ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
פרוטוקול זה יש את המטרה של ניטור שינויים vivo myelin (demyelination ו remyelination) על ידי טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיה במודל של בעלי חיים של טרשת נפוצה.
Abstract
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה נוירו-אינפלציה עם ניוון אקסונלי ונוירוני מתרחב ו demyelination במערכת העצבים המרכזית, המוביל תפקוד לקוי מוטורי, נכות נפשית, פגיעה קוגניטיבית במהלך התקדמות MS. טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) היא טכניקת הדמיה המסוגלת לכמת שינויים תאיים ומולקולריים של vivo.
מכשירי רדיו עם זיקה למיאלין שלם יכולים לשמש להדמיית vivo של שינויי תוכן מיאלין לאורך זמן. ניתן לזהות עלייה או ירידה בתוכן מיאלין, מה זה אומר טכניקת הדמיה זו יכולה לזהות demyelination ותהליכי remyelination של מערכת העצבים המרכזית. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשתמש בהדמיית PET כדי לזהות שינויים מיאלין במודל החולדה lysolecithin, שהוא מודל של נגע demyelination מוקד (המושרה על ידי הזרקה סטראוטקטית) (כלומר, מודל של מחלת טרשת נפוצה). 11 ,11 C-PIB PET הדמיה בוצעה בבסיס, ו 1 שבוע ו 4 שבועות לאחר הזרקה סטראוטקסית של lysolecithin 1% בסטריאטום הנכון (4 μL) ו כפיס המוח קורפוס (3 μL) של המוח אשרור, המאפשר כימות של demyelination המוקד (אתר הזרקה לאחר 1 שבוע) ואת תהליך remyelination (אתר הזרקה ב 4 שבועות).
הדמיית מיאלין PET הוא כלי מעניין לניטור שינויים vivo בתוכן מיאלין אשר יכול להיות שימושי לניטור התקדמות המחלה demyelinating ותגובה טיפולית.
Introduction
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה נוירו-אינפלציה המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית, המאופיינת בדלקת, דמילינקציה ואובדן אקסון1. הפרוגנוזה של מחלה זו משתנה גם עם התקדמות בטיפול, והיא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לגירעונות נוירולוגיים אצל צעירים1. האבחנה של טרשת נפוצה מבוססת על הקריטריונים של ביטוי קליני והדמיה של נגעים אופייניים על ידי הדמיית תהודה מגנטית (MRI)2,3.
טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) יכול להיות כלי שימושי עבור ניטור vivo של התקדמות MS ואפקטים טיפוליים. תרכובת פיטסבורג B radiotracer (PIB) שכותרתו פחמן-11(11C-PIB) נמצא בשימוש נרחב כדי לכמת לוחות עמילואיד β; עם זאת, בעשור האחרון, זה נחקר כדי לכמת תוכן myelin ולהראות demyelination דינמי remyelination4,5,6.
עוקבי PET עמילואיד שונים(11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18 F-flutemetamol)ניתן להשתמש כדי לכמת מיאלין ולספק מידע חשוב על התקדמות המחלה ותגובה טיפולית, המאפשר זיהוי של demyelination ותהליכי remyelination, ללא הפרעה של neuroinflammation, אשר יכול להתרחש עם תמונות תהודה מגנטית קונבנציונלית (MRI)7. עמילואיד PET הדמיה הראה ספיגת מעקב ירד בחולי טרשת נפוצה פעילים לעומת חולים שאינם פעילים אשר יכול להיות מוסבר על ידי נזק חומר לבן מוקדם בחולים הפעילים8. ספיגת מעקב עמילואיד התחתון היה קשור גם עם ירידה קוגניטיבית במחקר מעקב, מראה טכניקה זו להיות כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של המחלה ותוצאות קליניות9.
מודל החולדה lysolecithin (LPC) הוא מודל כימי המושרה של טרשת נפוצה, שבו רעלן מוזרק, LPC, גורם לתגובה גבוהה של מקרופאגים שתוצאתו דלקת מוגברת, וכתוצאה מכך, demyelination10,11. demyelination הוא התהפך במהירות, בתוך כ 4 שבועות, מה שהופך את זה מודל טוב להערכת demyelination ותהליכי remyelination מכרסמים. מודל זה כבר הוערך באמצעות הדמיית PET, עם תוצאות טובות ומתאם עם מאמרים שלאחר המוות12.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול להדמיית PET מיאלין עם 11C-PIB במודל עכברוש lysolecithin, מראה טכניקת הדמיה זו להיות כלי שימושי למדידת vivo של תוכן מיאלין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נערכו בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לפיקוח על ניסויים בבעלי חיים (CONCEA, ברזיל) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו (CEUA-FMUSP, ברזיל - מספר פרוטוקול: 25/15).
