Summary
Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.
Abstract
Die Darmschleimhaut wird von einer einzigen Schicht von Epithelzellen ausgekleidet, die eine dynamische Barriere bildet, die den parazellulären Transport von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig die Passage von leuchtenden Bakterien und exogenen Substanzen verhindert. Ein Bruch dieser Schicht führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit für luminalen Inhalt und zur Rekrutierung von Immunzellen, die beide Kennzeichen pathologischer Zustände im Darm einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) sind.
Mechanismen, die die epitheliale Barrierefunktion und die transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN) regulieren, sind aufgrund des Mangels an experimentellen In-vivo-Methoden, die quantitative Analysen ermöglichen, unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes murines experimentelles Modell, das ein exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet. Die exteriorisierte Darmschleife (iLoop) ist vollständig vaskularisiert und bietet physiologische Vorteile gegenüber ex vivo kammerbasierten Ansätzen, die üblicherweise zur Untersuchung der Permeabilität und PMN-Migration über Epithelzellmonoschichten verwendet werden.
Wir zeigen zwei Anwendungen dieses Modells im Detail: (1) quantitative Messung der Darmpermeabilität durch Nachweis von fluoreszenzmarkiertem Dextrans im Serum nach intraluminaler Injektion, (2) quantitative Beurteilung von migriertem PMN über das Darmepithel in das Darmlumen nach intraluminaler Einführung von Chemoattraktantien. Wir demonstrieren die Machbarkeit dieses Modells und liefern Ergebnisse mit dem iLoop bei Mäusen, denen das epitheliale Tight Junction-assoziierte Protein JAM-A im Vergleich zu Kontrollen fehlt. Es wurde gezeigt, dass JAM-A die epitheliale Barrierefunktion sowie PMN TEpM bei Entzündungsreaktionen reguliert. Unsere Ergebnisse mit dem iLoop bestätigen frühere Studien und unterstreichen die Bedeutung von JAM-A bei der Regulation der Darmpermeabilität und PMN TEpM in vivo während der Homöostase und Erkrankung.
Das iLoop-Modell bietet eine hochstandardisierte Methode für reproduzierbare In-vivo-Studien der intestinalen Homöostase und Entzündung und wird das Verständnis der Darmbarrierefunktion und der Schleimhautentzündung bei Krankheiten wie IBD deutlich verbessern.
Introduction
Die Darmschleimhaut umfasst eine einzige Schicht aus säulenförmigen Darmepithelzellen (IECs), darunter liegenden Lamina propria Immunzellen und den Muscularis mucosae. Neben seiner Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen ist das Darmepithel eine physikalische Barriere, die das Körperinnere vor luminalen kommensalen Bakterien, Krankheitserregern und diätetischen Antigenen schützt. Darüber hinaus koordinieren IECs und Lamina propria-Immunzellen die Immunantwort, die je nach Kontext und Reizen entweder Toleranz oder Reaktion induziert. Es wurde berichtet, dass die Störung der Epithelbarriere dem Beginn einer pathologischen Schleimhautentzündung vorausgehen und zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beitragenkann,die sowohl Colitis ulcerosa als auch Morbus Crohnumfassen 1,2,3 ,4,5,6,7. Personen mit Colitis ulcerosa zeigen eine übermäßige transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN), die Kryptenabszesse bilden, ein Befund, der mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebracht wurde8,9. Obwohl eine beeinträchtigte epitheliale Barrierefunktion und übermäßige Immunantworten Kennzeichen von IBD sind, fehlt es an experimentellen In-vivo-Assays, um quantitative Bewertungen der Darmpermeabilität und der Rekrutierung von Immunzellen in die Darmschleimhaut durchzuführen.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung der intestinalen epithelialen Permeabilität und PMN TEpM verwenden ex vivo kammerbasierte Ansätze unter Verwendung von IEC-Monoschichten, die auf semipermeablen porösen Membraneinsätzen10,11,12kultiviert werden. Die Integrität der epithelialen Barriere wird entweder durch Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) oder des parazellulären Flusses des Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Dextrans vom apikalen zum basalen Kompartiment13,14,15überwacht. In ähnlicher Weise wird PMN TEpM typischerweise als Reaktion auf ein Chemoattraktum untersucht, das in der unteren Kammer16hinzugefügt wird. PMN werden in die obere Kammer gelegt und nach einer Inkubationszeit werden PMN, die in das Basalkompartiment gewandert sind, gesammelt und quantifiziert. Während diese Methoden nützlich, einfach durchzuführen und sehr reproduzierbar sind, sind sie offensichtlich reduktionistische Ansätze und stellen nicht unbedingt eine genaue Reflexion der In-vivo-Bedingungen dar.
Bei Mäusen ist ein gängiger Assay zur Untersuchung der intestinalen parazellulären Permeabilität durch orale Gavage von FITC-Dextran und anschließende Messung des FITC-Dextran-Aussehens im Blutserum13,17. Der Nachteil dieses Assays besteht darin, dass er eine Beurteilung der allgemeinen Barriereintegrität des Magen-Darm-Trakts und nicht die der regionalen Darmbeiträge darstellt. Darüber hinaus wird Evans-Blau häufig verwendet, um vaskuläre Leckagen in vivo18 zu bewerten, und wurde auch verwendet, um die Darmschleimhautpermeabilität bei Maus und Ratte19,20,21zu bewerten . Die Quantifizierung von Evansblau in der Darmschleimhaut erfordert die Extraktion aus Gewebe, das über Nacht in Formamid inkubiert wird. Daher kann das gleiche Gewebe nicht verwendet werden, um die intestinale epitheliale Permeabilität und die Neutrophileninfiltration zu untersuchen.
Hier heben wir ein einfaches Protokoll hervor, das die Anzahl der Tiere reduziert, die benötigt werden, um reproduzierbare Daten über die Durchlässigkeit der Kolonschleimhaut und die transepitheliale Migration von Leukozyten in vivo zu sammeln. Wir empfehlen daher die Verwendung von FITC-Dextrans, die im Blutserum leicht nachweisbar sind, ohne die Integrität der Darmschlingen zu beeinträchtigen, die für weitere Analysen geerntet werden können. Bemerkenswert ist, dass die intestinalen ligaierten Schleifen bei verschiedenen Arten (einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Kalb) verwendet wurden, um bakterielle Infektionen (wie Salmonellen, Listeria monocytogenes und Escherichia coli)22,23,24,25 sowie Darmpermeabilität26zu untersuchen; Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Studien, die Mechanismen von PMN TEpM in bestimmten Regionen des Darms wie Ileum oder Dickdarm untersuchen, die häufig an IBD beteiligt sind.
