ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى رصد التغيرات في myelin (إزالة الغموض وإعادة التناخي) عن طريق التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET) في نموذج حيواني للتصلب المتعدد.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض عصبي مع توسع انحطاط عصبي وعصبية وديمالين في الجهاز العصبي المركزي ، مما يؤدي إلى الاختلالات الحركية ، والإعاقة النفسية ، والضعف المعرفي أثناء تقدم التصلب العصبي المتعدد. التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET) هو تقنية تصوير قادرة على قياس في التعديلات الخلوية والجزيئية.
يمكن استخدام أجهزة الراديو مع تقارب إلى myelin سليمة لفي التصوير في الجسم الحي من تغيرات محتوى myelin مع مرور الوقت. فمن الممكن للكشف عن زيادة أو نقصان في محتوى الميلين، ما يعني أن هذه التقنية التصوير يمكن الكشف عن عمليات إزالة الغموض وإعادة النعين في الجهاز العصبي المركزي. في هذا البروتوكول نبين كيفية استخدام التصوير بزيت PET للكشف عن التغيرات في myelin في نموذج الفئران lysolecithin ، وهو نموذج للآفات التململ البؤري (الناجمة عن حقن مجسم) (أي ، نموذج لمرض التصلب المتعدد). 11 تم إجراء التصوير بالحيوانات الأليفة C-PIB في خط الأساس ، وأسبوع و4 أسابيع بعد حقن الليسوليسيتين المجسمة 1٪ في المخطط الأيمن (4 ميكرولتر) والكولوسوم (3 ميكرولتر) من دماغ الفئران ، مما يسمح بالتدسيم الكمي لإزالة الغموض البؤري (موقع الحقن بعد أسبوع) وعملية إعادة النظر (موقع الحقن في 4 أسابيع).
Myelin PET التصوير هو أداة مثيرة للاهتمام لرصد التغيرات في الجسم الحي في محتوى myelin التي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تطور المرض demyelinating والاستجابة العلاجية.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض عصبي يصيب الجهاز العصبي المركزي ، ويتميز بالالتهاب ، وإزالة الغموض ، وفقدان المحوري1. تشخيص هذا المرض متغير حتى مع التقدم في العلاج، وهو واحد من الأسباب الأكثر شيوعا للعجز العصبي لدى الشباب1. ويستند تشخيص مرض التصلب العصبي المتعدد على معايير المظاهر السريرية والتصور للآفات المميزة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)2،3.
يمكن أن يكون التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET) أداة مفيدة لرصد في الجسم الحي لتطور مرض التصلب العصبي المتعدد والآثار العلاجية. ويستخدم على نطاق واسع مركب بيتسبرغ B radiotracer (PIB) المسمى مع الكربون-11(11C-PIB) لقياس β-اللويحات. ومع ذلك ، في العقد الماضي ، تمت دراسة كمي محتوى myelin وإظهار إزالة الغموض الديناميكية والتكميل4،5،6.
مختلفة من أجهزة تتبع PET اميلويد(11C-PIB، 18F-florbetaben،18F-florbetapir، 18F-flutemetamol) يمكن استخدامها لقياس myelin وتوفير معلومات هامة حول تطور المرض والاستجابة العلاجية، والسماح لتحديد عمليات إزالة الغموض والتجميل، دون تدخل من العصبية، والتي يمكن أن تحدث مع الصور بالرنين المغناطيسي التقليدي (MRI)7. وأظهرت التصوير PET Amyloid انخفاض امتصاص التتبع في مرضى التصلب المتعدد النشط مقارنة مع المرضى غير النشطين التي يمكن تفسيرها عن طريق الضرر في وقت مبكر من المادة البيضاء في المرضى النشطين8. كما ارتبط انخفاض امتصاص تتبع الأميلويد بالتدهور المعرفي في دراسة متابعة ، مما أظهر أن هذه التقنية أداة قيمة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للمرض والنتائج السريرية9.
نموذج الفئران lysolecithin (LPC) هو نموذج كيميائي مستحث من التصلب المتعدد ، حيث السم المحقون ، LPC ، يحفز استجابة عالية من الضامة التي تؤدي إلى زيادة الالتهاب ، وبالتالي ، إزالة الغموض10،11. يتم عكس إزالة الغموض بسرعة ، في حوالي 4 أسابيع ، مما يجعل هذا نموذجًا جيدًا لتقييم عمليات إزالة الغموض وإعادة النعم في القوارض. وقد تم بالفعل تقييم هذا النموذج باستخدام التصوير PET, مع نتائج جيدة والارتباط مع المقالات بعد الوفاة12.
هنا نقدم البروتوكول لتصوير MYELIN PET مع 11C-PIB في نموذج الفئران lysolecithin، مما يدل على هذه التقنية التصوير لتكون أداة مفيدة لقياس في الجسم الحي من محتوى الميلين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الوطني لمراقبة التجارب على الحيوانات (CONCEA، البرازيل) ووافقت عليها لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية التابعة لكلية الطب بجامعة ساو باولو (CEUA-FMUSP، البرازيل - رقم البروتوكول: 25/15).
ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونحن تبين كيفية الحث على نموذج الفئران lysolecithin من التصلب المتعدد وكيفية الحصول على وتحليل الصور PET الميلين.
1. إعداد حل ليسوليسيتين
- وزن lysolecithin (L-α-Lysphosphatidylylcholine من صفار البيض) على مقياس تحليلي باستخدام أنبوب بلاستيكي مخروطي (1.5 مل).
- إضافة المالحة المعقمة إلى أنبوب لجعل 1٪ حل (على سبيل المثال: تزن 1 ملغ من lysolecithin وحلها مع 100 ميكرولتر من المالحة) وحل الليسوليسيتين عن طريق هز الأنبوب (تهتز من جانب إلى جانب وعدم التحول من أعلى إلى أسفل).
- إعداد الحل قبل البدء في التعريفي نموذج الحيوان (لا تخزن الحل الجاهز النهائي).
2. Lysolecithin نموذج الفئران -- جراحة ثيريميكسيك
- استخدام الذكور الجرذان Wistar وزنها بين 220 - 270 غرام. استخدم القفازات والقناع أثناء جميع الإجراءات.
- حث التخدير مع 5٪ ايزوفلوران مختلطة في 100٪ O2 (1 لتر / دقيقة) باستخدام مربع التعريفي. تحقق مما إذا كان الحيوان مُنَقَّدًا من خلال ملاحظة غياب الحركة (يجب ملاحظة التنفس فقط).
- وضع الحيوان في جهاز استريو تكسينيك على وسادة التدفئة. إصلاح الأنف والأذنين من الحيوان إلى المعدات.
ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل كيفية إجراء جراحة تكسينية في قاعدة بيانات تعليم العلوم في JoVE. علم الأعصاب. جراحة القوارض المجذّبة. جوفي، كامبريدج، ماجستير، 2021.- مراقبة التخدير للعملية بأكملها (بما في ذلك عملية جراحية واقتناء الصورة). لضبط تركيز الأيزوفلوران، لاحظ معدل التنفس الحيواني. يتطلب معدل التنفس السريع تركيزًا أعلى ويتطلب معدل التنفس البطيء تركيزًا مخدرًا أقل.
- حقن مسكن (كيتوبروفين - 5 ملغ / كغ) تحت الجلد (تخفيف الدواء إلى 1 مل في المالحة، وهذا سوف يساعد على ترطيب الحيوان).
- ضعي كريم العين في عيون الحيوان للحماية من الجفاف.
- استخدم محلول 0.5٪ من الكلورهيكسيدين لتنظيف منطقة الشق.
- حقن 100 ميكرولتر من هيدروكلوريد ليدوكاين 2٪ تحت الجلد في منطقة شق.
- حلق منطقة الجمجمة.
- استخدام أدوات معقمة لهذا الإجراء.
- باستخدام مشرط، قم بعمل شق يبلغ حوالي 2 سم في الجلد فوق الجمجمة.
- كشف الجمجمة مع المشابك البلدغ.
- استخدام مسحة لتنظيف منطقة الجمجمة مع بيروكسيديز الهيدروجين 1٪.
- تحديد موقع ووضع علامة bregma (أطلس دماغ الفئران stereotaxic يمكن أن تساعد على هوية Bregma).
- ضع حقنة هاملتون (حقن العصاب ميكرولتر) في البريغما.
- باستخدام البريغما وأطلس مجسم كمرجع، ضع حقنة هاملتون في الإحداثيات التالية: إنترو-الخلفي: -0.30 ملم، latero-lateral: -3.0 مم، وpoporal حتى تلامس عظم الجمجمة، ووضع علامة على الجمجمة وملاحظة اتجاه الإحداثيات على الورق.
- حفر الجمجمة في إحداثي ملحوظ. رعاية مع ماطر دورا (إتلاف دورا ماطر يمكن أن يسبب الكثير من النزيف).
- ملء حقنة هاميلتون مع 7 ميكرولتر من محلول lysolecithin (1٪ في المالحة). ويمكن وضع حجم أكبر في الحقنة، ولكن سيتم حقن 7 ميكرولتر فقط (أخرج الفقاعات من الحقنة لقياس الحجم بشكل صحيح).
- ضع حقنة هاملتون في الإحداثيات السابقة لبدء حقن الدواء (إجمالي 7 ميكرولتر في 3 إحداثيات مجسمة بطنية مختلفة). وبالنظر إلى الإحداثيات التي سبق الإشارة إليها، قم بخفض حقنة هاملتون إلى الإحداثي البطني -5.0 ملم.
- حقن ببطء شديد 2 ميكرولتر من محلول lysolecithin (1 ميكرولتر/10 دقيقة). انتظر 3 دقائق.