הערה: בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד לגרום מודל עכברוש lysolecithin של טרשת נפוצה וכיצד לרכוש ולנתח את תמונות PET מיאלין.
1. הכנת פתרון ליסולציטין
- לשקול lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine מחלמון ביצה) בקנה מידה אנליטי באמצעות צינור פלסטיק חרוט (1.5 מ"ל).
- מוסיפים מלוחים סטריליים לצינור כדי להפוך 1% פתרון (למשל: לשקול 1 מ"ג של lysolecithin ולהמיס אותו עם 100 μL של מלוחים) ולהמיס את lysolecithin על ידי טלטול הצינור (רועד מצד לצד ולא מפנה מלמעלה למטה).
- הכינו את הפתרון רגע לפני תחילת האינדוקציה של מודל בעלי החיים (אל תמלאו את הפתרון הסופי המוכן).
2. דגם עכברוש ליסולציטין - ניתוח סטראוטקסי
- השתמש חולדות Wistar זכר במשקל בין 220 - 270 גרם. השתמש כפפות ומסכה במהלך כל ההליכים.
- לגרום להרדמה עם 5% isoflurane מעורבב 100% O2 (1 L / min) באמצעות תיבת אינדוקציה. בדוק אם החיה מורדמת על ידי התבוננות בהעדר תנועה (יש לראות רק נשימה).
- מניחים את החיה במנגנון סטראוטקסי על כרית חימום. תקן את האף והאוזניים של החיה לציוד.
הערה: פרטים על אופן ביצוע ניתוח סטריאוטאקסי ניתן למצוא במסד הנתונים של החינוך המדעי של JoVE. מדעי המוח. כירורגיה סטראוטקסית מכרסמים. יובה, קיימברידג', מסצ'וסטס, 2021.- לפקח על ההרדמה במשך כל ההליך (כולל ניתוח ורכישת תמונה). כדי להתאים את ריכוז isoflurane, לבחון את קצב הנשימה של בעלי החיים. קצב נשימה מהיר דורש ריכוז גבוה יותר וקצב נשימה איטי דורש ריכוז הרדמה נמוך יותר.
- להזריק את משכך כאבים (ketoprofen - 5 מ"ג / קילוגרם) תת עורית (לדלל את התרופה ל 1 מ"ל מלוחים, זה יעזור לחות את החיה).
- שים קרם עיניים בעיניים של החיה כדי להגן מפני התייבשות.
- השתמש בתמיסת כלורהקסידין של 0.5% כדי לנקות את אזור החתך.
- להזריק 100 μL של לידוקאין הידרוכלוריד 2% תת עורית באזור החתך.
- לגלח את אזור הגולגולת.
- השתמש בכלים סטריליים עבור הליך זה.
- באמצעות אזמל, לעשות חתך של כ 2 ס"מ בעור על הגולגולת.
- חשוף את הגולגולת עם מלחצי בולדוג.
- השתמש ספוגית כדי לנקות את אזור הגולגולת עם 1% מי חמצן.
- לאתר ולסמן את bregma (אטלס מוח עכברוש סטראוטקסי יכול לעזור לזהות את Bregma).
- מקם את מזרק המילטון (מזרקים נוירוס μL) ב bregma.
- באמצעות bregma ו אטלס סטראוטקסי כהתייחסות, למקם את מזרק המילטון על הקואורדינטות הבאות: Antero-אחורי: -0.30 מ"מ, לרוחב מאוחר יותר: -3.0 מ"מ, וגחוני עד שהוא נוגע בעצם הגולגולת, ולסמן את הגולגולת ולשים לב כיוון הקואורדינטות על נייר.
- תקדח את הגולגולת בקואורדינטת המסומנת. יש לדאוג עם דורה מאטר (פגיעה דורה מאטר יכול לגרום הרבה דימום).
- מלא את מזרק המילטון עם 7 μL של תמיסת ליסולציטין (1% מלוחים). נפח גדול יותר יכול להיות ממוקם במזרק, אבל רק 7 μL יוזרקו (להוציא את הבועות מן המזרק כדי למדוד את עוצמת הקול כראוי).
- מקם את מזרק המילטון בקואורדינטות הקודמות כדי להתחיל את הזרקת התרופה (סה"כ 7 μL לתוך 3 קואורדינטות סטראוטקטיות גחוני שונות). בהתחשב בקואורדינטות שצוינו קודם לכן, הורידו את מזרק המילטון לקואורדינטות גחון -5.0 מ"מ.
