Summary
Otolog kanın çift enjeksiyonu yoluyla bir sıçanda büyük bir pontin kanama modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bir sıçanda büyük bir pontin kanama modeli oluşturmak için bir protokol sağlıyoruz. Bu çalışmada yaklaşık 250 gram ağırlığında sıçanlar kullanılmıştır. Kuyruk damarından 100 mikrolitre otolog kan alındı ve ponslara stereotaksik olarak enjekte edildi. Enjeksiyon işlemi 2 adıma ayrıldı: İlk olarak, belirli bir yere 10 μL kan enjekte edildi, anteroposterior pozisyon (AP) -9.0 mm; yanal (Lat) 0 mm; dikey (Vert) -9.2 mm, ardından AP -9.0 mm'de bulunan kalıntı kanın ikinci bir enjeksiyonu; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm, 20 dakika arayla. Nörolojik fonksiyonu değerlendirmek için denge ışın testi, uzuv yerleştirme testi ve modifiye Voestch nöroscore kullanıldı. In vivo kanama hacmini değerlendirmek için Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) kullanıldı. Bu modelin semptomları büyük pontin kanaması olan hastalarla uyumludu.
Introduction
İntraserebral kanama inme hastalarının beşte birini oluşturur. İntraserebral kanamanın prognozu kanamanın hızına, hacmine ve konumuna bağlıdır1,2. Ön beyin kanaması ile karşılaştırıldığında, beyin sapı kanaması daha yüksek mortalite ve morbiditeye sahiptir3. Beyin sapı kanamasının yaklaşık% 40'ı ponlarda meydana gelir4. Pontin kanamasının etiyolojisi ve patofizyolojisi, ön beyin kanamasından oldukça farklı ve daha az çalışılmıştır5.
İki çeşit pontin kanaması hayvan modeli vardır. Bunlardan biri, pons 6,7,8'dekibakteriyelkollajenaz infüzyonu ile indüklenen spontan kanama modelidir. Bu modelin en büyük avantajı kanamanın kendiliğinden olmasıdır. Bununla birlikte, kollajenaz sadece küçük bir miktarda pontin kanamasına neden olabilir. Ayrıca, kollajenaz beyinde başka yaralanmalara neden olabilir. Diğer model, pons9'aotolog kanın stereotaktik enjeksiyonu ile indüklenmiştir. Bu modelin avantajı, yüksek başarı oranı ile ustalaşmanın kolay olmasıdır. Teorik olarak, araştırmacılar herhangi bir miktarda kanı midillilerin herhangi bir yerine enjekte edebilir. Bununla birlikte, iğne yolundan geri sızıntı nedeniyle, enjekte edilen hacim sınırlıdır. Son zamanlarda, çift enjeksiyon yöntemi geri sızıntıyı azaltmak için teşvik edilmiştir9. Bu yöntem, enjeksiyonlar arasında 20 dakikalık bir aralıkla iki kez otolog kan enjekte eder. Çift enjeksiyon yöntemi hafif (30 μL) ve orta (60 μL) pontin kanamasına neden olmak için uygulanır, ancak masif pontin kanamasına neden olmaz. Klinikte, prognozu zayıf olan pontin kanamalı hastaların çoğunda büyük kanama (10 mL'den fazla) vardır.
Önceki çalışmada, sıçan10'dabir pontin iskemik inme modeli oluşturmak için bir protokol sağladık. Bu çalışmada, mevcut çift enjeksiyon yöntemini değiştiriyoruz ve midillilerin iki farklı yerine 100 μL otolog kanın çift enjeksiyonu ile bir sıçanda masif pontin kanamasına neden olmak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Guangzhou Tıp Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Sıçanlar Güney Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi tarafından sağlandı. Deneysel tasarım Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Hayvan ve aletler
- 250 ± 10 g ağırlığında 8 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanın.
- Sıçanları ameliyattan önce en az 7 gün boyunca 25 °C ortam sıcaklığı, % 65 bağıl nem ve 12/12-h açık-karanlık döngü ile kontrollü çevre koşulları altında barındırın.
- Sınırsız yiyecek ve su sağlayın.
- Aletleri hazırlayın (Şekil 2A-E).
2. Kanı midillilere enjekte edin
- Deneyler için uygun vücut ağırlığına sahip sıçanları seçmek için ameliyattan 3 gün önce sıçanları tekrar tartın.
- Modellemeden önceki 3 gün boyunca, normal sıçanların denge ışınını duraksamadan geçirebilmelerini sağlamak için sıçanları günde 3 kez denge kirişi üzerinde yürümeleri için eğitin.
- Anesteziden önce ısıtma yastığını önceden 37 °C'ye ısıtın.
- Stereotaksik çerçevedeki tutucuya bir mikrodril takın.
