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प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल।

Published: February 14, 2021 doi: 10.3791/62100
Automatic Translation
*1,2, *2, 1, 1, 1,2, 2, 2, 1
1AO Research Institute Davos, Davos, Switzerland, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Centre-Albert-Ludwigs-University of Freiburg, Faculty of Medicine, Albert-Ludwigs-University of Freiburg, Freiburg, Germany
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क डिजनरेशन का अनुकरण करने के लिए प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी गोजातीय अंग संस्कृति का एक उपन्यास प्रयोगात्मक मॉडल प्रस्तुत करता है।

Abstract

रोगसूचक इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) डिजनरेशन (आइडी) एक प्रमुख सामाजिक आर्थिक बोझ है और सूजन और ऊतक क्षरण की विशेषता है। कारक चिकित्सा की कमी के कारण, इस रोग की प्रगति में शामिल तंत्र का अध्ययन करने, चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने और पशु मॉडलों की आवश्यकता को कम करने के लिए अभिनव प्रायोगिक अंग संस्कृति मॉडलों की तत्काल आवश्यकता है । हम यहां एक उपन्यास, त्रि-आयामी अंग संस्कृति मॉडल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रोइंफ्लेमेटरी और कैटाबोलिक माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करते हैं, जो आइडी के दौरान मौजूद है।

प्रारंभ में, गोजातीय कौडल आईवीडी को ऊतक संस्कृति माध्यम में विच्छेदित, साफ और सुसंस्कृत किया गया था। डायनेमिक फिजियोलॉजिकल या पैथोलॉजिकल लोडिंग को प्रति दिन 2 घंटे के लिए कस्टम-मेड बायोरिएक्टर में लागू किया गया था। आईवीडी को चार दिनों के लिए एक नियंत्रण समूह (उच्च ग्लूकोज माध्यम, शारीरिक लोडिंग, फॉस्फेट-बफर खारा इंजेक्शन) और एक पैथोलॉजिकल समूह (कम ग्लूकोज माध्यम, रोग लोडिंग, ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा इंजेक्शन) को सौंपा गया था। वातानुकूलित अंग संस्कृति मीडिया के आईवीडी और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख की एकत्र नाभिक लुगद कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था।

हमारे डेटा ने नियंत्रण समूह की तुलना में पैथोलॉजिकल समूह में लोड होने के बाद भड़काऊ मार्कर और कम डिस्क हाइट्स की उच्च अभिव्यक्ति का पता चला। यह प्रोटोकॉल आईवीडी सूजन और पतन का अनुकरण करने के लिए विश्वसनीय है और इसके आवेदन दायरे को व्यापक बनाने के लिए आगे विस्तार किया जा सकता है।

Introduction

कम पीठ दर्द (एलबीपी) सभी उम्र के व्यक्तियों को प्रभावित कर सकता है और दुनिया भर में विकलांगता का एक प्रमुख कारण है1,2,3. एलबीपी से जुड़ी कुल लागत प्रति वर्ष 100 बिलियन डॉलर से अधिक है,5. रोगसूचक इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) अध: पतन (आइडी), सूजन और ऊतक क्षरण की विशेषता वाली स्थिति,एलबीपी 6,7का एक प्रमुख कारण है। विशेष रूप से, आइडी को आईवीडी के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के धीरे-धीरे विकसित होने वाले टूटने की विशेषता है, जो कई कारकों से प्रेरित और ट्रिगर होता है जो त्वरित विकृति, न्यूरोलॉजिकल विकारों और अंततः विकलांगता का कारण बनता है। इसके अलावा, आइडी प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स, बदल रीढ़ बायोमैकेनिक्स, एंजियोजेनेसिस और तंत्रिका अंतर्वृद्धि की रिहाई से जुड़ा हुआ है, जो दर्द सनसनी को बढ़ाता है, पूरी तरह से क्रोनिक एलबीपी (सक्रिय डिस्कोथंडी)6,8का कारण बनता है। आज तक, उपचार विकल्पों में आसन्न कशेरुकी के डिस्केक्टॉमी और बाद में संलयन, आईवीडी कृत्रिम अंग का प्रत्यारोपण, या गैर-शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण, जैसे गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवाएं, ओपिओइड, औरआइडी 9वाले रोगियों के लिए मांसपेशियों में आराम करने वाले शामिल हैं। दोनों वर्तमान मानक चिकित्सीय विकल्प, शल्य चिकित्सा और गैर शल्य चिकित्सा, केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अंतर्निहित जैविक समस्या9,10को संबोधित करने में विफल रहे हैं । प्रारंभिक चरण अपक्षयी डिस्क रोग एक प्रारंभिक भड़काऊ ऊतक प्रतिक्रिया की विशेषता है, विशेष रूप से ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (टीएनएफ-अल्फा) अभिव्यक्ति11में वृद्धि। ये प्रारंभिक डिस्क परिवर्तन मुख्य रूप से डिस्क वास्तुकला को बाधित किए बिना सेलुलर स्तर पर होते हैं और पहले12समर्थक भड़काऊ स्थितियों के तहत पोषण की कमी से नकल की जा सकती थी। इसलिए, इन पतन तंत्रों की जांच करने और उपयुक्त चिकित्सीय लक्ष्यों को खोजने के लिए वीवो स्थिति का सटीक अनुकरण महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, आणविक गुणों के इन सिमुलेशन के लिए, डिस्क का यांत्रिक लोडिंग वातावरण आईवीडी के पैथोलॉजिकल और शारीरिक परिवर्तनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। नतीजतन, इन दृष्टिकोणों के संयोजन से हमें वीवो में आईवीडी के जटिल माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए एक कदम आगे लाया जा सकेगा । वर्तमान में हमारे ज्ञान के सर्वश्रेष्ठ करने के लिए समर्थक भड़काऊ और पोषण सेटिंग के साथ गतिशील लोडिंग के पहलू पर विचार करने वाले कोई अध्ययन नहीं हैं।

