under kontrollerte miljøforhold med en omgivelsestemperatur på 25 °C, relativ fuktighet på 65% og en 12/12-timers lys-mørk syklus.
- Gi mat og vann uten grenser.
- Klargjør instrumentene (Figur 2A-E).
2. Injiser blodet i ponsene
- Vei rottene igjen 3 dager før operasjonen for å velge rotter med passende kroppsvekt for forsøkene.
- I løpet av de 3 dagene før modellering, tren rottene til å gå på balansebjelke 3 ganger per dag for å sikre at normale rotter kunne passere balansestrålen uten pause.
- Forvarm varmeputen til 37 °C før anestesi.
- Fest en mikrodrill til holderen på den stereotaktiske rammen.
- Injiser rottene med 50 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin intraperitonealt. Vent til det ikke er noen tå-klype respons.
- Transporter rotten inn i den stereotaktiske rammen i en utsatt posisjon. Sett ørestengene over ørekanalen for å feste hodet. Fest skallen i horisontal stilling for å unngå forskyving av injeksjonen (Figur 2F).
- Oppretthold anestesi ved isofluran (97,5% oksygen og 2,5% isofluran) gjennom en stereotaxisk nesekjegle med innløps- og utløpsport.
- Bruk øyesalve for å holde hornhinnen fuktig.
- Barber håret over skallen med en mikro barbermaskin.
- Tegn en 3 cm midtlinje med en markørpenn i skallen fra linjen til det bilaterale laterale kanthus til 0,5 cm bak den bakre fontanellen, som vist i figur 2F.
- Påfør Entoiodine kirurgisk skrubb på en sirkulær måte, starter midt på den merkede midtlinjen og roterer utover.
- Plasser den kirurgiske gardinen.
- Lag et snitt med en skalpell langs den merkede midtlinjen.
- Bruk en bomullspinne for å fjerne potensielt blod.
- Plasser et stykke tang på hver side av hodebunnsklaffen for å eksponere skallen (Figur 2G).
- Dypp en bomullspinne i 0,9% saltvann og fjern forsiktig bindevevet fra skallebenet for å unngå at bindevevet blir fanget i mikrodrillen.
- Merk det sentrale punktet på bregmaen som opprinnelsespunktet via en markørpenn.
- Utfør en kraniotomi (1 mm i diameter) ved hjelp av en mikrodrill ved AP-9,0 mm, Lat 0 mm (Figur 1B og Tabell 1). Fortsett forsiktig fordi dette punktet er svært nær venøs sinus (Figur 2G).
- Fjern mikrodrillen fra den stereotaktiske rammen.
- Sett en 100 μL Hamilton-sprøyte inn i stereotakerholderen (Figur 2K). Slå på injeksjonspumpebryteren, klikk på Rapid Inhalation-knappen, aspirer heparinoppløsningen (12500 U fortynnet i 100 ml saltvann) til 100 μL og tøm den deretter helt for å forhindre blodpropp for fort.
- Påfør klorhexidin og 75% alkohol kirurgisk skrubb til hele halen fra rot til spiss minst 3 ganger for å desinfisere huden, myke kåtheten og utvide halevenen for å øke suksessraten for injeksjon.
- Fest en akupunktur i hodebunnen til en 1 ml sprøyte.
- Sett hodebunnen akupunktur inn i en lateral hale vene 3 cm fra hale spissen og ta 150 μL blod (Figur 2H).
- Fjern akupunkturen i hodebunnen fra 1 ml-sprøyten.
- Overfør blodet til et rør (Figur 2I).
MERK: Overfør raskt for å forhindre blodpropp. - Bytt kirurgiske hansker.
- Velg Uttaksmodus, sett volumet til 100 μL, still inn hastigheten på 200 μL/min, klikk på RUN-knappen, aspirer 100 μL blod inn i Hamilton-sprøyten (Figur 2J).
- Velg Infuse-modus, still inn hastigheten på 1 μL/min.
- Før sprøyten frem til spissen når 9,2 mm under overflaten av hjernen (Figur 1C og Figur 2L).
- Klikk Kjør -knappen, og sett inn de første 10 μL blod med en hastighet på 1 μL/min (Tabell 1).
- Stopp injeksjonen og la sprøyten stå i posisjon i 20 minutter for å forhindre at blod strømmer inn i subarachnoidrommet.