- Sıçanlara intraperitoneal olarak 50 mg/ kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin enjekte edin. Parmak sıkışması tepkisi gelene kadar bekleyin.
- Sıçanı stereotaksik çerçeveye eğilimli bir pozisyonda taşıyın. Başı sabitlemek için kulak çubuklarını kulak kanalının üzerine koyun. Enjeksiyonun eğrilmesi önlemek için kafatasını yatay bir pozisyonda sabitlenin (Şekil 2F).
- Giriş ve çıkış portlu stereotaksik burun konisi aracılığıyla izotropalran (%97,5 oksijen ve %2,5 izofluran) ile anesteziyi koruyun.
- Korneayı nemli tutmak için göz merhemini kullanın.
- Kafatasının üstündeki saçları mikro tıraş makinesi ile tıraş edin.
- Şekil 2F'degösterildiği gibi, kafatasında bilateral yanal canthus çizgisinden arka fontanelle'in 0,5 cm arkasına bir işaret kalemi ile 3 cm orta çizgi çizin.
- İşaretli orta çizginin ortasından başlayıp dışa doğru dönen Entoiodine cerrahi ovmayı dairesel bir şekilde uygulayın.
- Cerrahi örtünün yerine yerleştirin.
- İşaretli orta çizgi boyunca neşterle bir kesi yapın.
- Olası kanı çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisi kapağının her iki tarafına bir parça toka yerleştirin (Şekil 2G).
- Bir pamuklu çubuğu% 0.9 saline batırın ve bağ dokularının mikrodrillere yakalanmasını önlemek için bağ dokularını kafatası kemiğinden hafifçe çıkarın.
- Bregma'nın merkezi noktasını bir işaret kalemiyle başlangıç noktası olarak işaretleyin.
- AP-9,0 mm, Lat 0 mm (Şekil 1B ve Tablo 1)bir mikrodril kullanarak kraniyotomi(1 mm çapında) gerçekleştirin. Dikkatli bir şekilde ilerleyin, çünkü bu nokta venöz sinüse çok yakındır (Şekil 2G).
- Mikrodrilleri stereotaksik çerçeveden çıkarın.
- Stereotaksik tutucuya 100 μL Hamilton şırınnası koyun (Şekil 2K). Enjeksiyon pompası anahtarını açın, Hızlı Soluma düğmesine tıklayın, heparin çözeltisini (100 mL salinle seyreltilmiş 12500 U) 100 μL'ye kadar epiratlayın ve ardından kanın çok hızlı pıhtılaşmasını önlemek için tamamen boşaltın.
- Cildi dezenfekte etmek, azgınlığı yumuşatmak ve enjeksiyonun başarı oranını artırmak için kuyruk damarını genişletmek için kökten uca tüm kuyruğa en az 3 kez klorheksidin ve% 75 alkol cerrahi ovma uygulayın.
- 1 mL şırıngal kafa derisi akupunktur takın.
- Kafa derisi akupunkturunu kuyruk ucundan 3 cm uzaklıktaki yanal kuyruk damarına yerleştirin ve 150 μL kan alın(Şekil 2H).
- Kafa derisi akupunkturu 1 mL şırıngal çıkarın.
- Kanı bir tüpe aktarın (Şekil 2I).
NOT: Kanın pıhtılaşmasını önlemek için hızlı bir şekilde aktarın. - Cerrahi eldivenleri değiştirin.
- Geri Çekme modunu seçin, ses seviyesini 100 μL'ye ayarlayın, hızı 200 μL / dak olarak ayarlayın, RUN düğmesine tıklayın, Hamilton şırıngına 100 μL kan emiş (Şekil 2J).
- Dem açma modunu seçin, hızı 1 μL / dak olarak ayarlayın.
- Uç beyin yüzeyinin 9,2 mm altına ulaşana kadar şırınnayı ilerletin (Şekil 1C ve Şekil 2L).
- Çalıştır düğmesine tıklayın, ilk 10 μL kanı 1 μL / dk hızında enjekte edin (Tablo 1).
- Enjeksiyonu durdurun ve kanın subaraknoid alana akmasını önlemek için şırındıcı 20 dakika bekletin.
- Uç beyin yüzeyinin 9,0 mm altına ulaşana kadar şırınnayı geri çek.
- Artık kan tamamen enjekte edilene kadar enjeksiyonu 1 μL / dak'a kadar aynı hızda yeniden başlatın.
- Kan geri akışını önlemek için şırındıcı 10 dakika bekletin.
- Şırınnayı beyinden yavaşça çıkarın.
- Kraniyotomi deliğini kapatmak için kemik çimentosu kullanın.
- Çimento kuruduğunda, yarayı 4-0 poliamid dikiş filamenti ile dikin. 3 veya 4 dikiş diktikten sonra 2-1-1 standart cerrahi düğümleri bağlayın.
