Summary
このプロトコルは、初期段階の椎間板変性をシミュレートする炎症誘発性、変性ウシ器官培養の新しい実験モデルを提示する。
Abstract
症候性椎間板(IVD)変性(IDD)は、主要な社会経済的負担であり、炎症および組織の劣化を特徴とする。原因治療の欠如のために、疾患の進行に関与するメカニズムを研究し、治療目標を見つけ、動物モデルの必要性を減らすために、革新的な実験的臓器培養モデルが緊急に必要とされています。ここでは、IDD中に存在する炎症誘発性および同化微小環境を模倣した新しい3次元臓器培養モデルプロトコルを紹介する。
最初に、ウシのカウダルIVDを、組織培養培地で解剖、洗浄、培養した。動的生理学的または病理学的負荷を、1日2時間のカスタムメイドのバイオリアクターに適用した。IVDは、コントロール群(高グルコース培地、生理的負荷、リン酸緩衝生理食塩水注射)および病理学的群(低グルコース培地、病理学的負荷、腫瘍壊死因子α注射)に4日間割り当てられた。IVDsの採取されたパルポスス細胞および酵素結合免疫吸着剤アッセイから遺伝子発現解析を行った。
我々のデータは、対照群と比較して病理学群に負荷を与えた後、炎症性マーカーの高い発現と椎間板高の低下を明らかにした。このプロトコルは、IVDの炎症や変性をシミュレートするために信頼性が高く、さらにアプリケーションの範囲を広げるために拡大することができます。
Introduction
腰痛(LBP)は、すべての年齢の個人に影響を与えることができ、障害の主な原因は、世界1、2、3。LBP に関連する総コストは、年間 1,000 億ドルを超える4,5.症候性椎間板(IVD)変性(IDD)は、炎症および組織劣化を特徴とする状態であり、LBP6、7の主要な原因である。具体的には、IDDは、加速病理、神経疾患、および最終的に障害につながる複数の要因によって誘発され、誘発されるIVDの細胞外マトリックス(ECM)の徐々に進化する内訳によって特徴付けられる。さらに、IDDは、炎症性サイトカインの放出に関連しており、脊椎バイオメカニクス、血管新生、および神経の成長は、痛みの感覚を増加させ、慢性LBP(活動性ディスコパシー)6,8を完全に引き起こす。現在までに、治療の選択肢には、隣接する椎骨の椎間剥離およびそれに続く融合、IVD人工関節の移植、または非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、およびIDD9患者に対する筋弛緩剤などの非外科的アプローチが含まれる。外科的および非外科的な両方の現在の標準的な治療オプションは、部分的にしか有効であり、根本的な生物学的問題9,10に対処することができない。初期の退行性ディスク疾患は、初期の炎症性組織応答、特に腫瘍壊死因子α(TNF-α)発現11の増加を特徴とする。これらの初期のディスク変化は、主にディスクアーキテクチャを破壊することなく細胞レベルで起こり、以前は炎症促進条件12の下で栄養不足によって模倣され得る。したがって、これらの変性機構を調査し、適切な治療標的を見つけるためにin vivo状況の精密なシミュレーションが重要である。さらに、これらの分子特性のシミュレーションでは、ディスクの機械的負荷環境は、IVDの病理学的および生理学的変化において重要な役割を果たす。したがって、これらのアプローチを組み合わせることで、生体内のIVDの複雑な微小環境を模倣する一歩前進を生み出します。現在、私たちの知識を最大限に活用するために、炎症促進と栄養の設定と共に動的ローディングの側面を考慮した研究はありません。
大規模な動物モデルは、インビボ相互作用に関連する潜在的な調査を可能にしますが、コストがかかり、作業集約的です。また、研究における動物モデルの使用は長い間論争の問題であったため、重要な研究課題に答えるために必要な動物の数の減少は大きな関心事です。最後に、IVD研究13,14においてIDDを模倣する理想的な動物モデルは現在存在しない。したがって、IDDおよび関連する炎症および変性プロセスをシミュレートする臓器培養モデルのような費用対効果の高い、信頼性の高い置換を確立する必要がある。近年、初期段階の椎間板疾患をシミュレートする炎症誘発性および退行性臓器培養モデルの確立に本プロトコルを適用して、IDD臓器培養15における抗炎症薬の効果を調べ得た。