- Trekk sprøyten tilbake til spissen kommer 9,0 mm under overflaten av hjernen.
- Start injeksjonen på nytt med samme hastighet på 1 μL/min til restblodet er injisert fullstendig.
- La sprøyten stå i posisjon i 10 minutter for å unngå blodtilstrømning.
- Fjern sprøyten langsomt fra hjernen.
- Bruk beinsement for å dekke kraniotomihullet.
- Når sementen tørker, suturer såret med 4-0 polyamid suturfilament. Etter å ha sy 3 eller 4 stiches, bind 2-1-1 standard kirurgiske knuter.
- For å forhindre infeksjon, injiser rotten med penicillin (0,25 ml, 80 IE fortynnet i 4 ml saltvann) intraperitonealt.
- Injiser rottene subkutant med Butorphanol tartrat (2,5 mg/kg) og gjenta injeksjonen annenhver time for å lindre postoperativ smerte til 24 timer etter operasjonen.
- Vær oppmerksom på rotten hver 15 min til den helt gjenoppretter fra anestesi. Returner den til det opprinnelige buret, med en varmepute under buret. Gi rotten fri tilgang til mat og vann til offer.
3. Atferdstester
MERK: Utfør atferdstester på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 etter modellering, inkludert balansestråletest, lemplasseringstest og den modifiserte Voetsch-nevroscoren.
- Balanse bjelke test11.
MERK: Dette er en test spesielt for å undersøke den sensoriske funksjonen til bakbenet.- Klargjort apparatet for å sikre at bjelken (3 cm bred × 70 cm lang) er 20 cm over gulvet.
- Sett en mørk boks i bakenden av bjelken med en smal inngang.
- Plasser en hvit støygenerator og en lyskilde, som brukes til å motivere rotten til å krysse strålen og gå inn i målboksen, i hovedenden av strålen.
- Stopp støyen og lyset når dyret kommer inn i målboksen. Registrer ventetiden fra hodeenden til målboksen (i sekunder) og ytelsen til bakbenet under traversering av strålen.
- Registrer ytelsesresultatet som følger: 0, balanserer med jevn holdning; 1, griper siden av bjelken; 2, koser bjelken med 1 bakben som faller av; 3, koser bjelken med 2 lemmer som faller av, eller spinner rundt bjelken i mer enn 60 s; 4, forsøker å balansere på bjelke >40 s, men faller av; 5, forsøker å balansere på bjelke >20 s, men faller av; og 6, faller av, uten forsøk på å balansere eller balansere på bjelke <20 s.
- Plasseringstest for lem
MERK: Lemplasseringstesten undersøker 3 uavhengige stimuli av syn, berøring og proprioception med 6 parametere, for å evaluere den sensoriske funksjonen til rotte. Den totale nevrologiske funksjonsscoren varierte fra 0 til 12. Før testen bør rotte være vant til håndtering.- Hold rotten ved baksiden og legg den på bordet sakte fra en høyde på 10 cm. Normalt ville rotten strekke forben og plassere dem på bordet.
- Ta tak i rotten ved baksiden og hold den vendt mot kanten av bordet. Reaksjonen av forbenene observeres. En vanlig rotte ville plassere forbenene på bordet.
- La rotten gripe kanten av bordet. En vanlig rotte ville bruke haken for å forhindre at nese- og nesehåret berører bordkanten.
- Sett rotten på bordet, skyv rotten med et forsiktig lateralt trykk bak rottens skulder mot kanten av bordet, og observere plasseringen av forbenene og bakbenene. En vanlig rotte ville gripe kanten med forbenene og bakbenene.
- Plasser rotten på bordet med ansiktet mot kanten, og skyv den forsiktig fra baksiden til kanten. En vanlig rotte ville gripe kanten med forbenene.
- Plasser rotten på bordet med ryggen til kanten og skyv den ved baksiden til kanten av bordet. Vær oppmerksom på reaksjonen av bakbenene. En vanlig rotte ville gripe kanten med bakbenene.
- Vurder plasseringen av forbenene eller bakbenene til bordkanten. Registrer poengsummene som følger: 0, ingen plassering; 1, uferdig og/eller forsinket plassering; 2, umiddelbar, fullstendig plassering.