- خذ الإبرة إلى إحداثيات استريو تكسينية البطنية التالية (-4.2 مم) وضخ ببطء 2μL من محلول lysolecithin (1 ميكرولتر/ 10 دقيقة). انتظر 3 دقائق.
- حقن الإحداثي البطني الثالث -3.0 مم (3 ميكرولتر من محلول الليسوليسيتين - 1 ميكرولتر/ 10 دقيقة).
- انتظر 5 دقائق ثم قم بإزالة حقنة هاملتون من الدماغ.
- خياطة الجلد.
- إزالة الحيوان من جهاز stereotactic والسماح للحيوان لإيقاظ.
- عودة الحيوان إلى قفص المنزل، والحفاظ على الحيوان وحده وتحت إشراف للتحقق من علامات عدم الراحة.
- حقن مسكن تحت الجلد (كيتوبروفين - 5 ملغ / كغ) المخفف في المالحة، في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة.
3. الحصول على الحيوانات الأليفة
- خذ 7 إلى 20 م ب ج من 11نشاط إشعاعي C-PIB في الحقنة (1 مل هو الحد الأقصى للحجم المسموح به للحقن الوريدي في الفئران).
- تخدير الحيوان مع 5٪ ايزوفلوران مختلطة في 100٪ O2 (1 لتر / دقيقة) باستخدام مربع التعريفي.
- حقن 11C-PIB (النشاط الإشعاعي المحدد في البند 4.1 أعلاه) في الوريد القضيب، أو الوريد الذيل من الفئران (كلا موقعي الإدارة على ما يرام، والقرار هو خيار شخصي. نحن فقط المشورة بعدم استخدام حقنة مدارية رجعية لأن الموقع قريب جدًا من المنطقة ذات الاهتمام (الدماغ) ويمكن أن يضعف جودة الصورة.
ملاحظة: يتم تنفيذ الحصول على صورة نقطة الأساس قبل حقن ستيريو 2 نقطة الوقت في 1 أسبوع و 4 أسابيع بعد الجراحة. - إزالة الحيوان من التخدير للسماح للحيوان لإيقاظ (ترك الحيوان على وسادة دافئة حتى يكون مستيقظا تماما).
- أعيدوا الحيوان إلى القفص المنزلي.
- انتظر 30 دقيقة للخطوة التالية.
- تخدير الفئران مع 5٪ ايزوفلوران مختلطة في 100٪ O2 (1 لتر / دقيقة) باستخدام مربع التعريفي.
- فتح برنامج الماسح الضوئي PET.
- حدد المسح الضوئي > جاهز للحيوانات الأليفة.
- تفاصيل المحقق الرئيسي كاملة، معرف الدراسة، معرف السلسلة، معرف الحيوان، وزن الحيوان (ز)، وملاحظات إضافية. حدد التالي.
ملاحظة: استخدام نقطة (.) لرقم عشري في وزن الحيوان. - قم بتحرير منطقة عائد الاستثمار للمسح الضوئي (عادةً ما بين 3 و8). هذه هي المنطقة التي سيتم تضمينها في الصورة (ستظهر المساحات بين الرقمين 3 و 8 من غطاء السرير في الصورة النهائية).
- ضع الجرذ المخدر على سرير فأر قياسي من ماسح PET وقم بتشغيل التخدير (3٪ isoflurane في 100٪ O2 هو بداية جيدة ، ومن ثم يجب تعديل معدل التخدير عند الضرورة). لضبط التخدير، تحقق من بيانات مراقبة برنامج الماسح الضوئي للتحقق من أن الحيوان يتنفس في إيقاع ثابت وبطيء.
ملاحظة: تشغيل مضخة فراغ مقرونة إلى مرشح الكربون المنشط لجمع غاز ايزوفلورا الزائدة (إذا كانت المضخة متاحة). - تطبيق كريم العين لحماية عيون الحيوان.
- ادفع سرير الحيوان داخل ماسح PET.
- تفاصيل النشاط الكاملة، وقت معايرة النشاط، النظائر (C-11)، ومدة المسح الضوئي (20 دقيقة). حدد بدء المسح الضوئي.
ملاحظة: ستظهر رسالة سرير متحرك للحيوانات الأليفة، وسينتقل سرير الحيوان إلى المعدات ويتوقف عند موضع عائد الاستثمار الذي تم تحديده مسبقًا. سيبدأ وقت الاكتساب في العد التنازلي وسيظهر عدد عدد الأعداد في الثانية (CPS). - في برنامج الماسح الضوئي، انتقل إلى علامة التبويب "مراقبة" على يسار الشاشة، تحقق من تغيير عتبة تغيير الجهاز التنفسي (BPM).
ملاحظة: سوف نافذة يطفو على المنبثقة، كاملة مع المعلمة عتبة (500). حدد موافق. - انتقل إلى 0٪ الطاقة لتغيير المعلمات درجة الحرارة لتسخين الحيوان أثناء المسح الضوئي. نافذة سوف يطفو على المنبثقة؛ إكمال المعلمة (80 - 100). حدد موافق.
