Summary
Presentamos un protocolo para establecer un modelo masivo de la hemorragia del pontine en una rata vía la inyección dual de la sangre autóloga.
Abstract
Proporcionamos un protocolo para establecer un modelo masivo de la hemorragia del pontine en una rata. Las ratas que pesaban cerca de 250 gramos fueron utilizadas en este estudio. Cien microlitros de sangre autóloga fueron tomados de la vena de la cola y estereotáxicamente inyectados en el puente de Varolio. El proceso de inyección se dividió en 2 pasos: En primer lugar, se inyectaron 10 μL de sangre en una ubicación específica, posición anteroposterior (AP) -9,0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9,2 mm, seguida de una segunda inyección de la sangre residual localizada en AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm con un intervalo de 20 minutos. La prueba del haz de equilibrio, la prueba de colocación del miembro, y el neuroscore modificado de Voestch fueron utilizados para evaluar la función neurológica. La proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) fue utilizada para determinar el volumen de hemorragia in vivo. Los síntomas de este modelo estaban en línea con pacientes con hemorragia masiva del pontine.
Introduction
La hemorragia intracerebral explica una quinto de pacientes del movimiento. El pronóstico de la hemorragia intracerebral depende de la velocidad, el volumen y la ubicación del sangrado1,2. En comparación con la hemorragia del cerebro anterior, la hemorragia del tronco encefálico tiene mayor mortalidad y morbilidad3. El cerca de 40% de hemorragia del médula oblonga ocurre en el puente deVarolio 4. La etiología y fisiopatología de la hemorragia pontina son bastante diferentes y menos estudiadas que la hemorragia del cerebro anterior5.
Hay dos tipos de modelos animales de hemorragia pontina. Uno es el modelo de hemorragia espontánea inducida por infusión de colagenasa bacteriana en el puente deVarolio 6,7,8. La mayor ventaja de este modelo es que el sangrado es espontáneo. Sin embargo, la colagenasa puede inducir solamente un pequeño volumen de hemorragia del pontine. Además, la colagenasa podría causar otras lesiones en el cerebro. El otro modelo es inducido por la inyección estereotáctica de sangre autóloga en el puente deVarolio 9. La ventaja de este modelo es que es fácil de dominar con una alta tasa de éxito. Teóricamente, los investigadores podrían inyectar cualquier volumen de sangre en cualquier ubicación de puente de Varolio. Sin embargo, debido a la fuga posterior a través de la ruta de la aguja, el volumen inyectado es limitado. Recientemente, el método de doble inyección se ha promovido para reducir la fuga trasera9. Este método inyecta sangre autóloga dos veces con un intervalo de 20 minutos entre las inyecciones. El método de doble inyección se aplica para inducir hemorragia pontina leve (30 μL) y moderada (60 μL), pero no hemorragia pontina masiva. En la clínica, la mayoría de los pacientes con hemorragia pontina con mal pronóstico tienen hemorragia masiva (más de 10 mL).
En el estudio anterior, proporcionamos un protocolo para establecer un modelo isquémico del movimiento del pontine en la rata10. En este estudio, modificamos el método dual existente de la inyección, y proporcionamos un protocolo detallado para inducir hemorragia masiva del pontine en una rata por la inyección dual de la sangre autóloga del 100 μL en dos diversas localizaciones en el puente de Varolio.
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Protocol
El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou. Las ratas fueron proporcionadas por el Centro de Animales de la Universidad Médica del Sur. El diseño experimental se muestra en la Figura 1.
1. Animal e instrumentos
- Use ratas Sprague-Dawley machos de 8 semanas de edad que pesen 250 ± 10 g.
- Alojar a las ratas durante al menos 7 días antes de la cirugía en condiciones ambientales controladas con una temperatura ambiente de 25 °C, humedad relativa del 65% y un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h.
- Proporcione alimentos y agua sin límite.
- Preparar los instrumentos (Figura 2A-E).
2. Inyecte la sangre en el puente de Varolio
- Pesar las ratas de nuevo 3 días antes de la cirugía para seleccionar ratas con peso corporal adecuado para los experimentos.
- Durante los 3 días antes de modelar, entrene a las ratas para que caminen en el haz de equilibrio 3 veces al día para asegurarse de que las ratas normales puedan pasar el haz de equilibrio sin pausa.
- Precaliente la almohadilla térmica a 37 °C antes de la anestesia.
- Acople un microdrill al soporte en el marco estereotáxico.
- Inyecte a las ratas 50 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina por vía intraperitoneal. Espere hasta que no haya una respuesta de dedo deldo del dedo deldo del sistema.
