Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

Abstract

רירית המעי מרופד בשכבה אחת של תאי אפיתל היוצרת מחסום דינמי המאפשר הובלה paracellular של חומרים מזינים ומים תוך מניעת מעבר של חיידקים זוהרים וחומרים אקסוגניים. הפרה של שכבה זו גורמת לחמיצות מוגברת לתכולה זוהרת וגיוס של תאי מערכת החיסון, שניהם סימני היכר של מצבים פתולוגיים במעיים כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD).

מנגנונים המסדירים את תפקוד מחסום האפיתל ואת ההגירה הטרנס-אפיתלית (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) אינם מובנים לחלוטין בשל היעדר שיטות ניסיוניות ב- vivo המאפשרות ניתוחים כמותיים. כאן, אנו מתארים מודל ניסיוני מורין חזק המעסיק קטע מעיים חיצוני של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי. לולאת המעי החיצונית (iLoop) היא בעלת כלי דם מלאים ומציעה יתרונות פיזיולוגיים על פני גישות מבוססות תא ex vivo המשמשות בדרך כלל לחקר חלחנות ונדידת PMN על פני מונולי תאים אפיתל.

אנו מדגימים שני יישומים של מודל זה בפירוט: (1) מדידה כמותית של חמיטות מעיים באמצעות זיהוי של dextrans תווית פלואורסצנטיות בסרום לאחר הזרקה תוך אלומינלית, (2) הערכה כמותית של PMN נודד על פני אפיתל המעי לתוך לומן המעיים לאחר הקדמה תוך-אלומינלית של כימותרפיה. אנו מדגימים היתכנות של מודל זה ומספקים תוצאות המשתמשות ב- iLoop בעכברים חסר חלבון הקשור לאפיתל הדוק צומת JAM-A בהשוואה לבקרות. JAM-A הוכח לווסת את תפקוד מחסום האפיתל, כמו גם PMN TEpM במהלך תגובות דלקתיות. התוצאות שלנו באמצעות iLoop לאשר מחקרים קודמים ולהדגיש את החשיבות של JAM-A בוויסות של חדירות מעיים PMN TEpM ב vivo במהלך הומאוסטזיס ומחלות.

מודל iLoop מספק שיטה סטנדרטית מאוד לשחזור במחקרי vivo של הומאוסטזיס מעיים ודלקת וישפר באופן משמעותי את ההבנה של תפקוד מחסום המעי ודלקת ריריים במחלות כגון IBD.

Introduction

רירית המעי מקיפה שכבה אחת של תאי אפיתל מעיים טוריים (IECs), תאי מערכת החיסון הבסיסיים של למינה פרופריה וריריות השרירים. מלבד תפקידו בספיגת חומרים מזינים, אפיתל המעי הוא מחסום פיזי המגן על פנים הגוף מפני חיידקים קומנסליים זוהרים, פתוגנים ואנטיגנים תזונתיים. בנוסף, IECs ותאי חיסון lamina propria לתאם את התגובה החיסונית גרימת סובלנות או תגובה בהתאם להקשר וגירויים. דווח כי ההפרעה של מחסום האפיתל יכולה להקדים את תחילת דלקת רירית פתולוגית ולתרום למחלות מעי דלקתיות (IBD) המקיפה הן קוליטיס כיבית והן מחלת קרוהן1,2,3,4,5,6,7. אנשים עם קוליטיס כיבית מציגים הגירה טרנס-אפיתלאלית מוגזמת (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) היוצרים מורסות קריפטה, ממצא שנקשר לחומרת המחלה8,9. למרות תפקוד מחסום אפיתל נפגע ותגובות חיסוניות מוגזמות הם סימני היכר של IBD, יש חוסר ניסיוני בדיקות vivo לבצע הערכות כמותיות של חדורות מעיים וגיוס תאי החיסון לתוך רירית המעי.

השיטות הנפוצות ביותר המשמשות לחקר חדירות אפיתל מעיים ו- PMN TEpM משתמשות בגישות מבוססות תא ex vivo באמצעות monolayers של חברת החשמל המתרבתים על קרום נקבובי חדיר למחצה מוסיף10,11,12. שלמות מחסום האפיתל מנוטרת על ידי מדידות של התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) או השטף הפאראלי של האיזוטיווציאנאט פלואורסצין (FITC) המסומן על ידי דקסטרן מתא apical לסל13,14,15. באופן דומה, PMN TEpM נחקר בדרך כלל בתגובה כימותרפיה כי הוא הוסיף בתא התחתון16. PMN ממוקמים בתא העליון ולאחר תקופת דגירה, PMN כי היגרו לתוך התא בזאלי נאספים וכימות. בעוד שיטות אלה שימושיות, קלות לביצוע ומאוד ניתנות לשחזור, הן ללא ספק גישות רדוקציוניסטיות ואינן מייצגות בהכרח השתקפות מדויקת של תנאי vivo.

בעכברים, בדיקה נפוצה לחקר חמידות פראלית במעיים היא על ידי gavage אוראלי של FITC-dextran ומדידה לאחר מכן של FITC-dextran מראה בסרום הדם13,17. החיסרון של בדיקת זה הוא שזה מייצג הערכה של שלמות המחסום הכוללת של מערכת העיכול ולא של תרומות מעיים אזוריות. בנוסף, כחול אוונס משמש בדרך כלל להערכת דליפת כלי דם ב vivo18 וגם הועסק כדי להעריך חמלות רירית מעיים בעכבר וחולדה19,20,21. הכימות של כחול אוונס ברירית המעי דורש מיצוי מרקמות המעסיקות דגירה בפורמאמיד בן לילה. לכן, אותה רקמה לא יכולה לשמש לחקר חדירות אפיתל מעיים וחדירת נויטרופילים.

כאן אנו מדגישים פרוטוקול פשוט המפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאיסוף נתונים לשחזור על חלחוביות הרירית המעי הגס ונדידת לויקוציטים טרנספיטהל ב vivo. אנו, אם כן, ממליצים על השימוש FITC-dextrans כי ניתן לזהות בקלות בסרום דם מבלי להתפשר על שלמות לולאות מעיים אשר ניתן לקצור לניתוח נוסף. ראוי לציין, לולאות קשירה מעיים שימשו במינים שונים (כולל עכבר, חולדה, ארנב, עגל) כדי לחקור זיהום חיידקי (כגון סלמונלה, ליסטריה monocytogenes ו Escherichia coli)22,23,24,25, כמו גם חמיצות מעיים26; עם זאת, למיטב ידיעתנו אין מחקרים החוקרים מנגנונים של PMN TEpM באזורים ספציפיים במעי כגון ileum או המעי הגס המעורבים בדרך כלל IBD.