ملاحظة: اختر بين 80 و 100٪ من الطاقة على أساس ظروف درجة حرارة الغرفة (كلما زادت الطاقة، كلما زادت درجة حرارتها). - انتقل مرة أخرى إلى علامة التبويب SCAN.
- انتقل إلى أداة التكوين (رمز الترس) وكامل وقت الحقن، والنشاط المتبقي، وتبقى وقت معايرة النشاط. حدد حفظ.
ملاحظة: سوف إطار يطفو على المنبثقة "هل تريد بالتأكيد تعديل بيانات التعريف البروتوكول؟" > نعم - انتقل مرة أخرى إلى علامة التبويب مراقبة (تحقق من المعلمات الجهاز التنفسي الحيوان، وإذا لزم الأمر، زيادة أو نقصان تركيز ايزوفلوران - عادة 3٪ في 100٪ O2 يكفي).
- عند الانتهاء من الحصول على PET، ستظهر رسالة جاهزة للحيوانات الأليفة في علامة التبويب Scan ، تحقق من أيقونة السهم Out (يسار أداة التكوين) لنقل سرير الحيوان.
- إزالة الحيوان من التخدير والسماح لإيقاظ على وسادة دافئة.
- لإعادة بناء الصورة، انتقل إلى علامة التبويب إعادة البناء.
- تحقق من رمز زائد في أسفل يسار الشاشة، وحدد ملف الدراسة التي سيتم إعادة بنائها. حدد التالي.
- انتقل إلى أداة تحليل الطاقة. نافذة ستظهر تكوين ذروة الطاقة (keV) إلى المعلمة المعدات (على أساس مراقبة الجودة الشهرية). حدد إغلاق.
ملاحظة: يمكن أن تتغير ذروة الطاقة كل شهر عند إجراء معايرة شهرية للمعدات. - الاحتفاظ بكافة المعلمات الأخرى كـ الافتراضي (حجم voxel متساوي القياس: 400 مم؛ عدد التكرارات: 30؛ 30؛ 30؛ 30؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ 10؛ قرار الطاقة: 30٪؛ حفظ التكرار الأخير فقط; إلغاء الاحتفاظ بالبيانات الثنائية) .
- قم بالتحققمن إضافة .
ملاحظة: سوف نافذة يطفو على المنبثقة "إعادة البناء تمت إضافتها إلى قائمة الانتظار وسوف تبدأ بمجرد الانتهاء من الآخرين". حدد موافق. سيظهر ملف في قائمة إعادة البناء في علامة التبويب إعادة البناء، وستظهر الحالة كمنتظر أو ٪ (تقدم) أو منتهية.
4. تحليل الصور
ملاحظة: قم بإجراء تحليل الصور باستخدام برنامج مخصص لتحليل الصور. في البروتوكول الحالي العرض التوضيحي يستخدم برنامج معين، ولكن إذا لم يكن متوفراً، يمكن استخدام خيارات أخرى.
- فتح PMOD > دمجه.
- انتقل إلى علامة التبويب مطابقة في أعلى الشاشة.
- فتح القائمة إدخال التحميل في منتصف اليمين من الشاشة وحدد ملفات التصحيح التلقائي، حدد PET ملف (ديكوم، Interfile أو NifTI)، إضافة إلى تحديد، انقر مع العمليات، توجيه إلى الاتجاه القياسي، انقر فوق تحميل وإغلاق.
- تحقق من صحة الأنواع الحيوانية في أسفل الشاشة (RAT).
- حدد مربع القطع في أسفل يمين الشاشة.
- ضبط حجم مربع أصفر في صورة PET لاتخاذ الدماغ كله.
- انقر على زر جامد على يمين الشاشة. في نافذة التأكيد انقر فوق نعم.
- انقر على أداة الدماغ في منتصف اليمين من الشاشة لفتح أطلس المرجعية. حدد Px الجرذ (W.Schiffer) - T2.
- حدد نتائج مطابقة من أعلى يمين علامة التبويب (اختر علامة تبويب مرحلة المعالجة).
- انقر على إعادة الحصول على البيانات (علامة التبويب4في أعلى القائمة اليمنى).
- محاذاة صورة PET مع قالب المرجع باستخدام أداة التدوير (رمز أبيض في مركز صورة PET). تحقق من المحاذاة لـ 3 مستويات تشريحية.
- حفظ ملف التسجيل المشترك (القائمة الجانبية اليمنى من الشاشة).
- حدد تنسيق الإخراج (DICOMor NifTI) ، وبادئة الدليل والملف. انقر فوق حفظ.
ملاحظة: إذا تم حفظ الإخراج شارك في تسجيل كما NifTi سيتم فقدان معلومات صورة الرأس. - انقر على قائمة VOIs في أسفل الشاشة.
- انتقل إلى القالب > أطلس في أسفل الشاشة (أسفل نافذة VOIs).