हालांकि बड़े पशु मॉडल वीवो इंटरैक्शन में प्रासंगिक संभावित की जांच की अनुमति देते हैं, वे महंगे होते हैं और गहन काम करते हैं। इसके अलावा, चूंकि अनुसंधान में पशु मॉडलों का उपयोग लंबे समय से विवाद का विषय रहा है, इसलिए महत्वपूर्ण शोध प्रश्नों के उत्तर देने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी काफी रुचि है । अंत में, आईवीडी अनुसंधान13,14में आइडी की नकल करने के लिए वर्तमान में कोई आदर्श पशु मॉडल नहीं है। इसलिए, आइडी और संबद्ध भड़काऊ और अपक्षयी प्रक्रियाओं का अनुकरण करने के लिए एक अंग संस्कृति मॉडल जैसे लागत प्रभावी और विश्वसनीय प्रतिस्थापन स्थापित करना आवश्यक है। हाल ही में, प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी और अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल की स्थापना पर वर्तमान प्रोटोकॉल के आवेदन ने हमें आइडी अंग संस्कृति15में विरोधी भड़काऊ दवाओं के प्रभाव की जांच करने की अनुमति दी।

यहां, हम वर्णन करते हैं कि गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क कैसे प्राप्त करें और ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (टीएनएफ-α) के प्रत्यक्ष इंट्राडिस्कल इंजेक्शन के कारण एक कैटाबोलिक और प्रोइनफ्लेमेटर माइक्रोएनवायरमेंट के माध्यम से प्रारंभिक चरण की आइडी की स्थिति को प्रेरित करें और कम पोषक मध्यम परिस्थितियों में बायोरिएक्टर में अपक्षयी लोडिंग करें। चित्रा 1 प्रायोगिक मॉडल को दिखाता है और अपक्षयी और शारीरिक लोडिंग स्थितियों का अनुकरण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर को दिखाता है।

Figure 1
चित्र 1:प्रायोगिक सेटअप का चित्रण। एक:गोजातीय पूंछ; बी:विच्छेदित गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क; सी:डिस्क का संस्कृति माध्यम के साथ एक अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करना; घ:एक बायोरिएक्टर में सिमुलेशन लोड करना; ई:इंट्राडिस्कल इंजेक्शन तकनीक; एफ:वितरण प्रकट करने के लिए पीबीएस/ट्राइपैन ब्लू डाई के इंजेक्शन के बाद आईवीडी । आइडी: इंटरवर्टेब्रल डिस्क डिजनरेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

स्थानीय बूचड़खानों से प्राप्त गोजातीय पूंछ का उपयोग करके प्रयोग किए गए। वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल जैविक सामग्री खाद्य श्रृंखला से लिया जाता है और स्विस और यूरोपीय कानून में कोई नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता है ।

1. गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क का विच्छेदन

  1. सतह पर गंदगी और बालों को हटाने के लिए नल के पानी के साथ पूरी पूंछ को अच्छी तरह से कुल्लाएं।
    नोट: बरकरार, डिस्टल समाप्त होने के साथ, आईवीडी के वांछित आकार के आधार पर प्रयोगों के लिए अधिकतम 9 आईवीडी (कोसिगल 1-9) प्रति पूंछ का उपयोग किया जा सकता है। 15-20 मिमी के बीच वांछित व्यास को ध्यान में रखते हुए, हमने प्रयोगों के लिए प्रति पूंछ 5 IVDs के साथ 12 गोजातीय पूंछ का उपयोग किया।
  2. 10 मिनट के लिए 1% बीटाडीन समाधान वाले बॉक्स में पूरी पूंछ विसर्जित करें। संक्षेप में बाँझ धुंध के साथ पूंछ सूखी और यह एक बाँझ कपड़ा पर जगह है।
    नोट: डिस्क के विच्छेदन के दौरान, निर्जलीकरण को रोकने के लिए रिंगर के समाधान गीला धुंध के साथ पूंछ को आर्द्र करें। पूरी विच्छेदन प्रक्रिया पूरी होने तक गीली धुंध में लिपटे पूंछ (या बाएं-ओवर सेगमेंट) को स्टोर करें।
  3. आईवीडी की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए कौडल रीढ़ से पूरी तरह से नरम ऊतक को हटाने के लिए एक स्केलपेल (नंबर 20) का उपयोग करें। हड्डी हटाने चिमटा के साथ कशेरुकी की पतली और ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं को हटा दें।
    नोट: वांछित व्यास के साथ आईवीडी का चयन करें। वर्तमान अध्ययन में 15-20 मिमी व्यास रेंज वाले आईवीडी का उपयोग किया गया था।
  4. व्यक्तिगत गति खंडों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कशेरुकी शरीर के बीच के माध्यम से हड्डी चिमटा के साथ पार से कटें। रिंगर के समाधान के साथ गीला धुंध के साथ एक पेट्री डिश में मोशन सेगमेंट रखो।
  5. टटोली द्वारा और गति खंडों को धीरे-धीरे स्थानांतरित करके आईवीडी और कशेरुका का पता लगाएं। आईवीडी की ग्रोथ प्लेट में देखे गए बैंड के साथ दो समानांतर कटौती करें, जो आईवीडी के प्रत्येक पक्ष पर एक है। कन्वर्टा की ओर आईवीडी से लगभग 0.5-1 मिमी की सुरक्षा दूरी के साथ डिस्क (नरम) के निकट बोनी एंडप्लेट भाग (हार्ड) की उत्तल साइट को छूकर और खोजने के द्वारा विकास प्लेट के स्थान की पहचान करें। सुनिश्चित करें कि बैंड देखा के ब्लेड रिंगर के समाधान के साथ ठंडा है, जबकि कशेरुकी काटने ।
  6. रिंगर के समाधान के साथ गीले स्वच्छ धुंध के साथ एक साफ पेट्री डिश में आईवीडी स्थानांतरित करें।
    नोट: धुंध को गीला किया जाना चाहिए और आईवीडी की सूजन को रोकने के लिए बहुत गीला नहीं होना चाहिए,
  7. कशेरुकी शरीर (लाल/गुलाबी हड्डी), विकास प्लेट (सफेद उपास्थि) को कुरेदने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें, एंडप्लेट को बरकरार (पीला-गुलाबी) छोड़ दें। लोडिंग प्रक्रिया के लिए दो सतहों को सपाट और समानांतर बनाएं। रिंगर के समाधान के साथ गीला धुंध के साथ एक ताजा पेट्री डिश में स्क्रैप किए गए आईवीडी स्थानांतरित करें।
    नोट: आईवीडी और स्क्रैपिंग को पकड़ते समय हाथ की रक्षा के लिए एक चेनमेल दस्ताने पहनें।
  8. एक कैलिपर के साथ डिस्क ऊंचाई और व्यास को मापें। जेट लावेज सिस्टम का उपयोग करके रिंगर के समाधान के साथ कशेरुकी हड्डी में रक्त के थक्के को साफ करें।
  9. आईवीडी को 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब, एक आईवीडी प्रति ट्यूब में स्थानांतरित करें। फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) + 10% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) प्रति IVD के 25 एमएल जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर पर 15 मिनट के लिए मिलाते हुए छोड़ दें ।
  10. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और आईवीडी को कुल्ला करने के लिए 2 मिनट के लिए पीबीएस + 1% पी/एस प्रति आईवीडी के 10 एमएल जोड़ें ।