- Transporte la rata en el marco estereotáxico en una posición decúbito prono. Coloque las barras auriculares por encima del canal auditivo para asegurar la cabeza. Fije el cráneo en posición horizontal para evitar sesgar la inyección (Figura 2F).
- Mantener la anestesia por isoflurano (97,5% de oxígeno y 2,5% de isoflurano) a través de un cono de nariz estereotáxica con un puerto de entrada y salida.
- Use ungüento para los ojos para mantener la córnea húmeda.
- Afeitarse el pelo por encima del cráneo con una micro afeitadora.
- Dibuje una línea media de 3 cm con un rotulador en el cráneo desde la línea del canthus lateral bilateral hasta 0,5 cm detrás de la fontanela posterior, como se muestra en la Figura 2F.
- Aplique el exfoliante quirúrgico de entoiodina de manera circular, comenzando en el centro de la línea media marcada y girando hacia afuera.
- Coloque la cortina quirúrgica.
- Haga una incisión con un bisturí a lo largo de la línea media marcada.
- Use un hisopo de algodón para eliminar cualquier sangre potencial.
- Coloque un pedazo de fórceps a cada lado de la solapa del cuero cabelludo para exponer el cráneo (Figura 2G).
- Sumerja un hisopo de algodón en solución salina al 0,9% y retire suavemente los tejidos conectivos del hueso del cráneo para evitar que los tejidos conectivos quede atrapados en el microdrill.
- Marque el punto central del bregma como punto de origen a través de un rotulador.
- Realizar una craneotomía (1 mm de diámetro) utilizando un microdrill a AP-9,0 mm, Lat 0 mm(Figura 1B y Tabla 1). Proceda con cuidado porque este punto está muy cerca del seno venoso(Figura 2G).
- Retire el microdrill del marco estereotáxico.
- Coloque una jeringa Hamilton de 100 μL en el soporte estereotáxico (Figura 2K). Encienda el interruptor de la bomba de inyección, haga clic en el botón inhalación rápida, aspire la solución de heparina (12500 U diluida en 100 mL de solución salina) a 100 μL y luego drene completamente para evitar la coagulación de la sangre demasiado rápido.
- Aplique clorhexidina y exfoliante quirúrgico al 75% de alcohol en toda la cola desde la raíz hasta la punta al menos 3 veces para desinfectar la piel, suavizar la córnea y dilatar la vena de la cola para aumentar la tasa de éxito de la inyección.
- Coloque una acupuntura del cuero cabelludo a una jeringa de 1 ml.
- Inserte la acupuntura del cuero cabelludo en una vena lateral de la cola a 3 cm de la punta de la cola y tome 150 μL de sangre (Figura 2H).
- Retire la acupuntura del cuero cabelludo de la jeringa de 1 ml.
- Transferir la sangre a un tubo (Figura 2I).
NOTA: Transferir rápidamente para prevenir la coagulación de la sangre. - Cambie los guantes quirúrgicos.
- Elija el modo Retirar, ajuste el volumen a 100 μL, establezca la velocidad en 200 μL/min, haga clic en el botón EJECUTAR, aspire 100 μL de sangre en la jeringa Hamilton (Figura 2J).
- Elija el modo Infundir, establezca la velocidad en 1 μL/min.
- Avanza la jeringa hasta que la punta alcance 9,2 mm por debajo de la superficie del cerebro (Figura 1C y Figura 2L).
- Haga clic en el botón Ejecutar, inyecte los primeros 10 μL de sangre a una velocidad de 1 μL/min (Tabla 1).
- Detenga la inyección y deje la jeringa en su posición durante 20 minutos para evitar que la sangre fluya hacia el espacio subaracnoideo.
- Retraiga la jeringa hasta que la punta llegue a 9,0 mm por debajo de la superficie del cerebro.
- Reinicie la inyección a la misma velocidad de 1 μL/min hasta que la sangre residual se haya inyectado completamente.
- Deje la jeringa en su posición durante 10 minutos para evitar el reflujo de la sangre.
- Retire la jeringa del cerebro lentamente.
- Use cemento óseo para cubrir el orificio de la craneotomía.
- Cuando el cemento se seque, suturar la herida con filamento de sutura de poliamida 4-0. Después de coser 3 o 4 stiches, ate 2-1-1 nudos quirúrgicos estándar.
- Para prevenir la infección, inyecte a la rata penicilina (0,25 mL, 80 UI diluida en 4 mL de solución salina) por vía intraperitoneal.