Hier beschreiben wir das Maus-Darmschleifenmodell (iLoop), das eine robuste und zuverlässige mikrochirurgische In-vivo-Methode ist, die ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment des Ileums oder des proximalen Dickdarms verwendet. Das iLoop-Modell ist physiologisch relevant und ermöglicht die Beurteilung der Darmbarriereintegrität und PMN TEpM an lebenden Mäusen unter Betäubung. Wir zeigen zwei Anwendungen: 1) Quantifizierung der Serumspiegel von 4 kDa FITC-Dextran nach intraluminaler Verabreichung im iLoop 2) Quantifizierung von transmigriertem PMN im iLoop-Lumen nach intraluminaler Injektion des starken Chemottraktans LeukotrienB4 (LTB4)27. Darüber hinaus wird das iLoop-Modell mit Jam-a-null-Mäusenoder Mäusen verwendet, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) im Vergleich zu Kontrollmäusen können wir frühere Studien bestätigen, die einen wichtigen Beitrag für Tight Junction-assoziiertes Protein JAM-A zur Darmpermeabilität und neutrophilen Transmigration berichtet haben15,28,29,30,31.
Das iLoop-Modell ist eine hochfunktionelle und physiologische Methode, mit der In-vitro-Assays bestätigt werden können. Darüber hinaus ist dies ein vielseitiges experimentelles Modell, das die Untersuchung verschiedener Reagenzien ermöglicht, die in das Schleifenlumen injiziert werden können, einschließlich Chemokine, Zytokine, bakterielle Krankheitserreger, Toxine, Antikörper und Therapeutika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee an der University of Michigan genehmigt.
1. Präoperative Vorbereitung
HINWEIS: Diese Methode wurde mit erwachsenen Mäusen aus dem genetischen Hintergrund C57BL / 6 im Alter von 8 - 12 Wochen entwickelt. Alle Mäuse wurden unter strengen spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit ad libitum Zugang zu normalem Chow und Wasser gehalten. Die Ergebnisse wurden mit C57BL/6, Jam-a-Nullmäusen (Jam-a-/-) oder Mäusen mit selektivem Jam-A-Verlust auf IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) und littermate Jam-afl/fl-Steuerelemente wie zuvor beschrieben30.
-
Flächenvorbereitung
- Führen Sie eine Operation in einem sauberen Bereich durch. Das Intestinal-Loop-Modell ist jedoch eine Nicht-Überlebensoperation, die keine aseptische / sterile Technik erfordert. Beachten Sie die tierärztlichen Hygienepraktiken und verwenden Sie gereinigte chirurgische Instrumente (d. H. Mit Seife geschrubbt, mit Wasser gespült, gefolgt von 70% Ethanol).
- Schalten Sie ein temperaturgesteuertes Operationsbrett (oder Heizkissen) und eine angepasste Lichtquelle ein, um das Tier während der Anästhesie und Operation vor Hypothermie zu schützen.
- Bereiten Sie Ligaturen vor, indem Sie 6 cm Segmente von nicht resorbierbaren chirurgischen 4-0-Seidennähten schneiden.
- Bereiten Sie Baumwollgaze (5 cm x 5 cm) vor, die in der Mitte nach einer Ellipsoidform geschnitten werden. Diese werden verwendet, um die Midline-Laparotomie abzudecken und den direkten Kontakt zwischen dem exteriorisierten iLoop und dem Tierfell zu verhindern. Die geschnittenen Gazen in warmer Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in einem Petrischalenbehälter einweichen.
- Bereiten Sie nasse Wattestäbchen vor, die in warmem HBSS getränkt sind und zum Behandeln von Organen und exteriorisiertem iLoop verwendet werden.
- Bereiten Sie eine 10 ml Spritze mit warmem HBSS vor und befestigen Sie sie an einer gelben Ernährungssonde. Diese Spritze wird verwendet, um exponiertes Gewebe während der Operation mit Feuchtigkeit zu versorgen und den iLoop sanft vom Fäkalinhalt zu spülen.
-
Tierische Vorbereitung
- Betäuben Sie das Tier gemäß dem genehmigten Tierprotokoll. In diesem Protokoll wird eine Mischung aus Isofluran und Sauerstoff durch einen Anästhesie-Vaporizer verabreicht. Stellen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers den Sauerstoffdurchfluss auf 1 l / min ein. Stellen Sie den Vaporizer auf 5% und laden Sie die Induktionskammer vor. Nach 5 min reduzieren Sie den Isofluran-Vaporizer auf 2% - 2,5%.
- Legen Sie das Tier für 3 min - 5 min in die Induktionskammer, dann übertragen Sie das Tier auf eine beheizte Operationsplatte und schließen Sie einen Anästhesie-Nasenkon-Plug an. Halten Sie das Tier in Rückenlage an den vier Gliedmaßen mit Klebeband zurück.
HINWEIS: Als Anästhesiealternative kann eine Mischung aus Ketamin (80 mg/kg - 100 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg - 10 mg/kg), verdünnt in Kochsalzlösung (0,9% NaCl), durch intraperitoneale Injektion verabreicht werden. Die Anästhesie sollte während der gesamten Operation durch intramuskuläre Verabreichung von Ketamin / Xylazin (bei 0,1 - 0,25-fachen der Anfangsdosen) aufrechterhalten werden, um die Anästhesietiefe zu gewährleisten. Falls verfügbar, wird ein Isofluran-Anästhesie-Vaporizer dringend empfohlen, um eine bessere Reproduzierbarkeit und Überlebensfähigkeit zu gewährleisten und Tierschmerzen vorzubeugen. - Tragen Sie ophthalmische Salbe auf beide Augen auf, um Hornhautaustrocknung zu verhindern.
- Führen Sie eine körperliche Untersuchung durch, die Herzfrequenz (ca. 500 Schläge / min) und Rhythmus, Schleimhautfarbe (rosa), Kapillarnachfüllzeit (< 2 s), Atemfrequenz (nicht weniger als 40 - 60 Atemzüge / min) und Temperatur (36,5 ° C)32umfasst.
- Bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren, beurteilen Sie die Anästhesietiefe durch pedalentzugsreflex. Verwenden Sie einen schmerzhaften Reiz (Pinch) der Haut zwischen den Zehen und / oder Zehenpolstern. Die Maus reagiert, indem sie ihr Bein zusammenzieht und entfernt. Dieser Pedalreflex verschwindet, wenn das Tier tief betäubt wird.
HINWEIS: Die Überwachung der Vitalwerte und des Pedalreflexes wird während der gesamten Anästhesie mindestens alle 15 Minuten empfohlen. Die Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zur Bewertung der Anästhesietiefe empfehlen die Überwachung der folgenden Punkte: (a) Farbe von Schwanz, Fuß und Schleimhaut (z. B. Zunge). Farbe rosa als normal und blass oder blau als Hinweis auf verminderte Durchblutung oder Atemnot; b) Bewertung des Atemmusters als regelmäßige gegenüber unregelmäßigen Atemzügen. Ein rektaler Temperaturfühler, ein Nagetieroximeter und ein Herzfrequenzmesser können zur Beurteilung der Körpertemperatur, der Herz- bzw. der Atemfrequenz verwendet werden.