- Enfeksiyonu önlemek için, sıçana intraperitoneally penisilin (0.25 mL, 4 mL salin ile seyreltilmiş 80 IU) enjekte edin.
- Sıçanlara butorphanol tartrate (2.5 mg/kg) ile deri altından enjekte edin ve ameliyat sonrası ağrıyı ameliyattan 24 saat sonrasına kadar hafifletmek için enjeksiyonu her 2 saatte bir tekrarlayın.
- Anesteziden tamamen iyileşene kadar sıçanı her 15 dakikada bir gözlemleyin. Kafesin altında bir ısıtma yastığı ile orijinal kafese geri verin. Sıçanın kurban olana kadar yiyecek ve suya ücretsiz erişimini sağlayın.
3. Davranış testleri
NOT: Modellemeden sonra 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14.
- Denge kirişi testi11.
NOT: Bu, özellikle hindlimb'in sensorimotor işlevini incelemek için bir testtir.- Işın (3 cm genişliğinde × 70 cm uzunluğunda) zeminden 20 cm yukarıda olmasını sağlamak için aparat hazırlandı.
- Işın arka ucuna dar bir girişle koyu renkli bir kutu koyun.
- Işından geçmek ve kale kutusuna girmek için sıçanı motive etmek için kullanılan beyaz bir gürültü jeneratörü ve parlak bir ışık kaynağı yerleştirin.
- Hayvan kale kutusuna girdiğinde gürültüyü ve ışığı durdurun. Baş ucundan kale kutusuna (saniyeler içinde) gecikmeyi ve kirişten geçiş sırasında arka plan performansını kaydedin.
- Performans puanını aşağıdaki gibi kaydedin: 0, sabit duruşla dengeler; 1, kirişin tarafını kavrur; 2, 1 hindlimb düşen ile kirişi solar; 3, 2 uzuv düşerek kirişi sokarak veya 60 s'den fazla ışın etrafında döner; 4, ışın üzerinde dengeyi >40 s, ancak düşer; 5, ışın üzerinde dengeyi >20 s, ancak düşer; ve 6, 20 sn < ışın üzerinde dengeleme veya dengeleme girişimi olmadan düşer.
- Uzuv yerleştirme testi
NOT: Uzuv yerleştirme testi, sıçanın sensorimotor işlevini değerlendirmek için 6 parametre ile 3 bağımsız görme, dokunma ve propriyosepsiyon uyaranlarını inceler. Toplam nörolojik fonksiyon skoru 0 ile 12 arasında değişmektedir. Testden önce, sıçan elleçleme için alışkanlık haline verilmelidir.- Sıçanı sırtından tutun ve 10 cm yükseklikten yavaşça masaya yerleştirin. Normalde, sıçan ön ayakları uzatır ve masaya yerleştirir.
- Sıçanı arkadan tutun ve masanın kenarına bakacak şekilde tutun. Ön ayakların reaksiyonları gözlenir. Normal bir sıçan ön ayakları masaya yerleştirir.
- Farenin masanın kenarını kavramasına izin verin. Normal bir sıçan, burun ve burun kıllarının masa kenarına dokunmasını önlemek için çeneyi kullanırdı.
- Sıçanı masaya koyun, sıçanın omzunun arkasına hafif bir yanal basınçla masanın kenarına doğru itin ve ön ayakların ve arka ayakların yerleşimini gözlemleyin. Normal bir sıçan, ön ayakları ve arka ayaklarıyla kenarı kavrarırdı.
- Sıçanı yüzü kenara doğru olacak şekilde masaya yerleştirin ve yavaşça arkadan kenara doğru itin. Normal bir sıçan ön ayaklarıyla kenarı kavrarır.
- Sıçanı sırtını kenara doğru olacak şekilde masaya yerleştirin ve arkadan masanın kenarına doğru itin. Hindlimbs reaksiyon gözlemleyin. Normal bir sıçan, arka ayaklarıyla kenarı kavrarır.
- Ön ayakların veya arka ayakların masa kenarına yerleştirilmesini değerlendirin. Puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0, yerleştirme yok; 1, tamamlanmamış ve/veya gecikmiş yerleştirme; 2, hemen, tam yerleştirme.
- Modifiye Voetsch neuroscore8
NOT: Modifiye Voetsch nöroscore, sensorimotor yeteneğinin vertebrobasiler ölçek puanıdır, 14 parametre içerir: kafa hareketi, aktivite, işitme, ağrı refleksi, kornea refleksi, proprioception, boyun hissi, keşif, daire, eksenel gövde hissi, 4-limb hareketi, forelimb hareketi, tırmanma ve kiriş yürüyüşü. Her parametrenin puanı 0 (tam nörolojik açık) ile 3 (nörolojik açık yoktur) arasında değişmektedir. Toplam nörolojik fonksiyon skoru 0 ile 42 arasında değişmektedir.- Sıçanı masaya yerleştirin (50 cm uzunluğunda × 35 cm genişliğinde) ve beş dakika boyunca hareket etmesine izin verin. Başının spontan hareketini gözlemleyin: tüm boyutlarda hareket eder, 3; bir tarafı tercih eder, 2; sadece 1 tarafa hareket, 1; tek taraflı tarafa esnemiş, 0.