כאן אנו מתארים את מודל לולאת מעי העכבר (iLoop) שהוא שיטת vivo מיקרוכירורגית חזקה ואמינה המעסיקה מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי. מודל iLoop רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר הערכה של שלמות מחסום המעי ו- PMN TEpM על עכברים חיים תחת הרדמה. אנו מדגימים שני יישומים: 1) כימות של רמות סרום של 4 kDa FITC-dextran לאחר ניהול תוך-אלומינאלי ב- iLoop 2) כימות של PMN transmigrated ב- iLoop לומן לאחר הזרקה תוך-אלומינלית של chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. יתר על כן, ניצול מודל iLoop עם עכברים או עכברים או עכברים אועכברים המכילים אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) בהשוואה לעכברי בקרה, אנו מסוגלים לאמת מחקרים קודמים שדיווחו על תרומה משמעותית לחלבון צמוד הקשור לצומת JAM-A לחלחיליות במעיים ולהעברת נויטרופילים15,28,29,30,31.

מודל iLoop הוא שיטה פונקציונלית ופיזיולוגית מאוד שניתן להשתמש בה כדי לאשש במבחנות. יתר על כן, זהו מודל ניסיוני רב-תכליתי המאפשר לחקור ריאגנטים שונים שניתן להזריק ללומן הלולאה, כולל כימותרפיה, ציטוקינים, פתוגנים חיידקיים, רעלנים, נוגדנים וטיפולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ולמדיניות של המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.

1. הכנה טרום הניתוחית

הערה: שיטה זו נוצרה באמצעות עכברים בוגרים מרקע גנטי C57BL/6, בגילאי 8 - 12 שבועות. כל העכברים הוחזקו בתנאים קפדניים של פתוגן ספציפי ללא גישה למזון ומים רגילים. התוצאות התקבלו באמצעות C57BL/6, Jam-a - עכברים ריקים (Jam-a-/-) או עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) ופסולת ג'אם-אfl/fl שולט כפי שתואר בעבר30.

  1. הכנת שטח
    1. בצע ניתוח באזור נקי. מודל לולאת המעי, לעומת זאת, הוא ניתוח לא הישרדות שאינו דורש טכניקה אספטית / סטרילית. יש להקפיד על שיטות תברואה וטרינריות ולהשתמש במכשירים כירורגיים נקיים (כלומר, קרצוף עם סבון, שטוף במים ואחריו 70% אתנול).
    2. הפעל לוח כירורגי מבוקר טמפרטורה (או רפידות חימום) ומקור אור מותאם כדי למנוע מהיפותרמיה במהלך ההרדמה והניתוח.
    3. הכן קשירה על ידי חיתוך מקטעים 6 ס"מ של תפרים כירורגיים 4-0 משי שאינם נספגים.
    4. הכן גזות כותנה (5 ס"מ על 5 ס"מ) החתוכים במרכז בעקבות צורה אליפסואידית. אלה ישמשו כדי לכסות את לפרוסטומיה קו האמצע ולמנוע מגע ישיר בין iLoop חיצוני פרוות בעלי חיים. משרים את הגזות החתוכים בתמיסת מלח מאוזנת חמה של הנקס (HBSS) במיכל צלחת פטרי.
    5. הכן צמר גפן רטוב ספוג HBSS חם שישמש לטיפול באיברים ו- iLoop חיצוני.
    6. הכן מזרק 10 מ"ל מלא HBSS חם ולהתחבר צינור האכלה צהוב. מזרק זה ישמש לחות רקמות חשופות במהלך הניתוח כדי לשטוף בעדינות את iLoop של תוכן צואה.
  2. הכנת בעלי חיים
    1. להרום את החיה בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר. בפרוטוקול זה תערובת של איזופלוריין וחמצן ניתנת באמצעות מאדה הרדמה. על פי הוראות היצרן, להתאים את קצב זרימת החמצן ל 1 L / min. הגדר את האידוי ל -5% וטען מראש את תא האינדוקציה. לאחר 5 דקות, להפחית אידוי איזופלוראן ל 2% - 2.5%.
    2. מניחים את החיה בתא האינדוקציה למשך 3 דקות עד 5 דקות, ולאחר מכן מעבירים את החיה ללוח ניתוח מחומם ומחברים תקע אף הרדמה. לרסן את החיה בתנוחה על ידי ארבעת הגפיים באמצעות סרט הדבקה.
      הערה: כחלופת הרדמה, תערובת של קטמין (80 מ"ג/ק"ג - 100 מ"ג/ק"ג) וקסילאצין (5 מ"ג/ק"ג - 10 מ"ג/ק"ג) מדולל בתמיסת מלח (0.9% NaCl) ניתן לנהל על ידי הזרקה תוך-גופית. הרדמה צריכה להישמר לאורך כל הניתוח על ידי ניהול תוך שרירי של קטמין/ קסילסין (ב 0.1 - 0.25 פעמים של מינונים ראשוניים) כדי להבטיח עומק הרדמה. אם זמין, אידוי הרדמה איזופלורן מומלץ מאוד להבטיח רבייה טובה יותר, שרידות ולמנוע כאב בעלי חיים.
    3. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש קרנית.
    4. בצע בדיקה גופנית הכוללת קצב לב (סביב 500 פעימות / דקה) וקצב, צבע קרום רירי (ורוד), זמן מילוי נימי (< 2 s), קצב נשימה (לא נמוך מ 40 - 60 נשימות / דקה), וטמפרטורה (36 °C (36 °C)32.
    5. לפני שתמשיכו לשלבים הבאים, העריכו את עומק ההרדמה על ידי רפלקס משיכת דוושות. השתמש גירוי כואב (קמצוץ) של העור בין בהונות ו /או רפידות בוהן. העכבר יגיב על ידי התכווצות והסרת רגלו. רפלקס הדוושה הזה נעלם כאשר בעלי החיים הוא מרדים עמוק.
      הערה: ניטור של סימנים חיוניים ורפלקס דוושה מומלץ לאורך כל ההרדמה לכל הפחות כל 15 דקות. הנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) להערכת עומק הרדמה ממליצות ניטור של הדברים הבאים: (א) צבע הזנב, הרגל והריריות (כגון לשון). צבע ורוד כמו נורמלי חיוור או כחול כמעיד על זלוף דם ירד או מצוקה נשימתית; (ב) הערכת דפוס הנשימה כנשימות רגילות לעומת נשימות לא סדירות. בדיקה טמפרטורה רקטלית, oximeter מכרסמים ומוניטורים קצב הלב יכול לשמש להערכת טמפרטורת הגוף, קצב הלב והנשימה, בהתאמה.