2. आईवीडी संस्कृति और लोडिंग

  1. आईवीडी कक्षों में डिस्क स्थानांतरित करें और आईवीडी संस्कृति माध्यम जोड़ें (दुलबेको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम, शारीरिक समूह के लिए 4.5 ग्राम/एल उच्च ग्लूकोज डीएमईएम और रोग समूह के लिए 2 ग्राम/एल कम ग्लूकोज डीएमईएम) + 1% पी/एस + 2% भ्रूण बछड़ा सीरम + 1% 1% इसके (इसमें 5 g/ml इंसुलिन शामिल है, 6 μg/mL ट्रांसफरिन, और 5 एनजी/एमएल सेलेनियस एसिड) + ५० μg/mL ascorbate-2-फॉस्फेट + 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड + ५० μg/प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एमएल एंटीमाइक्रोबियल एजेंट) और ३७ डिग्री सेल्सियस, ८५% और 5%आर्द्रतापर एक इनक्यूबेटर में जगह है ।
  2. प्रायोगिक समूहों के अनुसार बायोरिएक्टर प्रणाली के भीतर 4 दिनों के लिए डिस्क संस्कृति16। पैथोलॉजिकल ग्रुप में 0.32-0.5 एमपीए, 2 घंटे/दिन के लिए 5 हर्ट्ज पर अपक्षयी लोडिंग की स्थिति बनाए रखें । शारीरिक नियंत्रण समूह में, 0.02-0.2 एमपीए, 2 एच/डे के लिए 0.2 हर्ट्ज के लोडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    नोट: लोडिंग प्रक्रियाओं के दौरान आईवीडी माध्यम के 5 एमएल वाले कक्षों में आईवीडी की स्थिति। मात्रा बायोरिएक्टर के लोडिंग कक्षों के आकार पर निर्भर करती है। लोडिंग प्रक्रियाओं के बीच, आईवीडी को छह-अच्छी प्लेटों में रखें, जिसमें आईवीडी संस्कृति माध्यम के 7 एमएल के साथ मुफ्त-सूजन वसूली के लिए है।
  3. प्रायोगिक अवधि के दौरान डिस्क ऊंचाई में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए, आईवीडी विच्छेदन (बेसलाइन) के बाद कैलिपर के साथ डिस्क ऊंचाई को मापें और फिर मुफ्त सूजन अवधि के बाद और प्रायोगिक अवधि के लिए गतिशील लोडिंग के बाद दैनिक।

3. इंट्राडिस्कल ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α) इंजेक्शन

  1. सीधे 1 दिन पहले गतिशील लोडिंग चक्र के बाद, एक वर्टिकल स्थिति में एक पेट्री डिश में आईवीडी रखें और एक चिमटी के साथ आईवीडी को स्थिर करें।
  2. रोग समूह 17 के नाभिक पल्पोसस ऊतक में 30 गेज इंसुलिन सुई के साथ पुनः संयोजन टीएनएफ-α (पीबीएस प्रति आईवीडी के70माइक्रोन में 100 एनजी) इंजेक्ट करें। 1 मिनट में लगभग 70 माइक्रोन की गति से धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
  3. इंजेक्शन के बाद, सिरिंज को आईवीडी के भीतर आधे रास्ते में खींचें और सिरिंज प्लंजर को एक वैक्यूम बनाने के लिए खींचें जो इंजेक्शन समाधान को वापस लीक करने से रोकता है, सुई और सिरिंज को पूरी तरह से आईवीडी से हटाने से पहले।
    नोट: लोडिंग और रातभर संस्कृति के बाद इंजेक्शन समाधान के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए ट्राइपैन ब्लू डाई युक्त पीबीएस इंजेक्शन द्वारा एक प्रायोगिक प्रयोग करें।