- Den modifiserte Voetsch neuroscore8
MERK: Den modifiserte Voetsch neuroscore er en vertebrobasilar skala score av sensorimotorisk evne, som inneholder 14 parametere: hodebevegelse, aktivitet, hørsel, smerte refleks, hornhinnen refleks, proprioception, nakke sensasjon, utforskning, sirkler, aksial torso sensasjon, 4-lem bevegelse, forelimb bevegelse, klatring, og stråle gange. Poengsummen for hver parameter varierer fra 0 (fullstendig nevrologisk underskudd) til 3 (ingen nevrologisk underskudd). Den totale nevrologiske funksjonspoengsummen varierer fra 0 til 42.- Plasser rotten på bordet (50 cm lang × 35 cm bred) og la den bevege seg rundt i fem minutter. Vær oppmerksom på den spontane bevegelsen av hodet: beveger seg i alle dimensjoner, 3; foretrekker den ene siden, 2; bare bevegelse til 1 side, 1; bøyd til ensidig side, 0.
- Plasser rotten på bordet (50 cm lang × 35 cm bred) og la den bevege seg rundt i fem minutter. Aktivitet er definert som: fullt responsiv, 3; moderat responsiv, 2; minimalt responsiv, 1; koma, 0.
- Vær oppmerksom på kraniociaudal sirkler: svinger bilateralt, 3; foretrekker 1 side, 2; bare til 1 side, 1; falt til 1 side, 0.
- Evaluer forbensbevegelsen: lik og bilateral bevegelse, 3; liten asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; parese, 0.
- Evaluer 4-lemmer bevegelsen: lik og bilateral bevegelse, 3; liten asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; parese, 0.
- Når rotten står stille, utfør en øreklemme for å stimulere auriklene og teste smerterefleksen: beveger seg raskt og symmetrisk bort fra stimulans, 3; beveger seg sakte eller asymmetrisk fra stimulans, 2; viser noe bevegelse som svar på smerte, 1; Ingen reaksjon, 0.
- Når rotten står stille, lag en lyd på hver side av rottens kropp for å teste hørselen: fingre gni, 3; trykk på fingrene, 2; høy klapping, 1 og ingen oppsiktsvekkende, 0.
- For å sjekke proprioception, berør rottens vibrissae på begge sider henholdsvis med en stump pinne og observere responsen på stimulansen: reagere på berøring, 3; redusert reaksjon på den ene siden, 2; redusert på begge sider, 1; fraværende, 0.
- For å evaluere torsoaksial følelse, plasser en stump pinne på hver side av rottens kropp og observere responsen på stimulansen: rask og symmetrisk reaksjon på stimuli, 3; litt redusert eller asymmetrisk reaksjon, 2; sterkt redusert og asymmetrisk reaksjon, 1 og ingen reaksjon, 0.
- For å teste hornhinnen refleks, hold rotte og raskt berøre hornhinnen på begge sider med en bomullspinne: begge øynene lukkes raskt, 3; redusert refleks på den ene siden, 2; redusert på begge sider, 1; fraværende, 0.
- For å sjekke følelsen av nakken, hold rotten og bruk en stump pinne for å berøre nakken: reagerer på berøring aktivt, 3; langsom reaksjon på berøring, 2; sterkt redusert reaksjon, 1; Ingen reaksjon, 0.
- For å observere utforskning, bruk en lys mørk boks.
MERK: To tredjedeler av esken skal være åpen og tent, mens resten er dekket og mørkt. En 7 cm dør forbinder de to rommene. - Plasser rotten i lysrommet i 5 min og deretter det mørke rommet i ytterligere 5 minutter, la det bevege seg rundt og registrere rottens aktiviteter. Når 4 lemmer er plassert i ett rom, registrer det som en inngang. Rekordresultater som følger: når de lyse og mørke rommene aktivt, 3; når 1 rom, 2; beveger seg sakte bare etter stimulans, 1; og ingen bevegelse, 0.
- For å kontrollere klatreevnen, plasser rotten på bunnen av et 20 cm bredt, 70 cm langt plan med en 30-graders vinkel mot horisontal bakken. Rekordresultater som følger: i stand til å klatre til toppen, 3; nedsatt klatring, 2; stasjonært grep, 1; og faller umiddelbart, 0.