2. דור לולאת האיל

  1. הכנת העור: לשפשף פרווה של קו האמצע הבטן עם ספוגיות אלכוהול או ספוג גזה ספוג עם 70% אתנול. אין להרטיב אזור רחב של פרווה עם אלכוהול כדי למנוע היפותרמיה.
  2. באמצעות מספריים, לבצע לפרוסטומיה בקו האמצע. לעשות קיסם אנכי באמצע הבטן (כ 2 ס"מ אורך) ולחשוף את צפק. היזהר לא לפגוע באיברים תוך-בטן.
  3. מניחים גזת כותנה רטובה חתוכה מראש על חלל הבטן החשוף.
  4. השתמש דגימות כותנה רטובה כדי לגייס חיצוני את caecum. מניחים בזהירות את הקקום על גזת הכותנה הרטובה.
    הערה: Caecum הוא מקומי ברביע caudal השמאלי של חלל הבטן ברוב העכברים ללא תלות המין של החיה.
  5. השתמשו בדגימות כותנה רטובות כדי להתגייס ולחוץ בעדינות את האיליום שבו החלק הסופי (קצה דיסטלי) מחובר לקאקום(איור 1B).
  6. לפרוס לפחות 6 ס"מ של ileum מסוף על גזה כותנה רטובה ללא הפרעה של כלי mesenteric ואספקת הדם. אספקת הדם נשמרת אם אין דימום והרקמה שומרת על צבעה הוורוד(איור 1B).
    הערה: הימנע ייבוש של רקמות חשופות על ידי שמירה על רקמות לחות בכל עת עם HBSS חם (כל 2 - 3 דקות) באמצעות מזרק 10 מ"ל מחובר צינור האכלה צהוב (שלב 1.1.6).
  7. קרוב לקאקום, זהה את העורק הראשי המספק את האיליום במזנטריה. לאחר מכן אתר שני אתרי קשירה במזנטריה נטולי כלי דם קריטיים.
  8. באמצעות מלקחיים רקמה קהה, בחוזקה לתפוס את ileum מסוף (הקרוב ביותר caecum) ושימוש מלקחיים קצה עדין, fenestrate mesentery הימנעות כלי הדם. מניחים תפר משי על פני הניקוד וקושרים קשר כירורגי כדי ליצור את הקשירה הראשונה (קצה דיסטלי של הלולאה).
  9. השתמש בסרגל כדי למדוד 4 ס"מ מהקשירה הראשונה וליצור את הקשירה השנייה (הקצה הפרוקסימלי של הלולאה) כאמור בשלב 2.8 (איור 1C).
  10. עם מספריים עדינים חתוכים בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד את לולאת ileal 4 ס"מ, שמירה על אספקת דם שלמה ממברנה mesenteric.
    הערה: לחתוך את שני הקצוות של החלק החיצוני של iLoop, ולאחר מכן לשטוף בעדינות כצעד הכרחי המונע הפרעה עם תוכן זוהר (חומר צואה), ובכך להקל על פיזור אפילו של FITC-dextrans או גירויים כימיים לאורך כל המקטע המבודד, כמו גם המאפשר כימות מדויק יותר של לויקוציטים על ידי ציטומטריית זרימה. הליך זה מאפשר גם התנערות אחידה של הרירית לאחר הזרקת כרכים מוגדרים של ריאגנט ושחזור טוב יותר בין בעלי חיים.
  11. שטף בעדינות את התוכן של מקטע לולאת ileal עם HBSS חם באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מ"ל (ראה שלב 1.1.6).
  12. ליגת את שני הקצוות החתוכים של לולאת האילול הסמוקה באמצעות תפר משי.
  13. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G לאט להזריק 250 μL של ריאגנט כגון FITC-dextrans (שלב 4.2) או chemokine (שלב 5.3) לתוך לומן המעי. לולאת האיליאל תנפח ותגרום להתנפחות מתונה של הרירית (איור 1D).
    הערה: הזריקו ריאגנט ללולאה לומן בצד הנגדי של העורק המזנטרי. היזהר לא לשלוף את לולאת ileal מן החיה תוך הזרקה כדי למנוע קריעת כלי הדם ולעורר דימום.
  14. בעזרת צמר גפן רטוב, החזירו בעדינות את לולאת האילול, האילאום הפרוקסימלי והקאקום.
  15. השתמש מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה כדי לסגור את דופן הבטן.
  16. מניחים את החיה בתא הרדמה מווסת טמפרטורה לתקופת הדגירה.

3. יצירת לולאת המעי הגס הפרוקסימלית (pcLoop)

הערה: לקבלת פרטים אודות עכברים ששימשו ליצירת pcLoop, עיין במידע שסופק בתחילת סעיף הפרוטוקול.

  1. בצע את שלבים 2.1. - 2.4. כפי שתואר לעיל עבור לולאת ileal.
  2. בעזרת צמר גפן רטוב, יש לחוץ את האיליום כולו ומניחים אותו על גבי גזת כותנה רטובה. זהה את המעי הגס הפרוקסימלי ואת אספקת הדם הממוקמת במזוקולון. גייסו את המעי הגס הפרוקסימלי ובאמצעות מלקחיים עדינים יוצרים את הקשירה הראשונה באזור נקי מכלים במזוקולון במהירות של כ-0.5 ס"מ מהקקום(איור 2B).
  3. מדוד 2 ס"מ מהקשירה הראשונה וצור קשירה שנייה באזור נקי מאספקת דם במזוקולון(איור 2C).
  4. באמצעות מספריים עדינים לחתוך בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד pcLoop באורך 2 ס"מ.
    הערה: כפי שהוזכר בפתק תחת שלב 2.10, חשוב לחתוך את שני הקצוות כדי לבודד pcLoop כי הוא ניקה בעדינות של תוכן זוהר. לחתוך בזהירות דרך הרקמה המעי הגס mesocolon כדי למנוע כלי קטן מדימום לתוך לומן המעי. במידת הצורך, השתמש בכרוה תרמית כדי להגביל את הדימום באתר החתכים.
  5. יש לשטוף בעדינות את ה-pcLoop עם HBSS חם כדי להסיר צואה באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מ"ל (ראה שלב 1.1.6).
  6. ליגט את שני קצות החתכים של pcLoop הסמוק באמצעות תפר משי.
  7. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30G לאט להזריק 200 μL של ריאגנט כגון FITC-dextrans (שלב 4.2) או chemokine (שלב 5.3) לתוך לומן המעי. ה- pcLoop יתנפח ויגרום להתנפחות מתונה של הרירית (איור 2D).
    הערה: הזריקו את ריאגנט ל-pcLoop לומן בצד הנגדי של העורק המזנטרי. להבטיח עקביות בין בעלי חיים וליצור pcLoop באורך 2 ס"מ כדי להבטיח התנערות שווה של הרירית.
  8. השתמש בטפטוף כותנה רטוב כדי להחזיר בעדינות את ה- pcLoop, האילול והקקום המסונפים לחלל הבטן.
  9. השתמש מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה כדי לסגור את דופן הבטן.
  10. מניחים את החיה בתא הרדמה מווסת טמפרטורה לתקופת הדגירה.