- לאט מאוד להזריק 2 μL של פתרון lysolecithin (1 μL / 10 דקות). חכה 3 דקות.
- קח את המחט עד הקואורדינטת סטראוטקסית הגחונית הבאה ( -4.2 מ"מ) ולאט לאט להזריק 2μL של פתרון lysolecithin (1 μL / 10 דקות). חכה 3 דקות.
- להזריק את הקואורדינטות הגחוני השלישי -3.0 מ"מ (3 μL של פתרון lysolecithin - 1 μL / 10 דקות).
- חכה 5 דקות ולאחר מכן להסיר את מזרק המילטון מהמוח.
- לתפור את העור.
- מוציאים את החיה מהמנגנון הסטראוטקטי ומאפשרים לבעל החיים להתעורר.
- להחזיר את החיה לכלוב הבית, לשמור על החיה לבד תחת פיקוח כדי לבדוק סימנים של אי נוחות.
- להזריק משכך כאבים תת עורי (ketoprofen - 5 מ"ג / קילוגרם) מדולל מלוחים, ב 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח.
3. רכישת PET
- קח 7 עד 20 MBq של 11רדיואקטיביות C-PIB במזרק (1 מ"ל הוא הנפח המרבי המותר להזרקה תוך ורידי בחולדות).
- יש למרדים את החיה עם 5% isoflurane מעורבב ב 100% O2 (1 L / min) באמצעות תיבת האינדוקציה.
- הזרק 11C-PIB (רדיואקטיביות מוגדרת בפריט 4.1 לעיל) לתוך וריד הפין, או וריד הזנב של החולדה (שני אתרי הממשל הם בסדר, ההחלטה היא בחירה אישית. אנו רק מייעצים לא להשתמש בהזרקת רטרו-מסלולית מכיוון שהמיקום קרוב מדי לאזור העניין (המוח) ויכול לפגוע באיכות התמונה.
הערה: רכישת תמונה של נקודת זמן בסיסית מבוצעת לפני הזרקה סטראוטקסית ואת 2 נקודות הזמן האחרות ב 1 שבוע ו 4 שבועות לאחר הניתוח. - מוציאים את החיה מהרדמה כדי לאפשר לבעל החיים להתעורר (משאירים את החיה על כרית חמה עד שהיא ערה לחלוטין).
- תחזיר את החיה לכלוב הביתי.
- חכה 30 דקות לשלב הבא.
- הרדמת החולדות עם 5% isoflurane מעורבב 100% O2 (1 L / min) באמצעות תיבת אינדוקציה.
- פתח תוכנת סורק PET.
- בחרו 'סריקה' > 'חיית מחמד מוכנה'.
- פרטי החוקר הראשי המלאים, מזהה מחקר, מזהה סדרה, מזהה בעלי חיים, משקל בעלי חיים (g) והערות נוספות. בחר הבא.
הערה: השתמש בנקודה (.) למספר עשרוני במשקל החיה. - ערוך אזור החזר על ההשקעה לסריקה (בדרך כלל בין 3 ל- 8). זהו האזור שייכלל בתמונה (אזורים בין המספרים 3 ו -8 של כיסוי המיטה יופיעו בתמונה הסופית).
- מקם את החולדה המרדים על מיטת עכברוש סטנדרטית של סורק PET והפעל את ההרדמה (3% isoflurane ב 100% O 2 היאהתחלה טובה, ולאחר מכן שיעור ההרדמה צריך להיות מותאם לפי הצורך). כדי להתאים את ההרדמה, בדוק את נתוני הניטור של תוכנת הסורק כדי לוודא שהחיה נושמת בקצב קבוע ואיטי.
הערה: הפעל את משאבת הוואקום יחד עם מסנן הפחמן הפעיל כדי לאסוף עודף גז isoflurane (אם המשאבה זמינה). - יש למרוח קרם עיניים כדי להגן על עיני החיה.
- לדחוף את מיטת החיה בתוך סורק PET.
- פרטי פעילות מלאים, זמן כיול פעילות, איזוטופ (C-11) ומשך סריקה (20 דקות). בחר התחל סריקה.
הערה: תופיע הודעת מיטה נעה לחיות מחמד, ומיטת החיה תעבור לציוד ותעצור בתנוחת ההחזר על ההשקעה שנבחרה קודם לכן. זמן הרכישה יתחיל לספור לאחור ומספר הספירות בשניות יופיע (CPS). - בתוכנת הסורק, נווט אל הכרטיסיה צג מימין למסך, סמן את שינוי סף לפרמטרים נשימתיים משתנה (BPM).