- For å undersøke strålevandringen, legg rotten på den ene enden av en 3 cm bred, 70 cm lang bjelke som er 20 cm over bakken, registrer score som følger: utforsker hele bjelken, 3; utforsker en del av bjelken, 2; noen bevegelse og faller, 1; ingen bevegelse, 0.
- Beregn poengene.
4. Blødningsbekreftelse ved MR
- Utfør MR-skanningen ved 24 timers etter operasjonen.
- Bedøv rotten med isofluran (5% for induksjon, 1%- 1,5% for vedlikehold).
- Sikre rottens hode i rottehjernens matrisespole kombinert med en volumspole som bare kan overføres.
- Plasser spolen sammen med rotten i MR-skanneren. Fest rotten i holderen via tann- og ørestengene.
- Bruk en lukket termisk jakke for å opprettholde rottens kroppstemperatur ved 37 ± 0,5 °C under MR-skanning.
- Utfør en pilotsekvens for å sikre riktig geometri.
- Påfør en ekkosekvens med raskt spinn for å samle inn T2-vektede skanninger. Angi parameterne på følgende måte: ekkotid (TE), 132 ms; repetisjonstid (TR), 2500 ms; oppkjøp matrise, 148 × 148; synsfelt, 100 mm × 100 mm; 12 skiver; 1,5 mm tykk.
- Returner rotten til buret.
5. Blødningsbekreftelse ved brutto anatomi
MERK: Ofre rottene på det angitte tidspunktet, 24 timer og 14 d etter operasjonen (Figur 1D).
- Bedøv rotten med 5% isofluran til bevissthetstap. Avlivet det deretter med karbondioksid (CO2) (20-30% av volumet av merden per minutt).
- Bekreft døden ved hjelp av følgende tegn: ingen bryst stiger og faller, ingen håndgripelig hjerterytme, ingen respons på tåklemme, dårlig slimhinnefarge, fargeendring eller opasitet i øynene.
- Utfør cervical dislokasjon.
- Sikre rotten ved å tappe potene på en steril plattform. Lag et midtlinje snitt fra livmorhalsen for å utsette hypogastrium for thorax og lever. Lag et lateralt snitt fra den øvre brystmargen langs kragebenet helt til venstre og et annet lateralt kutt fra xiphoid langs membranen til ytre venstre, for å avsløre hjertet. Løft ribcageklaffen og fest den til plattformen med en pinne.
- Koble enden av en nål (27 G) til en perfusjonspumpe som inneholder 4 °C saltvann. Før nålespissen inn i hjertet langs venstre kant av venstre ventrikel for å unngå å komme inn i atriet. Slå på perfusjonspumpen for å sikre at spissen er i venstre ventrikel, og lag deretter et kutt i høyre atrium.
- Slå av perfusjonspumpen når væsken som dreneres ut av høyre atrium blir fargeløs og leveren blir hvit. Denne prosedyren trenger ca. 100 ml 4 °C saltvann.
- Decapitate rotten og høst hele hjernen ved hjelp av saks og tang. Fjern eventuell fuktighet fra hjerneoverflaten med blotting papir.
- Hold hele hjernen ved -80 °C i 1 min.
MERK: Dette trinnet kan hoppes over hvis hjernen kan kuttes uten frysing. - Legg hjernen inn i koronal rotte hjernematrisen med dorsalsiden opp.
- Sett inn et 0,21 mm tykt blad i rustfritt stål i blødningssenteret i henhold til hullet i hjernens overflate.
- Sett andre kniver inn i hjernen med et intervall på 2 mm.
- Senk hjerneseksjonene ned i 10 ml 4 % paraformaldehydoppløsning (PFA) i 24 timer ved 4 °C. Skyll dem med 0,01 mmol/l fosfatbufret saltvann (PBS).
- Organiser seksjonene fra rostral til kaudal og bilde dem.
6. Parafinseksjon og hematoksylin og eosin (HE) farging
- Fest hjernen med 4% PFA-løsning i minst 24 timer ved romtemperatur. Volumet av PFA skal være 5-10 ganger hjernevolum.
- Klipp hjernen fra blødningssenteret i to stykker via blad og coronal rotte hjernematrise.
- Lag parafin-innebygde vevsblokker.
- Del den paraffin-innebygde vevsblokken koronally i 40 μm tykkelse lysbilder på en mikrotom, kutt 4 seksjoner etter hverandre, starter fra blødningssenter, og flyter dem i et 40 °C vannbad.