2. Erzeugung der Ilealschleife
- Hautvorbereitung: Peelingen Sie das Fell der Bauchmittellinie mit Alkoholtupfern oder Mullschwamm, getränkt mit 70% Ethanol. Befeuchten Sie einen großen Bereich des Fells nicht mit Alkohol, um Unterkühlung zu verhindern.
- Führen Sie mit einer Schere eine Midline-Laparotomie durch. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Mitte des Bauches (ca. 2 cm Länge) und legen Sie das Peritoneum frei. Achten Sie darauf, intraabdominale Organe nicht zu verletzen.
- Legen Sie vorgeschnittene nasse Baumwollgaze über die freiliegende Intraabdominhöhle.
- Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den Kaudarm zu mobilisieren und zu exteriorisieren. Legen Sie den Kaudarm vorsichtig auf die nasse Baumwollgaze.
HINWEIS: Caecum ist bei einer Mehrheit der Mäuse unabhängig vom Geschlecht des Tieres im linken schwanzenden Quadranten der Bauchhöhle lokalisiert. - Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um das Ileum, dessen Terminalabschnitt (distales Ende) am Schaum befestigt ist, zu mobilisieren und vorsichtig zu exteriorisieren (Abbildung 1B).
- Setzen Sie mindestens 6 cm terminales Ileum auf die nasse Baumwollgaze aus, ohne die Mesenterikumgefäße und die Blutversorgung zu stören. Die Blutversorgung wird aufrechterhalten, wenn keine Blutungen auftreten und das Gewebe seine rosa Farbe beibehält (Abbildung 1B).
HINWEIS: Vermeiden Sie das Trocknen von exponiertem Gewebe, indem Sie das Gewebe jederzeit mit warmem HBSS (alle 2 - 3 Minuten) mit einer 10-ml-Spritze, die an einer gelben Ernährungssonde befestigt ist, feucht halten (Schritt 1.1.6). - Identifizieren Sie in der Nähe des Caecums die Hauptarterie, die das Ileum im Mesenterium versorgt. Lokalisieren Sie dann zwei Ligationsstellen im Mesentery, die frei von kritischen Blutgefäßen sind.
- Greifen Sie mit einer stumpfen Gewebezette fest an das terminale Ileum (am nächsten zum Caecum) und fenestrieren Sie mit einer feinen Spitzenzette das Mesenterium und vermeiden Sie Blutgefäße. Legen Sie die Seidennähte über die Perforation und binden Sie einen chirurgischen Knoten, um die erste Ligatur (distales Ende der Schlaufe) zu erzeugen.
- Verwenden Sie das Lineal, um 4 cm von der ersten Ligatur entfernt zu messen und die zweite Ligatur (proximales Ende der Schleife) zu erstellen, wie in Schritt 2.8 erwähnt (Abbildung 1C).
- Mit einer feinen Schere, die sorgfältig neben jeder Ligatur geschnitten wird, um die 4 cm große Ilealschleife zu isolieren und die Blutversorgung und die Mesentermembran intakt zu halten.
HINWEIS: Schneiden Sie beide Enden des exteriorisierten Segments des iLoop ab und spülen Sie dann sanft als notwendigen Schritt, der Interferenzen mit luminalen Inhalten (Fäkalien) verhindert, wodurch eine gleichmäßige Verteilung von FITC-Dextrans- oder chemotaktischen Reizen über die gesamte Länge des isolierten Segments sowie eine genauere Quantifizierung der Leukozyten durch Durchflusszytometrie ermöglicht wird. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine gleichmäßige Dehnung der Schleimhaut nach Injektion bestimmter Reagenzvolumina und eine bessere Reproduzierbarkeit zwischen Tieren. - Spülen Sie den Inhalt des Ilealschleifensegments vorsichtig mit warmem HBSS unter Verwendung einer flexiblen gelben Ernährungssonde, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist (siehe Schritt 1.1.6).
- Ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden der geröteten Ilealschlaufe mit Seidennäht.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit 30-G-Nadel, um 250 μL Reagenz wie FITC-Dextrans (Schritt 4.2) oder Chemokin (Schritt 5.3) langsam in das Darmlumen zu injizieren. Die Ilealschleife bläst sich auf und verursacht eine moderate Dehnung der Schleimhaut (Abbildung 1D).
HINWEIS: Reagenz in das Schleifenlumen auf der gegenüberliegenden Seite der Mesentericarterie injizieren. Achten Sie darauf, die Ilealschleife während der Injektion nicht aus dem Tier herauszuziehen, um zu vermeiden, dass Blutgefäße gerissen werden und Blutungen induziert werden. - Legen Sie mit nassen Wattestäbchen vorsichtig die Ilealschlaufe, das proximale Ileum und den Caecum zurück.
- Verwenden Sie einen Nadelhalter, eine anatomische Einezette und 3,0 nicht resorbierbare Seidennähte mit umgekehrter Schneidnadel, um die Bauchdecke zu schließen.
- Legen Sie das Tier für die Inkubationszeit in eine temperaturregulierte Anästhesiekammer.
3. Erzeugung der proximalen Dickdarmschleife (pcLoop)
HINWEIS: Details zu Mäusen, die für die Generierung des pcLoop verwendet wurden, finden Sie in den Informationen am Anfang des Protokollabschnitts.
- Führen Sie die Schritte 2.1 aus. - 2.4. wie oben für die Ilealschleife beschrieben.
- Mit nassen Wattestäbchen das gesamte Ileum außen vor und legen Sie es auf die Oberseite einer nassen Baumwollgaze. Identifizieren Sie den proximalen Dickdarm und die Blutversorgung im Mesokolon. Mobilisieren Sie den proximalen Dickdarm und erzeugen Sie mit einer feinen Spitzenzette die erste Ligatur in einem Bereich frei von Gefäßen im Mesokolon bei etwa 0,5 cm distal vom Dickdarm (Abbildung 2B).
- Messen Sie 2 cm von der ersten Ligatur und erstellen Sie eine zweite Ligatur an einem Bereich, der frei von Blutversorgung im Mesokolon ist (Abbildung 2C).
- Mit einer feinen Schere sorgfältig neben jeder Ligatur schneiden, um eine 2 cm lange pcLoop zu isolieren.