- Inyecte las ratas por vía subcutánea con tartrato de butorfanol (2,5 mg/kg) y repita la inyección cada 2 horas para aliviar el dolor postoperatorio hasta 24 horas después de la cirugía.
- Observe a la rata cada 15 minutos hasta que se recupere completamente de la anestesia. Devuélvalo a la jaula original, con una almohadilla térmica debajo de la jaula. Proporcionar a la rata acceso gratuito a alimentos y agua hasta el sacrificio.
3. Pruebas de comportamiento
NOTA: Realice pruebas de comportamiento en el día 1, día 3, día 7 y día 14 después del modelado, incluida la prueba de haz de equilibrio, la prueba de colocación de extremidades y la puntuación neutiva de Voetsch modificada.
- Prueba del haz deequilibrio 11.
NOTA: Esta es una prueba específicamente para examinar la función sensoriomotora de la extremidad posterior.- Preparó el aparato para asegurarse de que la viga (3 cm de ancho × 70 cm de largo) está a 20 cm por encima del suelo.
- Coloque una caja oscura en el extremo posterior de la viga con una entrada estrecha.
- Coloque un generador de ruido blanco y una fuente de luz brillante, que se utilizan para motivar a la rata a atravesar el haz y entrar en la caja de la meta, en el extremo de la cabeza del haz.
- Detenga el ruido y la luz cuando el animal entre en la caja de la meta. Registre la latencia desde el extremo de la cabeza hasta la caja de la meta (en segundos) y el rendimiento de la extremidad posterior durante el cruce de la viga.
- Registre la puntuación de rendimiento de la siguiente manera: 0, equilibrios con postura constante; 1, agarres lado de la viga; 2, acurruca la viga con 1 extremidad posterior que se cae; 3, acurruca la viga con 2 extremidades que se caen, o girando alrededor de la viga durante más de 60 s; 4, intenta equilibrarse en la viga >40 s, pero se cae; 5, intenta equilibrarse en la viga >20 s, pero se cae; y 6, se cae, sin intento de equilibrio o equilibrio en la viga <20 s.
- Prueba de colocación de extremidades
NOTA: La prueba de colocación del miembro examina 3 estímulos independientes de la visión, del tacto, y del propiocepción con 6 parámetros, para evaluar la función sensoriomotora de la rata. La cuenta neurológica total de la función se extendió a partir de la 0 a 12. Antes de la prueba, la rata debe estar habituada a la manipulación.- Sostenga la rata por la espalda y colóquela sobre la mesa lentamente desde una altura de 10 cm. Normalmente, la rata estiraba las extremidades anteriores y las colocaba sobre la mesa.
- Agarra la rata por la espalda y mantenla mirando hacia el borde de la mesa. Se observa la reacción de las extremidades anteriores. Una rata normal colocaría las extremidades anteriores sobre la mesa.
- Deje que la rata agarre el borde de la mesa. Una rata normal usaría la barbilla para evitar que la nariz y el pelo de la nariz toquen el borde de la mesa.
- Ponga a la rata sobre la mesa, empuje a la rata con una presión lateral suave detrás del hombro de la rata hacia el borde de la mesa, y observe la colocación de las extremidades anteriores y posteriores. Una rata normal agarraría el borde con sus extremidades anteriores y extremidades posteriores.
- Coloque la rata sobre la mesa con la cara hacia el borde y empúcela suavemente desde la parte posterior hasta el borde. Una rata normal agarraría el borde con sus extremidades anteriores.
- Coloque la rata en la mesa con su espalda al borde y empúcela por la espalda al borde de la mesa. Observe la reacción de las extremidades posteriores. Una rata normal agarraría el borde con sus extremidades posteriores.
- Evalúe la colocación de las extremidades anteriores o posteriores en el borde de la mesa. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: 0, sin colocación; 1, colocación inacabada y/o retrasada; 2, colocación inmediata, completa.
- El neuroscore modificado de Voetsch8
NOTA: El neuroscore modificado de Voetsch es una cuenta vertebrobasilar de la escala de la capacidad sensoriomotora, conteniendo 14 parámetros: movimiento de la cabeza, actividad, audiencia, reflejo del dolor, reflejo córneo, propiocepción, sensación del cuello, exploración, circundando, sensación axial del torso, movimiento de 4 miembros, movimiento del miembro anterior, trepando, y caminata de la viga. La puntuación para cada parámetro oscila entre 0 (déficit neurológico completo) y 3 (sin déficit neurológico). La cuenta neurológica total de la función se extiende a partir de la 0 a 42.- Coloque la rata sobre la mesa (50 cm de largo × 35 cm de ancho) y deje que se mueva durante cinco minutos. Observar el movimiento espontáneo de su cabeza: se mueve en todas las dimensiones, 3; prefiere un lado, 2; sólo movimiento a 1 lado, 1; flexionado al lado unilateral, 0.