- Monter de 40 μm seksjonene (8 lysbilder totalt for en hjerne) på rene glasssklier og lufttørk over natten ved romtemperatur.
- Stek skliene ved 56 °C i 1 time.
- Vask i 3 min i xylen, 3 ganger.
- Dypp seksjoner 30 ganger i 100% etanol, 30 ganger til i 100% etanol, 30 ganger i 95% etanol og 30 ganger til i 95% etanol.
- Skyll i vann fra springen til det er klart.
- Senk seksjonene i Hematoxylin i ca. 10 min.
- Skyll i vann fra springen til det er klart.
- Dypp seksjoner i eosinflekk i 30 s.
- Dehydrere lysbilder med 3-4 dips 95% etanol, 3-4 dips i 100% etanol, 100% etanol i 1 minutt, og 10 dips i 100% etanol + xylen (1:1).
- Rengjør seksjoner med xylen i 1 min, 2 ganger.
- Monter med ikke-vandig monteringsmedium og en deksleslip.
- Tørk seksjonene i luften over natten ved romtemperatur, og saner dem deretter.
7. Statistikk
- Bruk GraphPad Prism 6.0 til å beregne Student t-test eller Mann Whitney U test.
MERK: Alle data bør uttrykkes som gjennomsnittlige ± SE. Forskjeller mellom to grupper bestemmes med en to-tailed Student t-test eller Mann Whitney U test. P<0,05 er definert som statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 25 dyr ble brukt, 3 for kontroll, 6 for 30 μL, 6 for 60 μL og 10 for 100 μL blodinjeksjoner. En rotte som fikk en 100 μL injeksjon av autologt blod (1/10) døde innen 24 timer etter operasjonen.
Atferdstester ble utført på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 etter operasjonen. Poengsummene for kontrollgruppen og blodinjeksjonsgruppene på ulike tidspunkter etter operasjonen er presentert i tabell 2. Pontinblødningen forårsaket nevrologiske underskudd som redusert hornhinnenrefleks og sirkler (Figur 3B,C). Injeksjon av 100 μL blod induserte også myotonia (Figur 3A). Resultatene av balansestråletesten, lemplasseringstesten og den modifiserte Voetsch-nevroscoren viste at den nevrologiske funksjonen ble redusert etter hvert som volumet av pontinblødning økte.
MR-skanning ble utført 24 timer etter operasjonen (figur 4). I blodinjeksjonsgruppene, på T2-sekvensen, ble blødning oppdaget som en hypointense kant med en iso- til litt hyperintense kjerne i basilardelen av pons. Det ble ikke påvist blødninger ved MR i andre hjerneområder (figur 4). Volumet av blødning ble økt etter hvert som injeksjonsvolumet av autologt blod økte.
Deretter ble rotter ofret ved 24 timer og dag 14 etter operasjonen, separat, og 2 mm tykke seksjoner ble laget (Figur 4). Blødning ble oppdaget rundt injeksjonsstedet og distribusjon i bunnen av pons. Det var lite ødem rundt blødningen i blodinjeksjonsgruppen på 100 μL.
Noen av rottene ble ofret 3 dager etter operasjonen og parafin-seksjonert for å gjøre HE farging. Resultatene viste at i blodinjeksjonsgruppene beriket inflammatoriske celler i peri-blødningssonen (Figur 5C og F). Hemoglobinet forblir i intakte røde blodlegemer (Figur 5D og G).