הערה: חלון יתפוצץ, עם פרמטר סף (500). בחר אישור. - נווט ל- 0% POWER כדי לשנות פרמטרי טמפרטורה כדי לחמם את החיה במהלך הסריקה. חלון צוץ; להשלים את הפרמטר (80 - 100). בחר אישור.
הערה: בחר בין 80 ל 100% כוח בהתבסס על תנאי טמפרטורת החדר (יותר כוח, חם יותר זה יקבל). - נווט חזרה לכרטיסיה סריקה.
- נווט אל כלי קביעת התצורה (סמל גלגל השיניים) וזמן ההזרקה המלא, הפעילות הנותרת, זמן כיול הפעילות הנותרת. בחר שמור.
הערה: חלון יופיע "האם אתה בטוח שברצונך לשנות את המטה-נתונים של הפרוטוקול?" > כן - נווט חזרה לכרטיסיה צג (בדוק את הפרמטרים הנשימתיים של החיה, ובמידת הצורך, להגדיל או להקטין את ריכוז isoflurane - בדרך כלל 3% ב 100% O2 מספיק).
- לאחר השלמת רכישת PET, הודעת Pet Ready תופיע בכרטיסיה סריקה, סמן את סמל חץ החוצה (משמאל לכלי קביעת התצורה) כדי לצאת ממיטת החיה.
- מוציאים את החיה מהרדמה ומאפשרים להתעורר על כרית חמה.
- לבנייה מחדש של התמונה, נווט לכרטיסיה 'בנייה מחדש'.
- בדוק את סמל הפלוס בפינה השמאלית התחתונה של המסך ובחר את קובץ הלימוד אשר ישוחזר. בחר הבא.
- נווט אל הכלי רזולוציית אנרגיה. חלון יתפוצץ. קבע את שיא האנרגיה (keV) לפרמטר הציוד (בהתבסס על בקרת איכות חודשית). בחר סגור.
הערה: שיא האנרגיה יכול להשתנות מדי חודש בעת ביצוע כיול ציוד חודשי. - שמור את כל הפרמטרים האחרים כברירת המחדל (גודל voxel איזומטרי: 400 מ"מ; מספר איטרציות: 30; רזולוציית אנרגיה: 30%; שמור איטרציה אחרונה בלבד; בטל את הסימון של שמור נתונים בינאריים) .
- בדוק את הוסף.
הערה: חלון יתפוצץ "השחזור נוסף לתור ויתחיל לאחר שהאחרים יסיימו". בחר אישור. קובץ יופיע ברשימת השחזור בכרטיסיה בנייה מחדש והמצב יופיע כממתין או כ- % (התקדמות) או כגמור.
4. ניתוח תמונה
הערה: בצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנה ייעודית לניתוח תמונות. בפרוטוקול הנוכחי ההדגמה משתמשת בתוכנה ספציפית, אך אם היא אינה זמינה, ניתן להשתמש באפשרויות אחרות.
- פתח את PMOD > נתיך אותו.
- נווט אל הכרטיסיה התאמה בחלק העליון של המסך.
- פתח את תפריט טען קלט באמצע המסך ובחר קבצי זיהוי אוטומטי, בחר קובץ PET (DICOM, Interfile או NifTI), הוסף לבחירה, לחץ עם פעולות, כוון מחדש לכיוון רגיל, לחץ על טען וסגור.
- ודא אם מין החיה נכון בתחתית המסך (RAT).
- סמן את התיבה חתוך בפינה השמאלית התחתונה של המסך.
- התאם את גודל התיבה הצהובה בתמונת PET כדי לקחת את המוח כולו.
- לחץ על לחצן קשיח בצד ימין של המסך. בחלון האישור לחץ על כן.
- לחץ על כלי המוח במרכז הימני של המסך כדי לפתוח אטלס הפניה. בחר עכברוש Px (W.Schiffer) - T2.
- בחר התאם תוצאות מהכרטיסיה השמאלית העליונה (בחר בכרטיסיה שלב עיבוד).
- לחץ על שכפול נתונים (הכרטיסיה 4בתפריט השמאלי העליון).
- יישר את תמונת PET עם תבנית הפניה באמצעות כלי הסיבוב (סמל לבן במרכז תמונת PET). בדוק יישור עבור 3 מישורים אנטומיים.
- שמור את קובץ הרישום המשותף (התפריט השמאלי של המסך).
- בחר תבנית פלט (DICOMor NifTI), ספריה וקידומת קובץ. לחץ על שמור.
הערה: אם פלט שנרשם במשותף נשמר כ- NifTi, פרטי תמונת הכותרת יאבדו. - לחץ על תפריט VOIs בתחתית המסך.
- נווט אל תבנית > אטלס בתחתית המסך (מתחת לחלון VOIs).