- Sıçanı masaya yerleştirin (50 cm uzunluğunda × 35 cm genişliğinde) ve beş dakika boyunca hareket etmesine izin verin. Etkinlik şu şekilde tanımlanır: tamamen duyarlı, 3; orta derecede duyarlı, 2; en az duyarlı, 1; koma, 0.
- Kraniosaudal daireyi gözlemleyin: iki taraflı döner, 3; 1 tarafı tercih eder, 2; sadece 1 tarafa, 1; 1 tarafa düştü, 0.
- Ön ayak hareketini değerlendirin: eşit ve ikili hareket, 3; hafif asimetri, 2; büyük asimetri, 1; parez, 0.
- 4 uzuv hareketini değerlendirin: eşit ve ikili hareket, 3; hafif asimetri, 2; büyük asimetri, 1; parez, 0.
- Sıçan sabit olduğunda, kulak kepçelerini uyarmak ve ağrı refleksini test etmek için bir kulak sıkışması gerçekleştirin: uyarandan hızlı ve simetrik olarak uzaklaşır, 3; uyarandan yavaşça veya asimetrik olarak uzaklaşır, 2; ağrıya yanıt olarak bir miktar hareket gösterir, 1; Tepki yok, 0.
- Sıçan sabit olduğunda, işitmeyi test etmek için sıçanın vücudunun her iki tarafında bir gürültü yapın: parmaklar ovuşturuyor, 3; parmak şıklat, 2; yüksek sesle alkışlama, 1 ve şaşırtıcı değil, 0.
- Propriyosepsiyonu kontrol etmek için, sıçanın vibrissae'sine sırasıyla her iki tarafa da künt bir çubukla dokunun ve uyarana tepkisini gözlemleyin: dokunmada tepki verin, 3; bir tarafta azalmış reaksiyon, 2; her iki tarafta da azalmış, 1; yok, 0.
- Gövde eksenel hissini değerlendirmek için, sıçanın vücudunun her iki tarafına künt bir çubuk yerleştirin ve uyarana tepkisini gözlemleyin: uyaranlara tempolu ve simetrik reaksiyon, 3; hafif azalmış veya asimetrik reaksiyon, 2; büyük ölçüde azalmış ve asimetrik reaksiyon, 1 ve reaksiyon yok, 0.
- Kornea refleksini test etmek için, sıçanı tutun ve her iki taraftaki korneaya pamuklu çubukla hızlıca dokunun: her iki göz de hızla kapanır, 3; bir tarafta azalmış refleks, 2; her iki tarafta da azalmış, 1; yok, 0.
- Boynun hissini kontrol etmek için, sıçanı tutun ve boyuna dokunmak için künt bir çubuk kullanın: aktif olarak dokunmaya tepki verir, 3; dokunmaya yavaş tepki, 2; büyük ölçüde azalmış reaksiyon, 1; Tepki yok, 0.
- Keşifleri gözlemlemek için açık koyu renkli bir kutu kullanın.
NOT: Kutunun üçte ikisi açık ve açık, geri kalanı ise kapalı ve koyu olmalıdır. 7 cm'lik bir kapı iki bölmeyi birbirine bağlar. - Sıçanı 5 dakika boyunca ışık bölmesine ve ardından karanlık bölmeye 5 dakika daha yerleştirin, hareket etmesine izin verin ve sıçanın aktivitelerini kaydedin. Bir odaya 4 uzuv yerleştirildiğinde, giriş olarak kaydedin. Aşağıdaki gibi puanlar kaydedin: açık ve koyu bölmelere aktif olarak ulaşır, 3; 1 bölmeye ulaşır, 2; sadece uyarandan sonra yavaşça hareket eder, 1; ve hareket yok, 0.
- Tırmanma yeteneğini kontrol etmek için, sıçanı yatay zemine 30 derecelik bir açı ile 20 cm genişliğinde, 70 cm uzunluğunda bir düzlemin altına yerleştirin. Rekor puanlar aşağıdaki gibidir: zirveye tırmanabilir, 3; engelli tırmanışı, 2; sabit kavrama, 1; ve hemen düşer, 0.
- Işın yürüyüşünü incelemek için, sıçanı yerden 20 cm yükseklikteki 3 cm genişliğinde, 70 cm uzunluğunda bir kirişin bir ucuna koyun, aşağıdaki gibi puan kaydedin: tüm kirişi keşfeder, 3; kirişin bir kısmını keşfeder, 2; bazı hareket ve düşmeler, 1; Hareket yok, 0.