Figur 1: Skjematiske diagrammer over pontinblødningsmodell. (A) Autolog blodoppsamling fra halevenen. (B) Det skjematiske diagrammet for borelokasjon. (C) De skjematiske diagrammene for injeksjonsstedet. (D) Eksperimentell design. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Instrumenter og prosedyre for kirurgi. (A) Anestesimaskin. (B) Kirurgiske instrumenter. (C) Mikrodrill. (D) Mikroinjeksjonspumpe. (E) Stereotaxisk apparat. (F) En linje merket midt i skallen. (G) Gul pil peker mot borestedet. (H) Drenering av blod fra halevenen. (I) Overfør blodet til Eppendorf tube. (J) Aspirer blodet inn i Hamilton-sprøyten. (K) Før Hamilton-sprøyten gjennom skallehullet. (L) Injeksjonsprosess av autologt blod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av atferdstester. (A) Myotonia hos en rotte injisert 100 μL autologt blod. (B) Redusert hornhinnen refleks på høyre side i en rotte injisert 60 μL autologt blod. (C) Redusert hornhinnen refleks i bilaterale sider i en rotte injisert 100 μL autologt blod. (D) En rotte fikk 60 μL autologt blod sirklet til den kontralaterale siden av lesjonen. (E) Resultater av balansestråletest. (F) Resultater av den modifiserte Voetsch neuroscore. (G) Resultater av lemplasseringstest. Linje betyr signifikant forskjell mellom de to gruppene (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av MR-skanning og brutto anatomi. MR-skanningen (øvre) ble utført 24 timer etter pontinblødning, da rottene ble ofret og kuttet i 2 mm hjerneseksjoner (bunn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av HE-farging. Hjerner ble høstet fra rotter injisert 100 μL blod 3 d etter operasjonen. (A) Hele hjerneseksjonen. Lave felt fra (B) det normale pontinområdet, (C) peri-lesjonssone og (D) blødningskjerne. Høye felt fra (E) normalt pontinområde, (F) peri-lesjonssone og (G) blødningskjerne. Skalalinjen var 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Representative resultater av brutto anatomi på dag 14 etter operasjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Litt | moderat | massiv | |
| Totalt volum | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Første injeksjon | |||
| Stereotaktiske koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volum | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| fart | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Tid med intervall | 20 min | 20 min | 20 min |
| Andre injeksjon | |||
| Stereotaktiske koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volum | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| fart | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Før tilbaketrekking av nålen | 10 min | 10 min | 10 min |
| AP: anteroposterior posisjon | |||
| Lat: lateral | |||
| Toppunkt: loddrett | |||
Tabell 1: Injeksjon av autologt blod.
| Rotte nummer | Dag 1 | Dag 3 | Dag 7 | Dag 14 |
| Den modifiserte Voetsch neuroscore | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Test av balansestråle | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Plasseringstest for lem | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabell 2: Resultater av atferdstester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nåværende studien ga vi en protokoll for å generere en massiv pontinblødning rotte modell. Denne modellen kan brukes til forskning på patofysiologisk mekanisme og prognose for massiv pontinblødning.
Gjennom hele eksperimentet ble 25 rotter brukt, hvorav bare en døde. Verifiseringen av MR, brutto anatomi og HE-farging indikerte at denne metoden hadde en svært lav dødelighet og høy suksessrate. For å etablere massiv pontinblødningsmodell, må to problemer løses, det injiserte autologe blodet har en tendens til å lekke inn i subarachnoid-rommet og strømme tilbake til den fjerde ventrikelen langs nålekanalen. Den eksisterende dobbeltinjeksjons moderate (60 μL autologe blodet totalt) pontinblødningsmodellen løste det første problemet, knapt noe blod strømmet inn i subarachnoid-rommet. Imidlertid var det fortsatt en liten mengde blodtilstrømning. I den nåværende studien ble det brukt flere strategier for å optimalisere den eksisterende dobbeltinjeksjonsmetoden for å gjøre det mulig å injisere en større mengde 100 μL autologt blod uten tilbakestrømning. Først ble to forskjellige injeksjonssteder i stedet for en ansatt. For det andre ble heparin brukt til å skylle sprøyten med minimal rest for å redusere doseringen, for bare å beskytte blodet mot koagulering under injeksjonsprosessen, men ikke nok til å fremme lekkasje og tilbakestrømning etter injeksjonen. For det tredje var injeksjonstiden lang og injeksjonshastigheten var langsom, 1 μL/min. Videre ble bare en liten mengde autologt blod injisert første gang, mens den andre injeksjonen ble utført 20 minutter senere. Etterpå ble nålen trukket tilbake først etter 10 minutter, og denne prosedyren ble utført ekstremt sakte. Ved hjelp av denne metoden var det knapt noe blod som strømmet inn i subarachnoid-rommet eller fjerde ventrikel i rotter injisert med 30 μL eller 60 μL autologt blod, men det var fortsatt en liten mengde tilbakestrømning hos rotter injisert med 100 μL. Å forlenge tiden før du fjernet nålen kunne løse dette problemet.
