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Neuroscience

Imágenes de tomografía por emisión de Positron para la medición in vivo del contenido de mielina en el modelo de rata de lysolecitina de esclerosis múltiple

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo tiene como objetivo monitorear los cambios in vivo de mielina (desmielinización y remilinación) mediante imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) en un modelo animal de esclerosis múltiple.

Abstract

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neuroinflamatoria con degeneración y desmielinización axonal y neuronal en expansión en el sistema nervioso central, lo que conduce a disfunciones motoras, discapacidad psíquica y deterioro cognitivo durante la progresión de la EM. La tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imagen capaz de cuantificar alteraciones celulares y moleculares in vivo.

Los radiotracers con afinidad a la mielina intacta se pueden utilizar para imágenes in vivo de los cambios de contenido de mielina con el tiempo. Es posible detectar un aumento o disminución en el contenido de mielina, lo que significa que esta técnica de imagen puede detectar procesos de desmielinización y remielinización del sistema nervioso central. En este protocolo demostramos cómo utilizar imágenes de PET para detectar cambios de mielina en el modelo de rata de lisolcitina, que es un modelo de lesión de desmielinización focal (inducida por inyección estereotáctica) (es decir, un modelo de enfermedad de esclerosis múltiple). 11 Las imágenes de PET C-PIB se realizaron al inicio, y 1 semana y 4 semanas después de la inyección estereotáxica de lysolecitina 1% en el estriado derecho (4 μL) y el cuerpo calloso (3 μL) del cerebro de la rata, permitiendo la cuantificación de la desmielinización focal (sitio de inyección después de 1 semana) y el proceso de remyelinación (sitio de inyección a las 4 semanas).

Imágenes de PET de mielina es una herramienta interesante para monitorear los cambios in vivo en el contenido de mielina que podrían ser útiles para monitorear la progresión de la enfermedad desmielinizante y la respuesta terapéutica.

Introduction

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neuroinflamatoria que afecta al sistema nervioso central, caracterizada por inflamación, desmielinización y pérdida axonal1. El pronóstico de esta enfermedad es variable incluso con avances en el tratamiento, y es una de las causas más comunes de déficit neurológico en los jóvenes1. El diagnóstico de la EM se basa en los criterios de manifestación clínica y visualización de lesiones características por resonancia magnética (RM)2,3.

La tomografía por emisión de positrones (PET) puede ser una herramienta útil para el monitoreo in vivo de la progresión de la EM y los efectos terapéuticos. El radiopasero B (PIB) compuesto de Pittsburgh etiquetado con carbono-11(11C-PIB) es ampliamente utilizado para cuantificar las placas β-amiloide; sin embargo, en la última década, se ha estudiado cuantificar el contenido de mielina y mostrar desmielinización dinámica y remyelination4,5,6.

Diferentes trazadores de PET amiloides(11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flutemetamol) se pueden utilizar para cuantificar la mielina y proporcionar información importante sobre la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica, permitiendo la identificación de procesos de desmielinización y remielinización, sin la interferencia de la neuroinflamación, que puede ocurrir con imágenes convencionales de resonancia magnética (RM)7. Las imágenes de PET amiloides mostraron una disminución de la absorción de trazas en pacientes activos con EM en comparación con pacientes no activos, lo que podría explicarse por el daño temprano de la materia blanca en los pacientes activos8. La absorción del trazador de amiloide inferior también se asoció con el deterioro cognitivo en un estudio de seguimiento, mostrando esta técnica como una herramienta valiosa para estudiar la fisiopatología de la enfermedad y los resultados clínicos9.

El modelo de rata de lysolecitina (LPC) es un modelo químico inducido de esclerosis múltiple, donde la toxina inyectada, LPC, induce una alta respuesta de macrófagos que resulta en un aumento de la inflamación y, en consecuencia, desmielinización10,11. La desmielinización se invierte rápidamente, en aproximadamente 4 semanas, lo que hace de este un buen modelo para evaluar los procesos de desmielinización y remielinación en roedores. Este modelo ya ha sido evaluado utilizando imágenes pet, con buenos resultados y correlación con ensayos post mortem12.