- Puanları hesaplayın.
4. MR ile kanama onayı
- MRI taramasını ameliyat sonrası 24 saat olarak yapın.
- Sıçanı izofluran ile uyuşturun (indüksiyon için% 5, bakım için% 1- 1.5).
- Sıçanın kafasını, sadece iletim hacmindeki bir bobinle birlikte sıçan beyin dizisi bobinine sabitleyin.
- Bobini MRI tarayıcısında fareyle birlikte yerleştirin. Sıçanı beşik içinde diş ve kulak çubukları aracılığıyla sabitleyin.
- MRI taraması sırasında sıçanın vücut sıcaklığını 37 ± 0,5 °C'de tutmak için kapalı devre termal ceket kullanın.
- Doğru geometriyi sağlamak için bir pilot sıra gerçekleştirin.
- T2 ağırlıklı taramaları toplamak için hızlı dönüş yankı dizisi uygulayın. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: yankı süresi (TE), 132 ms; tekrarlama süresi (TR), 2.500 ms; satın alma matrisi, 148 × 148; görüş alanı, 100 mm × 100 mm; 12 dilim; 1,5 mm kalınlığında.
- Fareyi kafese geri götür.
5. Brüt anatomiye göre kanama onayı
NOT: Sıçanları belirlenen zaman noktasında, ameliyattan sonra 24 saat ve 14 d'de kurban edin (Şekil 1D).
- Bilinç kaybına kadar sıçanı% 5 izofluran ile uyuşturun. Daha sonra, karbondioksit (CO2)(kafes hacminin dakikada% 20-30'u) ile ötenazi.
- Aşağıdaki işaretleri kullanarak ölümü onaylayın: göğüs yükselme ve düşme yok, hissedilebilir kalp atışı yok, parmak sıkışmasına yanıt yok, zayıf mukoza rengi, renk değişimi veya gözlerde opaklık.
- Servikal çıkık gerçekleştirin.
- Pençeleri steril bir platforma bantlayarak sıçanı sabitleyin. Hipogastrium'u toraks ve karaciğere maruz bırakmak için serviksten bir orta çizgi kesi oluşturun. Köprücük kemiği boyunca üst sternal kenardan en sola doğru yanal bir kesi ve kalbi açığa çıkarmak için diyafram boyunca xiphoidden en sola doğru başka bir yanal kesik yapın. Göğüs kafesi kapağını kaldırın ve bir pim ile platforma sabitlayın.
- Bir iğnenin ucunu (27 G) 4 °C salin içeren bir perfüzyon pompasına bağlayın. Atriyuma girmemek için iğne ucunu sol ventrikülün sol kenarı boyunca kalbe ilerletin. Ucun sol ventrikülde olduğundan emin olmak için perfüzyon pompasını açın, ardından sağ kulakçıkta bir kesik yapın.
- Sağ kulakçık dışına boşaltılan sıvı renksiz hale geldiğinde ve karaciğer beyazladığında perfüzyon pompasını kapatın. Bu prosedür yaklaşık 100 mL 4 °C salin gerekir.
- Farenin kafasını koparın ve makas ve asala tüm beyni toplayın. Şişkin kağıtla beyin yüzeyindeki nemi giderin.
- Tüm beyni 1 dakika boyunca -80 °C'de tutun.
NOT: Beyin donmadan kesilebilirse bu adım atlanabilir. - Beyni, sırt tarafı yukarıdayken koronal sıçan beyin matrisine yatırın.
- Beynin yüzeyindeki deliğe göre kanama merkezine 0,21 mm kalınlığında paslanmaz çelik bir bıçak yerleştirin.
- Diğer bıçakları beyne 2 mm aralıklarla yerleştirin.
- Beyin bölümlerini 4 °C'de 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisinin 10 mL'sinde daldırın. Bunları 0,01 mmol/L fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
- Rostral'dan kaudal'a kadar bölümleri düzenleyin ve görüntüleyin.
6. Parafin bölümü ve hematoksilin ve eozin (HE) boyama
- Beyni oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca% 4 PFA çözeltisi ile sabitlayın. PFA hacmi beyin hacminin 5-10 katı olmalıdır.
- Beyin kanaması merkezinden bıçak ve koronal sıçan beyin matrisi ile iki parçaya bölün.
- Parafin gömülü doku blokları yapın.
- Parafin gömülü doku bloğunu bir mikrotom üzerinde 40 μm kalınlığında slaytlar halinde koronal olarak bölümleyin, kanama merkezinden başlayarak art arda 4 bölüm kesin ve 40 °C'lik bir su banyosunda yüzdürün.
- 40 μm'lik bölümleri (bir beyin için toplamda 8 slayt) temiz cam slaytlara monte edin ve oda sıcaklığında gece boyunca hava kurutun.