- حدد Px Rat (W.Schiffer) من القائمة المنسدلة.
ملاحظة: إذا كنت بحاجة إلى تحليل VOIs محددة فقط يمكنك تحديد مناطق الدماغ فقط من الاهتمام. إذا كنت تريد جميع مناطق الدماغ من أطلس الدماغ، لا حاجة إلى اتخاذ أي إجراء. - انقر على مخطط تفصيلي في أسفل الشاشة.
ملاحظة: VOIs من مناطق الدماغ سوف تظهر في إطار VOIs. - رسم يدويا VOI في موقع الآفة ومنطقة نصف الكرة الأرضية الدماغ contralateralral(11C-PIB منطقة امتصاص منخفضة ونصف الكرة الأرضية الدماغ contralateralral، على التوالي).
- انقر في منطقة صورة PET مع 11C-PIB امتصاص منخفض.
- حدد VOI جديد > موافق.
ملاحظة: سوف تظهر جدول بيانات - انتقل إلى رمز SPHERE في الجزء الأوسط من الشاشة (إلى يسار نافذة VOIs)
ملاحظة: سوف يظهر جدول بيانات. - اختر اسم VOI: الآفة وحدد تطبيق.
ملاحظة: ستظهر كرة في الصورة المسجلة بشكل مشترك. - محاذاة الكرة في منطقة الآفة وضبط VOI لجميع الطائرات التشريحية.
- انقر على إغلاق (في الجزء السفلي من جدول البيانات).
- حدد آفة VOI (من VOIs قائمة).
- انتقل إلى رمز عمليات النسخ المتطابق VOI (في أعلى يمين نافذة VOIs) وحدد النسخ ومرآة اليسار /اليمين.
- انتقل إلى حساب إحصائيات VOI المحددة في أعلى إطار قائمة VOIs. انتقل إلى تحديد إحصائيات ليتم حسابها لاختيار بيانات الإخراج (إلى الجانب الأيسر من رمز إحصائيات VOI). عادة لمحتوى myelin فحص الإحصاءات لمجموعة VOIs، متوسط، SD، الحد الأدنى، ماكس).
ملاحظة: سوف يظهر جدول بيانات. الإعداد الافتراضي هو "وحدة البيانات" kBq/cc. على الجزء العلوي الأيسر من جدول البيانات (إحصاءات VOI) يمكنك التحقق من وحدة البيانات كما SUV (قيمة امتصاص موحدة). إذا أكملت إدارة radiotracer وتفاصيل الحصول على الصورة بشكل صحيح في برنامج الماسح الضوئي، كما هو موضح سابقا، سيتم حساب البيانات SUV تلقائيا من قبل برنامج PMOD، إذا لم يكن كذلك، يمكنك تحرير التفاصيل. - انتقل إلى نسخ باستخدام تنسيق الأرقام المحلية للنظام.
ملاحظة: تحقق من تحديد كافة الإحصائيات لنسخها كإخراج (التحقق من الرمز في أعلى الشاشة الأيمن). تعتمد البيانات التي سيتم نسخها على وحدة البيانات المحددة. - قم بلصق بيانات الإخراج في المفكرة أو جدول البيانات.
ملاحظة: العناية بإعدادات البرامج لرموز النقاط والفواصل بين الأرقام. يمكن أن يكون هذا مختلفاً بين تكوينات اللغة. - حفظ الملف مع اسم الدراسة والتفاصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الصور التوضيحية 11C-PIB PET PET مع التغيرات myelin مع مرور الوقت. في المسح الأساسي، لا يمكن رؤية أي اختلافات في محتوى myelin (أي، لا يوجد أي إزالة الغموض). في صورة نقطة الوقت لمدة أسبوع واحد ، من الممكن رؤية الآفة ذات الديمايلات البؤرية (في نصف الكرة الأيمن) كما هو مبين من قبل السهم الأبيض. يتم عرض الصور في 3 طائرات تشريحية (إكاليل، محوري، والقوس) ومن الممكن تحديد الآفة ذات المحاية في كل منها. صورة 1-أسبوع هو التوضيح من آفة محددة جيدا في موقع الحقن، تمثل التعريفي النموذج الصحيح والكشف عن الصور. في الصورة 4 أسابيع، لا توجد آفة مرئية بعد الآن، مما يشير إلى أن إعادة الرضاعة قد حدث ومحتوى الميلين عاد إلى طبيعته (أو قريب منه).
الرسوم البيانية التمثيلية تظهر كمي من الصور من 4 في 3 نقاط زمنية مختلفة. الرسم البياني الأول يظهر النتائج من الكم من الآفة (يدوي VOI) إلى نسبة الجانب contralateral يدل على تغييرات أكثر المحورية myelin، حيث تم تنفيذ حقن lysolecithin. الرسم البياني الثاني يظهر نفس القياس الكمي، ولكن في المخطط (حقن المخطط إلى نسبة contralateral) وفي هذه الحالة الفرق ليس مهما إحصائيا، والتي يمكن تفسيرها من خلال حجم عينة صغيرة ولأن VOI هو أكبر ويتم قياس تركيز النشاط الإشعاعي ليس فقط حيث تم حقن lysolecithin.