Aquí presentamos el protocolo para imágenes pet mielina con 11C-PIB en el modelo de rata de lisolcitina, mostrando esta técnica de imagen para ser una herramienta útil para la medición in vivo del contenido de mielina.

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Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA, Brasil) y fueron aprobados por el Comité de Ética para la Investigación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo (CEUA-FMUSP, Brasil - número de protocolo: 25/15).

NOTA: En este protocolo, mostramos cómo inducir un modelo de ratas de liolecitina de esclerosis múltiple y cómo adquirir y analizar las imágenes de PET de mielina.

1. Preparación de la solución de lysolecitina

  1. Pesar la lysolecitina (L-α-Lysophosphatidylcholine de yema de huevo) en una escala analítica utilizando un tubo de plástico cónico (1,5 ml).
  2. Añadir solución salina estéril al tubo para hacer una solución del 1% (por ejemplo: pesar 1 mg de liolecitina y disolverla con 100 μL de solución salina) y disolver la lisololecitina agitando el tubo (temblando de lado a lado y no girando de arriba a abajo).
  3. Prepare la solución justo antes de iniciar la inducción del modelo animal (no almacene la solución definitiva).

2. Modelo de rata de lysolecitina - Cirugía estereotáxica

  1. Utilice ratas Wistar macho que pesen entre 220 y 270 g. Use guantes y máscara durante todos los procedimientos.
  2. Inducir anestesia con 5% isoflurano mezclado en 100% O2 (1 L/min) utilizando una caja de inducción. Compruebe si el animal está anestesiado observando la ausencia de movimiento (sólo se debe observar la respiración).
  3. Coloque al animal en aparatos estereotáxicos en una almohadilla de calefacción. Fije la nariz y las orejas del animal al equipo.
    NOTA: Los detalles de cómo realizar la cirugía estereotáxica se pueden encontrar en jove science education database. Neurociencia. Cirugía estereotáxica de roedores. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
    1. Monitoree la anestesia durante todo el procedimiento (incluida la cirugía y la adquisición de imágenes). Para ajustar la concentración de isofluranos, observe la frecuencia de respiración animal. Una frecuencia respiratoria rápida requiere una mayor concentración y una frecuencia respiratoria lenta requiere una concentración anestésica más baja.
  4. Inyectar el analgésico (ketoprofeno - 5 mg/kg) por vía subcutánea (diluir el medicamento a 1 ml en solución salina, esto ayudará a hidratar al animal).
  5. Ponga crema para los ojos en los ojos del animal para protegerse contra la deshidratación.
  6. Utilice una solución de clorhexidina al 0,5% para limpiar el área de incisión.
  7. Inyectar 100 μL de clorhidrato de lidocaína 2% subcutáneamente en la región de la incisión.
  8. Afeita el área del cráneo.
  9. Utilice instrumentos estériles para este procedimiento.
  10. Usando un bisturí, haz una incisión de unos 2 cm en la piel sobre el cráneo.
  11. Expone el cráneo con abrazaderas Bulldog.
  12. Usa un hisopo para limpiar el área del cráneo con un 1% de peroxidasa de hidrógeno.
  13. Localice y marque el bregma (un atlas de cerebro de rata estereotáxica puede ayudar a identificar el Bregma).
  14. Coloque la jeringa Hamilton (jeringas neuroeficientes μL) en el bregma.
  15. Usando el bregma y un atlas estereotáxico como referencia, coloque la jeringa Hamilton en las siguientes coordenadas: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm, y ventral hasta que toque el hueso del cráneo, y marque el cráneo y observe la orientación de coordenadas en el papel.
  16. Perfore el cráneo en la coordenada marcada. Tener cuidado con dura mater (dañar dura mater puede causar mucho sangrado).
  17. Llene la jeringa Hamilton con 7 μL de solución de lysolecitina (1% en solución salina). Se puede colocar un mayor volumen en la jeringa, pero solo se inyectarán 7 μL (saque las burbujas de la jeringa para medir el volumen correctamente).
  18. Coloque la jeringa Hamilton en las coordenadas anteriores para iniciar la inyección del fármaco (total de 7 μL en 3 coordenadas estereotácticas ventrales diferentes). Teniendo en cuenta las coordenadas previamente señaladas, baje la jeringa de Hamilton a la coordenada ventral -5,0 mm.
  19. Inyectar muy lentamente 2 μL de solución de liolecitina (1 μL/10 min). Espera 3 min.
  20. Lleve la aguja hasta la siguiente coordenada estereotáxica ventral (-4,2 mm) e inyecte lentamente 2μL de solución de liolecitina (1 μL/ 10 min). Espera 3 min.
  21. Inyecte la tercera coordenada ventral -3,0 mm (3 μL de solución de liolecitina - 1 μL/ 10 min).
  22. Espera 5 minutos y luego retira la jeringa Hamilton del cerebro.
  23. Sutura la piel.
  24. Retire al animal del aparato estereotáctico y deje que el animal despierte.
  25. Devolver al animal a la jaula de casa, mantener al animal solo y bajo supervisión para comprobar si hay signos de incomodidad.
  26. Inyectar analgésico subcutáneo (ketoprofeno - 5 mg/kg) diluido en solución salina, a 24 h y 48 h después de la cirugía.