HINWEIS: Wie in der Anmerkung unter Schritt 2.10 erwähnt, ist es wichtig, beide Enden abzuschneiden, um einen pcLoop zu isolieren, der sanft von Luminalinhalten gereinigt wird. Schneiden Sie vorsichtig durch das Dickdarmgewebe und das Mesokolon, um zu verhindern, dass kleine Gefäße in das Darmlumen bluten. Verwenden Sie bei Bedarf thermische Kauterie, um Blutungen an der Schnittstelle zu begrenzen. - Spülen Sie den pcLoop vorsichtig mit warmem HBSS, um Kot mit einer flexiblen gelben Ernährungssonde zu entfernen, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist (siehe Schritt 1.1.6).
- Ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden des gespülten pcLoop mit Seidennäht.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit 30G-Nadel, um 200 μL Reagenz wie FITC-Dextrans (Schritt 4.2) oder Chemokin (Schritt 5.3) langsam in das Darmlumen zu injizieren. Der pcLoop bläst sich auf und verursacht eine moderate Dehnung der Schleimhaut (Abbildung 2D).
HINWEIS: Injizieren Sie das Reagenz in das pcLoop-Lumen auf der gegenüberliegenden Seite der Mesenteriumsarterie. Sorgen Sie für Konsistenz zwischen den Tieren und erstellen Sie einen 2 cm langen pcLoop, um eine gleichmäßige Dehnung der Schleimhaut zu gewährleisten. - Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den ligierten pcLoop, das Ileum und den Caecum vorsichtig in die Bauchhöhle zurück zu legen.
- Verwenden Sie einen Nadelhalter, eine anatomische Einezette und 3,0 nicht resorbierbare Seidennähte mit umgekehrter Schneidnadel, um die Bauchdecke zu schließen.
- Legen Sie das Tier für die Inkubationszeit in eine temperaturregulierte Anästhesiekammer.
4. Quantitative Beurteilung der Darmpermeabilität: 4 kDa FITC-Dextran-Assay
- Führen Sie eine Ilealschleife oder einen pcLoop durch (wie oben beschrieben).
- Mit einer 1 ml Spritze mit 30 G Nadel entweder 250 μL (Ileum - Schritt 2.13) oder 200 μL (Dickdarm - Schritt 3.7) von 4 kDa FITC-Dextranlösung (1 mg / ml in HBSS) in das Darmlumen injizieren. Bewahren Sie die unbenutzte FITC-Dextran-Lösung vor Licht geschützt auf, um die Standardkurve nach der Serumentnahme vorzubereiten.
- Für die Ilealschleife folgen die Schritte 2.14 bis 2.16, für den pcLoop die Schritte 3.8 bis 3.10. Legen Sie kurz Organe und iLoop wieder in die Bauchhöhle, schließen Sie die Bauchdecke.
- Legen Sie das Tier für 120 minuten in eine beheizte Anästhesiekammer.
- Öffnen Sie nach der Inkubationszeit die Bauchdecke, erhalten Sie Zugang zum Herzen und führen Sie eine Herzpunktion mit einer 1-ml-Spritze mit 25G-Nadel durch, um das Blut zu sammeln. Übertragen Sie das Blut in ein 1,3 ml Serumgerinnsel-Aktivator-Röhrchen, mischen Sie es sanft und halten Sie es vor Licht geschützt auf Eis. Sammeln Sie mindestens 500 μL Blut pro Maus.
HINWEIS: Tiere werden unter Betäubung mit einer physikalischen Methode wie Enthauptung oder Zervixluxation und in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierprotokoll eingeschläfert. - Zentrifugenserumrinnenaktivatorröhrchen für 5 min bei 10.000 x g bei Raumtemperatur gemäß Herstellerempfehlungen. Sammeln Sie das Serum (Überstand) und geben Sie es in ein 1,7 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das Rohr auf Eis und vor Licht geschützt.
- Quantifizierung der Fluoreszenz im Blutserum
- Bereiten Sie eine Standardkurve von FITC-Dextran 4 kDa im Serum von Kontrollmäusen vor (Kochsalzlösung oder HBSS ist eine gültige Alternative). Erzeugen Sie eine zweifache serielle Verdünnung mit einer Ausgangskonzentration von 1 mg/ml FITC-Dextran. Die gemessenen FITC-Dextran 4 kDa-Konzentrationen liegen zwischen 0,25 mg/ml und 2 μg/ml.
- Übertragen Sie das gleiche Volumen der Probe und der Standards auf eine schwarze 96-Well-Platte (flacher Boden) und messen Sie FITC in einem Fluoreszenzplattenleser (Anregung 490 nm, Emission 520 nm), gemäß den Anweisungen des Herstellers und den veröffentlichten Protokollen33. Berechnen Sie die FITC-Konzentration basierend auf der Standardkurve oder den vorhandenen Permeabilitätswerten als Faltänderung, normalisiert zur experimentellen Kontrollgruppe.
5. Quantitative Beurteilung von in das Darmlumen migriertem PMN nach intraluminaler Stimulation mit Chemokinen
HINWEIS: Sehr wenige PMN befinden sich in der Darmschleimhaut auf dem Ausgangsniveau. Die Vorbehandlung von Tieren mit entzündungsfördernden Zytokinen führt zu einer entzündlichen Umgebung, die die PMN-Rekrutierung aus dem Blutkreislauf in die Darmschleimhaut erleichtert.
- Führen Sie mit einer 1-ml-Spritze mit 30 G-Nadel eine intraperitoneale (i.p.) Injektion einer sterilen Lösung von 100 ng Tumornekrosefaktor-α (TNFα) und 100 ng Interferon-γ (INFγ) in 200 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch.
- Nach 4 - 24 Stunden Vorbehandlung mit entzündungsfördernden Zytokinen führen Sie eine Ilealschleife oder einen pcLoop (wie oben beschrieben) durch.
- In das Darmlumen werden mit einer 1-ml-Spritze mit 30 G-Nadel entweder 250 μL (Ileum - Schritt 2.13) oder 200 μL (Dickdarm - Schritt 3.7) Chemoattraktorlösung Leukotrien B4 (LTB4)1 nM in HBSS injiziert.
HINWEIS: Leukotrien B4 (LTB4)wird in diesem Protokoll als starkes Chemoattraktans für PMN verwendet. Andere Chemoattraktantien wie N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLF) oder Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 (CXCL1/KC) können ebenfalls verwendet werden, um eine signifikante Rekrutierung von PMN in das Kolonlumen30zu induzieren. - Führen Sie für die Ilealschleife die Schritte 2.14 bis 2.16 aus. Führen Sie für den pcLoop die Schritte 3.8 bis 3.10 aus. Legen Sie kurz Organe und iLoop wieder in die Bauchhöhle, schließen Sie die Bauchdecke.
- Legen Sie das Tier für 60 minuten in eine beheizte Anästhesiekammer.