- Coloque la rata sobre la mesa (50 cm de largo × 35 cm de ancho) y deje que se mueva durante cinco minutos. La actividad se define como: totalmente receptiva, 3; moderadamente sensible, 2; mínimamente sensible, 1; coma, 0.
- Observe el círculo craneocaudal: vueltas bilateralmente, 3; prefiere 1 lado, 2; sólo a 1 lado, 1; cayó a 1 lado, 0.
- Evaluar el movimiento de las extremidades anteriores: movimiento igual y bilateral, 3; asimetría leve, 2; gran asimetría, 1; paresia, 0.
- Evaluar el movimiento de 4 extremidades: movimiento igual y bilateral, 3; asimetría leve, 2; gran asimetría, 1; paresia, 0.
- Cuando la rata está estacionaria, realizar un pellizco en el oído para estimular las aurículas y probar el reflejo del dolor: se aleja rápida y simétricamente del estímulo, 3; se aleja lenta o asimétricamente del estímulo, 2; muestra algún movimiento en respuesta al dolor, 1; ninguna reacción, 0.
- Cuando la rata está estacionaria, hacer un ruido a cada lado del cuerpo de la rata para probar la audición: frotamiento de los dedos, 3; chasquido de dedos, 2; aplausos fuertes, 1 y ningún sorprendente, 0.
- Para comprobar la propiocepción, toque las vibrisas de la rata en ambos lados respectivamente con un palo contundente y observe su respuesta al estímulo: reaccione al tacto, 3; reacción disminuida en un lado, 2; disminuido en ambos lados, 1; ausente, 0.
- Para evaluar la sensación axial del torso, coloque un palo romo a cada lado del cuerpo de la rata y observe su respuesta al estímulo: reacción enérgica y simétrica a los estímulos, 3; reacción ligeramente disminuida o asimétrica, 2; reacción muy disminuida y asimétrica, 1 y ninguna reacción, 0.
- Para probar el reflejo corneal, sostenga a la rata y toque rápidamente la córnea en ambos lados con un hisopo de algodón: ambos ojos se cierran rápidamente, 3; reflejo disminuido en un lado, 2; disminuido en ambos lados, 1; ausente, 0.
- Para comprobar la sensación del cuello, sostenga la rata y use un palo romo para tocar el cuello: reacciona al tacto activamente, 3; reacción lenta al tacto, 2; reacción muy disminuida, 1; ninguna reacción, 0.
- Para observar la exploración, utilice una caja oscura clara.
NOTA: Dos tercios de la caja deben estar abiertos e iluminados, mientras que el resto está cubierto y oscuro. Una puerta de 7 cm conecta los dos compartimentos. - Coloque la rata en el compartimiento de luz durante 5 minutos y luego en el compartimiento oscuro durante otros 5 minutos, permita que se mueva y registre las actividades de la rata. Cuando se coloquen 4 extremidades en una habitación, górtela como una entrada. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: alcanza los compartimentos claros y oscuros activamente, 3; alcanza 1 compartimento, 2; se mueve lentamente sólo después del estímulo, 1; y sin movimiento, 0.
- Para comprobar la capacidad de escalada, coloque la rata en la parte inferior de un plano de 20 cm de ancho y 70 cm de largo con un ángulo de 30 grados con respecto al suelo horizontal. Puntajes de registro de la siguiente manera: capaz de subir a la cima, 3; escalada deteriorada, 2; agarre estacionario, 1; y cae inmediatamente, 0.
- Para examinar la caminata del haz, coloque a la rata en un extremo de un haz de 3 cm de ancho y 70 cm de largo que esté a 20 cm sobre el suelo, registre las puntuaciones de la siguiente manera: explora todo el haz, 3; explora parte de la viga, 2; algún movimiento y caídas, 1; sin movimiento, 0.
- Calcular los puntos.
4. Confirmación de hemorragia por RMN
- Realice la resonancia magnética a las 24 h después de la cirugía.
- Anestesiar la rata con isoflurano (5% para la inducción, 1%- 1.5% para el mantenimiento).
- Asegure la cabeza de la rata en la bobina de la matriz del cerebro de la rata combinada con una bobina del volumen de transmitir-solamente.