تم تحليل الاختلافات بين المجموعات من خلال اختبار Kruskal Wallis ، يليه اختبار دان لمقارنات متعددة ويتم تقديم النتائج على أنها متوسط ± SD. في الآفة VOI (H = 7.063; P= 0.017، في صورة 1 أسبوع، كانت نسبة امتصاص التتبع (0.90±0.07) أقل بنسبة 16٪ من خط الأساس (1.07±0.06)، مع أهمية إحصائية (p =0.024). لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في صورة 4 أسابيع (1.01±0.06).
في المخطط، لم يتم العثور على اختلافات إحصائية (H = 1.412; P= 0.5393). وكانت نسب الاستيعاب للصور 1.07±0.07 لخط الأساس، و1.02±0.07 لمدة أسبوع، و1.01±0.08 لمدة 4 أسابيع.
الرسم البياني الثالث (الخط السفلي، الرسم البياني الأيسر) يعرض القياس الكمي للمخطط contralateral (الجانب غير المحقون). في هذا الرسم البياني من الممكن ملاحظة أنه لم يكن هناك فرق (P = 9397) بين نقاط الوقت ، مما يعني أن الاختلاف في الجانب المحقون يرجع إلى تغييرات myelin وليس بسبب اختلاف امتصاص التتبع بمرور الوقت.
الرسم البياني النهائي، في أسفل اليمين، يظهر القياس الكمي للموقع المحقون (آفة VOI) في الحيوانات حيث لم يتم حث النموذج بشكل جيد (ربما يرجع ذلك إلى حقن lysolecithin سريع، والتلاعب المجسومي خاطئ، و / أو إعداد حل غير صحيح). في هذه الحالة ، لا ينظر إلى انخفاض امتصاص في 1 نقطة زمنية الأسبوع ، وهذا يعني لم يحدث عملية إزالة الغموض ، ويمكن أن يرتبط انخفاض امتصاص في 4 أسابيع لعملية إزالة الغموض في وقت لاحق أو تلف الأنسجة ، وكلا الحالتين ترتبط الحث نموذج حيواني سيئة. تمت إضافة هذا الرسم البياني إلى البروتوكول لتجسيد ظهور النتائج عندما لا يكون أداء تحريض الحيوان جيدًا وللتأكيد على أهمية كل خطوة من خطوات البروتوكول ، من البداية إلى النهاية. لا توجد فروق في امتصاص التتبع (H = 2.745، P = 0.267) مع نسب امتصاص 1.06±0.05، 1.02±0.14، و0.96±0.10 لخط الأساس، أسبوع، و4 صور بزيت PET في الأسبوع.
2 يضيف الشكل مزيد من المعلومات إلى النتائج، حيث الشكل 2A تفاصيل حيث تم رسم VOI دليل، استنادا إلى مرجع قالب التصوير بالرنين المغناطيسي والشكل 2B يظهر تلطيخ الأزرق السريع luxol (للحصول على تفاصيل حول بروتوكول تلطيخ الأزرق السريع luxol، انظر دي بولا فاريا وآخرون13) من الجانب حقن الجانب وغير حقن في 7 أيام حقن ما بعد 333333.
الشكل 1: صور 11C-PIB PET PET توضح صور خط الأساس، أسبوع 1، و 4 أسابيع بعد الحقن المجسم. تمثل الرسوم البيانية في الجزء السفلي من الشكل القياس الكمي لامتصاص التتبع (n = 4) في نقاط زمنية مختلفة. تمثل الرسوم البيانية الأولى 2 نسبة امتصاص في الجانب حقن إلى الجانب contralateral في الآفة وفي المخطط في نموذج مستحث جيدا (أي الفئران تقديم آفة بعد حقن lysolecithin). الرسم البياني الثالث (أسفل اليسار) يبين كمي من المخطط غير المحقون (السيطرة السلبية)، والرسم البياني النهائي (أسفل اليمين) يمثل امتصاص C-PIB 11في موقع حقن الحيوانات التي لم تقدم آفة demyelinated (نموذج تسبب بشكل سيئ). وتعرض النتائج على أنها متوسطة±SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تفاصيل موقع الآفة. A)VOIs توضيحي من الجانب المحقون (خط متقطع) وغير حقن الجانب (خط أبيض) رسمها يدويا على أساس قالب التصوير بالرنين المغناطيسي (منطقة من الكاملوسوم وsstriatum) في 1 أسبوع حقن ستيريو. B) Luxol تلطيخ سريع الأزرق تظهر demyelination في نصف الكرة الأرضية حقن مقارنة مع الجانب غير حقن (أعلى: 40x التكبير، أسفل: 100x التكبير). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أكبر ميزة من استخدام نموذج lysolecithin لدراسة التصلب المتعدد هو الجدول الزمني السريع لإزالة الغموض (حوالي 1 أسبوع) و remyelination (حوالي 4 أسابيع) أن يحدث14. ويمكن أيضا أن يكون هذا النموذج في الفئران15, ومع ذلك, التعريفي في الفئران هو أكثر فائدة لفي التصوير في الحيوانات الأليفة في الجسم الحي نظرا لحجم أكبر من الدماغ الفئران مقارنة الفئران.