- Sammlung des Darmschleifeninhalts
- Lösungen vorbereiten und auf Eis lagern: Für die Ilealschleife und den pcLoop einen Waschpuffer vorbereiten, der 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) und 2% FBS in sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium enthält.
- Öffnen Sie nach der Inkubationszeit und unter Betäubungserhaltung die Bauchdecke und ziehen Sie den iLoop (Ilealschleife oder pcLoop) heraus. Einschläfern Sie Tiere, wenn sie unter Betäubung sind, indem Sie eine physikalische Methode wie Enthauptung oder Zervixluxation und in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierprotokoll anwenden.
- Spülschlaufe mit kaltem PBS, um Reste von Blutverunreinigungen zu entfernen und überschüssiges PBS mit Gewebetüchern zu absorbieren. Sammeln Sie den Schleifeninhalt vorsichtig in einem 1,7 mL Zentrifugenröhrchen (ca. 250 μL für Ilealschleife und 200 μL für pcLoop). Spülen Sie die Schlaufe mit 500 μL Kaltwaschpuffer und legen Sie das Röhrchen unmittelbar nach dem Sammeln auf Eis.
HINWEIS: DTT hilft, Schleim aufzulösen. Wenn der iLoop-Luminalgehalt sehr viskos ist (abhängig vom genetischen Hintergrund der Maus), verdünnen Sie ihn 1:2 oder 1:3 mit einem DTT-haltigen Waschpuffer. - Die Lösung mit luminalem Inhalt wird durch einen 35 μm Nylon-Mesh-Filter mit einem 5-ml-Rundbodenrohr mit Zellsiebkappe gegeben. Dieser Schritt hilft, Gewebefragmente und Zellaggregate zu entfernen. Spülen Sie das Zellsieb mit 1 ml Waschpuffer ab.
- Zentrifugenröhrchen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Überstand entsorgen, Pellet mit 500 μL - 1 mL Waschpuffer abspülen, dann bei 400 x g zentrifugieren für 5 min, 4 °C.
- Resuspend iLoop Luminalzellpellet in 200 μL Durchflusszytometriepuffer (FCB) mit 2% FBS in sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium. Die Zellen können in einem Röhrchen aufbewahrt oder zur Durchflusszytometrie zur Färbung und Analyse auf eine runde 96-Well-Bodenplatte übertragen werden.
- Durchflusszytometrie Färbung und Analyse
- Kompensationskontrollen: weiße Blutkörperchen
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit 25-G-Nadel vor, die mit sterilem 0,5 M EDTA (pH 8,0) vorgefüllt ist. 10% EDTA pro erwartetem Blutvolumen (100 μL EDTA für 1 ml Blut).
- Sammeln Sie Blut unter Betäubung durch Herzpunktion. Blut in ein 1,7 ml Röhrchen geben, dann zentrifugieren Sie bei 400 x g für 10 min, 4 °C.
HINWEIS: Während die Maus unter Betäubung ist, verwenden Sie eine physikalische Methode, um den Tod in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierprotokoll zu bestätigen (z. B. zervikale Luxation). - Saugen Sie den Überstand an. Resuspend das Pellet in 1 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer für die Lyse der roten Blutkörperchen. Inkubieren Sie für 3 min - 5 min auf Eis. Zentrifuge 400 x g für 5 min, 4 °C. Wenn das Pellet noch rot ist, wiederholen Sie diesen ACK-Lysepufferschritt, bis das Pellet weiß wird.
- Resuspend das Pellet in 1 mL FCB und Platte 0,5 x 106- 1 x 106 Zellen pro Vertiefung. Bereiten Sie fünf Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte vor. Legen Sie den Teller auf Eis.
HINWEIS: Verwenden Sie dieselbe 96-Well-Platte, die den Luminalinhalt der Schleife enthält (siehe Schritt 5.6.6).
- Durchflusszytometrie Färbung
- Zentrifuge die 96-Well-Platte für 5 min bei 400 x g,4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 50 μL Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 als Fc-Block (1 μg pro 100 μL FCB). Inkubieren Sie für 5 min - 10 min auf Eis.
- Immunfärbung des iLoop-Luminalgehalts: Herstellung einer Mischung, die alle fluorochromkonjugierten Antikörper enthält (1:50 Verdünnung in FCB): Anti-CD45-PerCP, Anti-CD11b-PE und Anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Fügen Sie 50 μL der Kombination pro Vertiefung hinzu, für ein Endvolumen von 100 μL.
- Immunfärbung der weißen Blutkörperchen zur Kompensation (1:50 Verdünnung bei FCB): Verwenden Sie 50 μL FCB allein (ungefärbte Probe, Vertiefung 1), 50 μL jedes einzelnen fluorochromkonjugierten Antikörpers (Vertiefungen 2 - 4), 50 μL der Kombination aller fluorochromkonjugierten Antikörper (Vertiefung 5). Endvolumen von 100 μL.
- Inkubieren Sie die Platte für 30 minuten auf Licht geschütztem Eis.
- Zentrifuge die Platte für 5 min bei 400 x g,4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 200 μL FCB. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
- FcB 150 μL/Well zu den Blutproben geben.
- Fügen Sie der iLoop-Probe mit luminalen Inhalten 100 μL/Well FCB hinzu. Dann 50 μL/Well fluoreszierende Zählperlen.
- Durchflusszytometrie-Analyse
- Gate für CD45 positive Ereignisse und für die Expression von Ly-6G-/Gr-1 und CD11b30.
- Verwenden Sie 100 μL des Probenvolumens als Stoppbedingung.
- Berechnen Sie die absolute Anzahl der PMN, die in das iLoop-Lumen migriert ist, nach den Angaben des Herstellers der fluoreszierenden Zählperlen.
ANMERKUNG: Die Daten können als (1) Gesamtzahl der PMN im Lumen30,34,35, (2) PmNzahl pro Gramm Gewebe sowie (3) PmNzahl pro mm3 dargestellt werden, indem die Formel für das Volumen eines Zylinders verwendet wird: V = π(pi) r2 h (V für Volumen, r für Radius und h für Höhe).