- בחר Px Rat(W.Schiffer) מהתפריט הנפתח.
הערה: אם אתה צריך לנתח רק VOIs ספציפיים אתה יכול לבחור רק את אזורי המוח של עניין. אם אתה רוצה את כל אזורי המוח של אטלס המוח, אין צורך בפעולה. - לחץ על מיתאר בתחתית המסך.
הערה: VOIs של אזורי מוח יופיעו בחלון VOIs. - צייר באופן ידני את ה- VOI באתר הנגע ובאזור חצי הכדור של המוח הנגדי(11אזור ספיגה נמוכה C-PIB וחציית מוח מנוגדת, בהתאמה).
- לחץ באזור של תמונת PET עם 11C-PIB ספיגה נמוכה.
- בחרו 'VOI חדש' > 'אישור'.
הערה: יופיע גיליון אלקטרוני - ניווט לסמל SPHERE בחלק האמצעי של המסך (מימין לחלון VOIs)
הערה: יופיע גיליון אלקטרוני. - בחר את שם VOI: נגע ובחר החל.
הערה: כדור יופיע בתמונה הרשומה במשותף. - ליישר את הכדור באזור הנגע ולהתאים את VOI עבור כל המישורים האנטומיים.
- לחץ על סגור (בחלק התחתון של הגיליון האלקטרוני).
- בחר את הנגע VOI (מרשימת VOIs).
- נווט אל סמל פעולות שיקוף VOI (בחלק הימני העליון של חלון VOIs) ובחר לשכפל ולשקף שמאלה /ימינה.
- נווט אל חישוב סטטיסטיקת VOI שנבחרה בראש חלון רשימת VOIs. נווט אל בחר סמל סטטיסטיקה לחישוב כדי לבחור את נתוני הפלט (לצד השמאלי של סמל סטטיסטיקת VOI). בדרך כלל עבור בדיקת תוכן myelin סטטיסטיקה עבור קבוצה של VOIs, ממוצע, SD, מינימום, מקסימום).
הערה: יופיע גיליון אלקטרוני. הגדרת ברירת המחדל יחידת נתונים היא kBq/cc. בחלק הימני של הגיליון האלקטרוני (סטטיסטיקת VOI) באפשרותך לבדוק את יחידת הנתונים כ- SUV (ערך ספיגה מתוקננת). אם השלמת את ניהול הרדיוטרייזר ואת פרטי רכישת התמונה כראוי בתוכנת הסורק, כפי שתואר קודם לכן, נתוני SUV יחושבו באופן אוטומטי על ידי תוכנת PMOD, אם לא, תוכל לערוך את הפרטים. - נווט אל העתק באמצעות תבנית מספר של אזור מערכת.
הערה: ודא אם כל הסטטיסטיקות נבחרו להעתקה כפלט (בדוק את הסמל בחלק השמאלי של המסך). הנתונים שיועתקו תלויים באפשרות יחידת הנתונים שנבחרה. - הדבק את נתוני הפלט בפנקס רשימות או בגיליון אלקטרוני.
הערה: טפל בהגדרות תוכנה עבור סימני נקודה ופסיק בין מספרים. זה יכול להיות שונה בין תצורות שפה. - שמור את הקובץ בשם ובפרטי המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג 11תמונות C-PIB PET עם שינויי מיאלין לאורך זמן. בסריקה הבסיסית, לא ניתן לראות הבדלים בתוכן מיאלין (כלומר, אין demyelination קיים). בתמונת נקודת הזמן של שבוע אחד, ניתן לראות את הנגע demyelinated המוקד (בחצי הכדור הימני) כפי שצוין על ידי החץ הלבן. התמונות מוצגות ב-3 המישורים האנטומיים (קורונל, צירי ושגיטלי) וניתן לזהות את הנגע הדמוגרפי בכולם. התמונה בת שבוע היא המחשה של נגע מופרד היטב באתר ההזרקה, המייצג את האינדוקציה של הדגם הנכון וזיהוי תמונה. בתמונה 4 שבועות, אין נגע גלוי יותר, המציין כי remyelination התרחשה תוכן myelin היא חזרה לקדמותו (או קרוב אליו).
הגרפים הייצוגיים מראים את הכימות של התמונות של 4 בעלי חיים ב -3 נקודות הזמן השונות. הגרף הראשון מציג את התוצאות מכימות הנגע (VOI ידני) ליחס צד מנוגד המדגים שינויים מיאליניים מוקדיים יותר, שבהם בוצעה הזרקת lysolecithin. הגרף השני מראה את אותה כימות, אבל בסטריאטום (סטריאום מוזרק ליחס קונטרה-צדדי) ובמקרה זה ההבדל אינו מובהק סטטיסטית, אשר ניתן להסביר על ידי גודל המדגם הקטן ומכיוון שה- VOI גדול יותר וריכוז הרדיואקטיביות נמדד לא רק במקום שבו הוזרק הליזולציטין.
ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי מבחן קרוסקל ווליס, ואחריו המבחן של דאן להשוואות מרובות והתוצאות מוצגות כמשמעותיות ± SD. בנגע VOI (H = 7.063; P=0.017), בתמונה של שבוע אחד, יחס ספיגת המעקב (0.90±0.07) היה נמוך ב-16% מקו הבסיס (1.07±0.06), עם מובהקות סטטיסטית (p=0.024). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתמונה בת 4 השבועות (1.01±0.06).
בסטריאטום לא נמצאו הבדלים סטטיסטיים (H =1.412; P =0.5393). יחסי הספיגה עבור התמונות היו 1.07±0.07 עבור תוכנית בסיסית, 1.02±0.07 במשך שבוע אחד ו- 1.01±0.08 במשך 4 שבועות.
הגרף השלישי (שורה תחתונה, גרף שמאלי) מציג את הכימות של הסטריאטום הנגדי (צד לא מוזרק). בגרף זה ניתן להבחין כי לא היה הבדל (P = 9397) בין נקודות זמן, כלומר השוני בצד מוזרק נובע משינויים מיאלין ולא עקב וריאציה ספיגת מעקב לאורך זמן.
הגרף הסופי, בפינה הימנית התחתונה, מראה את הכימות של האתר המוזרק (נגע VOI) בבעלי חיים שבהם המודל לא היה המושרה היטב (כנראה בגלל הזרקת lysolecithin מהירה, מניפולציה סטראוטקסית שגויה, ו / או הכנת פתרון שגוי). במקרה זה, הספיגה הנמוכה יותר אינה נראית בנקודת הזמן של שבוע אחד, כלומר לא התרחש תהליך demyelination, ואת ספיגה נמוכה ב 4 שבועות יכול להיות קשור תהליך demyelination מאוחר יותר או נזק לרקמות, שני המצבים קשורים אינדוקציה מודל בעלי חיים רע. גרף זה נוסף לפרוטוקול כדי להדגים את מראה התוצאות כאשר אינדוקציה של בעלי חיים אינה מבוצעת היטב ולהדגיש את החשיבות של כל שלב בפרוטוקול, מההתחלה ועד הסוף. אין הבדלים בספיגת המעקב (H = 2.745, P = 0.267) עם יחסי ספיגה של 1.06±0.05, 1.02±0.14 ו- 0.96±0.10 עבור תמונות בסיסיות, שבוע אחד ו- 4 שבועות PET.
איור 2 מוסיף מידע נוסף לתוצאות, שבהן איור 2A מפרט היכן צויר VOI הידני, בהתבסס על הפנייה לתבנית MRI ואיור 2B מציג את הכתם הכחול המהיר של לוקסול (לפרטים על פרוטוקול הכתם הכחול המהיר של לוקסול, ראה דה פאולה פאריה ואח '13) מהצד המוזרק וצד שאינו מוזרק בהזרקה סטראוטקסית של 7 ימים לאחר הזרקה סטריאוטקסית.
איור 1: המחשה של 11תמונות C-PIB PET המציגות תמונות של תוכנית בסיסית, שבוע ו-4 שבועות לאחר הזרקה סטראוטקטית. הגרפים בתחתית האיור מייצגים את הכימות של ספיגת המעקב (n=4) בנקודות זמן שונות. שני הגרפים הראשונים מייצגים את יחס הספיגה בצד המוזרק לצד הנגדי בנגע ובסטריאטום במודל המושרה היטב (כלומר, חולדות המציגות נגע לאחר הזרקת ליסולציטין). הגרף השלישי (משמאל למטה) מציג את הכימות של סטריאטום לא מוזרק (שליטה שלילית), והגרף הסופי (מימין למטה) מייצג את ספיגת C-PIB 11באתר ההזרקה של בעלי חיים שלא הציגו נגע demyelinated (מודל המושרה קשות). התוצאות מוצגות כ±SD ממוצע.