4. הערכה כמותית של חלחיליות מעיים: 4 kDa FITC-dextran assay

  1. בצע לולאת ileal או pcLoop (כמתואר לעיל).
  2. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, להזריק לתוך לומן המעיים או 250 μL (ileum - שלב 2.13) או 200 μL (המעי הגס - שלב 3.7) של 4 kDa FITC-dextran פתרון (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS). שמור על פתרון FITC-dextran שאינו בשימוש מוגן מפני אור כדי להכין את העקומה הסטנדרטית לאחר איסוף הסרום.
  3. עבור לולאת ileal בצע את השלבים 2.14 עד 2.16, עבור pcLoop שלבים 3.8 עד 3.10. בקצרה, לשים איברים ו iLoop בחזרה במקום לתוך חלל הבטן, לסגור את דופן הבטן.
  4. מניחים את החיה במשך 120 דקות בתא הרדמה מחומם.
  5. לאחר תקופת הדגירה לפתוח את דופן הבטן, לקבל גישה ללב ולבצע ניקוב לב באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G כדי לאסוף את הדם. מעבירים דם לצינור הפעלה של קריש דם בסרום 1.3 מ"ל, מערבבים בעדינות ושומרים על קרח מוגן מפני אור. לאסוף לפחות 500 μL של דם לעכבר.
    הערה: בעלי חיים מורדמים כאשר הם נמצאים תחת הרדמה באמצעות שיטה פיזית כגון עריפת ראש או נקע צוואר הרחם, ובהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שאושר.
  6. צינור מפעיל קרישת סרום צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x גרם בטמפרטורת החדר על פי המלצות היצרן. לאסוף את הסרום (supernatant) ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל. שמור את הצינור על קרח ומוגן מפני אור.
  7. כימות פלואורסצנטיות בסרום דם
    1. הכן עקומה סטנדרטית של FITC-dextran 4 kDa בסרום של עכברי בקרה (מלוחים או HBSS היא חלופה תקפה). צור דילול טורי כפול עם ריכוז התחלתי של 1 מ"ג / מ"ל FITC-dextran. FITC-dextran 4 kDa ריכוזים הנמדדים בטווח שבין 0.25 מ"ג /מ"ל ו 2 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. העבר נפח שווה של המדגם והסטנדרטים ללוח שחור 96-באר (תחתון שטוח) ולמדוד FITC בקורא לוחות פלואורסצנטי (עירור 490 ננומטר, פליטה 520 ננומטר), על פי הוראות היצרן ופרוטוקולים שפורסמו33. חשב את ריכוז FITC בהתבסס על העקומה הסטנדרטית או ערכי החמיאות הנוכחיים כקיפול-שינוי מנורמל לקבוצת הביקורת הניסיונית.

5. הערכה כמותית של PMN נודד לתוך לומן המעי לאחר גירוי תוך אלומינלי עם כימותרפיה

הערה: מעט מאוד PMN מתגוררים ברירית המעיים ברמה הבסיסית. טיפול מקדים בבעלי חיים עם ציטוקינים פרו דלקתיים גורם לסביבה דלקתית המאפשרת גיוס PMN ממחזור הדם אל רירית המעי.