- Coloque la bobina junto con la rata en el escáner de RMN. Asegure la rata dentro de la cuna a través de los dientes y las barras para los oídos.
- Utilice una camisa térmica de circuito cerrado para mantener la temperatura corporal de la rata a 37 ± 0,5 °C durante la resonancia magnética.
- Realice una secuencia piloto para garantizar la geometría correcta.
- Aplique una secuencia de eco de giro rápido para recopilar exploraciones ponderadas por T2. Establezca los parámetros de la siguiente manera: tiempo de eco (TE), 132 ms; tiempo de repetición (TR), 2.500 ms; matriz de adquisiciones, 148 × 148; campo de visión, 100 mm × 100 mm; 12 rebanadas; 1,5 mm de espesor.
- Devolver la rata a la jaula.
5. Confirmación de la hemorragia por anatomía gruesa
NOTA: Sacrificar las ratas en el punto de tiempo designado, 24 h y 14 d después de la cirugía (Figura 1D).
- Anestesiar a la rata con isoflurano al 5% hasta la pérdida del conocimiento. Luego, eutanasia con dióxido de carbono(CO2)(20-30% del volumen de la jaula por minuto).
- Confirme la muerte usando los siguientes signos: sin aumento y caída del pecho, sin latidos del corazón palpables, sin respuesta al pellizco del dedo deldo deldo del artículo, color pobre color, o opacidad en los ojos.
- Realizar luxación cervical.
- Asegure la rata grabando las patas en una plataforma estéril. Cree una incisión en la línea media del cuello uterino para exponer el hipogastrio al tórax y al hígado. Haga una incisión lateral desde el margen esternal superior a lo largo de la clavícula hacia el extremo izquierdo y otro corte lateral desde el xifoideo a lo largo del diafragma hacia el extremo izquierdo, para exponer el corazón. Levante la solapa de la caja torácica y colótela en la plataforma con un pasador.
- Conecte el extremo de una aguja (27 G) a una bomba de perfusión que contenga solución salina a 4 °C. Avance la punta de la aguja en el corazón a lo largo del borde izquierdo del ventrículo izquierdo para evitar entrar en la aurícula. Encienda la bomba de perfusión para asegurarse de que la punta esté en el ventrículo izquierdo y, a continuación, realice un corte en la aurícula derecha.
- Apague la bomba de perfusión cuando el líquido drenado de la aurícula derecha se vuelva incoloro y el hígado se vuelva blanco. Este procedimiento necesita aproximadamente 100 mL de solución salina a 4 °C.
- Decapitar la rata y cosechar todo el cerebro usando tijeras y esgrimeos. Retire cualquier humedad de la superficie del cerebro con papel secante.
- Mantenga todo el cerebro a -80 °C durante 1 min.
NOTA: Este paso podría omitirse si el cerebro se puede cortar sin congelar. - Enya el cerebro en la matriz coronal del cerebro de la rata con el lado dorsal para arriba.
- Inserte una cuchilla de acero inoxidable de 0,21 mm de espesor en el centro de la hemorragia de acuerdo con el agujero en la superficie del cerebro.
- Inserte otras cuchillas en el cerebro a un intervalo de 2 mm.
- Sumergir las secciones cerebrales en 10 mL de solución de paraformadehído al 4% (PFA) durante 24 h a 4 °C. Enjuáguelos con solución salina tamponada (PBS) con 0,01 mmol/L de fosfato.
- Organiza las secciones de rostral a caudal y ístralas.
6. Sección de parafina y tinción de hematoxilina y eosina (HE)
- Fije el cerebro con una solución de PFA al 4% durante al menos 24 h a temperatura ambiente. El volumen de PFA debe ser 5-10 veces del volumen del cerebro.
- Corte el cerebro del centro de la hemorragia en dos pedazos vía la lámina y la matriz cerebral coronal de la rata.
- Haga bloques de tejido incrustados en parafina.
- Seccione el bloque de tejido incrustado en parafina coronalmente en portaobjetos de espesor de 40 μm en un microtomo, corte 4 secciones sucesivamente, a partir del centro de la hemorragia, y flote en un baño de agua de 40 ° C.
- Monte las secciones de 40 μm (8 diapositivas en total para un cerebro) en toboganes de vidrio limpio y seque al aire durante la noche a temperatura ambiente.
- Hornear los portaobjetos a 56 °C durante 1 h.
- Lavar durante 3 min en xileno, 3 veces.
- Sumerja secciones 30 veces en etanol 100%, 30 veces más en etanol 100%, 30 veces en etanol 95% y 30 veces más en etanol 95%.