الخطوة الأولى من نموذج التعريفي هو أن نكون حذرين للغاية. تم التحقق من صحة هذا النموذج لتصوير MYELIN PET من قبل de Paula Faria et al.10 في عام 2014 ، وتبين أن سرعة حقن الليسوليسيتين داخل الدماغ أمر بالغ الأهمية لنموذج مستحث جيدًا. يجب أن يتم إجراء الحقن ببطء شديد ، 1 ميكرولتر كل 10 دقائق ، كوسيلة لتجنب تلف الأنسجة. وينبغي أيضا أن يكون حل lysolecithin أعدت في نفس اليوم الحقن المجسم, ويفضل قبل بدء عملية جراحية. إذا كان النموذج سيتم استخدامه لأول مرة في مجموعة بحثية، نوصي بالتحقق من صحة النموذج قبل إجراء أي تحديد كمي للميلين بواسطة التصوير المقطعي. التحقق من الصحة يجب أن تشمل تحليل الأنسجة بعد الوفاة عن طريق تلطيخ الميلين، على سبيل المثال: Luxol النسيج الأزرق السريع، كما هو مبين في الشكل 2، والبروتين الأساسي myelin (MPB) الكيمياء المناعية، في نقاط زمنية مختلفة تهدف إلى استخدامها في تحليل الجسم الحي. في قسم النتائج أظهرنا كمية من امتصاص الأشعة حيث لم تنجح الحث الآفة بشكل جيد ، وبالتالي ، لم يتم الكشف عن الاختلافات من قبل 11تصوير PET C-PIB.
يجب أن تكون الآفة التي سيتم تحديدها كمياً بواسطة هذه التقنية أكبر من دقة الماسح الضوئي PET (حوالي 1 مم في المعدات قبل السريرية وحوالي 5 مم في المعدات السريرية).
مرة واحدة يتم حث النموذج بشكل جيد، يجب أن يكون إجراء التصوير مخططا جيدا، وذلك بسبب radiotracer المسمى مع الكربون-11، الذي لديه نصف عمر قصيرة من 20 دقيقة. يحتاج موظفو مختبر التصوير قبل الفحص إلى إعداد جميع المواد الضرورية، وملء نظام التخدير، والتحقق مما إذا كان كل شيء يعمل بشكل صحيح، وطباعة الاستمارات التي سيتم إكمالها أثناء التجربة. وينبغي أيضا التحقق من الماسح الضوئي PET قبل التجربة، عندما يجب إجراء جميع ضوابط الجودة اللازمة في المعدات (تعتمد على كل بلد) للتحقق من الماسح الضوئي يعمل بشكل جيد. بعد تلقي المقتفي للحقن ، يجب أيضًا قياس النشاط بمعايرة الجرعة معايرة لضمان الجرعة الصحيحة المحقونة ، والمعلومات (النشاط في الحقنة ، قبل الحقن وبعده) المكتوبة على النموذج ، وكذلك الوقت المعني عند إجراء القياس. تحديد التي هي ساعة سوف تستخدم، والوقت المناسب هو الوقت على محطة العمل من الماسح الضوئي PET، والوقت الذي سيتم النظر في تصحيح الاضمحلال من الصور، وبالتالي، أي الساعات المستخدمة خلال التجربة يجب أن تكون متزامنة مع وقت محطة العمل الماسح الضوئي.
أثناء اكتساب صورة الحيوان، ينبغي رصد درجة الحرارة والتنفس الحيواني وتعديل التخدير، حسب الضرورة. درجة الحرارة هي موقع تعتمد وينبغي تعديلها للرفاهية الحيوانية. بعد الانتهاء من الحصول على الصورة ، من المهم الحفاظ على الحيوان على وسادة دافئة للتعافي قبل إعادته إلى القفص.
تعد معالجة الصور أمرًا حاسمًا للحصول على نتائج موثوقة من التجارب باستخدام التصوير المقطعي PET. المثل الأعلى هو أن المحلل ليس على بينة من مجموعات الحيوانات و / أو العلاج وأنه لديه خبرة بالفعل في الصور PET مع تتبع PET المستخدمة في مثل هذه الطريقة لضمان التسجيل المثالي بين التصوير PET و MRI القالب. استخدمنا برنامج PMOD في هذا البروتوكول ، ولكن إذا لم يكن هذا البرنامج متاحًا ، فيمكن استخدام برنامج تحديد كمية الصور البديل ، على الرغم من أنه يجب إيلاء الاهتمام لتحقيق تعريف منطقة الدماغ الجيدة وتحديد كمها. لتحديد موقع الآفة ، يجب توخي المزيد من الحذر لضمان أن الموقع المحقون داخل الآفة المسحوبة VOI (معرفة تشريح دماغ الفئران ضروري).