Atferdstester ble utført på dag 1, dag 3, dag 7 og dag 14 etter modellering, inkludert balansestråletest, lemplasseringstest og den modifiserte Voetsch-nevroscoren. På den første dagen etter operasjonen viste nesten alle rotter i blodinjeksjonsgruppene sirklende oppførsel (dvs. å svinge til venstre eller høyre), ledsaget av forsvinning av ensidig eller bilateral hornhinnerefleks. Selv om autologt blod ble injisert i midtlinjen av pontinen, ble det ujevnt fordelt i de to sidene av hjernen. Dette så ut til å være årsaken til den forskjellige ytelsen i atferdstester. Rottenes aktiviteter og reaksjoner injiserte 30 μL eller 60 μL autologt blod redusert nærmere det normale. Hos rotter injisert 100 μL blod, ble de sensoriske funksjonene betydelig svekket og responsen var dårlig. Muskelstivhet dukket opp hos noen rotter i hviletilstand. På dag 1, dag 3 og dag 7 var det åpenbare forskjeller mellom rotter injisert 30 μL, 60 μL eller 100 μL autologt blod og rotter i kontrollgruppen i den modifiserte Voetsch nevroscore. I balansestråletesten og lemstedstesten var det ingen signifikante forskjeller mellom rotter injisert 30 μL eller 60 μL blod og rotter i kontrollgruppe når som helst. Resultatene av balansestråletesten og lemplasseringstesten hos rotter injisert 100 μL autologt blod var imidlertid betydelig forskjellig sammenlignet med kontrollgruppen på dag 1 og dag 3. Den mulige årsaken kan være at det er færre evalueringspunkter i balansestråletesten og lemplasseringstesten sammenlignet med den modifiserte Voetsch-nevroscoren, som ikke er følsom nok til å oppdage subtile nevrologiske underskudd. Det er upassende å bruke disse to metodene for å evaluere atferd i blødningsmodeller med milde symptomer, men de gjelder i den massive pontinblødningsmodellen. Totalt sett viste den modifiserte Voetsch neuroscore seg å være mer egnet for omfattende og nøyaktig vurdering av nevrologiske funksjoner i forskjellige pontinblødningsmodeller.
Det er flere fordeler med denne metoden. Basert på den forrige dobbeltinjeksjonsmetoden ble det andre injeksjonsstedet endret, og doseringen av heparin ble justert for å unngå lekkasje og tilbakestrømning i den milde (30 μL) og moderate (60 μL) pontinblødningsmodellen. Selv i den massive (100 μL) pontinblødningsmodellen var tilbakestrømningen svært begrenset, og skjedde bare i et lite antall rotter. Denne metoden kan enkelt utføres med høy suksessrate og lav dødsrate. Videre kan den eksperimentelle pontinblødningen observeres i løpet av en lang periode, minst 14 dager etter modellering, noe som bidrar til å undersøke hele sykdomsutviklingen og effekten av behandlinger. Det viktigste fremskrittet med denne modellen var at den etterlignet symptomene på pasienter med pontinblødning. Klinisk sett resulterer massiv pontinblødning i alvorlige nevrologiske underskudd, mens tidligere pontinblødningsmodeller bare utviklet relativt lite hemorragisk volum med milde symptomer. Den massive pontinblødningen i denne modellen distribuert i de bilaterale ponsene, som ligner med blødningsfordeling hos pontinblødningspasienter. I tidligere eksperimentelle pontinblødningsmodeller ligger blødningen bare i de ensidige pons9.
Det er imidlertid også noen begrensninger ved denne metoden. For det første var pontinblødning i denne studien forårsaket av injeksjon av blod, delvis heparinisert under overgangen, noe som kan påvirke blodkoagulasjonen eller til og med homeostase i de omkringliggende ponsene. For det andre krever denne modellen spesialutstyr, for eksempel stereotaxisk apparat og injeksjonspumpe. For det tredje kan denne modellen ikke etterligne spontan blødning.
Til slutt ga denne studien en metode for å skape en eksperimentell akutt massiv pontinblødningsmodell hos rotten, noe som kunne fremme ny mekanisk og terapeutisk forskning på dette feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble økonomisk støttet av National Science Foundation of China (81471181 og 81870933) og Åpningslabprogrammet til Guangzhou Medical University (0506308) til Y Jiang, og av National Science Foundation of China (81701471) og det vitenskapelige programmet til Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) til Z Qiu, og av National Science Foundation of China (81501009) til L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