- Enjuague con agua del grifo hasta que esté claro.
- Sumergir las secciones en Hematoxylin durante unos 10 min.
- Enjuague en el agua del grifo hasta que esté despejado.
- Sumergir las secciones en la tinción de eosina durante 30 s.
- Portaobjetos deshidratados con 3-4 inmersiones 95% etanol, 3-4 inmersiones en etanol 100%, 100% Etanol durante 1 minuto, y 10 inmersiones en etanol 100% + xileno (1:1).
- Limpiar secciones con xileno durante 1 min, 2 veces.
- Monte utilizando un medio de montaje no acuoso y un cubrebocas.
- Seque las secciones en el aire durante la noche a temperatura ambiente, luego sanearlas.
7. Estadísticas
- Utilice GraphPad Prism 6.0 para calcular la prueba t de Student o la prueba U de Mann Whitney.
NOTA: Todos los datos deben expresarse como media ± SE. Las diferencias entre dos grupos se determinan con una prueba t de Student de dos colas o una prueba U de Mann Whitney. P<0,05 se define como significancia estadística.
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Representative Results
Se utilizaron un total de 25 animales, 3 para el control, 6 para 30 μL, 6 para 60 μL y 10 para las inyecciones de sangre de 100 μL. Una rata que recibió una inyección de 100 μL de sangre autóloga (1/10) murió dentro de las 24 horas posteriores a la cirugía.
Las pruebas del comportamiento fueron conducidas el día 1, el día 3, el día 7 y el día 14 después de cirugía. Las puntuaciones para el grupo control y los grupos de inyección de sangre en diferentes puntos de tiempo después de la cirugía se presentan en la Tabla 2. La hemorragia pontina provocó déficits neurológicos como disminución del reflejo corneal y circunvalación(Figura 3B,C). La inyección de 100 μL de sangre también indujo la miotonía(Figura 3A). Los resultados de la prueba del haz de equilibrio, de la prueba de colocación del miembro, y del neuroscore modificado de Voetsch revelaron que la función neurológica fue disminuida mientras que el volumen de hemorragia del pontine aumentó.
La resonancia magnética se realizó 24 horas después de la cirugía(Figura 4). En los grupos de la sangre-inyección, en secuencia T2, la hemorragia fue detectada como borde del hypointense con un iso- a la base levemente del hyperintense en la parte basilar del puente de Varolio. No se detectó hemorragia por RMN en otras áreas del cerebro(Figura 4). El volumen de hemorragia fue aumentado mientras que el volumen de la inyección de sangre autóloga aumentó.
Luego se sacrificaron ratas a las 24 horas y se realizó el día 14 después de la cirugía, por separado, y se hicieron secciones de 2 mm de espesor(Figura 4). La hemorragia fue detectada rodeando el sitio de la inyección y distribuyendo en la base del puente de Varolio. Hubo un ligero edema alrededor de la hemorragia en el grupo de inyección de sangre de 100 μL.
Algunas de las ratas fueron sacrificadas 3 días después de la cirugía y parafina-seccionados para hacer ÉL que manchaba. Los resultados mostraron que en los grupos de inyección de sangre, las células inflamatorias enriquecidas en la zona de peri-hemorragia (Figura 5C y F). La hemoglobina permanece contenida dentro de los glóbulos rojos intactos(Figura 5D y G).