3. Adquisición de PET

  1. Tome de 7 a 20 MBq de radiactividad C-PIBen una jeringa (1 ml es el volumen máximo permitido para la inyección intravenosa en ratas).
  2. Anestesiar al animal con un 5% de isoflurano mezclado en 100% O2 (1 L/min) utilizando la caja de inducción.
  3. Inyectar 11C-PIB (radiactividad definida en el punto 4.1 anterior) en la vena del pene, o vena trasera de la rata (ambos sitios de administración están bien, la decisión es una elección personal. Sólo aconsejamos no utilizar una inyección retro-orbital ya que la ubicación está demasiado cerca de la región de interés (el cerebro) y puede afectar la calidad de la imagen.
    NOTA: La adquisición de imágenes del punto de tiempo de referencia se realiza antes de la inyección estereotáxica y los otros 2 puntos de tiempo a 1 semana y 4 semanas después de la cirugía.
  4. Retire al animal de la anestesia para permitir que el animal despierte (deje al animal en una almohadilla caliente hasta que esté completamente despierto).
  5. Devuelve al animal a la jaula de casa.
  6. Espere 30 minutos para el siguiente paso.
  7. Anestesiar las ratas con 5% isofluranos mezclados en 100% O2 (1 L/min) usando una caja de inducción.
  8. Abra el software del escáner PET.
  9. Seleccione Escanear > Listo para mascotas.
  10. Detalles completos del investigador principal, identificación del estudio, identificación de la serie, identificación animal, peso animal (g) y notas adicionales. Seleccione Siguiente.
    NOTA: Utilice el punto (.) para el número decimal en el peso animal.
  11. Edite el área de ROI para escanear (normalmente entre 3 y 8). Esta es la zona que se incluirá en la imagen (las áreas entre los números 3 y 8 de la cubierta de la cama aparecerán en la imagen final).
  12. Coloque la rata anestesiada en un lecho de rata estándar del escáner pet y encienda la anestesia (3% isoflurano en 100% O2 es un buen comienzo, y luego la tasa de anestesia debe ajustarse según sea necesario). Para ajustar la anestesia, compruebe los datos de monitoreo del software del escáner para verificar que el animal está respirando a un ritmo constante y lento.
    NOTA: Encienda la bomba de vacío acoplada al filtro de carbono activado para recoger el exceso de gas isoflurano (si la bomba está disponible).
  13. Aplicar crema para los ojos para proteger los ojos del animal.
  14. Empuje la cama del animal dentro del escáner de PET.
  15. Detalles completos de la actividad, tiempo de calibración de la actividad, isótopo (C-11) y duración del escaneo (20 minutos). Seleccione Iniciar análisis.
    NOTA: Aparecerá un mensaje de cama móvil para mascotas, y la cama del animal se moverá en el equipo y se detendrá en la posición de ROI previamente seleccionada. El tiempo de adquisición comenzará a contar hacia abajo y aparecerá el número de recuentos por segundo (CPS).
  16. En el software del escáner, vaya a la pestaña Monitor a la izquierda de la pantalla, compruebe Cambiar umbral a parámetros respiratorios (BPM).
    NOTA: Aparecerá una ventana, completa con el parámetro threshold (500). Seleccione Aceptar.
  17. Vaya a 0% DE POTENCIA para cambiar los parámetros de temperatura para calentar al animal durante el escaneo. Aparecerá una ventana; completar el parámetro (80 - 100). Seleccione Aceptar.
    NOTA: Elija entre un 80 y un 100% de potencia en función de las condiciones de temperatura ambiente (cuanto más potencia, más caliente será).
  18. Vuelva a la pestaña SCAN.
  19. Vaya a la herramienta de configuración (icono de engranaje) y complete el tiempo de inyección, la actividad restante, el tiempo de calibración de actividad restante. Seleccione Guardar.
    NOTA: Aparecerá una ventana "¿Está seguro de que desea modificar los metadatos del protocolo?" > SÍ
  20. Vaya de vuelta a la pestaña Monitor (compruebe los parámetros respiratorios del animal, y si es necesario, aumente o disminuya la concentración de isoflurano - por lo general 3% en 100% O2 es suficiente).
  21. Cuando finalice la adquisición de PET, aparecerá el mensaje Listo para mascotas en la pestaña Escanear, consulte Icono de flecha hacia fuera (izquierda de la herramienta de configuración) para mover el lecho de animales.
  22. Retire al animal de la anestesia y deje despertar en una almohadilla caliente.
  23. Para reconstruir laimagen, vaya a la pestaña Reconstruir.
  24. Compruebe más icono en la parte inferior izquierda de la pantalla y seleccione el archivo de estudio que se reconstruirá. Seleccione Siguiente.
  25. Vaya a la herramienta Resolución de energía. Aparecerá una ventana. Configure el pico de energía (keV) en el parámetro del equipo (basado en el control de calidad mensual). Seleccione Cerrar.
    NOTA: El pico de energía puede cambiar cada mes al realizar la calibración mensual del equipo.
  26. Mantenga todos los demás parámetros como predeterminados (tamaño de voxel isométrico: 400 mm; número de iteraciones: 30; Resolución energética: 30%; Guarde solo la última iteración; desmarque Mantener datos binarios) .
  27. Marque Agregar.
    NOTA: Aparecerá una ventana "La reconstrucción se agregó a la cola y comenzará una vez que los demás hayan terminado". Seleccione Aceptar. Aparecerá un archivo en la lista de reconstrucción de la pestaña Reconstruir y el estado aparecerá como espera o % (progreso) o terminado.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Realice análisis de imágenes utilizando software de análisis de imágenes dedicado. En el protocolo actual la demostración utiliza un programa de software específico, pero si no está disponible, se pueden utilizar otras opciones.

  1. Abra PMOD > Fusionarlo.
  2. Vaya a la pestaña Coincidencia en la parte superior de la pantalla.
  3. Abra el menú Cargar entrada en el centro derecho de la pantalla y seleccione Archivos de detección automática, seleccione Archivo PET (DICOM, Interarchivo o NifTI), agregue al seleccionado, haga clic con Operaciones, Reorientar a orientación estándar, haga clic en Cargar y cerrar.
  4. Verifique si la especie animal es correcta en la parte inferior de la pantalla (RAT).
  5. Marque la casilla Recortar en la parte inferior derecha de la pantalla.
  6. Ajuste el tamaño de la caja amarilla en la imagen de PET para tomar todo el cerebro.
  7. Haga clic en el botón Rígido situado a la derecha de la pantalla. En la ventana de confirmación, haga clic en Sí.
  8. Haga clic en la herramienta cerebral en el centro derecho de la pantalla para abrir Atlas de referencia. Seleccione Rata Px (W.Schiffer) - T2.
  9. Seleccione Coincidir resultados en la pestaña superior derecha (seleccione la pestaña Fase de procesamiento).
  10. Haga clic en Reslicing de datos (4ªpestaña en el menú superior derecho).
  11. Alinee la imagen PET con la plantilla de referencia utilizando la herramienta de rotación (icono blanco en el centro de la imagen PET). Compruebe la alineación de 3 planos anatómicos.
  12. Guarde el archivo de coregistro (menú del lado derecho de la pantalla).
  13. Seleccione el formato de salida (DICOMor NifTI), el prefijo de directorio y archivo. Haga clic en Guardar.
    NOTA: Si la salida co-registrada se guarda como NifTi, se perderá la información de la imagen del encabezado.
  14. Haga clic en el menú VOIs en la parte inferior de la pantalla.
  15. Vaya a Plantilla > Atlas en la parte inferior de la pantalla (debajo de la ventana de VOIs).
  16. Seleccione Px Rat(W.Schiffer) en el menú desplegable.
    NOTA: Si necesita analizar solo VOIs específicos, solo puede seleccionar las áreas de interés cerebral. Si quieres todas las áreas cerebrales del atlas cerebral, no se necesita acción.
  17. Haga clic en Contorno en la parte inferior de la pantalla.
    NOTA: Los VOIs de las áreas cerebrales aparecerán en la ventana de VOIs.
  18. Dibuje manualmente el VOI en el sitio de la lesión y el área del hemisferio cerebral contralateral(11área de baja absorción de C-PIB y hemisferio cerebral contralateral, respectivamente).
  19. Haga clic en el área de la imagen PET con 11C-PIB baja absorción.
  20. Seleccione Nuevo VOI > Aceptar.
    NOTA: Aparecerá una hoja de cálculo
  21. Desplácese hasta el icono SPHERE en la parte central de la pantalla (a la izquierda de la ventana de los VOIs)
    NOTA: Aparecerá una hoja de cálculo.
  22. Elija el nombre VOI: lesión y seleccione Aplicar.
    NOTA: Aparecerá una esfera en la imagen co-registrada.
  23. Alinee la esfera en el área de la lesión y ajuste el VOI para todos los planos anatómicos.
  24. Haga clic en Cerrar (en la parte inferior de la hoja de cálculo).
  25. Seleccione el VOI de lesiones (de la lista de VOIs).
  26. Vaya al icono de operaciones de creación de reflejo de VOI (en la parte superior derecha de la ventana de VOIs) y seleccione Clonar y reflejar izquierda/derecha.
  27. Vaya a Calcular estadísticas VOI seleccionadas en la parte superior de la ventana de lista de VOIs. Navegue al icono Seleccionar estadísticas que se calcularán para elegir los datos de salida (en el lado derecho del icono de estadísticas VOI). Por lo general, para el contenido de mielina comprobar estadísticas para el grupo de VOIs, Promedio, SD, Min, Max).
    NOTA: Aparecerá una hoja de cálculo. La configuración predeterminada de Unidad de datos es kBq/cc. En la parte superior izquierda de la hoja de cálculo (ESTADÍSTICAS VOI) puede comprobar la unidad de datos como SUV (valor de captación estandarizado). Si completó correctamente los detalles de administración de radiosonda y adquisición de imágenes en el software del escáner, como se describió anteriormente, los datos del SUV serán calculados automáticamente por el software PMOD, si no, puede editar los detalles.
  28. Vaya a Copiar utilizando el formato de número de configuración regional del sistema.
    NOTA: Verifique si todas las estadísticas están seleccionadas para copiar como salida (marque el icono en la parte superior derecha de la pantalla). Los datos que se copiarán dependen de la unidad de datos seleccionada.
  29. Pegue los datos de salida en un bloc de notas o hoja de cálculo.
    NOTA: Tenga cuidado con la configuración de software para símbolos de puntos y comas entre números. Esto puede ser diferente entre las configuraciones de idioma.
  30. Guarde el archivo con el nombre y los detalles del estudio.

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Representative Results

La Figura 1 muestra imágenes ilustrativas de PET de 11C-PIB con cambios de mielina con el tiempo. En el análisis de línea base, no se pueden ver diferencias en el contenido de mielina (es decir, no hay desmielinización presente). En la imagen de punto de tiempo de 1 semana, es posible ver la lesión desmielinada focal (en el hemisferio derecho) como lo indica la flecha blanca. Las imágenes se presentan en los 3 planos anatómicos (coronal, axial y sagital) y es posible identificar la lesión desmielinada en todos ellos. La imagen de 1 semana es la ilustración de una lesión bien delimitada en el lugar de inyección, que representa la correcta inducción del modelo y la detección de imágenes. En la imagen de 4 semanas, ya no hay ninguna lesión visible, lo que indica que se ha producido una remielinación y que el contenido de mielina ha vuelto a la normalidad (o cerca de ella).

Los gráficos representativos muestran la cuantificación de las imágenes de 4 animales en los 3 puntos de tiempo diferentes. El primer gráfico muestra los resultados de la cuantificación de la lesión (VOI manual) a la relación lateral contralateral que demuestra cambios de mielina más focales, donde se realizó la inyección de lisolesterotina. El segundo gráfico muestra la misma cuantificación, pero en el estriado (estriado inyectado a relación contralateral) y en este caso la diferencia no es estadísticamente significativa, lo que puede explicarse por el pequeño tamaño de la muestra y porque el VOI es mayor y la concentración de radiactividad se mide no sólo donde se inyectó la lisolecitina.

Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por la prueba Kruskal Wallis, seguida por la prueba de Dunn para múltiples comparaciones y los resultados se presentan como media ± SD. En la lesión VOI (H = 7.063; P=0,017), en la imagen de 1 semana, la relación de absorción del trazador (0,90±0,07) fue un 16% inferior a la línea de base (1,07±0,06), con significación estadística (p=0,024). No se encontraron diferencias significativas en la imagen de 4 semanas (1.01±0.06).

En el estriado, no se encontraron diferencias estadísticas (H =1.412; P=0,5393). Los ratios de captación de las imágenes fueron 1,07±0,07 para la línea de base, 1,02±0,07 durante 1 semana y 1,01±0,08 durante 4 semanas.

El tercer gráfico (línea inferior, gráfico izquierdo) presenta la cuantificación del estriado contralateral (lado no inyectado). En este gráfico es posible observar que no había diferencia (P=9397) entre los puntos de tiempo, lo que significa que la variación en el lado inyectado se debe a los cambios de mielina y no debido a la variación de absorción del trazador con el tiempo.

El gráfico final, en la parte inferior derecha, muestra la cuantificación del sitio inyectado (VOI de lesiones) en animales donde el modelo no fue bien inducido (probablemente debido a una rápida inyección de liolecitina, manipulación estereotáxica incorrecta y/o preparación incorrecta de la solución). En este caso, la absorción más baja no se ve en el punto de tiempo de 1 semana, lo que significa que no se ha producido ningún proceso de desmielinización, y la baja absorción a las 4 semanas puede estar relacionada con un proceso posterior de desmielinización o daño tisular, ambas situaciones están relacionadas con la inducción de modelos animales malos. Este gráfico se añadió al protocolo para ejemplificar la aparición de los resultados cuando la inducción animal no está bien realizada y para enfatizar la importancia de cada paso del protocolo, desde el principio hasta el final. No hay diferencias en la captación del trazador (H = 2.745, P = 0.267) con relaciones de absorción de 1.06±0.05, 1.02±0.14 y 0.96±0.10 para imágenes de BASE, 1 semana y PET de 4 semanas.

La Figura 2 añade más información a los resultados, donde la Figura 2A detalla dónde se dibujó el VOI manual, basado en la referencia de la plantilla de RMN y la Figura 2B muestra la tinción azul brillante luxol (para obtener detalles sobre el protocolo de tinción azul rápido luxol, ver De Paula Faria et al.13) desde el lado inyectado y el lado no inyectado a los 7 días después de la inyección estereotáxica.

Figure 1
Figura 1: Ilustrativa 11imágenes pet C-PIB que muestran imágenes de línea base, 1 semana y 4 semanas después de la inyección estereotáctica. Los gráficos en la parte inferior de la figura representan la cuantificación de la captación del trazador (n=4) en diferentes puntos de tiempo. Los dos primeros gráficos representan la relación de absorción en el lado inyectado al lado contralateral en la lesión y en el estriado en un modelo bien inducido (es decir, ratas que presentan lesión después de la inyección de lisolcitina). El tercer gráfico (abajo a la izquierda) muestra la cuantificación del estriado no inyectado (control negativo), y el gráfico final (parte inferior derecha) representa la absorción de 11C-PIB en el lugar de inyección de animales que no presentaban lesión desmielinada (modelo mal inducido). Los resultados se presentan como media±SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Detalles de la ubicación de la lesión. A) VOIs ilustrativos de lado inyectado (línea discontinua) y lado no inyectado (línea blanca) dibujados manualmente en función de la plantilla de RMN (región de cuerpo calloso y estriado) a la 1 semana después de la inyección estereotáctica. B) Tinción azul rápido Luxol que muestra desmielinización en el hemisferio inyectado en comparación con el lado no inyectado (Superior: aumento de 40x, inferior: aumento de 100x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La mayor ventaja de usar el modelo de lysolecihin para estudiar la esclerosis múltiple es la línea de tiempo rápida para la desmielinización (aproximadamente 1 semana) y la remyelination (aproximadamente 4 semanas) que ocurrirá14. Este modelo también puede ser inducido en ratones15,sin embargo, la inducción en ratas es más ventajosa para las imágenes de PET in vivo debido al mayor tamaño del cerebro de la rata en comparación con los ratones.

El primer paso del modelo de inducción es ser extremadamente cauteloso. Este modelo fue validado para imágenes de PET de mielina por de Paula Faria et al.10 en 2014 y se demostró que la velocidad de la inyección de lisolcitina dentro del cerebro es crucial para un modelo bien inducido. La inyección debe realizarse muy lentamente, 1 μL cada 10 min, como una forma de evitar daños tisulares. La solución de lysolecihin también debe prepararse el mismo día que la inyección estereotáctica, preferiblemente justo antes de iniciar el procedimiento quirúrgico. Si el modelo se utilizará por primera vez en un grupo de investigación, recomendamos que el modelo se valide antes de realizar cualquier cuantificación de mielina por imágenes de PET. La validación debe incluir el análisis de tejido post mortem por tinción de mielina, por ejemplo: histología azul rápido Luxol, como se muestra en la Figura 2,y inmunohistoquímica de proteína básica de mielina (MPB), en los diferentes puntos de tiempo destinados a ser utilizados en análisis in vivo. En la sección de resultados mostramos una cuantificación de la absorción de radiotrabador donde la inducción de lesiones no tuvo mucho éxito y, por lo tanto, las diferencias no fueron detectadas por 11imágenes de PET C-PIB.

La lesión que debe cuantificarse con esta técnica debe ser mayor que la resolución del escáner pet (aproximadamente 1 mm en equipo preclínico y unos 5 mm en equipos clínicos).

Una vez que el modelo está bien inducido, el procedimiento de diagnóstico por imágenes debe estar bien planificado, debido al radiopaso etiquetado con carbono-11, que tiene una vida media corta de 20 minutos. El personal del laboratorio de imágenes preclínicas necesita preparar todo el material necesario, llenar el sistema de anestesia, comprobar si todo funciona correctamente e imprimir los formularios que se completarán durante el experimento. El escáner pet también debe verificarse antes del experimento, cuando todos los controles de calidad necesarios en el equipo (dependiendo de cada país) deben realizarse para comprobar que el escáner funciona bien. Después de recibir el trazador para inyección, la medición de la actividad también debe medirse en un calibrador de dosis calibrado para garantizar la dosis correcta inyectada, y la información (actividad en la jeringa, antes y después de la inyección) escrita en el formulario, así como el momento respectivo en que se realizó la medición. Establecer qué reloj se va a utilizar, ya que el momento adecuado es el tiempo en la estación de trabajo del escáner pet, el tiempo que se considerará en la corrección de decaimiento de las imágenes, por lo tanto, cualquier reloj utilizado durante el experimento debe sincronizarse con el tiempo de estación de trabajo del escáner.

Durante la adquisición de imágenes de animales, se debe controlar la temperatura y la respiración animal y ajustar la anestesia, según sea necesario. La temperatura depende de la ubicación y debe ajustarse para el bienestar animal. Una vez finalizada la adquisición de la imagen, es importante mantener al animal en una almohadilla caliente para recuperarse antes de ser devuelto a la jaula.

El procesamiento de imágenes es crucial para obtener resultados fiables de los experimentos mediante imágenes de PET. Lo ideal es que el analizador no sea consciente de los grupos de animales y/o tratamiento y que ya tenga experiencia en imágenes PET con el trazador pet utilizado de tal manera que garantice un registro perfecto entre la plantilla de imágenes pet y rmn. Utilizamos el software PMOD en este protocolo, pero si este software no está disponible, se puede utilizar software alternativo de cuantificación de imágenes, aunque se debe prestar atención a lograr una buena definición y cuantificación de la región cerebral. Para la definición de la ubicación de la lesión, se debe tener especial cuidado para asegurarse de que el sitio inyectado está dentro de la lesión dibujada VOI (un conocimiento de anatomía cerebral de rata es necesario).

Es importante decir que las imágenes de PET de mielina también se pueden realizar en otros modelos animales de EM, mostrando lesiones impredecibles, como ya demostró nuestro grupo en la encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) marmoset modelo5. Como ya se ha indicado, el parámetro importante a tener en cuenta en la cuantificación de lesiones es la resolución del escáner de PET, que es la limitación para la detección de lesiones que son demasiado pequeñas. La imagen pet es una técnica de imagen de baja resolución en comparación con otras técnicas como la RMN, sin embargo, es una modalidad muy específica y, debido a esto, la cuantificación de las imágenes pet utiliza una plantilla anatómica, como la RESONANCIA MAGNÉTICA, para ayudar a dibujar la región de interés, como se muestra en el protocolo anterior.

Aunque el dibujo manual de VOIs depende del operador, es la mejor opción para el modelo animal LPC, ya que la lesión puede ser variable entre animales. Para disminuir el sesgo en el proceso de cuantificación, es importante realizar un VOI espejo, como se explica en el protocolo, que estará en la misma región y del mismo tamaño que el lado inyectado. También es importante tener las coordenadas estereotáxicas en mente al dibujar el VOI en la plantilla de RMN para garantizar que se considere la región cerebral correcta. El uso de la tinción de mielina como guía para identificar el área desmielinada también puede ayudar en el dibujo, como se explica en de Paula Faria12.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

β-cube equipment (Molecubes NV, Bélgica) fue apoyado por la São Paulo Research Foundation, FAPESP - Brasil (#2018/15167-1). LES tiene una beca de estudiante de doctorado de FAPESP - Brasil (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

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References

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  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Neurociencia Número 168 11C-PIB Imágenes de PET mielina esclerosis múltiple imágenes moleculares modelo de rata de liolecitina análisis de VOI

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

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de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Imágenes de tomografía por emisión de Positron para la medición <em>in vivo</em> del contenido de mielina en el modelo de rata de lysolecitina de esclerosis múltiple
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