- Kompensationskontrollen: weiße Blutkörperchen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine schematische Darstellung der Ilealschleifen- und pcLoop-Modelle ist in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2dargestellt. Die anatomischen Bilder zeigen die kritischen Schritte des Verfahrens, einschließlich der Exteriorisierung des Darmsegments (Abbildung 1B und Abbildung 2B), der Identifizierung einer geeigneten Stelle für Ligationen, die eine minimale Störung der Blutversorgung ermöglicht (Abbildung 1C und Abbildung 2C) und der Reinigung mit anschließender Ligatur der geschnittenen Enden des iLoop, die mit Reagenzlösung gefüllt werden können ( Abbildung1D und Abbildung 2D). Wichtig ist, dass das iLoop-Modell die lebenswichtige Blutversorgung erhält und die physiologische Absorption von applizierten Reagenzien wie FITC-Dextrans oder dem starken PMN-Chemoattraktant LTB4ermöglicht. Am Ende des Assays sollte der iLoop aufgeblasen werden (wie in Abbildung 1D und Abbildung 2Dzu sehen) und eine normale Schleimhautperfusion mit hellroten Mesenterikumgefäßen aufweisen. Je nach Assay wird Blut entnommen, um FITC-Dextran im Serum zu messen, oder iLoop-Luminalgehalte werden zur Quantifizierung von PMN TEpM vor der Einschläferung des Tieres verarbeitet.
Um die Genauigkeit des iLoop-Modells zur Beurteilung der Darmpermeabilität zu überprüfen, wurde ein FITC-Dextran pcLoop-Assay durchgeführt, um die Rolle des TJ-assoziierten Proteins JAM-A bei der Regulation der Darmbarrierefunktion in vivo zu bewerten. Bemerkenswert ist, dass berichtet wurde, dass JAM-A-Mangel zu einer erhöhten epithelialen Darmpermeabilität in vitro28 und nach oraler Gavage in vivo29führte. Hierin wurde unter Verwendung des pcLoop-Modells ein 2,5-facher Anstieg der 4 kDa FITC-Dextran-Serumspiegel bei Jam-a-null-Mäusen (Jam-a-/-) im Vergleich zu Kontrollen (Jam-a+/+) (Abbildung 3A)30quantifiziert. Darüber hinaus wurden ähnliche Ergebnisse bei Mäusen erzielt, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) im Vergleich zu Littermate-Kontrollen (Jam-a fl/fl) (Abbildung 3B)30. Daher konnte das pcLoop-Modell frühere Studien bestätigen, die einen positiven Beitrag für JAM-A zur Darmbarrierefunktion berichtet haben.
Dann wurde das pcLoop-Modell verwendet, um die PMN-Rekrutierung in die Darmschleimhaut und anschließendes TEpM in vivo zu untersuchen. Wie in Abbildung 4Agezeigt, wurde die Anzahl der PMN im Luminalgehalt des pcLoop durch Durchflusszytometrie-Analyse quantifiziert. PMN wurden als Zellen definiert, die für jeden der Zelloberflächenhersteller CD45, CD11b und Ly6G36positiv waren. Zirkulierende weiße Blutkörperchen wurden als Positivkontrolle für die Gating-Strategie verwendet. Wie erwartet, war die Anzahl der PMN in einem Segment des proximalen Dickdarms, das dem pcLoop ähnelte, unter physiologischen Bedingungen niedrig (Abbildung 4B). Die Vorbehandlung mit den entzündungsfördernden Zytokinen TNFα und IFNγ vor der Operation führte zu einer erhöhten Anzahl von PMN, die im pcLoop-Lumen rekrutiert wurden. Die Verabreichung des PMN-Chemoattraktionsmittels LTB 4 führte zueinem dramatischen Anstieg der PMN-Zählungen, die eine LTB4-abhängigePMN-Rekrutierung unterstützen (Abbildung 4B). Immunhistochemische Färbung von PMN in der Dickdarmschleimhaut bestätigt die erhöhte Rekrutierung von PMN nach Stimulation mit Zytokinen und LTB4 im Vergleich zu einer Zytokinbehandlung ohne LTB4 (Abbildung 4C)30. Das pcLoop-Modell wurde verwendet, um den Beitrag von JAM-A zu PMN TEpM unter Verwendung von Villin-cre zu untersuchen; Jam-a fl/fl Mäuse. Der Verlust von epithelialer JAM-A führte zu einer reduzierten Anzahl von transmigriertem PMN im Dickdarmlumen im Vergleich zu Littermatkontrollen (Abbildung 4D)30. Diese Ergebnisse unterstützen stark eine Rolle für JAM-A bei der Erleichterung der PMN-Migration durch das Darmepithel und liefern ergänzende Einblicke in Studien, die die Beteiligung von JAM-A an der PMN-Migration über vaskuläres Endothel in verschiedenen Modellen der Entzündung31,37,38berichtet haben .
Abbildung 1:Das Ilealschleifenmodell. (A) Schematischer Überblick über das Ilealschleifenmodell. Die mediale Laparotomie wird an Mäusen unter Betäubung durchgeführt und auf eine temperaturkontrollierte Operationstafel gelegt. (B) Exteriorisierung des Caecum (*), Ileums und Mesenteriums. Es werden zwei geeignete Stellen für die Ligatur identifiziert (1,2). (C) Isolieren Sie ein Segment von 4 cm Länge: Die erste Ligatur (1) wird in der Nähe der ileo-caecal-Verbindung und eine zweite Ligatur (2) wird 4 cm von der ersten Ligatur entfernt platziert. (D) Im Mesentery (1, 2) werden zwei kleine Einschnitte vorgenommen, um eine 4 cm lange Ilealschleife zu erzeugen. Nach Entfernung des Luminalgehalts und Ligatur der Cut-Ends können Reagenzien wie fluoreszierende Marker und Chemoattraktantien in das Lumen injiziert werden. Die Ilealschleife ist gut vaskularisiert (schwarze Pfeilspitzen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das proximale Doppelpunktschleifenmodell. (A) Schematische Übersicht des pcLoop-Modells. Die mediane Laparotomie wird an Mäusen unter Betäubung durchgeführt, die auf einem temperaturkontrollierten Operationsbrett platziert sind. (B) Exteriorisierung des Dickdarms (*), proximaler Dickdarm, Mesokolon und Ileum. Es werden zwei geeignete Stellen für die Ligatur identifiziert (1,2). (C) Die erste Ligatur (1) wird in der Nähe des Kauders platziert und eine zweite Ligatur (2) wird 2 cm distaler von der ersten Ligatur platziert. (D) Der pcLoop ist außen, vom Luminalgehalt gereinigt und mit Reagenzien wie fluoreszierenden Markern und Chemoattraktantien aufgeblasen. Der pcLoop ist ein gut vaskularisiertes 2 cm Segment des proximalen Dickdarms (schwarze Pfeilspitzen zeigen die Blutversorgung an). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: JAM-A reguliert die Darmpermeabilität in vivo. (A) JAM-A-Mangel (Jam-a-/-) führte zu einer erhöhten Dickdarmpermeabilität auf 4 kDa FITC-Dextran. Jam-a-/- (13x Tiere; schwarze Punkte) wurden mit Jam-a+/+ Kontrollen (12x Tiere; weiße Punkte) verglichen. 4 kDa FITC-Dextran (1 mg/ml) in HBSS wurde in das pcLoop-Lumen injiziert. Die Fluoreszenz wurde im Blutserum nach einer Inkubationszeit von 120 Minuten gemessen. Daten werden als Mittel ± SEM ausgedrückt; n = 3 unabhängige Experimente. P < 0,0001; Mann-Whitney U-Test. (B) Erhöhte Darmpermeabilität auf 4 kDa FITC-Dextran in Villin-cre; Jam-afl/fl (18x Tiere, schwarze Punkte) im Vergleich zu Steuerungen(Jam-afl/fl,12x Tiere, weiße Punkte). Daten sind Mittel ± SEM; n = 4 unabhängige Experimente. P < 0,0001; Mann-Whitney U-Test. Diese Zahl wurde von Flemming S, Luissint AC et al.30modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: JAM-A fördert die LTB4-abhängigeRekrutierung von PMN in das Lumen des pcLoop. (A) Gating-Strategie zur Quantifizierung von PMN (CD45+, CD11b+und Ly-6G / Gr1+ Zellen) im Luminalgehalt durch Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zählperlen. Leukozyten aus Blutproben wurden als Positivkontrolle für die Gating-Strategie verwendet. (B) Anzahl der PMN, die nach einer Zytokinbehandlung (TNFα+IFNγ, je 100ng) (10x Tiere; weiße Punkte) oder nach einer Kombination von Zytokinen und 1 nM LTB 4 (10x Tiere; schwarze Punkte) in daspcLoop-Lumen rekrutiert wurden. Schwarze Quadrate repräsentieren die Anzahl der PMN zu Studienbeginn, die in einem intakten Kolonsegment beurteilt wurde, das in seiner Länge mit dem pcLoop identisch ist und keiner Operation oder Behandlung mit proinflammatorischen Zytokinen und LTB4 (9x Tiere) unterzogen wurde. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM(n = 3 unabhängige Experimente), Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichstest. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C) Immunhistochemische Färbung von PMN (Anti-Ly6G/Gr1-Antikörper) im Epithel des pcLoop nach Behandlung mit Zytokinen allein (linkes Panel, TNFα+IFNγ) oder einer Kombination von Zytokinen und LTB4 (rechtes Panel). Die Anzahl der im pcLoop rekrutierten PMN wird in Gegenwart von LTB4 (schwarze Pfeilspitzen) erhöht. Maßstabsleiste: 100 μm. (D) Anzahl der pmN, die im pcLoop-Lumen in Villin-cre rekrutiert wurden; Jam-afl/fl Mäuse (11x Tiere; schwarze Punkte) im Vergleich zu Jam-afl/fl Mäusen (10x Tiere; weiße Punkte) als Reaktion auf 1 nM LTB4. Daten sind Mittel ± SEM; n = 3 unabhängige Experimente. *P < 0,05; 2-tailed Student's t Test. Diese Zahl wurde von Flemming S, Luissint AC et al.30modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Mechanismen, die für die Dysregulation der Darmbarrierefunktion und die Rekrutierung von Immunzellen unter pathologischen Erkrankungen wie IBD verantwortlich sind, sind unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes in vivo murines Modell, das ein gut vaskularisiertes exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet und die Beurteilung der Darmpermeabilität, neutrophilen Migrationsstudien sowie anderer Anwendungen ermöglicht.
Der iLoop ist eine Nicht-Genesungsoperation, die an lebenden Tieren durchgeführt wird. Die Anästhesie muss im Laufe des Experiments kontinuierlich überwacht werden und die Beurteilung der Sedierungstiefe ist obligatorisch. Zu den kritischsten Schritten gehören (1) die Isolierung des iLoop, (2) die Ligatur der geschnittenen Enden und (3) das Aufblasen des iLoop durch intraluminale Injektion von Reagenzlösung. In jedem dieser Schritte können Blutungen auftreten, die die Blutversorgung des iLoop beeinträchtigen und die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Bemerkenswert ist, dass in seltenen Fällen von intraluminalen Blutungen während des PMN TEpM-Assays die hier vorgestellte Durchflusszytometrie-Gating-Strategie dazu beitragen wird, transmigriertes PMN von PMN zu unterscheiden, das direkt aus dem Blutkreislauf stammt (nicht migriertes PMN). Transmigriertes PMN, das im iLoop-Lumen gesammelt wurde, drückt hohe Konzentrationen des OberflächenmarkersCD11b 10 im Vergleich zu zirkulierendem PMN aus (Abbildung 4D).
Da der iLoop quantitative Analysen der Darmpermeabilität und Migration von Blut-PMN in das Darmlumen ermöglicht, ist es wichtig, die Größe des absorbierenden Schleimhautbereichs und die Blutversorgung zu standardisieren. Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu gewährleisten, ist es wichtig, dass eine korrekte Länge des Darmsegments nach außen ziert wird. Der iLoop sollte 4 cm für die Ilealschleife und 2 cm für den pcLoop betragen und durch eine vergleichbare Blutversorgung durchblutet werden. Inkonsistenz in diesen Parametern führt auch zu einer ungleichen Dehnung des iLoop nach intraluminaler Injektion von Reagenzien und erhöht die Variabilität zwischen und zwischen experimentellen Gruppen. Um eine Überdehnung des iLoop zu vermeiden, empfehlen wir außerdem, nicht mehr als 250 μL Reagenzlösung in das Lumen für die Ilealschleife bzw. 200 μL für den pcLoop zu injizieren.
Es gibt einige Einschränkungen, die mit der Art des Verfahrens verbunden sind. Der iLoop ist eine Nicht-Genesungsoperation, die an lebenden Tieren durchgeführt wird. Dies ist eine technisch anspruchsvolle mikrochirurgische Methode; Das Personal kann jedoch chirurgische Fähigkeiten durch Übung erwerben. Die durchschnittliche Dauer der Operation sollte kurz sein (maximal 15 min). Wir empfehlen 120 min als ideale Inkubationszeit für die Messung der Darmpermeabilität und 60 min für die PMN TEpM. Die Inkubationszeiten können verkürzt werden, aber längere Zeiträume können den allgemeinen Entzündungszustand des Tieres unter Anästhesie beeinflussen. Darüber hinaus kann das Protokoll vom Beginn des chirurgischen Eingriffs bis zur Probenentnahme / Analyse nicht pausiert werden.
Dieses iLoop-Modell bietet wesentliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden: (1) Der iLoop ist vollständig vaskularisiert und physiologisch relevanter, (2) im Gegensatz zur oralen Gavage-Methode, die die Integrität des gesamten Magen-Darm-Trakts bewertet und von der gastrointestinalen Motilität abhängt13, ermöglicht der iLoop die Untersuchung der Eigenschaften bestimmter lokalisierter Bereiche im Darm (terminales Ileum oder proximaler Dickdarm), die häufig an IBD beteiligt sind, (3) der iLoop ist das erste In-vivo-Modell, das die quantitative Untersuchung von PMN TEpM in das Darmlumen sowie in andere Teile der Darmschleimhaut, einschließlich Lamina propria und Epithelfraktionen30,35, ermöglicht. Es ist möglich, hoch- und niedermolekulares FITC-markiertes Dextrans (4 bis 150 kDa) zu verwenden, um sowohl die Größenselektivität als auch die Schwere von Epithelbarrieredefekten bei Knockout/Knock-in-Mäusen oder verschiedene experimentelle Modelle, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Darmentzündungen, zu bewerten. Darüber hinaus kann FITC-markiertes Dextrans in anderen Organen wie der Leber39 quantifiziert werden oder als neuartiger Ansatz für Studien der Blut-Hirn-Schranke, die Einblicke in die Rolle der Darmpermeabilität in Darm-Leber und Darm-Hirn-Achsen geben40,41,42. Darüber hinaus bietet diese Methode die Möglichkeit, zwei Schleifen parallel durchzuführen (Ilealschleife und pcLoop im selben Tier) und zwei verschiedene fluoreszierend markierte Sonden für Analysen von Barriereeigenschaften in verschiedenen Bereichen des Darms einzuflößen. In ähnlicher Weise kann die Erzeugung von zwei Schleifen parallel verwendet werden, um Ileum versus Dickdarm spezifisch auf Unterschiede oder Ähnlichkeiten bei der Rekrutierung von Immunzellen als Reaktion auf dasselbe Reagenz zu bewerten.
Hier durch die Verwendung des pcLoop mit Jam-a-nullMäusen oder Mäusen, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) bestätigen wir Ergebnisse aus früheren Studien, die eine positive Rolle für das TJ-assoziierte Protein JAM-A bei der Darmpermeabilität und PMN TEpM berichtet haben. Die Anwendungen des iLoop können auf verschiedene Reagenzien erweitert werden, darunter Antikörper, mikrobielle Krankheitserreger und therapeutische Medikamente30,34,35. Bemerkenswert ist, dass wir LTB4 (336,5 Da) verwendet haben, um PMN TEpM zu modellieren, da es ein gut akzeptiertes potentes und physiologisches PMN-Chemoattraktans ist und seine Fähigkeit, TEpM in niedrigen Konzentrationen (1 nM) im physiologischen Bereich zu induzieren. Unser Schleifenmodell ist jedoch an andere relevante Chemoattraktantien anpassbar. Wir haben über die Verwendung des bakteriellen Peptids N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLF) berichtet, um eine signifikante Rekrutierung von PMN in das Kolonlumen30zu induzieren. fMLF (437,5 Da) ist ein Chemoattraktivum mit geringerer Affinität bei Mäusen, das viel höhere Konzentrationen benötigt, um wirksam zu sein (1μM). Dieses Modell ist anpassbar für die Verwendung von CXCL1 / KC, einem weiteren starken physiologischen Chemoattraktans, das wir erfolgreich eingesetzt haben, aber CXCL1 / KC ist teuer und ein relativ großes Molekül (11 kDa), das weniger effizient bei der Überquerung der Epithelbarriere ist. Wir haben auch gezeigt, dass neutralisierende Antikörper gegen Leukozyten-spezifisches Integrin CD11b/CD18 (αMβ2), die vor der Verabreichung des Chemoattraktantiens LTB4 in das Schleifenlumen injiziert wurden, zu reduzierten PMN TEpM-bestätigenden Ergebnissen aus In-vitro-Studienführten 10,30,35. Darüber hinaus wurde der pcLoop kürzlich verwendet, um die Wirkung von PMN im Vergleich zu epithelialen Glykanen bei der Kontrolle der PMN TEpM43-Ratezu untersuchen. Reagenzien wurden vor der Verabreichung des Chemoattraktanten LTB 4 in daspcLoop-Lumeninjiziert. Daher kann der iLoop mit seinem breiten Anwendungsspektrum die durch In-vitro-Assays gewonnenen Erkenntnisse ergänzen und bestätigen. Ligated Intestinal Loops wurden auch von anderen verwendet, um bakterielle Infektionen zu untersuchen (wie Salmonellen, L. monocytogenes und E. coli),daher glauben wir, dass die leichte Anpassungsfähigkeit dieses iLoop-Modells auch für diese Studien verwendet werden kann.
Nach der Behandlung mit entzündungsfördernden Immunmediatoren kann der iLoop als akutes Modell für Darmentzündungen eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte der iLoop Studien ermöglichen, die den Zusammenhang zwischen erhöhter Darmpermeabilität und Immunzellrekrutierung nach Exposition gegenüber intraluminalen Krankheitserregern oder in chronisch entzündlichen experimentellen Modellen aufklären. Bemerkenswert ist, dass wir kürzlich unter Verwendung des pcLoop-Modells beobachtet haben, dass als Reaktion auf eine hohe Dosis der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IFNγ (jeweils 1 mg) die intestinale parazelluläre Permeabilität zu 4 kDa FITC-Dextran zu einer verbesserten PMN-Rekrutierung in das pcLoop-Lumen als Reaktion auf LTB4 im Vergleich zu niedrig dosierten Zytokinen (jeweils 100 ng)führte 30. Interessanterweise zeigen wir hier, dass eine erhöhte epitheliale Permeabilität nach Jam-a-Mangel nicht zu einem erhöhten PMN-TEpM führte, sondern es verringerte. Alle zusammen deuten darauf hin, dass die intestinale parazelluläre Permeabilität die Rate von PMN TEpM beeinflusst, aber die Korrelation ist nicht direkt und hängt von Faktoren wie der Expression von Adhäsionsmolekülen (ähnlich wie JAM-A) ab, die sowohl bei der epithelialen Barrierefunktion als auch bei der Leukozytenmigration eine wichtige Rolle spielen16. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die Feinabstimmung der Immunzellreaktionen durch das Darmepithel und beiträge zu pathologischen Schleimhautentzündungen wie entzündlichen Darmerkrankungen zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das iLoop-Modell eine wesentliche Verbesserung gegenüber bestehenden Ansätzen zur Beurteilung der Darmpermeabilität und pmN TEpM in vivo bietet, die signifikant zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die der Regulation von Darmentzündungen und IBD zugrunde liegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Sven Flemming von der Universität Würzburg für seine Beiträge zur Etablierung des proximalen Dickdarmschleifenmodells, Sean Watson für das Management der Mauskolonien und Chithra K. Muraleedharan für die Hilfe bei der Anschaffung der Bilder des iLoop-Modells. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft/DFG (BO 5776/2-1) zu KB, R01DK079392, R01DK072564 und R01DK061379 zu C.A.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
References
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