من المهم أن نقول أن التصوير PET المايلين يمكن أيضا أن يؤديها في نماذج حيوانية أخرى التصلب العصبي المتعدد, عرض الآفات لا يمكن التنبؤ بها, كما هو موضح بالفعل من قبل مجموعتنا في التهاب الدماغ المناعية الذاتية التجريبية (EAE) نموذج marmoset5. كما ذكر سابقا ، فإن المعلمة الهامة التي يجب مراعاتها في القياس الكمي للآفات هي دقة الماسح الضوئي PET ، وهي الحد من اكتشاف الآفات الصغيرة جدًا. التصوير بPET هو تقنية تصوير ضعيفة الدقة بالمقارنة مع تقنيات أخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، ومع ذلك فهي طريقة محددة للغاية ، وبسبب هذا ، يستخدم القياس الكمي لصور PET قالبًا تشريحيًا ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ، للمساعدة في رسم المنطقة ذات الاهتمام ، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه.
على الرغم من أن الرسم اليدوي لـ VOIs يعتمد على المشغل ، إلا أنه الخيار الأفضل لنموذج الحيوان LPC ، حيث يمكن أن تكون الآفة متغيرة بين الحيوانات. وللتقليل من التحيز في عملية القياس الكمي، من المهم إجراء VOI مرآة، كما هو موضح في البروتوكول، والتي ستكون في نفس المنطقة وبنفس حجم الجانب المحقون. من المهم أيضا أن يكون إحداثيات stereotaxic في الاعتبار عند رسم VOI في قالب التصوير بالرنين المغناطيسي لضمان أن يتم النظر في منطقة الدماغ الصحيح. استخدام المايلين تلطيخ كدليل لتحديد منطقة إزالة الغموض يمكن أن تساعد أيضا في الرسم، كما هو موضح في دي باولا فاريا12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
β معدات المكعبات (Molecubes NV، بلجيكا) بدعم من مؤسسة ساو باولو للبحوث، FAPESP - البرازيل (#2018/15167-1). لدى LES منحة دراسية للدكتوراه من FAPESP - البرازيل (#2019/15654-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical Balance | Marte | AUWZZOD | max: 220 g- min: 1 mg |
| Anestesia vaporizer | Nanitech | 15800 | |
| Beta-cube | Molecubes | ||
| Bulldog clamp | Stoelting | 5212043P | |
| clorexidine | Rioquimica | 0.5%/100 mL | |
| Cotton swabs | johnson e johnson | ||
| Dose calibrator | Capintech | ||
| Drill | Kinzo powertools | 352901 | Model Q0M-DC3C |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL |
| Eye lubricant | ADVFARMA | 30049099 | vaseline 15 g (pharmaceutical purity) |
| Fine forceps | Stoelting | 52102-38P | |
| Gloves | Descarpack | 212101 | 6.5 size |
| Heating pad | Softhear | ||
| Injection Syringe | Hamilton | 80314 | 10µ, 32ga, model 701 |
| Insuline syringe | BD | 328328 | 1 mL insulin syringes with needle |
| Isoflurane | Cristália | 410525 | 100 mL , concentration 1 mL/1 mL |
| Ketoprofen or other analgesic | Sanofi | 100 mg/2 mL | |
| lidocaine | Hipolabor | 1.1343.0102.001-5 | 2%/20mL |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-aldrich | L-4129 | 25 mg - ≥99%, Type I, powder |
| Needle holder | Stoelting | 5212290P | |
| Oxygen | White Martins | 7782-44-7 | Compressed gas |
| PMOD software | PMOD technologies | Version 4.1 | module fuse it |
| Rat anesthesia mask | KOPF | Model 906 | |
| Saline | Farmace | 0543325/ 14-8 | 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL |
| Scapel blades | Stoelting | 52173-10 | |
| Scapel handles | Stoelting | 52171P | |
| Scissor | Stoelting | 52136-50P | |
| Semi-analytical Balance | Quimis | BK-3000 | max:3,100 g; min:0.2 g |
| shaver | Mega profissional | AT200 model | |
| Stereotactic Apparatus | KOPF | Nodel 900 | |
| Universal holder with needle support | KOPF | Model 1772-F1 | Hamilton support for 5 and 10 µL |
References
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
- Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
- Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
- Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
- Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
- Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
- Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
- Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
- Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
- Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
- vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).
Tags
علم الأعصاب، العدد 168، 11C-PIB، التصوير PET، الميلين، التصلب المتعدد، التصوير الجزيئي، نموذج الفئران lysolecithin، تحليل VOIErratum
Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