ここでは、低栄養性の培地条件下での腫瘍壊死因子α(TNF-α)の直接の日の注入とバイオリアクターでの変性負荷によって引き起こされる、異化および炎症誘発性微小環境を介して、牛椎間板を取得し、早期IDDの状態を誘導する方法を説明する。 図1 は実験モデルを示し、変性および生理的負荷条件をシミュレートするために使用されるバイオリアクターを示す。
図1: 実験用セットアップの図A: 牛の尾; B: 牛の椎間板を解剖; C: ディスクを培養培地と共にウェルプレートに移す。 D: バイオリアクターでシミュレーションをロードする。 E: 椎間板内注射技術; F: PBS/トリパンブルー染料を注入した後のIVDが分布を明らかにする。IDD:椎間板変性。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
実験は、局所アバトワールから得られた牛の尾を用いて行った。現在の研究で使用されている生物学的材料は食物連鎖から採取され、スイスとヨーロッパの法律では倫理的な承認を必要としません。
1. 牛椎間板の解剖
- 表面の汚れや髪を取り除くために水道水で尾全体を十分に洗い流します。
注: 無傷で遠位端、1 つの尾翼あたりの 9 個の IVD (尾骨 1- 9) の目的のサイズに応じて実験に使用できます。15~20mmの所望の直径を考慮し、実験には1個の12個のウシの尾部を使用し、1尾あたり5IVDを使用しました。 - 1%ベタジン溶液を含む箱に尾全体を10分間浸します。尾を滅菌ガーゼで短時間乾燥させ、滅菌ドレープの上に置きます。
注:ディスクの解剖中に、脱水を防ぐためにリンガーの溶液湿潤ガーゼで尾を加湿します。全体の解剖手順が完了するまで、濡れたガーゼで包まれた尾(または残りのセグメント)を保管します。 - メス(20)を使用して軟部組織を尾背脊椎からできるだけ完全に取り除き、IVDの同定を容易にします。骨の除去ペンチで椎骨の棘および横のプロセスを取除く。
注: 希望の直径の IvD を選択します。15-20のmmの直径の範囲のIvDは、現在の研究で使用されました。 - 各椎体の中央を通って骨ペンチで横断的に切断し、個々のモーションセグメントを得ます。リンガーの溶液で濡れたガーゼでペトリ皿にモーションセグメントを入れます。
- 触診とモーションセグメントを穏やかに移動させることによって、IVDと椎骨を見つけます。IVDの成長プレートにバンドソーを2つ平行にカットし、IVDの両側に1つずつ行います。IVDから椎骨に向かう約0.5-1mmの安全距離で、円盤(ソフト)に隣接する骨エンドプレート部分(硬)の凸部位に触れて見つけることで、成長板の位置を特定します。バンドソーのブレードが、椎骨を切断しながらRingerの溶液で冷却されていることを確認します。
- リンガーの溶液で濡れたきれいなガーゼできれいなペトリ皿にIVDを移す。
注:ガーゼは湿らせ、IVDの腫れを防ぐために濡れすぎないようにする必要があります。 - 頭皮の刃を使用して椎体(赤/ピンクの骨)、成長プレート(白い軟骨)を削り取り、エンドプレートをそのままにしておきます(黄色-ピンク)。2 つのサーフェスを平坦にして、荷重手順を平行にします。掻き取ったIVDをリンガーの溶液で濡らしたガーゼで新鮮なペトリ皿に移します。
注:IVDを保持し、擦り傷しながら手を保護するためにチェーンメール手袋を着用してください。 - ディスクの高さと直径をキャリパーで測定します。ジェットラベージシステムを使用して、リンガーの溶液で椎骨の血栓をきれいにします。
- IVDを50 mLプラスチックチューブ(チューブあたり1個のIVD)に移します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+10%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)をIVDあたり25mL加え、室温で軌道シェーカーで15分間揺れ動かします。
- 上清を吸引し、IVDあたり10mL+1%P/Sを2分間添加してIVDをすすいます。
2. IVDの培養と荷重