- Slaytları 56 °C'de 1 saat pişirin.
- Ksilende 3 dakika yıkayın, 3 kez.
- Bölümleri % 100 etanolde 30 kez, % 100 etanolde 30 kez, % 95 etanolde 30 kez ve% 95 etanolde 30 kez daha daldırın.
- Temiz olana kadar musluk suyunda durulayın.
- Bölümleri Hematoksilin'de yaklaşık 10 dakika daldırın.
- Musluk suyunu temiz olana kadar durulayın.
- Bölümleri 30 sn boyunca eosin lekesi içine daldırın.
- %95 etanol, %100 etanolde 3-4 daldırma, 1 dakika %100 Etanol ve %100 etanol + ksilende 10 daldırma ile susuzluk kayar (1:1).
- Xylene ile bölümleri 1 dakika, 2 kez temizleyin.
- Sulu olmayan montaj ortamı ve kapak kılıfı kullanarak monte edin.
- Havadaki bölümleri oda sıcaklığında gece boyunca kurulayın, sonra sanlayın.
7. İstatistikler
- Öğrencinin t testını veya Mann Whitney U testını hesaplamak için GraphPad Prism 6.0'ı kullanın.
NOT: Tüm veriler SE± ortalama olarak ifade edilmelidir. P<0.05 istatistiksel anlamlı olarak tanımlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontrol için 3, 30 μL için 6, 60 μL için 6 ve 100 μL kan enjeksiyonu için 10 olmak üzere toplam 25 hayvan kullanıldı. Otolog kanın 100 μL enjeksiyonu (1/10) alan bir sıçan ameliyattan sonraki 24 saat içinde öldü.
Davranış testleri ameliyattan sonra 1. gün, 3. gün, 7. gün ve 14. Kontrol grubu ve ameliyat sonrası farklı zaman noktalarında kan enjeksiyon grupları için puanlar Tablo 2'desunulmuştur. Pontin kanaması, kornea refleksinin azalması ve daire çizilme gibi nörolojik eksikliklere neden oldu (Şekil 3B,C). 100 μL kan enjeksiyonu da miyotonia indüklendi (Şekil 3A). Denge kirişi testi, uzuv yerleştirme testi ve modifiye Voetsch nöroscore sonuçları, pontin kanaması hacmi arttıkça nörolojik fonksiyonun azaldığını ortaya koydu.
MRI taraması ameliyattan 24 saat sonra yapıldı(Şekil 4). Kan enjeksiyon gruplarında, T2 dizisinde, kanama, ponların basilar kısmında iso-hafif hiperintense çekirdeğine sahip bir hypointense jant olarak tespit edildi. Diğer beyin bölgelerinde MR ile herhangi bir kanama saptanmıştır(Şekil 4). Otolog kanın enjeksiyon hacmi arttıkça kanama hacmi de artmıştır.
Daha sonra sıçanlar ameliyattan sonra 24 saat ve 14. günde ayrı ayrı kurban edildi ve 2 mm kalınlığında bölümler yapıldı (Şekil 4). Enjeksiyon bölgesini çevreleyen ve pons tabanında dağılan kanama tespit edildi. 100 μL kan enjeksiyon grubunda kanama çevresinde hafif ödem vardı.
Sıçanların bazıları ameliyattan 3 gün sonra kurban edildi ve HE lekeleme yapmak için parafin kesiti yapıldı. Sonuçlar, kan enjeksiyon gruplarında peri-kanama bölgesinde zenginleştirilmiş enflamatuar hücrelerin(Şekil 5C ve F)olduğunu göstermiştir. Hemoglobin bozulmamış kırmızı kan hücrelerinde bulunur (Şekil 5D ve G).
Şekil 1: Pontine kanama modelinin şematik şemaları. (A) Kuyruk damarından otolog kan toplanması. (B) Matkap konumunun şematik diyagramı. (C) Enjeksiyon konumunun şematik diyagramları. (D) Deneysel tasarım. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ameliyat aletleri ve prosedürü. (A) Anestezi makinesi. (B) Cerrahi aletler. (C) Mikrodrill. (D) Mikro enjeksiyon pompası. (E) Stereotaksik aparat. (F) Kafatasının ortasında işaretlenmiş bir çizgi. (G) Sarı ok matkap konumunu işaret eder. (H) Kuyruk damarından kan drenajı. (I) Kanı Eppendorf tüpüne aktarın. (J) Kanı Hamilton şırındına apire edin. (K) Hamilton Şırındını kafatası deliğinden ilerletin. (L) Otolog kanın enjeksiyon işlemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Davranışsal testlerin temsili sonuçları. (A) Bir sıçandaki miyotoni 100 μL otolog kan enjekte etti. (B) 60 μL otolog kan enjekte edilen bir sıçanda sağ taraftaki kornea refleksinin azalması. (C) 100 μL otolog kan enjekte edilen bir sıçanda ikili taraflarda kornea refleksinin azalması. (D) Bir sıçan, lezyonun kontrallateral tarafına daire içine alınmış 60 μL otolog kan aldı. (E) Denge kirişi testinin sonuçları. (F) Modifiye Voetsch neuroscore sonuçları. (G) Uzuv yerleştirme testinin sonuçları. Çizgi, iki grup arasında önemli fark anlamına gelir (p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MRI taraması ve brüt anatomi ile ilgili temsili sonuçlar. MRI taraması (Üst) pontin kanama ameliyatından 24 saat sonra yapıldı, daha sonra sıçanlar kurban edildi ve 2 mm beyin bölümlerine (Alt) kesildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: HE boyamanın temsili sonuçları. Ameliyattan sonra 3 d 100 μL kan enjekte edilen sıçanlardan beyinler alındı. (A) Tüm beyin bölümü. (B) normal pontin bölgesinden, (C) peri-lezyon bölgesinden ve (D) kanama çekirdeğinden düşük alanlar. (E) normal pontin bölgesinden, (F) peri-lezyon bölgesinden ve (G) kanama çekirdeğinden yüksek alanlar. Ölçek çubuğu 100 μm idi.
Şekil S1: Ameliyattan sonraki 14. günde brüt anatominin temsili sonuçları. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| Hafif | ılımlı | büyük | |
| Toplam birim | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| İlk enjeksiyon | |||
| Stereotaktik koordinatlar | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| hacim | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| hız | 1 μL/dk | 1 μL/dk | 1 μL/dk |
| Aralık süresi | 20 dk | 20 dk | 20 dk |
| İkinci enjeksiyon | |||
| Stereotaktik koordinatlar | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| hacim | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| hız | 1 μL/dk | 1 μL/dk | 1 μL/dk |
| İğne çekilmeden önce | 10 dk | 10 dk | 10 dk |
| AP: anteroposterior pozisyon | |||
| Lat: yanal | |||
| Vert: dikey | |||
Tablo 1: Otolog kan enjeksiyonu.
| Fare Numarası | 1. Gün | 3. Gün | 7. Gün | 14. Gün |
| Modifiye Voetsch neuroscore | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Şem-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Şem-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Şem-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Denge kirişi testi | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Şem-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Şem-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Şem-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Uzuv yerleştirme testi | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Şem-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Şem-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Şem-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tablo 2: Davranışsal testlerin sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, büyük bir pontin kanama sıçanı modeli oluşturmak için bir protokol sağladık. Bu model patofizyolojik mekanizma ve masif pontin kanaması prognozu üzerine araştırma için kullanılabilir.
Deney boyunca, sadece biri ölen 25 sıçan kullanıldı. MRI, brüt anatomi ve HE lekelemenin doğrulanması, bu yöntemin çok düşük bir ölüm oranına ve yüksek bir başarı oranına sahip olduğunu gösterdi. Masif pontin kanama modeli oluşturmak için iki sorun çözülmelidir, enjekte edilen otolog kan subaraknoid alana sızma ve iğne yolu boyunca dördüncü ventriküle geri akma eğilimindedir. Mevcut çift enjeksiyonlu orta (toplamda 60 μL otolog kan) pontin kanama modeli ilk sorunu çözdü, subaraknoid alana neredeyse hiç kan aktı. Ancak, hala az miktarda kan akışı vardı. Bu çalışmada, daha büyük miktarda 100 μL otolog kanın geri akış olmadan enjekte edilmesini mümkün kılmak için mevcut çift enjeksiyon yöntemini optimize etmek için çeşitli stratejiler uygulanmıştır. İlk olarak, bir yerine iki farklı enjeksiyon noktası kullanıldı. İkincisi, heparin, kanı sadece enjeksiyon işlemi sırasında pıhtılaşmadan korumak için, ancak enjeksiyondan sonra sızıntıyı ve geri akışı teşvik etmek için yeterli olmamak üzere, dozu azaltmak için şırınnayı minimum artıkla yıkamak için kullanıldı. Üçüncüsü, enjeksiyon süresi uzundu ve enjeksiyon hızı yavaştı, 1 μL / dk. Ayrıca, ilk seferinde sadece az miktarda otolog kan enjekte edilirken, ikinci enjeksiyon 20 dakika sonra yapıldı. Daha sonra, iğne sadece 10 dakika sonra çekildi ve bu prosedür son derece yavaş bir şekilde yapıldı. Bu yöntemi kullanarak, 30 μL veya 60 μL otolog kan enjekte edilen sıçanlarda subaraknoid alana veya dördüncü ventriküle neredeyse hiç kan akmamıştır, ancak 100 μL enjekte edilen sıçanlarda hala az miktarda geri akış vardı. İğneyi çıkarmadan önceki sürenin uzatılması bu sorunu çözebilir.
Davranış testleri, modellemeden sonra 1. Ameliyattan sonraki ilk gün, kan enjeksiyonu gruplarındaki sıçanların neredeyse tamamı, tek taraflı veya bilateral kornea refleksinin kaybolması eşliğinde daire şeklinde (yani sola veya sağa dönme) davranış gösterdi. Pontinin orta çizgisine otolog kan enjekte edilmiş olmasına rağmen, beynin iki tarafına eşit olmayan bir şekilde dağılmıştır. Davranış testlerindeki farklı performansın nedeni bu gibi görünüyordu. 30 μL veya 60 μL otolog kan enjekte edilen sıçanların aktiviteleri ve reaksiyonları normale yaklaştı. 100 μL kan enjekte edilen sıçanlarda sensorimotor fonksiyonları önemli ölçüde zayıfladı ve yanıt zayıftı. Istirahat durumundaki bazı sıçanlarda kas sertliği ortaya çıktı. 1. Gün, 3. gün ve 7. Denge kirişi testi ve uzuv yeri testinde, 30 μL veya 60 μL kan enjekte edilen sıçanlar ile kontrol grubundaki sıçanlar arasında herhangi bir zaman noktasında önemli bir fark yoktu. Bununla birlikte, 100 μL otolog kan enjekte edilen sıçanlarda denge ışını testi ve uzuv yerleştirme testinin sonuçları, 1. ve 3. gün kontrol grubu ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklıydı. Olası neden, denge kirişi testinde ve uzuv yerleştirme testinde, ince nörolojik açıkları keşfedecek kadar hassas olmayan modifiye Voetsch nöroscore'a kıyasla daha az değerlendirme öğesi olması olabilir. Hafif semptomlar gösteren kanama modellerinde davranışı değerlendirmek için bu iki yöntemi kullanmak uygun değildir, ancak masif pontin kanama modelinde uygulanabilir. Genel olarak, modifiye Voetsch nöroscore'un farklı pontin kanama modellerindeki nörolojik fonksiyonları kapsamlı ve doğru bir şekilde değerlendirmek için daha uygun olduğu ortaya çıktı.
Bu yöntemin birkaç avantajı vardır. Önceki çift enjeksiyon yöntemine dayanarak, ikinci enjeksiyon yeri değiştirildi ve heparin dozluğu hafif (30 μL) ve orta (60 μL) pontin kanama modelinde sızıntı ve geri akışı önlemek için ayarlandı. Masif (100 μL) pontin kanama modelinde bile, geri akış çok sınırlıydı ve sadece az sayıda sıçanda meydana geldi. Bu yöntem yüksek başarı oranı ve düşük ölüm oranı ile kolayca yapılabilir. Ayrıca, deneysel pontin kanaması, modellemeden en az 14 gün sonra, tüm hastalık gelişimini ve tedavilerin etkilerini araştırmaya elverişli olan uzun bir süre boyunca gözlenebilir. Bu modelin en büyük ilerlemesi, pontin kanaması olan hastaların semptomlarını taklit ettiğiydi. Klinik olarak, masif pontin kanaması ciddi nörolojik eksikliklerle sonuçlanırken, önceki pontin kanama modellerinde sadece hafif semptomlarla nispeten küçük hemorajik hacim gelişti. Bu modeldeki masif pontin kanaması, pontin kanaması hastalarında kanama dağılımı ile benzer olan bilateral ponlarda dağıtılmaktadır. Önceki deneysel pontin kanama modellerinde, kanama sadece tek taraflı ponlarda bulunur9.
Ancak, bu yöntemin bazı sınırlamaları da vardır. İlk olarak, bu çalışmada pontin kanaması, geçiş sırasında kısmen heparinize edilen ve çevredeki ponlardaki kan pıhtılaşmasını ve hatta homeostazı etkileyebilecek kan enjeksiyonundan kaynaklandı. İkincisi, bu model stereotaksik aparat ve enjeksiyon pompası gibi özel ekipmanlar gerektirir. Üçüncüsü, bu model spontan kanamayı taklit edemez.
Sonuç olarak, bu çalışma sıçanda deneysel bir akut masif pontin kanama modeli oluşturmak için bir yöntem sağlamıştır ve bu da bu alanda yeni mekanik ve terapötik araştırmaları teşvik edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (81471181 ve 81870933) ve Guangzhou Tıp Üniversitesi (0506308) Açılış Laboratuvarı Programı tarafından Y Jiang'a, Çin Ulusal Bilim Vakfı (81701471) ve Guangzhou Belediye Sağlık Komisyonu Bilimsel Programı (20191A011083) tarafından Z Qiu'ya ve Çin Ulusal Bilim Vakfı (81501009) tarafından L Wu'ya finansal olarak desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