  1. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, לבצע הזרקה intraperitoneal (i.p.) של פתרון סטרילי של 100 ננוגרם של פקטור נמק הגידול α (TNFα) ו 100 ננוגרם של אינטרפרון-γ (INFγ) ב 200 μL של פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
  2. לאחר 4 - 24 שעות של טיפול מקדים עם ציטוקינים פרו דלקתיים, לבצע לולאה ileal או pcLoop (כמתואר לעיל).
  3. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G, להזריק לתוך לומן המעיים או 250 μL (ileum - שלב 2.13) או 200 μL (המעי הגס - שלב 3.7) של פתרון chemoattractant Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM ב HBSS.
    הערה: Leukotriene B4 (LTB4) משמש בפרוטוקול זה כמו כימותרפיה חזקה עבור PMN. כימותרפיה אחרת כגון N-פורמילמתיניל-לאוסיל-פנילאלנין (fMLF) או כימוקין (מוטיב C-X-C) ליגנד 1 (CXCL1/KC) יכולים לשמש גם כדי לגרום לגיוס משמעותי של PMN לתוך לומן המעי הגס30.
  4. עבור לולאת ileal בצע את השלבים 2.14 עד 2.16. עבור pcLoop בצע את השלבים 3.8 עד 3.10. בקצרה, לשים איברים ו iLoop בחזרה במקום לתוך חלל הבטן, לסגור את דופן הבטן.
  5. מניחים את החיה במשך 60 דקות בתא הרדמה מחומם.
  6. אוסף תוכן לולאת המעי
    1. הכן פתרונות ואחסן על קרח: עבור לולאת ileal ו- pcLoop, הכינו מאגר כביסה המכיל 2 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) ו-2% FBS ב-PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום.
    2. לאחר תקופת הדגירה ותחת תחזוקת הרדמה, פתחו את דופן הבטן ושלפו את ה-iLoop (לולאת ileal או pcLoop). המת חסד בעלי חיים כאשר הם תחת הרדמה באמצעות שיטה פיזית כגון עריפת ראש או נקע צוואר הרחם, ובהתאם לפרוטוקול בעלי החיים המאושר.
    3. יש לשטוף את הלולאה עם PBS קר כדי להסיר כל שאריות זיהום דם ולספוג עודף PBS עם מגבונים רקמה. בזהירות לאסוף את תוכן הלולאה לתוך צינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל (כ 250 μL עבור לולאה ileal ו 200 μL עבור pcLoop). לשטוף את הלולאה עם חוצץ לשטוף קר 500 μL, מיד לאחר האיסוף, למקם את הצינור על קרח.
      הערה: DTT מסייע להמסת ריר. אם תוכן זוהר iLoop הוא מאוד צמיג (בהתאם לרקע הגנטי של העכבר), לדלל אותו 1:2 או 1:3 עם מאגר לשטוף המכיל DTT.
    4. להעביר את פתרון התוכן הזוהר דרך מסנן רשת ניילון 35 מיקרומטר באמצעות צינור עגול 5 מ"ל עם כובע מסננת תא. שלב זה מסייע בהסרת שברי רקמות וצבירים של תאים. לשטוף את מסננת התא עם 1 מ"ל של חוצץ לשטוף.
    5. צינור צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). להשליך supernatant, לשטוף גלולה עם 500 μL - 1 מ"ל לשטוף חוצץ, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות, 4 °C (4 °F).
    6. גלולה של תאי אור iLoop resuspend ב 200 μL של חוצץ ציטומטריית זרימה (FCB) המכיל 2% FBS ב- PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום. תאים יכולים להישמר בצינור או מועברים לצלחת תחתונה עגולה 96 היטב עבור כתמים ציטומטריה זרימה וניתוח.
  7. כתמים וניתוח ציטומטריה של זרימה
    1. בקרת פיצוי: תאי דם לבנים
      1. הכן מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G מלא מראש עם סטרילי 0.5 M EDTA (pH 8.0). 10% EDTA לכל נפח דם צפוי (100 μL של EDTA עבור 1 מ"ל דם).
      2. לאסוף דם תחת הרדמה על ידי ניקוב לב. להעביר דם לתוך צינור 1.7 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות, 4 °C (7 °F).
        הערה: בעוד העכבר נמצא תחת הרדמה להשתמש בשיטה פיזית כדי לאשר מוות בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים שאושר (כגון נקע צוואר הרחם).
      3. שאף את סופר-טבעי. Resuspend הכדור ב 1 מ"ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן(ACK) חוצץ תמוז עבור תמוז של תאי דם אדומים. דגירה במשך 3 דקות - 5 דקות על קרח. צנטריפוגה 400 x גרם למשך 5 דקות, 4 °C (70 °F). אם הכדור עדיין אדום, חזור על שלב חיץ תמוז ACK זה עד שהכדור יהפוך ללבן.
      4. resuspend הכדור ב 1 מ"ל FCB צלחת 0.5 x 106- 1 x 106 של תאים לבאר. הכינו חמש בארות של צלחת עגולה 96 היטב. מניחים את הצלחת על קרח.
        הערה: השתמש באותה צלחת של 96 באר המכילה את התוכן הלומינלי של הלולאה (ראה שלב 5.6.6).
    2. כתמי ציטומטריה של זרימה
      1. צנטריפוגות צלחת 96-באר במשך 5 דקות ב 400 x גרם,4 °C (70 °F). להשליך את supernatant ו resuspend הכדורים עם 50 μL של CD16/CD32 עכבר מטוהרים כמו בלוק Fc (1 מיקרוגרם לכל 100 μL של FCB). דגירה במשך 5 דקות - 10 דקות על קרח.
      2. חיסון של התוכן הזוהר iLoop: הכן תערובת המכילה את כל הנוגדנים מצומדים פלואורוכרום (1:50 דילול ב- FCB): אנטי CD45-PerCP, אנטי CD11b-PE ואנטי-Ly-6G-Alexa Fluor 647. הוסף 50 μL של השילוב לכל באר, עבור נפח סופי של 100 μL.
      3. חיסון של תאי הדם הלבנים לפיצויים (1:50 דילול ב- FCB): השתמש ב- 50 μL של FCB בלבד (מדגם לא מזוהם, ובכן 1), 50 μL של כל נוגדן מצומד פלואורוכרום בודד (בארות 2 - 4), 50 μL של השילוב של כל הנוגדנים מצומדים פלואורוכרום (טוב 5). נפח סופי של 100 μL.
      4. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות על קרח מוגן מפני אור.
      5. צנטריפוגות את הצלחת במשך 5 דקות ב 400 x גרם,4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ולשטוף עם 200 μL של FCB. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
      6. הוסף FCB 150 μL / באר לדגימות הדם.
      7. הוסף 100 μL / גם FCB לדגימת התוכן הזוהר iLoop. ואז 50 μL / באר של חרוזי ספירה פלואורסצנטיים.
    3. ניתוח ציטומטריית זרימה
      1. שער לאירועים חיוביים CD45 ולביטוי של Ly-6G-/Gr-1 ו- CD11b30.
      2. השתמש ב- 100 μL של אמצעי האחסון לדוגמה כתנאי עצירה.
      3. חשב את המספר המוחלט של PMN שהועבר ל- iLoop lumen בעקבות המידע שסופק על ידי היצרן של חרוזי ספירה פלואורסצנטיים.
        הערה: הנתונים עשויים להיות מוצגים כ -(1) המספר הכולל של PMN בלומן30,34,35, (2) מספר PMN לגרם של רקמה וכן (3) מספר PMN למ"מ3 באמצעות הנוסחה לנפח של גליל: V = π(pi) r 2 שעות (V עבור נפח, r עבור רדיוס ו- h לגובה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצוג סכמטי של דגמי לולאת ileal ו- pcLoop מתואר באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. התמונות האנטומיות מציגות את השלבים הקריטיים של ההליך, כולל חשיש של מקטע המעי (איור 1B ואיור 2B),זיהוי מיקום מתאים לקשירות המאפשר הפרעה מינימלית באספקת הדם (איור 1C ואיור 2C) וניקוי ואחריו קשירה של קצות חתוכים של ה- iLoop שניתן למלא בתמיסת ריאגנט (איור 1D ואיור 2D). חשוב לציין, מודל iLoop משמר אספקת דם חיונית ומאפשר ספיגה פיזיולוגית של ריאגנטים יישומיים כגון FITC-dextrans או LTBכימותרפיPMN חזק . בסוף ההסתערות, יש לנפח את ה-iLoop (כפי שניתן לראות באיור 1D ובאיור 2D)ולהציג זלוף ריר רגיל עם כלי מזנטריים בצבע אדום בוהק. בהתאם לבדיקה, דם נאסף כדי למדוד FITC-dextran בסרום או תכולה זוהרת iLoop מעובדים לכימות של PMN TEpM לפני המתת חסד החיה.