איור 2: פרטי מיקום הנגע. A) VOIs להמחשה של צד מוזרק (קו מקווקו) וצד לא מוזרק (קו לבן) שצויר באופן ידני בהתבסס על תבנית ה- MRI (אזור של כפיס המוח הקורפוס והסטריאטום) בהזרקה סטריאוטקטית של שבוע אחד. B) כתמים כחולים מהירים Luxol מראה demyelination בחצי הכדור מוזרק לעומת הצד שאינו מוזרק (למעלה: 40x הגדלה, למטה: 100x הגדלה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרון הגדול ביותר של שימוש במודל lysolecithin ללמוד טרשת נפוצה הוא ציר הזמן המהיר עבור demyelination (כשבוע) ו remyelination (כ 4 שבועות) להתרחש14. מודל זה יכול גם להיות המושרה בעכברים15, עם זאת, אינדוקציה בחולדות הוא יתרון יותר עבור הדמיה PET vivo בשל הגודל הגדול יותר של מוח החולדה בהשוואה לעכברים.
הצעד הראשון של מודל האינדוקציה הוא להיות זהיר מאוד. מודל זה אומת להדמיית מיאלין PET על ידי דה פאולה פאריה ואח'10 בשנת 2014 והוכח כי המהירות של הזרקת lysolecithin בתוך המוח הוא חיוני עבור מודל המושרה היטב. הזריקה חייבת להתבצע לאט מאוד, 1 μL כל 10 דקות, כדרך למנוע נזק לרקמות. פתרון lysolecithin צריך להיות מוכן גם באותו יום כמו הזרקה סטראוטקטית, רצוי רק לפני תחילת הליך הניתוח. אם המודל ישמש לראשונה בקבוצת מחקר, אנו ממליצים לאמת את המודל לפני ביצוע כימות מיאלין כלשהו על ידי הדמיית PET. האימות צריך לכלול ניתוח רקמות לאחר המוות על ידי כתמי מיאלין, למשל: היסטולוגיה כחולה מהירה של לוקסול, כפי שמוצג באיור 2, ואימונוהיסטוכימיה של חלבון בסיסי מיאלין (MPB), בנקודות הזמן השונות שנועדו לשמש בניתוח vivo. בחלק התוצאות הראינו כימות של ספיגת רדיוטרכר שבו אינדוקציה הנגע לא הצליח היטב, ולכן, ההבדלים לא זוהו על ידי 11C-PIB PET הדמיה.
הנגע שיש לכמת בטכניקה זו חייב להיות גדול יותר מרזולוציית סורק PET (כ -1 מ"מ בציוד פרה-קליני וכ -5 מ"מ בציוד קליני).
ברגע שהמודל מושרה היטב, הליך ההדמיה חייב להיות מתוכנן היטב, בשל radiotracer שכותרתו פחמן-11, אשר יש זמן מחצית חיים קצר של 20 דקות. אנשי מעבדת ההדמיה הפרה-קולינית צריכים להכין את כל החומר הדרוש, למלא את מערכת ההרדמה, לבדוק אם הכל עובד כראוי ולהדפיס את הטפסים שיש למלא במהלך הניסוי. יש לאמת גם את סורק PET לפני הניסוי, כאשר יש לבצע את כל בקרות האיכות הדרושות בציוד (התלוי בכל מדינה) כדי לבדוק שהסורק מתפקד היטב. לאחר קבלת המעקב להזרקה, יש למדוד את מדידת הפעילות גם בכיול מינון מכויל כדי להבטיח את המינון המוזרק הנכון, ואת המידע (פעילות במזרק, לפני ואחרי ההזרקה) שנכתב בטופס, כמו גם את הזמן המתאים שבו בוצעה המדידה. לקבוע איזה שעון הולך לשמש, כמו הזמן הנכון הוא הזמן בתחנת העבודה של סורק PET, הזמן שייחשב בתיקון ריקבון של התמונות, ולכן, כל השעונים המשמשים במהלך הניסוי צריך להיות מסונכרן לזמן תחנת העבודה של הסורק.
במהלך רכישת תמונה של בעלי חיים, יש לפקח על הטמפרטורה ועל הנשימה של בעלי החיים ולהתאים את ההרדמה, לפי הצורך. הטמפרטורה תלויה במיקום ויש להתאים אותה לרווחת בעלי החיים. לאחר סיום רכישת התמונה, חשוב לשמור את החיה על כרית חמה כדי להתאושש לפני החזרה לכלוב.
עיבוד תמונה חיוני לקבלת תוצאות אמינות מהניסויים באמצעות הדמיית PET. האידיאל הוא שהמנתח אינו מודע לקבוצות בעלי החיים ו/או לטיפול וכי כבר יש לו ניסיון בתמונות PET עם מעקב PET המשמש באופן שיבטיח רישום מושלם בין הדמיית PET לתבנית MRI. השתמשנו בתוכנת PMOD בפרוטוקול זה, אך אם תוכנה זו אינה זמינה, ניתן להשתמש בתוכנה חלופית לכימות תמונה, אם כי יש לתת תשומת לב להשגת הגדרה וכימות טובים של אזור המוח. עבור ההגדרה של מיקום הנגע, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח כי האתר מוזרק הוא בתוך VOI הנגע נמשך (ידע של אנטומיה המוח חולדה יש צורך).
חשוב לומר כי הדמיית מיאלין PET יכולה להתבצע גם במודלים אחרים של בעלי חיים MS, המציגים נגעים בלתי צפויים, כפי שכבר הוכח על ידי הקבוצה שלנו באנצפלומליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) marmoset מודל5. כאמור, הפרמטר החשוב שיש לקחת בחשבון לכימות הנגע הוא רזולוציית סורק PET, שהיא המגבלה לגילוי נגעים קטנים מדי. הדמיית PET היא טכניקת הדמיה ברזולוציה ירודה בהשוואה לטכניקות אחרות כגון MRI, אולם היא שיטה ספציפית מאוד, ובגלל זה, כימות של תמונות PET משתמש בתבנית אנטומית, כגון MRI, כדי לעזור לצייר את האזור של עניין, כפי שמוצג בפרוטוקול לעיל.
למרות שהציור הידני של VOIs תלוי באופרטור, זוהי האפשרות הטובה ביותר עבור מודל בעלי החיים LPC, שכן הנגע יכול להיות משתנה בין בעלי חיים. כדי להפחית את ההטיה בתהליך הכימות, חשוב לבצע VOI מראה, כפי שמוסבר בפרוטוקול, אשר יהיה באותו אזור ובאותו גודל כמו הצד מוזרק. חשוב גם לזכור את הקואורדינטות הסטראוטקסיות בעת ציור VOI בתבנית MRI כדי להבטיח כי אזור המוח הנכון נחשב. שימוש בכתם מיאלין כמדריך לזיהוי האזור demyelinated יכול גם לעזור בציור, כפי שהוסבר דה פאולה פאריה12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
ציוד קוביית β (Molecubes NV, בלגיה) נתמך על ידי קרן המחקר סאו פאולו, FAPESP - ברזיל (#2018/15167-1). ל-LES מלגת סטודנט לתואר שלישי מ-FAPESP - ברזיל (#2019/15654-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical Balance | Marte | AUWZZOD | max: 220 g- min: 1 mg |
| Anestesia vaporizer | Nanitech | 15800 | |
| Beta-cube | Molecubes | ||
| Bulldog clamp | Stoelting | 5212043P | |
| clorexidine | Rioquimica | 0.5%/100 mL | |
| Cotton swabs | johnson e johnson | ||
| Dose calibrator | Capintech | ||
| Drill | Kinzo powertools | 352901 | Model Q0M-DC3C |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL |
| Eye lubricant | ADVFARMA | 30049099 | vaseline 15 g (pharmaceutical purity) |
| Fine forceps | Stoelting | 52102-38P | |
| Gloves | Descarpack | 212101 | 6.5 size |
| Heating pad | Softhear | ||
| Injection Syringe | Hamilton | 80314 | 10µ, 32ga, model 701 |
| Insuline syringe | BD | 328328 | 1 mL insulin syringes with needle |
| Isoflurane | Cristália | 410525 | 100 mL , concentration 1 mL/1 mL |
| Ketoprofen or other analgesic | Sanofi | 100 mg/2 mL | |
| lidocaine | Hipolabor | 1.1343.0102.001-5 | 2%/20mL |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-aldrich | L-4129 | 25 mg - ≥99%, Type I, powder |
| Needle holder | Stoelting | 5212290P | |
| Oxygen | White Martins | 7782-44-7 | Compressed gas |
| PMOD software | PMOD technologies | Version 4.1 | module fuse it |
| Rat anesthesia mask | KOPF | Model 906 | |
| Saline | Farmace | 0543325/ 14-8 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
| Scapel blades | Stoelting | 52173-10 | |
| Scapel handles | Stoelting | 52171P | |
| Scissor | Stoelting | 52136-50P | |
| Semi-analytical Balance | Quimis | BK-3000 | max:3,100 g; min:0.2 g |
| shaver | Mega profissional | AT200 model | |
| Stereotactic Apparatus | KOPF | Nodel 900 | |
| Universal holder with needle support | KOPF | Model 1772-F1 | Hamilton support for 5 and 10 µL |
References
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
- Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
- Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
- Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
- Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
- Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
- Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
- Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
- Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
- Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).
Tags
מדעי המוח גיליון 168 11C-PIB הדמיית PET מיאלין טרשת נפוצה הדמיה מולקולרית מודל עכברוש ליסולציטין ניתוח VOIErratum
Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