4. जीन अभिव्यक्ति

  1. 4 दिन पर आईवीडी की कटाई करें। बायोप्सी पंच के साथ नाभिक पल्पसस (एनपी) ऊतक (आईवीडी के बीच में जेली हिस्सा) ले लीजिए। एक स्केलपेल ब्लेड (नंबर 20) के साथ बाहरी annulus फाइब्रोसस (एएफ) ले लीजिए।
    नोट: 0 दिन में बेसलाइन संदर्भ के लिए, आरएनए निष्कर्षण के लिए विच्छेदन के तुरंत बाद ऊतकों को इकट्ठा करें।
  2. प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आवश्यक एनपी या एएफ ऊतक की मात्रा का उपयोग करें।
    नोट: वर्तमान प्रयोगों के लिए, लगभग 150 मिलीग्राम ऊतक का उपयोग किया गया था। ऊतक द्रव्यमान के लिए आरएनए अलगाव समाधान का अनुपात कुशल निष्कर्षण के लिए प्रति 100-150 मिलीग्राम ऊतक कम से कम 2 मिलीग्राम होना चाहिए।
  3. पाचन समाधान के साथ एनपी या वायु सेना के ऊतकों को पचाएं (डीएमईएम में 0.2% प्रोनेस, फ़िल्टर स्टरलाइज्ड) और चुंबकीय सरगर्मी 18 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर1घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके ऊतक के नमूनों को फ्लैश-फ्रीज करें और एक ठीक पाउडर में स्पंदित करें। पल्वराइज्ड टिश्यू पाउडर को समान रूप से दो 2 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें प्रत्येक में 1 एमएल ग्वानाइन डाइओसाइनेट और फिनॉल एक मोनोफेज समाधान (आरएनए आइसोलेशन सॉल्यूशन) में शामिल हैं।
  5. आरएनए आइसोलेशन सॉल्यूशन और पल्वराइज्ड टिश्यू पाउडर युक्त 2 एमएल ट्यूबों में समरूपता का प्रदर्शन करें। टिश्यू पाउडर 5x को 8 एमएम स्टेनलेस स्टील बॉल के साथ और 3 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर टिश्यू-लाइजर। 12,000 x g,10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज और एक ताजा ट्यूब के लिए सुपरनेट स्थानांतरित करें। सुपरनेटैंट्स को कम से कम एक महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. आरएनए आइसोलेशन सॉल्यूशन के प्रति 1-ब्रोमो-3-क्लोरोप्रोपेन (बीसीपी) प्रति 1 मिलियन का 0.1 एमएल जोड़ें और 15 एस के लिए सख्ती से हिलाएं। परिणामस्वरूप मिश्रण को कक्षीय शेखर पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
    नोट: आरएनए ऊपरी जलीय चरण में विशेष रूप से रहता है ।
  7. जलीय चरण को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और शुरुआती समरूपता के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए आइसोप्रोपेनॉल के 0.25 एमएल और उच्च नमक वर्षा समाधान के 0.25 एमएल के साथ आरएनए को स्थानांतरित करें। एक कक्षीय शेखर और अपकेंद्रित्र पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर स्टोर करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कॉलम-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग करें जो आम तौर पर उच्च आरएनए शुद्धता की ओर जाता है लेकिन कम आरएनए उपज होता है।
  8. सुपरनेट निकालें और आरएनए पेलेट को प्रारंभिक समरूपता के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए आइसोलेशन समाधान के प्रति 1 मिलीलन प्रति 75% इथेनॉल के 1 मिलियन के साथ धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  9. इथेनॉल धोने और संक्षेप में हवा-सूखी आरएनए गोली को 3-5 मिनट के लिए निकालें। एक पिपेट टिप के माध्यम से समाधान को कई बार पारित करके और 55-60 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके डायथिलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के 20 माइक्रोन में आरएनए को भंग करें।
  10. क्रमशः 230 एनएम, 260 एनएम, और 280 एनएम (A230, A260 और A280) पर अवशोषण को मापें। 1.0 का A260 40 μg/mL आरएनए से मेल खाता है। 1.6-1.9 के A260/A280 अनुपात की उम्मीद है, जबकि संदूषण के परिणामस्वरूप <1.6 के A260/A280 अनुपात में है ।
  11. 20 माइक्रोल रिएक्शन वॉल्यूम के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (आरटी) रिएक्शन मिक्स तैयार करें। मिश्रण में आरटी एंजाइम मिक्स, रिबोन्यूक्लियेज अवरोधक, हेल्पर प्रोटीन, प्राइमर, डीएनटीपीएस, एमजीसीएल2,आरएनएई मुफ्त पानी और आरएनए नमूने का 0.4 माइक्रोग्राम शामिल है।
  12. संक्षेप में ट्यूब के तल पर सभी घटकों को मिलाने के लिए आरटी ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।
  13. नमूनों को थर्मोसाइकिलर यंत्र में रखें। आरटी के लिए उपयुक्त कार्यक्रम का चयन करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए आरटी चलाएं, इसके बाद 42 डिग्री सेल्सियस पर 120 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन स्टेप और 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज की निष्क्रियता, अंत में इसे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाए।
  14. इसके परिणामस्वरूप सीडीएनए को ट्रिस (हाइड्रोक्सीमेथाइल) अमीनोमेथेन (ट्रिस)-एथिलेंडियामाइनेट्राएकेटिक एसिड (EDTA) (TE) बफर (1 एमएम ईडीटीए के साथ 10 एमएम ट्रिज़) के साथ 0.4 माइक्रोन आरएनए की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें जो आरटी प्रति 100 μL cDNA समाधान के लिए उपयोग किया जाता है। सीडीएनए नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. 10 माइक्रोल रिएक्शन वॉल्यूम का उपयोग करके वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें। प्रतिक्रिया की मात्रा में मास्टर मिश्रण होता है (डीएनए पॉलीमरेज युक्त, उरासिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज, DUTP, निष्क्रिय संदर्भ और अनुकूलित बफर घटकों के साथ dNTPs), फॉरवर्ड प्राइमर 45 माइक्रोन, रिवर्स प्राइमर 45 माइक्रोन, जांच 12.5 माइक्रोन (जांच के 5' अंत से जुड़े एक रिपोर्टर डाई युक्त, जांच के 3 ' अंत में एक मामूली नाली बांधने की मशीन, और जांच के 3 ' अंत में एक nonfluorescent quencher) , 2 माइक्रोन सीडीएनए और डीईपीसी-उपचारित पानी।
  16. 2-ΑCT विधि19के साथ सापेक्ष मात्राकरण के लिए एक अंतर्जात नियंत्रण (आरपीएलपी0) चलाएं।
  17. डुप्लीकेट में नमूने जोड़ें और सीडीएनए के बजाय ते-बफर जोड़कर नो टेम्पलेट कंट्रोल चलाएं। मानक स्थितियों पर पीसीआर चलाएं (50 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के 40 चक्र, और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट)।
  18. तुलनात्मक सीटी विधि के बाद एमआरएनए लक्ष्यों के सापेक्ष मात्राकरण करें। बेसलाइन नमूने के लिए सामान्यीकृत एमआरएनए की मात्रा की गणना 2-एनएसीटीके रूप में की जाती है, जबकि एनएसीटी बेसलाइन नमूने के नमूने और आईसीटीटी (सीटी लक्ष्य और सीटी अंतर्जात नियंत्रण) के बीच अंतर है।