על מנת לאמת את הדיוק של מודל iLoop להערכת חמילות מעיים, FITC-dextran pcLoop assay בוצע כדי להעריך את התפקיד של חלבון הקשורים TJ JAM-A ברגולציה של תפקוד מחסום המעי ב vivo. ראוי לציין, דווח כי חוסר JAM-A להוביל חדורות מעיים אפיתל מוגבר במבחנה28 ואחרי gavage אוראלי ב vivo29. בזאת, באמצעות דגם pcLoop, עלייה של פי 2.5 ברמות סרום FITC-dextran 4 kDa היה כימות ג'אם -עכברים ריקים (Jam-a-/-) לעומת פקדים (Jam-a+/+) (איור 3A)30. יתר על כן, תוצאות דומות התקבלו עם עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (ויללין-cre; Jam-a fl/fl) בהשוואה לבקרות המלטה(Jam-a fl/fl)(איור 3B)30. לכן, מודל pcLoop היה מסוגל לאשש מחקרים קודמים שדיווחו על תרומה חיובית עבור JAM-A לתפקוד מחסום המעי.

לאחר מכן מודל pcLoop הועסק כדי ללמוד גיוס PMN לתוך רירית המעי ו TEpM הבאים ב vivo. כפי שמוצג באיור 4A, מספר PMN בתוכן הזוהר של pcLoop היה מכומת על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. PMN הוגדרו כתאים חיוביים עבור כל אחד מיצרני פני התא CD45, CD11b ו- Ly6G36. תאי דם לבנים במחזור שימשו כשליטה חיובית לאסטרטגיית הגינגינג. כצפוי, מספר PMN הנוכחי בפלח של המעי הגס הפרוקסימלי דומה pcLoop היה נמוך בתנאים פיזיולוגיים (איור 4B). טיפול מקדים עם ציטוקינים פרו דלקתיים TNFα ו- IFNγ לפני הניתוח הביא למספרים מוגברים של PMN שגויסו ב- pcLoop lumen. הממשל של ה-PMN chemoattractant LTB4 הוביל לעלייה דרמטית בספירות PMN התומכות בגיוס PMN תלוי LTB4(איור 4B). כתמים אימונוהיסטוכימיים של PMN ברירית המעי הגס מאששים את הגיוס הגבוה של PMN בעקבות גירוי עם ציטוקינים ו- LTB4 בהשוואה לטיפול ציטוקינים ללא LTB4 (איור 4C)30. מודל pcLoop הועסק כדי ללמוד את התרומה של JAM-A ל- PMN TEpM באמצעות ויללין-cre; עכברי ג'אם- fl/fl. אובדן של אפיתל JAM-A הוביל למספר מופחת של PMN transmiged בלומן המעי הגס לעומת פקדי המלטה (איור 4D)30. ממצאים אלה תומכים מאוד בתפקיד עבור JAM-A בסיוע להגירת PMN על פני אפיתל המעי ומספקים תובנות משלימות למחקרים שדיווחו על מעורבות של JAM-A בנדידת PMN על פני אנדותל וסקולרי במודלים שונים של דלקת31,37,38.

Figure 1
איור 1: מודל לולאת האיליאל. (A)מבט כולל סכמטי על מודל לולאת ileal. לפרוסטומיה חציונית מבוצעת על עכברים תחת הרדמה ומונחת על לוח ניתוח מבוקר טמפרטורה. (ב)חיצוניות של caecum (*), אילום ו mesentery. שני אתרים מתאימים לקשירה מזוהים (1,2). (C)בודד קטע באורך 4 ס"מ: הקשירה הראשונה (1) ממוקמת קרוב לצומת האילו-קאקל וקשירה שנייה (2) ממוקמת במרחק של 4 ס"מ מהקשירה הראשונה. (D)שני חותכים קטנים נעשים במנסנטריה (1, 2) כדי ליצור לולאת אילאל באורך 4 ס"מ. לאחר הסרת תוכן זוהר וקשירה של קצות חיתוך, ריאגנטים כגון סמנים פלואורסצנטיים וכימותרפיה ניתן להזריק לתוך לומן. לולאת ileal הוא כלי דם היטב (ראשי חץ שחורים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מודל לולאת המעי הגס הפרוקסימלי. (A) סקירה סכמטית של דגם pcLoop. לפרוסטומיה חציונית מבוצעת על עכברים תחת הרדמה המונחת על לוח ניתוח מבוקר טמפרטורה. (B)חיצוניות של caecum (*), המעי הגס הפרוקסימלי, מסוקולון ו ileum. שני אתרים מתאימים לקשירה מזוהים (1,2). (C)הקשירה הראשונה (1) ממוקמת קרוב לקאקום וקשירה שנייה (2) ממוקמת 2 ס"מ יותר דיסטלי מהקשירה הראשונה. (D)ה- pcLoop חיצוני, מנוקה מתכולה זוהרת ומנופח עם ריאגנטים כגון סמנים פלואורסצנטיים וכימותרפיה. ה- pcLoop הוא קטע 2 ס"מ בעל כלי דם של המעי הגס הפרוקסימלי (ראשי חץ שחורים מצביעים על אספקת דם). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: JAM-A מווסת את חדירות המעיים ב- vivo. (A)מחסורב- JAM-A ( Jam-a-/-) הוביל לחדירות מעיים מוגברת ל- 4 kDa FITC-dextran. Jam-a-/- (13x בעלי חיים; נקודות שחורות) הושוו לבקרות Jam-a+/+ (12x בעלי חיים; נקודות לבנות). 4 kDa FITC-dextran (1 מ"ג /מ"ל) ב HBSS הוזרק לתוך לומן pcLoop. פלואורסצנטיות נמדדה בסרום דם לאחר תקופת דגירה של 120 דקות. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעי ± SEM; n = 3 ניסויים עצמאיים. ****P < 0.0001; מבחן מאן-וויטני יו. (B)חמידות מעי גסה מוגברת ל- 4 kDa FITC-dextran בווילין-cre; Jam-afl/fl (18x בעלי חיים, נקודות שחורות) בהשוואה לבקרות(Jam-afl/fl,12x בעלי חיים, נקודות לבנות). נתונים הם אמצעי ± SEM; n = 4 ניסויים עצמאיים. ****P < 0.0001; מבחן מאן-וויטני יו. נתון זה שונה מפלמינג S, לואיסינט AC ואח'30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: JAM-A מקדםגיוסLTB 4 -תלוי PMN ללומן של pcLoop. (A)אסטרטגיית גטינג לכימות PMN (CD45+, CD11b+, ו Ly-6G / Gr1+ תאים) בתוכן זוהר על ידי ציטומטריית זרימה עם חרוזי ספירה פלואורסצנטיים. לויקוציטים מדגימות דם שימשו כשליטה חיובית לאסטרטגיית הג'יטינג. (B)מספר PMN שגויסו ל- pcLoop lumen לאחר ציטוקינים (TNFα+IFNγ, 100ng כל אחד) טיפול (10x בעלי חיים; נקודות לבנות) או לאחר שילוב של ציטוקינים ו 1 nM LTB4 (10x בעלי חיים; נקודות שחורות). ריבועים שחורים מייצגים את מספר PMN בבסיס כפי שהוערך במקטע המעי הגס שלם זהה באורך ל- pcLoop שלא היה נתון לשום ניתוח או טיפול עם ציטוקינים proinflammatory ו LTB4 (9x בעלי חיים). נתונים הם ממוצע ± SEM (n = 3 ניסויים עצמאיים), מבחן Kruskal-Wallis עם מבחן ההשוואה המרובה של דאן. *P < 0.05, ****P < 0.0001. (C)כתמים אימונוהיסטוכימיים של PMN (נוגדן אנטי Ly6G / Gr1) באפיתל של pcLoop לאחר טיפול עם ציטוקינים לבד (פאנל שמאלי, TNFα +IFNγ) או שילוב של ציטוקינים ו- LTB4 (פאנל ימני). מספר PMN שגויס ב pcLoop גדל בנוכחות LTB4 (ראשי חץ שחורים). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (D)מספר PMN שגויסו ב- pcLoop lumen בווילין-cre; עכברי ג'אם-א-פל (11x בעלי חיים; נקודות שחורות) בהשוואה לעכברי ג'אם-א-פל/fl (10x בעלי חיים; נקודות לבנות) בתגובה ל-1 ננומטר LTB4. נתונים הם אמצעי ± SEM; n = 3 ניסויים עצמאיים. *P < 0.05; מבחן סטודנט בעל זנבות. נתון זה שונה מפלמינג S, לואיסינט AC ואח'30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המנגנונים האחראים על dysregulation של תפקוד מחסום המעי וגיוס תאי מערכת החיסון בתנאים פתולוגיים כגון IBD אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מפרטים מודל חזק ב vivo murine אשר מעסיק קטע מעיים חיצוני היטב של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי ומאפשר הערכה של חדירה במעיים, מחקרי הגירה נויטרופילים, כמו גם יישומים אחרים.