- IVDチャンバーにディスクを移し、IVD培養培地(DMEM、生理学的群の場合は4.5g/L高グルコースDMEM、病理学的群の場合は2g/L低グルコースDMEM)+1%P/S+ 2%胎児血清+1%ITS(5μg/mLインスリンを含む) 6 μg/mLトランスフェリン、および5 ng/mLセレニシャス酸)+50 μg/mLのアスコルビン酸-2リン酸+1%非必須アミノ酸+1%非必須アミノ酸+10μg/mL抗菌剤)を37°C、85%の湿度および5%CO2でインキュベーターに入れる。
- 実験グループ16に従ってバイオリアクターシステム内で4日間ディスクを培養する。病理群では、変性負荷条件を0.32-0.5 MPa、5 Hzで2時間/日に維持します。生理学的制御群では、0.02-0.2 MPa、0.2Hzの2時間/日の負荷プロトコルを使用する。
注:荷重手順中にIVD媒体の5 mLを含むチャンバーにIVDを配置します。容積はバイオリアクターの負荷室の大きさに依存する。荷重手順の間に、IVD を 7 mL の IVD 培養培地で 6 ウェルプレートに入れ、フリー膨潤回復を行います。 - 実験期間中のディスク高さの変化を解析するために、IVD解剖後のキャリパー(ベースライン)でディスクの高さを測定し、その後、自由な膨潤期間の後、そして実験期間の動的ローディング後に毎日測定します。
3. 椎間板内腫瘍壊死因子α(TNF-α)注射
- 1日目の最初のダイナミックローディングサイクルの直後に、垂直位置のペトリ皿にIVDを配置し、トゥイーザでIVDを安定させます。
- 組換えTNF-α(IVD当たりPBSの70μLで100ng)を病理学グループ17の核果体組織に30ゲージのインスリン針で注入する。約70μLの速度で1分ほどゆっくりと注入します。
- 注射後、注射器をIVD内で途中まで引き戻し、注射器プランジャーを引っ張って、注射液が漏れるのを防ぐ真空を作り、針と注射器をIVDから完全に取り除きます。
注:トリパンブルー染料を含むPBSを注入して試験実験を行い、負荷および夜間培養後に注入された溶液の分布を評価します。
4. 遺伝子発現
- 4日目にIVDを収穫します。生検パンチで、核パルポス(NP)組織(IVDの真ん中にゲル状の部分)を収集します。メスの刃(No.20)で外環状繊維(AF)を集める。
注: 0日目のベースライン基準については、RNA抽出のために解剖した直後に組織を採取します。 - 実験計画に応じて、遺伝子発現解析に必要なNPまたはAF組織の量を使用してください。
注:本実験では約150mgの組織が用いられました。組織質量に対するRNA単離溶液の比率は、効率的な抽出のために100〜150mgの組織あたり少なくとも2 mLでなければなりません。 - 消化液(DMEMでは0.2%プロナーゼ、フィルター滅菌)でNPまたはAF組織を消化し、磁気撹拌18で37°Cで1時間インキュベートする。
- 液体窒素を用いて組織サンプルをフラッシュフリーズし、微粉に粉砕します。粉砕された組織粉末を、単相溶液(RNA分離溶液)に1mLのグアニジンチオシアネートとフェノールをそれぞれ含む2つの2mLチューブに均等に分割する。
- RNA分離溶液と粉砕した組織粉末を含む2mLチューブで均質化を行います。30 Hzで30Hzで、組織粉末5xを30Hzで均質化します。遠心分離機は12,000xg、4°Cで10分間、上清を新鮮なチューブに移します。 上清は、少なくとも1ヶ月間-80°Cで保存することができます。
- RNA分離溶液1 mLあたり1-ブロモ-3-クロロプロパン(BCP)の0.1 mLを加え、15秒激しく振る。得られた混合物を15分間軌道シェーカーの室温で保存し、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間保存します。
注:RNAは上の水相に排他的に残ります。 - 新鮮なチューブに水相を移し、イソプロパノールの0.25 mLと、初期均質化に使用されるRNA分離液1 mL当たり0.25 mLの高塩沈殿液でRNAを沈殿させます。サンプルを15分間室温で、軌道シェーカーに、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで8分間保存します。
注: あるいは、カラムベースの RNA 抽出方法を使用すると、一般的に RNA の純度は高くなりますが、RNA の収率は低下します。 - 上清を取り除き、初期均質化に使用するRNA分離溶液1mL当たり75%エタノールの1mLでRNAペレットを洗浄します。遠心分離機 7,500 x g で 5 分 4 °C.