5. आईवीडी माध्यम में प्रोटीन सामग्री का मात्राकरण

  1. माध्यम में प्रोटीन की मात्रा को मापने के लिए आईवीडी नमूनों द्वारा वातानुकूलित माध्यम एकत्र करें। टारगेट प्रोटीन के प्रोटोकॉल के मुताबिक एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसॉरबेंट परख (एलिसा) करें।
  2. निर्माता के निर्देश के अनुसार गोजातीय इंटरल्यूकाइन-8 (आईएल-8) एंटी-गोजातीय आईएल8 एलिसा किट द्वारा निर्धारित किया गया है।

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Representative Results

टीएनएफ-α इंजेक्शन के साथ संयुक्त कम ग्लूकोज माध्यम में अपक्षयी लोडिंग के कारण संस्कृति के 4 दिनों(चित्रा 2)के बाद एनपी कोशिकाओं में शारीरिक नियंत्रण समूह की तुलना में प्रोइनफ्लेमेटरी मार्कर इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) और इंटरल्यूकिन 8 (आईएल-8) की जीन अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इसके विपरीत, हमने एनपी कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाए गए) में प्रोइनफ्लेमेटरी जीन इंटरल्यूकिन 11 (आईएल-1) और टीएनएफ-α के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पालन नहीं किया। इसके अलावा, अपक्षयी संस्कृति की स्थिति ने वायु सेना की कोशिकाओं में आईएल-6 और आईएल-8 की जीन अभिव्यक्ति को नहीं बदला।

Figure 2
चित्रा 2:नाभिक पल्पोसस (एनपी) ऊतक और annulus फाइब्रोसस (वायु सेना) ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति का स्तर । इन्हें शारीरिक या रोग संस्कृति स्थिति के तहत संस्कृति के 4 दिनों के बाद मापा गया था, बेसलाइन (दिन 0) को सामान्यीकृत किया गया था। मतलब ± 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल एन = 8, **p<0.01। इस आंकड़े को20से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन अभिव्यक्ति के निष्कर्षों के अनुरूप, माध्यम में आईएल-8 प्रोटीन सामग्री ने शारीरिक स्थिति(चित्रा 3)की तुलना में 2 दिन और 4 दिनों के बाद उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई । हालांकि, 3 दिन में माप (मुक्त सूजन या लोडिंग के बाद) अध्ययन समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर का पता चला, हालांकि परिणाम अपक्षयी समूह के लिए उच्च मूल्यों का संकेत दिया ।

Figure 3
चित्रा 3:मुक्त सूजन संस्कृति (एफएस) और गतिशील लोडिंग (लोड) के बाद आईवीडी संस्कृति माध्यम में समर्थक भड़काऊ प्रोटीन आईएल-8 रिलीज का परिमाणीकरण। परिणाम सामान्यीकरण के बिना माध्यम में एनजी/एमएल में मूल सांद्रता के रूप में दिखाए जाते हैं । मतलब ± 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल, एन = 8, **p<0.01। इस आंकड़े को20से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिस्क ऊंचाई (DH) विच्छेदन के बाद डीएच के लिए सामान्यीकृत परिवर्तन चित्र 4 में दिखाया गयाहै । जबकि डीएच कटौती के बाद लोड होने से शारीरिक समूहों की तुलना में अपक्षयी समूह के लिए उच्च मूल्यों (यानी, अधिक ऊंचाई में कमी) का पता चला, अध्ययन समूहों के बीच मुक्त सूजन अवधि के बाद डिस्क ऊंचाई लाभ में कोई अंतर नहीं देखा गया। यह संकेत दिया है कि रोग और शारीरिक समूह के बीच डिस्क ऊंचाई परिवर्तन में अंतर लोडिंग प्रक्रिया के बाद अधिक था । इसके अलावा, 2 और 3 दिनों पर माप की तुलना में 1 दिन के बाद मतभेद कम स्पष्ट थे, जो अपक्षयी और भड़काऊ स्थितियों के प्रगतिशील प्रभाव का संकेत देते हैं।

Figure 4
चित्र 4:डिस्क ऊंचाई आधारभूत मूल्यों (विच्छेदन के बाद) के लिए सामान्यीकृत परिवर्तन। मतलब 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल ±। एफएस: फ्री-सूजन। N=10, ***p<0.001. इस आंकड़े को20से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमने यहां अपक्षयी और भड़काऊ आईवीडीडी का अनुकरण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस प्रोटोकॉल को भड़काऊ रास्तों की विस्तृत परीक्षाओं के लिए लागू किया जा सकता है जिससे डिस्क पर विनाशकारी प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल रोग की प्रगति में शामिल आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों को निर्धारित करने में मदद कर सकता है।

हमने हाल ही में दिखाया है कि मानव पुनः संयोजन टीएनएफ-α गोजातीय और मानव एनपी कोशिकाओं21दोनों में सूजन पैदा कर सकता है, जो क्षेत्र में अन्य अध्ययनों के अनुसार है जो इस बात की पुष्टि करता है कि टीएनएफ-α का उपयोग आईवीडी कोशिकाओं22,23में सूजन सिमुलेशन के लिए किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, सूजन को प्रेरित करने के लिए प्रति IVD 100 एनजी टीएनएफ-α की खुराक का उपयोग किया गया था। इस खुराक में अपक्षयी लोडिंग और सीमित पोषण15,20के संयोजन में लागू होने पर भड़काऊ मार्कर को प्रभावीढंगसे शामिल दिखाया गया . आईवीडी डिजनरेशन के एकमात्र दीक्षा कारक के रूप में टीएनएफ-α का उपयोग करके हाल ही में किए गए एक अध्ययन में, आईवीडी21में भड़काऊ और अपक्षयी परिवर्तनों को शामिल करने के लिए 100 एनजी टीएनएफ-α/सेमी3 डिस्क वॉल्यूम की एक प्रभावी खुराक के रूप में निर्धारित किया गया है। यह सुझाव दिया जाता है कि सूजन को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली टीएनएफ-α खुराक को प्रजनन प्रभावों के लिए डिस्क की मात्रा में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि आईवीडी में इंजेक्शन सामग्री का अच्छा वितरण हो और बाद के प्रयोगों में यह इंजेक्शन पर्याप्त रूप से पुन: उत्पन्न होगा। चूंकि इंजेक्शन का दबाव व्यक्तियों के बीच भिन्न हो सकता है, इसलिए विभिन्न प्रयोगों में एक ही अध्ययन समूहों के बीच सामग्री का विभिन्न वितरण हो सकता है। एक दृष्टिकोण हम समान वितरण की जांच करने के लिए चुना PBS पतला ट्राइपन नीले इंजेक्शन का उपयोग कर रहा था । इंजेक्शन पंप और पूर्वनिर्धारित और प्रजनन योग्य इंजेक्शन दरों के साथ इंजेक्शन तकनीक को मानकीकृत करने की सिफारिश की जाती है। जैसा कि पहले दिखाया गया है, आईवीडी में 22 गेज, 25 गेज, या 30 गेज सुइयों के साथ एक एकल सुई पंचर का कारण नहीं था जो अध्ययन परिणामों के साथ बातचीत की20,21,24, 25। पदार्थ की मात्रा के लिए डिस्क आकार पर विचार करने की सिफारिश की जाती है और इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले सुई आकार के लिए। इसके अलावा , कई वलयाकार इंजेक्शन21,26के कारण संभावित अपक्षयी प्रभावों को उत्प्रेरित करने से बचने के लिए एक ही इंजेक्शन का उपयोग करने की सिफारिश कीजातीहै ।

वर्तमान मॉडल की कुछ सीमाओं को दूर करने की जरूरत है । आईवीडी की लोडिंग के लिए बायोरिएक्टर तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जो वर्तमान में आइडी पर काम करने वाली कई प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, प्रीक्लिनिकल आईवीडी डिजनरेशन मॉडल की जरूरत बढ़ रही है। अंग संस्कृति मॉडल पशु मॉडल की आवश्यकता को कम करने के नैतिक लाभ लाते हैं, और बायोरिएक्टर लागत पर एक बार निवेश अपक्षयी उत्तेजना की प्रजनन क्षमता को ध्यान में रखते हुए सस्ती हो सकती है, और पशु प्रयोगों से जुड़ी लागतों में कटौती। फिर भी, वीवो इंटरैक्शन में कुछ, जैसे प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका, प्रदान किए गए अंग संस्कृति मॉडल के साथ नकली नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, तंत्रिका संकेतों की माप और पशु मॉडल में संभव होगा कि दर्द का मूल्यांकन वर्तमान मॉडल के साथ वर्तमान पर विचार नहीं किया जा सकता है। कुछ चिंताएं व्यक्त की गई थीं कि क्या पूंछ IVDs के यांत्रिक गुणों की तुलना मानव आईवीडी के साथ की जा सकती है क्योंकि मनुष्यों में रीढ़ की सीधी स्थिति अद्वितीय है। गोजातीय पूंछ IVDs के शारीरिक और आणविक गुण, जैसे सेल घनत्व, नोटोकॉर्डल कोशिकाओं की कमी, जैव रासायनिक संरचना29,30,और गोजातीय कौडल आईवीडी के यांत्रिक गुण, जैसे फ्लेक्सन, एक्सटेंशन, मरोड़ में गति की सीमा, औरझुकने 31 मानव IVDs के समान हैं। विशेष रूप से, मानव आईवीडी अंग संस्कृति मॉडल28के लिए हाल ही में अधिक से अधिक ध्यान प्राप्त करते हैं। पूर्व वीवो मॉडल में मानव कैडेवरिक आईवीडी को अत्यधिक कुशल मानाजाताहै क्योंकि वे प्रजातियों के मतभेदों से बच सकते हैं जो अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हैं। बूचड़खानों से प्राप्त गोजातीय आईवीडी पूंछ के विपरीत, इसके लिए मानव आईवीडी 24 एच पोस्टमार्टम के प्रत्यारोपण की आवश्यकता होगी और इस प्रकार, स्थानीय अंग प्रत्यारोपण कानूनों के बाद नैतिक अनुमोदन28। वर्तमान विधि को अन्य प्रजातियों के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

पूर्व वीवो संस्कृतियों के अन्य तरीकों की तुलना में तकनीक का एक प्रमुख लाभ इंट्राडिस्कल इंजेक्शन, पैथोलॉजिकल मध्यम स्थितियों और अपक्षयी डिस्क के प्रारंभिक चरण को बेहतर अनुकरण करने के लिए हानिकारक लोडिंग का संयोजन है। वाल्टर एट अल23 ने आईवीडी में इंजेक्शन के बजाय गतिशील रूप से लोड किए गए गोजातीय आईवीडी के माध्यम में टीएनएफ-अल्फा का उपयोग किया और अन्नूस फाइब्रोसस की तुलना में नाभिक लुगूपन में माध्यम से टीएनएफ-अल्फा के परिवहन में वृद्धि दिखाई, जो हमारे परिणामों के अनुसार है। जैसा कि हमने आइडी के शुरुआती चरणों का अनुकरण करने का लक्ष्य लिया है, जो डिस्क आर्किटेक्चर 12 के प्रमुख अवरोधों के बिना सेलुलर स्तर पर होता है, हमनेआइडी 12,22, 23के शुरुआती चरणों को अनुकरण करने के लिए माध्यम में टीएनएफ-अल्फा का उपयोग करके पिछले अंग संस्कृति अध्ययनों के आधार पर टीएनएफ-अल्फा सांद्रता को चुना। अध्ययन प्रश्न के आधार पर वांछित अपक्षयी डिस्क राज्य का अनुकरण करने के लिए अन्य भड़काऊ उत्तेजक और टीएनएफ-अल्फा की उच्च सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। टीएनएफ-अल्फा की उच्च सांद्रता डिस्क अध: पतन के दौरान मौजूद प्रणालीगत प्रतिरक्षा नियामक फीडबैक की कमी की बेहतर भरपाई कर सकती है जैसा कि पोन्नाप्पन एट अल द्वारा प्रस्तावित है ।12 कम ग्लूकोज के साथ हानिकारक मध्यम स्थितियों का उपयोग पिछले काम पर आधारित था जिसमें यह दर्शाया गया था कि पोषण से मीडिया को सीमित करना और टीएनएफ-अल्फा के संपर्क में आने से आणविक परिवर्तन विशेषताएं होती हैं जो प्रारंभिक डिस्क पतन राज्य12,27में उपलब्ध हैं । इस प्रकार, दृष्टिकोण प्रारंभिक अपक्षयी डिस्क रोग के एक पूर्व वीवो अंग संस्कृति मॉडल में पिछले अध्ययनों द्वारा प्रदान किए गए सबूतों को जोड़ती है।

इस प्रोटोकॉल को कई तरीकों से और बेहतर बनाया जा सकता है। लोडिंग और फ्री-सूजन अवधि की अवधि और सीमा वांछित अध्ययन योजना के आधार पर चुनी जा सकती है। डिस्क अध: पतन पर भड़काऊ या अपक्षयी उत्तेजनाओं के दीर्घकालिक प्रभाव उच्च नैदानिक हित के हैं और वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ पूरा किया जा सकता है। हमनेआइडी 11की प्रारंभिक स्थिति के लिए अत्यधिक प्रासंगिक समझे जाने वाले केवल चयनित जीन का उपयोग किया . इस मॉडल के अतिरिक्त सत्यापन में जीन और प्रोटीन का व्यापक आकलन शामिल हो सकता है, जैसे ओमिक्स दृष्टिकोण । नतीजतन, वांछित अपक्षयी स्थिति के आधार पर, अपक्षयी लोडिंग के संयोजन में अन्य भड़काऊ कारकों की जांच की जा सकती है। उदाहरण के लिए, आईवीडी33में सूजन को उत्तेजित करने के लिए लिपोपोलिनासैकराइड इंजेक्शन दिखाए गए हैं। वांछित अध्ययन प्रश्न के लिए सबसे उपयुक्त भड़काऊ उत्तेजक खोजने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ विभिन्न भड़काऊ उत्तेजक की तुलना पूरी की जा सकती है। हमने वर्तमान प्रोटोकॉल20के साथ चयनित भड़काऊ मार्कर (आईएल-6, आईएल-8), एनाबोलिक मार्कर (एग्रीकन, कोलेजन), और कैटाबोलिक मार्कर (मैट्रिक्स मेटललोपेप्टिस, थ्रोम्बोस्पॉन्टिन रूपांकनों के साथ एक डिइंटेग्रिन और मेटललोप्रोटीन) के परिवर्तनों का मूल्यांकन किया है। के रूप में पूरे जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल बदल सकता है, भविष्य परीक्षाओं अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण तकनीकों को शामिल करने के लिए डिस्क अध: पतन निदान और जल्दी जैविक हस्तक्षेप के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए उपंयास biomarkers निर्धारित कर सकते हैं । इसके अलावा, अन्य पद्धतियों, जैसे कि हिस्टोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों के जैव रासायनिक माप (जैसे ग्लाइकोसामिनोग्लिकन, जीएजी), और गतिशील संपीड़न परीक्षण वर्तमान मॉडल के साथ आईवीडी के जैविक, जैव रासायनिक और बायोमैकेनिकल गुणों का विश्लेषण करने के लिए किए जा सकते हैं। एक अन्य संभव विश्लेषणात्मक तरीका बाहरी वायु सेना और एनपी ऊतक पर प्रभाव का अलग से विश्लेषण करना होगा, जिसमें बाहरी वायु सेना34, 35के लिए जीन अभिव्यक्ति मार्कर के रूप में bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α और एमकेएक्स का उपयोग किया जाएगा। न्यू ऑरलियन्स में २०१४ वार्षिक ओआरएस की बैठक में स्पाइन रिसर्च इंटरेस्ट ग्रुप ने स्वस्थ एनपी फेनोटाइपिक मार्कर के बाद सिफारिश की: HIF-1alpha, भरमार-1, एग्रीकन/कोलेजन द्वितीय अनुपात >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12, और सीडी24 ३६। एनपी मार्कर जीन bBrachyury/T और bSecreted frizzled से संबंधित प्रोटीन 2 गोजातीय IVD३४में भीतरी और बाहरी वायु सेना के ऊतकों से एनपी को अलग करने के लिए सबसे अधिक कायल थे । इसके अलावा, एनपी की एसजीजी सामग्री बाहरी वायु सेना34की तुलना में काफी अधिक बताई गई थी।

अंत में, यह उपन्यास प्रोइन्फ्लेमेटरी और अपक्षयी आईवीडी अंग संस्कृति मॉडल अत्यधिक प्रासंगिक 3 डी माइक्रोएनवायरमेंट में प्रारंभिक चरण के IDD का अनुकरण करने के लिए प्रासंगिक शर्तें प्रदान करता है। निश्चित रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल को अन्वेषक के उद्देश्यों के अनुसार और संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, हमारा मॉडल आवश्यक अध्ययन जानवरों की संख्या को कम करने में सक्षम है और इस प्रकार पूरी तरह से कम करने, बदलने, परिष्कृत करने के 3R सिद्धांतों को दर्शाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एओ फाउंडेशन और एओस्पिन इंटरनेशनल ने सपोर्ट किया । बाबाक सरवी को जर्मन स्पाइन फाउंडेशन और जर्मन ऑस्टियोआर्थराइटिस फाउंडेशन से फैलोशिप सपोर्ट मिला । गेर्नोट लैंग को उन्नत चिकित्सकीय वैज्ञानिकों, चिकित्सा संकाय, फ्रीबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी के लिए बर्टा-ओटेनस्टीन-कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Bromo-3-chloropropane(BCP) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA B9673
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8960
Band saw Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany model 30/833
Betadine Munndipharma, Frankfurt, Germany
Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA Kingfisher Biotech, St. Paul, USA DIY1028B-003
Corning ITS Premix Corning Inc., New York, USA 354350
DMEM high glucose Gibco by life technologies, Carlsbad, USA 10741574
DMEM low glucose Gibco by life technologies, Carlsbad, USA 11564446
Ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 09-0851
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco by life technologies, Carlsbad, USA A4766801
Non-essential amino acid solution Gibco by life technologies, Carlsbad, USA 11140050
Penicillin/Streptomycin(P/S) gibco by life technologies, Carlsbad, USA 11548876
Phosphate Buffer Solution, tablet Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P4417
Pronase Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10165921001
Primocin InvivoGen, Sandiego, USA ant-pm-05
Pulsavac Jet Lavage System Zimmer, IN,USA
TissueLyser II Quiagen, Venlo, Netherlands 85300
Streptavidinn-HRP Kingfisher Biotech, St. Paul, USA AR0068-001
Superscript VILO Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA 10704274
cDNA Synthesis Kit Applied Biosystems by life technologies 10400745
TaqMan Universal Master Mix Applied Biosystems by life technologies
TNF-alpha, recombinant human protein R&D systems, Minnesota, USA 210-TA-005
TRI Reagent Molecular Research Center, Cincinnati, USA TR 118
Tris-EDTA buffer solution sigma-Aldrich, St. Louis, USA 93283
Gene bIL-6 Applied Biosystems by life technologies Custom made probes Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A
Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT
Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT
Gene bIL8 Applied Biosystems by life technologies Bt03211906_m1
Gene bTNF-alpha Applied Biosystems by life technologies Custom made probes Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A
Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT
Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G
GENE bIL1beta Applied Biosystems by life technologies Custom made probes Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT
Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A
Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A
RPLP0 Applied Biosystems by life technologies Bt03218086_m1

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References

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चिकित्सा अंक 168 इंटरवर्टेब्रल डिस्क सूजन रीढ़ 3R अंग संस्कृति प्रयोगात्मक मॉडल डिस्क अध: पतन बायोरिएक्टर
प्रारंभिक चरण के इंटरवर्टेब्रल डिस्क रोग का अनुकरण करने के लिए एक प्रोइनफ्लेमेटरी, अपक्षयी अंग संस्कृति मॉडल।
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Saravi, B., Lang, G., Grad, S., Alini, M., Richards, R. G., Schmal, H., Südkamp, N., Li, Z. A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.. J. Vis. Exp. (168), e62100, doi:10.3791/62100 (2021).

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