ה- iLoop הוא ניתוח ללא התאוששות המתבצע על בעלי חיים חיים. הרדמה חייבת להיות במעקב רציף במהלך הניסוי והערכה של עומק הרדמה היא חובה. הצעדים הקריטיים ביותר כוללים (1) בידוד של iLoop, (2) קשירה של קצות לחתוך, ו, (3) האינפלציה של iLoop על ידי הזרקה תוך-לומינלית של פתרון ריאגנט. בכל אחד מהצעדים האלה, דימום יכול להתרחש, להתפשר על אספקת הדם של iLoop ומשפיע על הדיוק של התוצאות. שימו לב, במקרים נדירים של דימום תוך-תאי במהלך בדיקת PMN TEpM, אסטרטגיית הגיטינג של ציטומטריית הזרימה המוצגת כאן תסייע להבחין בין PMN טרנסגרסי ל- PMN שמקורו ישירות ממחזור הדם (PMN שאינו נודד). PMN transmigrated שנאסף ב- iLoop לומן מבטא רמות גבוהות של סמן פני השטח CD11b10 בהשוואה ל- PMN במחזור (איור 4D).

בהתחשב בכך iLoop מאפשר ניתוחים כמותיים של חלחול מעיים נדידה של PMN דם לתוך לומן המעי, חשוב לתקנן את גודל אזור האיריות סופג ואת אספקת הדם. על מנת להבטיח עקביות בין בעלי חיים, חיוני כי אורך נכון של קטע מעיים הוא חיצוני. ה- iLoop צריך להיות 4 ס"מ עבור לולאת ileal ו 2 ס"מ עבור pcLoop ולהיות perfused על ידי אספקת דם דומה. חוסר עקביות בפרמטרים אלה יגרום גם להתפכחות לא שוויונית של ה- iLoop לאחר הזרקה תוך-אלומינלית של ריאגנטים ושונות מוגברת בין קבוצות ניסוי. יתר על כן, כדי למנוע התנפחות יתר של iLoop, אנו ממליצים כי לא יותר מ 250 μL של פתרון ריאגנט להיות מוזרק בלומן עבור לולאת ileal ו 200 μL עבור pcLoop, בהתאמה.

ישנן כמה מגבלות הטמונות באופי ההליך. ה- iLoop הוא ניתוח ללא התאוששות המתבצע על בעלי חיים חיים. זוהי שיטה מיקרו-כירורגית מאתגרת מבחינה טכנית; עם זאת, כוח אדם יכול לרכוש מיומנויות כירורגיות באמצעות תרגול. משך הניתוח הממוצע צריך להיות קצר (מקסימום 15 דקות). אנו ממליצים על 120 דקות כזמן דגירה אידיאלי למדידת חלחיליות מעיים ו 60 דקות עבור PMN TEpM. זמני הדגירה יכולים להיות מופחתים, אבל נקודות זמן ממושכות עשויות להשפיע על המצב הדלקתי הכולל של החיה תחת הרדמה. בנוסף, הפרוטוקול מתחילת ההליך הכירורגי ועד איסוף / ניתוח לדוגמה לא ניתן להשהות.