- エタノール洗浄を取り除き、3〜5分間の空気乾燥RNAペレットを取り除きます。20 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水にRNAを溶解し、ピペットチップを通して溶液を数回通過させ、55〜60°Cで10〜15分間インキュベートします。
- 230 nm、260 nm、および 280 nm (それぞれ A230、A260、A280) で吸光度を測定します。A260の1.0は40 μg/mL RNAに相当する。A260/A280比は1.6~1.9と予想され、汚染の結果としてA260/A280の比率は<1.6となります。
- 20 μL 反応量に対して逆転写酵素 (RT) 反応ミックスを準備します。この混合液には、RT酵素ミックス、リボヌクレアーゼ阻害剤、ヘルパータンパク質、プライマー、dNTP、MgCl2、RNase遊離水、および0.4μgのRNAサンプルが含まれています。
- RTチューブを簡単に遠心分離して、チューブの下部にあるすべてのコンポーネントを混合します。
- サンプルをサーモサイクラー装置に入れます。RTに適したプログラムを選択し、RTを25°Cで10分間実行し、続いて42°Cで120分間の逆転写ステップを実行し、85°Cで5分間逆転写酵素を不活性化し、最後に4°Cまで冷却します。
- 得られたcDNAをトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)エチレンアミンテア酢酸(EDTA)(TE)バッファー(10 mM EDTAで10 mMトリス)で希釈し、100 μL cDNA溶液当たりRTに使用する0.4 μgのRNAの最終濃度にします。cDNAサンプルを-20°Cに保存します。
- 10 μL反応量を使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行します。反応量は、マスターミックス(DNAポリメラーゼを含む)を含む、 ウラシルDNAグリコシラーゼ、dUTP付dNT、パッシブリファレンスおよび最適化バッファコンポーネント付きdMP、フォワードプライマー45μM、リバースプライマー45μM、プローブ12.5μM(プローブの5'末端に連結されたレポーター色素、プローブの3'末端のマイナーグルーブバインダー、プローブの3'末端の非蛍光クオンチャーを含む)、2 μL cDNAおよびDEPC処理水。
- 2-ΔΔCT 法19で相対定量を行う内因性制御(RPLP0)を実行します。
- 重複するサンプルを追加し、cDNA の代わりに TE バッファを追加して、テンプレートなしコントロールを実行します。PCR は標準条件で実行します (50 °C で 2 分、95 °Cで 10 分、95 °Cで 15 s の 40 サイクル、60 °C で 1 分)
- 比較CT法に従ってmRNA標的の相対定量を行う。ベースライン試料に正規化されたmRNAの量は、2-ΔΔCTとして計算され、ΔΔCTは、ベースラインサンプルのΔCT(CT標的−CT内因性対照)とΔCT(CT標的およびCT内因性対照)との差である。
IVD培地中のタンパク質含有量の定量化
- IVDサンプルで調整された培地を収集し、培地中のタンパク質含有量を測定します。標的タンパク質のプロトコルに従って酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行う。
- ウシインターロイキン-8(IL-8)は、製造業者の指示に従って抗牛IL8 ELISAキットによって定量化されます。
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Representative Results
TNF-α注射と組み合わせた低グルコース培地における退行性負荷は、培養4日後のNP細胞における生理学的対照群と比較して、炎症促進マーカーインターロイキン6(IL-6)およびインターロイキン8(IL-8)の遺伝子発現の有意な増加を引き起こした(図2)。これに対し、NP細胞におけるインターロイキン1β(IL-1β)およびTNF-αの炎症促進性遺伝子に対して有意な変化を観察しなかった(データは示していない)。さらに、変性培養条件は、AF細胞におけるIL-6およびIL-8の遺伝子発現を変化させなかった。
図2:核パルポス(NP)組織および環状線維症(AF)組織における遺伝子発現量 これらは、生理学的または病理学的培養条件下での培養の4日後に測定し、ベースライン(Day 0)に正規化した。95% 信頼区間 n=8、**p<0.01 を±意味します。この図は20から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
遺伝子発現所見と一致して、培地中のIL-8タンパク質含有量は、生理学的状態と比較して2日および4日後に顕著な増加を示した(図3)。しかし、3日目(自由な腫れまたは負荷後)の測定では、研究群間に有意な差は見つからず、結果は変性群の値が高いことを示した。
図3:遊離膨潤培養後のIVD培養培地中の炎症性タンパク質IL-8放出の定量化(FS)および動的負荷(Load)。 結果は、正常化せずに培地中のng/mLの元の濃度として示される。平均± 95% 信頼区間、n=8、**p<0.01。この図は20から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ディスクの高さ (DH) の変更は、解剖後に DH に正規化された 図 4に示されています。負荷後のDH減少は生理学的群と比較して変性群の高い値(すなわち、より高さ低下)を明らかにしたのに対し、自由膨張期間後のディスク高さの上昇に差は見られなかった。これは、病理学的および生理学的群間のディスク高さの変化の差が、負荷処置後より高いことを示した。さらに、2日目と3日目の測定値と比較して1日後の差はあまり顕著ではなく、変性および炎症状態の進行性効果を示す。
図4:ディスクの高さの変化は、(解剖後)ベースライン値に正規化された。 平均±95%の信頼区間。FS:自由腫脹。N=10、***p<0.001。この図は20から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々はここで変性および炎症性IVDDをシミュレートするための詳細なプロトコルを提供した。このプロトコルは、ディスクに破壊的な影響をもたらす炎症経路の詳細な検査に適用することができる。さらに、このプロトコルは、疾患の進行に関与する有望な治療標的を決定するのに役立つ。
我々は最近、ヒト組換えTNF-αがウシおよびヒトNP細胞21の両方に炎症を誘発する可能性 αがあることを示した。本研究では、1IVD当たり100ng TNF-αの用量を使用して炎症を誘発した。この用量は、変性負荷と限定栄養15,20との組み合わせで適用された場合の炎症マーカーの有効な誘導を示した。IVD変性の唯一の開始因子としてTNF−αを用いた最近の研究では、100ng TNF-α/cm3ディスク体積の閾値が、IVD21における炎症性および変性変化の誘導に対する有効用量として決定されている。炎症を誘発するために使用されるTNF-α用量は、再現性のある効果のためにディスクの体積に正規化されるべきであることが示唆される。さらに、IVD内に注入材料の分布が良好であり、この注射は、その後の実験で十分に再現可能であることを確認する必要があります。射出圧力は個人によって異なる可能性があるため、異なる実験で同じ研究グループ間で材料の分布が異なる可能性があります。等分布を調べるために選んだアプローチの1つは、PBS希釈トリパンブルー注射を使用したものでした。たとえば、注入ポンプや事前定義された再現性の注入速度などで、注入技術を標準化することをお勧めします。前に示したように、IVDへの22ゲージ、25ゲージ、または30ゲージの針を用いた1本の針穿刺は、研究結果20、21、24、25と相互作用する効果を生じなかった。注射する物質の体積と注射に使用される針のサイズのディスクサイズを考慮することをお勧めします.また、複数の環状注射21,26によって引き起こされる潜在的な変性効果を誘発することを避けるために単一の注射を使用することを推奨する。
現在のモデルのいくつかの制限に対処する必要があります。IVDのローディングは、現在、IDDに取り組んでいる多くの研究室で広く利用されていないバイオリアクターへのアクセスを必要とします。しかし、前臨床IVD変性モデルの必要性は高まっています。臓器培養モデルは、動物モデルの必要性を減らすという倫理的利益をもたらし、バイオリアクターコストへの1回限りの投資は、変性刺激の再現性と動物実験に関連するコストの削減を考慮すると、手頃な価格になる可能性があります。それにもかかわらず、免疫系の役割のような一部の生体内相互作用は、提供された臓器培養モデルではシミュレートできない。また、神経信号の測定や動物モデルで可能な痛みの評価は、現在のモデルでは考慮できません。直立した脊椎の位置がヒト28においてユニークであるため、尾翼IVDの機械的特性がヒトIVDと同等であるかどうかが懸念された。細胞密度、脊索細胞の欠如、生化学的組成29、30などのウシ尾翼IVDの解剖学的および分子的特性、およびウシの錐体IVDの機械的特性(屈曲、伸長、トーション、曲げ31の可動域など)は、ヒトIVDと非常によく似ています。特に、ヒトIVDは最近、臓器培養モデル28に対してますます注目を集めている。ex vivoモデルにおけるヒトキャダビリックIVDは、より臨床的に関連する種の違いを避けることができるため、非常に効率的であると考えられています。アバトワールから得られたウシIVD尾とは対照的に、これは死後24時間のヒトIVDの移植を必要とし、したがって、局所臓器移植法28に従う倫理的承認を必要とする。本方法は、他の種に容易に適合させることができる。
この技術の主な利点の1つは、他のエキビボ培養法と比較して、ディスクの初期段階をより良くシミュレートするための、椎間内注射、病理学的培地条件、および有害な負荷の組み合わせである。Walterらら23は、IVDへの注入の代わりに動的にロードされたウシIVDの培地にTNF-αを使用し、環状線維症と比較して培地から核パルプへのTNF-αの輸送の増加を示した。ディスクアーキテクチャ12の大きな破壊なしに細胞レベルで起こるIDDの初期段階をシミュレートすることを目指して、我々は、IDD12、22、23の初期段階をシミュレートするために培地中のTNF-αを用いた以前の臓器培養研究に基づいてTNF-α濃度を選択した。他の炎症性覚醒剤の使用とTNF-αのより高い濃度は、研究の質問に応じて所望の変性ディスク状態をシミュレートするためにテストすることができます..より高濃度のTNF-αは、Ponnappanら(12)が提案したディスク変性時に存在する全身性免疫調節フィードバックの欠如をより良く補償する可能性があるが、低グルコースを有する有害な培地条件の使用は、TNF-αへの栄養的に制限する培地およびTNF-αへの暴露が初期のディスク変性状態12,27で利用可能な分子変化特性を模倣することを示す前作に基づいたものである。したがって、このアプローチは、初期の変性ディスク疾患の1つのex vivo器官培養モデルにおける以前の研究によって提供された証拠を組み合わせたものである。
このプロトコルは、いくつかの方法でさらに改善することができます。荷重の持続時間と範囲と自由膨張期間は、所望のスタディ計画に基づいて選択できます。椎間板変性に対する炎症または変性刺激の長期的な影響は、高い臨床的関心であり、現在のプロトコルで達成することができる。IDD11の初期状態に対して非常に関連性が高いと考えられる遺伝子のみを使用しました。このモデルの追加の検証には、オミックスアプローチなどの遺伝子やタンパク質の評価が広がっています。その結果、他の炎症因子は、所望の変性状態に応じて、変性負荷と組み合わせて調査することができた。例えば、リポ多糖剤の注射は、IVD33における炎症を刺激することが示されている。異なる炎症性覚醒剤の比較は、所望の研究の質問に最も適切な炎症性覚醒剤を見つけるために、本プロトコルで達成することができる。我々は、選択した炎症性マーカー(IL-6、IL-8)、同化マーカー(アグリカン、コラーゲン)、および同化マーカー(マトリックスメタロペプチダーゼ、ジシンテグリンおよびトロンボシンをモチーフとするメタロプロテイナーゼ)の変化を本プロトコル20で評価した。遺伝子発現プロファイル全体が変化する可能性があるため、今後の検査には、ディスク変性診断のための新しいバイオマーカーと早期生物学的介入のための治療標的を決定するための次世代RNAシーケンシング技術が含まれる可能性があります。さらに、その他の方法論は、例えば、構造学、免疫物質化学的染色、細胞外マトリックス成分(グリコサミノグリカン、GAGなど)の生化学的測定、および動的圧縮試験を行って、本モデルを用いてIVDの生物学的、生化学的、および生力学的特性をさらに分析することができる。もう一つの可能な分析方法は、bCol1a1、Col1a2、CD146、SM22α、およびMKXを外側AF34,35の遺伝子発現マーカーとして用いて、外部AFおよびNP組織への影響を別々に分析することである。2014年のニューオーリンズ年次ORS会議の脊椎研究関心グループは、健康なNPフェノーチマーカーに従うことを推奨しました:HIF-1alpha、GLUT-1、アグレカン/コラーゲンII比>20、Shh、ブラチュリー、KRT18/19、CA12、CD2436。NPマーカー遺伝子bBrachyury/Tおよびbシークレットフリズル関連タンパク質2は、ウシIVD34内の内外のAF組織からNPを分離する最も説得力があった。さらに、NPのsGAG含有量は、外部AF34と比較して有意に高いことが報告された。
結論として、この新しい炎症誘発性および退行性のIVD器官培養モデルは、非常に関連性の高い3D微小環境における初期段階のIDDをシミュレートするための関連条件を提供する。確かに、現在のプロトコルは、調査員の目的に応じてさらに変更することができます。さらに、我々のモデルは必要な研究動物の数を減らすことができ、こうして、減らす、置き換える、精製する3Rの原則を完全に反映する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、AO財団とアオスパイン・インターナショナルによって支援されました。ババク・サラヴィは、ドイツ脊椎財団とドイツ変形性関節症財団からフェローシップ支援を受けました。ゲルト・ラングは、ドイツのフライブルク大学医学部先端臨床医のためのベルタ・オッテンシュタイン・プログラムの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
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