Figura 1: Diagramas esquemáticos del modelo de hemorragia pontina. (A) Extracción de sangre autóloga de la vena de la cola. (B) El diagrama esquemático de la ubicación del taladro. (C) Los diagramas esquemáticos de la ubicación de la inyección. D) Diseño experimental. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Instrumentos y procedimiento de cirugía. (A) Máquina de anestesia. B) Instrumentos quirúrgicos. (C) Microdrill. (D) Bomba de microinyección. E) Aparatos esteretáxicos. (F) Una línea marcada en el centro del cráneo. (G) La flecha amarilla apunta a la ubicación del taladro. (H) Drenaje de sangre de la vena de la cola. (I) Transferir la sangre al tubo de Eppendorf. (J) Aspirar la sangre en la jeringa hamilton. (K) Avance la jeringa Hamilton a través del agujero del cráneo. (L) Proceso de inyección de sangre autóloga. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de las pruebas de comportamiento. (A) Miotonía en una rata inyectó 100 μL de sangre autóloga. (B) Disminución del reflejo corneal en el lado derecho en una rata inyectada 60 μL de sangre autóloga. (C) Disminución del reflejo corneal en los lados bilaterales en una rata inyectada 100 μL de sangre autóloga. (D) Una rata recibió 60 μL de sangre autóloga circundada al lado contralateral de la lesión. (E) Resultados de la prueba del haz de equilibrio. (F) Resultados del neuroscore modificado de Voetsch. (G) Resultados de la prueba de colocación de extremidades. La línea significa diferencia significativa entre los dos grupos (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Resultados representativos de la resonancia magnética y la anatomía gruesa. La exploración de MRI (superior) fue realizada 24 h después de cirugía de la hemorragia del pontine, después las ratas fueron sacrificadas y cortadas en las secciones del cerebro de 2 milímetros (fondo). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:Resultados representativos de la tinción he. Los cerebros fueron cosechados de las ratas inyectadas 100 μL de sangre 3 d después de la cirugía. (A) Toda la sección del cerebro. Campos bajos (b) del área normal del pontine, de la zona de la peri-lesión (c) y de la base (d) de la hemorragia. Altos campos del área normal del pontine (e), de la zona de la peri-lesión (f) y de la base (g) de la hemorragia. La barra de escala era de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: Resultados representativos de la anatomía gruesa el día 14 después de la cirugía. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Leve | moderado | masivo | |
| Volumen total | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Primera inyección | |||
| Coordenadas estereotácticas | AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volumen | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| velocidad | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Tiempo de intervalo | 20 minutos | 20 minutos | 20 minutos |
| Segunda inyección | |||
| Coordenadas estereotácticas | AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9.0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volumen | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| velocidad | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Antes de la retirada de la aguja | 10 minutos | 10 minutos | 10 minutos |
| AP: posición anteroposterior | |||
| Lat: lateral | |||
| Vert: vertical | |||
Tabla 1: Inyección de sangre autóloga.
| Número de rata | Día 1 | Día 3 | Día 7 | Día 14 |
| El neuroscore modificado de Voetsch | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Prueba de haz de equilibrio | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba de colocación de extremidades | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabla 2: Resultados de las pruebas de comportamiento.
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Discussion
En el actual estudio, proporcionamos un protocolo para generar un modelo masivo de la rata de la hemorragia del pontine. Este modelo se puede utilizar para la investigación sobre el mecanismo fisiopatológico y el pronóstico de la hemorragia masiva del pontine.
A lo largo del experimento, se utilizaron 25 ratas, de las cuales solo una murió. La verificación de MRI, de la anatomía gruesa, y él que manchaba indicó que este método tenía una tarifa de mortalidad muy baja y una alta tasa de éxito. Para establecer el modelo masivo de la hemorragia del pontine, dos problemas deben ser solucionados, la sangre autóloga inyectada tiende a escaparse en el espacio subaracoideo y a fluir de nuevo al cuarto ventrículo a lo largo de la zona de la aguja. El modelo existente de hemorragia pontina moderada de doble inyección (60 μL de sangre autóloga en total) resolvió el primer problema, apenas fluyó sangre hacia el espacio subaracnoideo. Sin embargo, todavía había una pequeña cantidad de reflujo de sangre. En el presente estudio, se aplicaron varias estrategias para optimizar el método de doble inyección existente para permitir la inyección de una mayor cantidad de sangre autóloga de 100 μL sin reflujo. En primer lugar, se emplearon dos puntos de inyección diferentes en lugar de uno. En segundo lugar, la heparina fue utilizada para enjuagar la jeringuilla con el residuo mínimo para reducir la dosificación, para proteger solamente la sangre de coagular durante el proceso de inyección, pero no bastante para promover salida y reflujo después de la inyección. En tercer lugar, el tiempo de inyección fue largo y la velocidad de inyección fue lenta, 1 μL/min. Por otra parte, solamente una pequeña cantidad de sangre autóloga fue inyectada la primera vez, mientras que la segunda inyección fue realizada 20 minutos más adelante. Posteriormente, la aguja fue retirada solamente después de 10 minutos, y este procedimiento fue conducido extremadamente lentamente. Usando este método, apenas había sangre fluyendo hacia el espacio subaracnoideo o cuarto ventrículo en las ratas inyectadas con 30 μL o 60 μL de sangre autóloga, pero todavía había una pequeña cantidad de reflujo en las ratas inyectadas con 100 μL. Extender el tiempo antes de retirar la aguja podría resolver este problema.
Las pruebas del comportamiento fueron realizadas el día 1, el día 3, el día 7 y el día 14 después de modelar, incluyendo la prueba del haz de equilibrio, la prueba de colocación del miembro, y el neuroscore modificado de Voetsch. En el primer día después de la cirugía, casi todas las ratas en los grupos de inyección de sangre mostraron un comportamiento de circunvalación (es decir, girando a la izquierda o a la derecha), acompañado por la desaparición del reflejo corneal unilateral o bilateral. Aunque la sangre autóloga fuera inyectada en el midline del pontine, fue distribuida desigual en los dos lados del cerebro. Esta parecía ser la razón del diferente rendimiento en las pruebas de comportamiento. Las actividades y reacciones de las ratas inyectadas 30 μL o 60 μL de sangre autóloga disminuyeron más cerca de lo normal. En las ratas inyectadas 100 μL de sangre, las funciones sensoriomotoras se debilitaron significativamente y la respuesta fue pobre. La rigidez muscular apareció en algunas ratas en estado de reposo. En el día 1, día 3 y día 7, hubo diferencias obvias entre las ratas inyectadas 30 μL, 60 μL o 100 μL de sangre autóloga y las ratas en el grupo de control en el neuroscore de Voetsch modificado. En la prueba del haz de equilibrio y la prueba de lugar de las extremidades, no hubo diferencias significativas entre las ratas inyectadas 30 μL o 60 μL de sangre y las ratas en el grupo control en ningún momento. Sin embargo, los resultados de la prueba del haz de equilibrio y la prueba de colocación de extremidades en ratas inyectadas 100 μL de sangre autóloga fueron significativamente diferentes en comparación con el grupo control en el día 1 y el día 3. La razón posible podría ser que hay menos elementos de evaluación en la prueba del haz de equilibrio y la prueba de colocación del miembro comparadas al neuroscore modificado de Voetsch, que no son bastante sensibles descubrir déficits neurológicos sutiles. Es inadecuado utilizar estos dos métodos para evaluar comportamiento en modelos de la hemorragia con síntomas suaves, pero son aplicables en el modelo masivo de la hemorragia del pontine. Total, el neuroscore modificado de Voetsch resultó ser más conveniente para evaluar comprensivo y exactamente las funciones neurológicas en diversos modelos de la hemorragia del pontine.
Hay varias ventajas de este método. Sobre la base del método de doble inyección anterior, se cambió la ubicación de la segunda inyección y se ajustó la dosis de heparina para evitar la fuga y el reflujo en el modelo de hemorragia pontina leve (30 μL) y moderada (60 μL). Incluso en el modelo masivo (100 μL) de hemorragia pontina, el reflujo fue muy limitado, y ocurrió sólo en un pequeño número de ratas. Este método se puede realizar fácilmente con una alta tasa de éxito y una baja tasa de mortalidad. Por otra parte, la hemorragia experimental del pontine se puede observar durante un período largo, por lo menos 14 días después del modelado, que es conducente a investigar el desarrollo entero de la enfermedad y los efectos de tratamientos. El avance principal de este modelo era que mímico los síntomas de pacientes con hemorragia del pontine. Clínico, la hemorragia masiva del pontine da lugar a déficits neurológicos severos, mientras que los modelos anteriores de la hemorragia del pontine desarrollaron solamente volumen hemorrágico relativamente pequeño con síntomas suaves. La hemorragia masiva del pontine en este modelo distribuyó en el puente de Varolio bilateral, que es similar con la distribución de la hemorragia en pacientes de la hemorragia del pontine. En modelos experimentales anteriores de la hemorragia del pontine, la hemorragia localizó solamente en el puente de Varolio unilateral9.
Sin embargo, también hay algunas limitaciones de este método. Primero, la hemorragia del pontine en este estudio fue causada por la inyección de la sangre, heparinized parcialmente durante la transición, que pudo influenciar la coagulación de sangre o aún el homeostasis en el puente de Varolio circundante. En segundo lugar, este modelo requiere equipos especiales, como aparatos esteretáxicos y bombas de inyección. En tercer lugar, este modelo no puede mímico hemorragia espontánea.
En conclusión, este estudio proporcionó un método para crear un modelo masivo agudo experimental de la hemorragia del pontine en la rata, que podría promover la nueva investigación mecánica y terapéutica en este campo.
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Disclosures
Sin conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencia de China (81471181 y 81870933) y el Programa de Laboratorio de Apertura de la Universidad Médica de Guangzhou (0506308) a Y Jiang, y por la Fundación Nacional de Ciencia de China (81701471) y el Programa Científico de la Comisión Municipal de Salud de Guangzhou (20191A011083) a Z Qiu, y por la Fundación Nacional de Ciencia de China (81501009) a L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
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- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