מודל iLoop זה מציג יתרונות מרכזיים ביחס לשיטות הקיימות: (1) ה- iLoop הוא בעל כלי דם מלאים ורלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, (2) בניגוד לשיטת gavage אוראלי שמעריכה את שלמות מערכת העיכול הכוללת ותלויה בתנועתיות במערכת העיכול13, ה- iLoop מאפשר לחקור את המאפיינים של אזורים מקומיים ספציפיים במעי (אילום סופני או מעי גס פרוקסימלי) המעורבים בדרך כלל ב- IBD, (3) iLoop הוא הראשון במודל vivo המאפשר את המחקר הכמותי של PMN TEpM לתוך לומן המעיים, כמו גם חלקים אחרים של mucosa המעי, כולל lamina propria ופלגים אפיתל30,35. ניתן להשתמש dextrans FITC במשקל גבוה לעומת נמוך FITC (4 עד 150 kDa) כדי להעריך הן סלקטיביות גודל ו /או חומרה של פגמים מחסום אפיתל בנוקאאוט / לדפוק-in עכברים או מודלים ניסיוניים שונים כולל, אך לא רק, דלקת מעיים. בנוסף, ניתן לכמת dextrans המסומנים על ידי FITC באיברים אחרים כגון הכבד39 או כגישה חדשנית למחקרים על מחסום הדם במוח המספק תובנות על תפקיד חמידות המעיים בצירי המעיים ובטן-מוח40,41,42. יתר על כן, שיטה זו מציעה את האפשרות לבצע שתי לולאות במקביל (לולאת ileal ו pcLoop באותה חיה) ולהחדיר שתי בדיקות פלואורסצנטיות שונות עבור ניתוחים של תכונות מחסום באזורים נפרדים במעי. לאורך קווים דומים, ייצור של שתי לולאות במקביל ניתן להשתמש כדי להעריך באופן ספציפי ileum לעומת המעי הגס עבור הבדלים או קווי דמיון בגיוס של תאי מערכת החיסון בתגובה לאותו ריאגנט.

כאן, באמצעות pcLoop עם עכברים או עכברים ג'אם-א-nullמחסה אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl), אנו מאששים ממצאים ממחקרים קודמים שדיווחו על תפקיד חיובי לחלבון הקשור ל- TJ JAM-A בחלחוביות במעיים ו- PMN TEpM. היישומים של iLoop ניתן להרחיב ריאגנטים שונים כולל נוגדנים, פתוגנים מיקרוביאליים ותרופות טיפוליות30,34,35. שימו לב, השתמשנו ב- LTB4 (336.5 Da) לדגם PMN TEpM בהתחשב בכך שהוא כימותרפיה PMN חזקה ופיזיולוגית מקובלת ויכולתו לגרום ל- TEpM בריכוזים נמוכים (1 ננומטר) בטווח הפיזיולוגי. עם זאת, מודל הלולאה שלנו מותאם לכימותרפיה רלוונטית אחרת. דיווחנו על השימוש בפפטיד החיידקי N-פורמיל-מתיוניל-לאוסיל-פנילאלנין (fMLF) כדי לגרום לגיוס משמעותי של PMN ללומן המעי הגס30. fMLF (437.5 Da) הוא כימותרפיה זיקה נמוכה יותר בעכברים אשר דורש ריכוזים גבוהים בהרבה כדי להיות יעיל (1μM). מודל זה ניתן להתאמה לשימוש ב- CXCL1/KC, עוד כימותרפיה פיזיולוגית חזקה בה השתמשנו בהצלחה, אך CXCL1/KC יקר ומולקולה גדולה יחסית (11 kDa) יעילה פחות בחציית מחסום האפיתל. הוכחנו גם כי נטרול נוגדנים נגד לויקוציטים ספציפיים CD11b / CD18 (αMβ2) שהוזרקו לתוך הלולאה לומן ממשל קודם של LTBכימותרפיה הביאה לתוצאות תומכות PMN TEpM מופחתות ממחקרי במבחנה10,30,35. יתר על כן, pcLoop הועסק לאחרונה כדי ללמוד את ההשפעה של PMN לעומת גליקנס אפיתל בשליטה על שיעור PMN TEpM43. ריאגנטים הוזרקו למחשבLoop לומן ממשל קודם של LTBכימותרפיה 4. לכן, עם קשת רחבה של יישומים, iLoop יכול להשלים ולאשר ממצאים שהושגו באמצעות במבחנה assays. לולאות מעיים ligated שימשו גם על ידי אחרים כדי לחקור זיהום חיידקי (כגון סלמונלה, L. monocytogenes ו- E. coli), ולכן אנו מאמינים כי הקלות בהסתגלות של מודל iLoop זה יכול לשמש גם עבור מחקרים אלה.

לאחר טיפול עם מתווכים חיסוניים פרו דלקתיים, iLoop יכול לשמש מודל חריף של דלקת מעיים. יתר על כן, iLoop עשוי לאפשר מחקרים המפרטים את הקשר בין חדורות מעיים מוגברת וגיוס תאי מערכת החיסון לאחר חשיפה לפתוגנים תוך אלומינליים או במודלים ניסיוניים דלקתיים כרוניים. ראוי לציין, לאחרונה נצפינו על ידי שימוש במודל pcLoop כי בתגובה מינון גבוה של ציטוקינים proinflammatory TNFα ו- IFNγ (1 מ"ג של כל) חמילאות פראלית מעיים ל 4 kDa FITC-dextran הביא גיוס PMN משופר לתוך pcLoop לומן בתגובה LTB4 בהשוואה ציטוקינים במינון נמוך (100 ננומטר מכל אחד)30. מעניין, כאן אנו מראים כי חדור אפיתל מוגבר משני ג'אם-מחסור לא הוביל PMN TEpM משופרת אבל צמצם אותו. כל התוצאות הללו יחד מצביעות על כך שחלחול תאי במעיים משפיע על קצב ה- PMN TEpM אך המתאם אינו ישיר ותלוי בגורמים כגון ביטוי של מולקולות הידבקות (בדומה ל- JAM-A) הממלאות תפקיד חשוב הן בתפקוד מחסום האפיתל והן בנדידת לויקוציטים16. דרושים מחקרים עתידיים כדי לחקור את הכוונון העדין של תגובות תאי החיסון על ידי אפיתל המעי, ותרומות לדלקת רירית פתולוגית כגון מחלות מעי דלקתיות.

לסיכום, מודל iLoop מספק שיפור משמעותי בגישות הקיימות להערכת חלחיליות מעיים ו- PMN TEpM ב- vivo שיסייעו באופן משמעותי בהבנת מנגנונים שבבסיס הרגולציה של דלקת מעיים ו- IBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר סוון פלמינג מאוניברסיטת וירצבורג על תרומתו להקמת מודל לולאת המעי הגס הפרוקסימלי, שון ווטסון על ניהול מושבות העכברים וצ'ית'רה ק. מוראלדהרן על שעזרו ברכישת התמונות של מודל iLoop. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית /DFG (BO 5776/2-1) ל- KB, R01DK079392, R01DK072564 ו- R01DK061379 ל- C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 168 תפקוד מחסום מעיים אימונולוגיה רירית אפיתל מעיים בדיקת חמיצות בדיקת הגירה טרנס-אפיתלית לויקוציטית לולאת איל לולאת המעי הגס הפרוקסימלית איסותיוצינאט פלואורסצנטי (FITC)-dextran chemokine ציטוקינים פרו-דליקים
הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter