Summary
Dit protocol presenteert een nieuw experimenteel model van pro-inflammatoire, degeneratieve runderorgaancultuur om vroege tussenwervelschijfdegeneratie te simuleren.
Abstract
Symptomatische tussenwervelschijf (IVD) degeneratie (IDD) is een belangrijke sociaaleconomische last en wordt gekenmerkt door ontsteking en weefselafbraak. Vanwege het gebrek aan oorzakelijke therapieën is er dringend behoefte aan innovatieve experimentele orgaancultuurmodellen om de mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de progressie van de ziekte, therapeutische doelen te vinden en de behoefte aan diermodellen te verminderen. We presenteren hier een nieuw, driedimensionaal orgaancultuurmodelprotocol dat het pro-inflammatoire en katabole micromilieu nabootst, dat aanwezig is tijdens IDD.
Aanvankelijk werden runderaudale IVD's ontleed, gereinigd en gekweekt in het weefselkweekmedium. Dynamische fysiologische of pathologische belasting werd gedurende 2 uur per dag toegepast in een op maat gemaakte bioreactor. IVD's werden gedurende vier dagen toegewezen aan een controlegroep (hoog glucosemedium, fysiologische belasting, fosfaatgebufferde zoutoplossinginjectie) en een pathologische groep (laag glucosemedium, pathologische belasting, tumornecrosefactor-alfa-injectie). Genexpressieanalyse van verzamelde nucleus pulposuscellen van de IVD's en enzymgekoppelde immunosorbente assay van de geconditioneerde orgaankweekmedia werd uitgevoerd.
Onze gegevens onthulden een hogere expressie van ontstekingsmarkers en verminderde schijfhoogten na belasting in de pathologische groep in vergelijking met de controlegroep. Dit protocol is betrouwbaar om IVD-ontsteking en degeneratie te simuleren en kan verder worden uitgebreid om het toepassingsgebied ervan te verbreden.
Introduction
Lage rugpijn (LBP) kan individuen van alle leeftijden treffen en is wereldwijd een belangrijke oorzaak voor invaliditeit1,2,3. De totale kosten in verband met LBP bedragen meer dan $ 100 miljard per jaar4,5. Symptomatische tussenwervelschijf (IVD) degeneratie (IDD), een aandoening die wordt gekenmerkt door ontsteking en weefselafbraak, is een belangrijke oorzaak van LBP6,7. In het bijzonder wordt IDD gekenmerkt door een geleidelijk evoluerende afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) van het IVD, geïnduceerd en geactiveerd door meerdere factoren die leiden tot een versnelde pathologie, neurologische aandoeningen en uiteindelijk invaliditeit. Bovendien wordt IDD geassocieerd met het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokinen, veranderde wervelkolombiomechanica, angiogenese en zenuwingroei, wat het pijngevoel verhoogt, wat in totaal chronische LBP (actieve discopathie) veroorzaakt6,8. Tot op heden omvatten behandelingsopties discectomie en daaropvolgende fusie van de aangrenzende wervels, implantatie van een IVD-prothese of niet-chirurgische benaderingen, zoals niet-steroïde ontstekingsremmende geneesmiddelen, opioïden en spierverslappers voor patiënten met IDD9. Beide huidige standaard therapeutische opties, chirurgisch en niet-chirurgisch, zijn slechts gedeeltelijk effectief en pakken het onderliggende biologische probleem niet aan9,10. Degeneratieve schijfziekte in een vroeg stadium wordt gekenmerkt door een initiële inflammatoire weefselrespons, met name een toename van tumornecrosefactor-alfa (TNF-alpha) expressie11. Deze vroege schijfveranderingen treden voornamelijk op cellulair niveau op zonder de schijfarchitectuur te verstoren en kunnen eerder worden nagebootst door voedingstekort onder pro-inflammatoire aandoeningen12. Daarom is nauwkeurige simulatie van de in vivo situatie om deze degeneratiemechanismen te onderzoeken en geschikte therapeutische doelen te vinden cruciaal. Bovendien speelt de mechanische belastingsomgeving van de schijven een sleutelrol bij pathologische en fysiologische veranderingen van IVD. Bijgevolg zou het combineren van deze benaderingen ons een stap vooruit brengen om de complexe micro-omgeving van IVD's in vivo na te bootsen. Er zijn momenteel geen studies die het aspect van dynamische belasting in overweging nemen, samen met de pro-inflammatoire en nutritionele setting voor zover wij weten.
Hoewel grote diermodellen het mogelijk maken om potentiële relevante in vivo interacties te onderzoeken, zijn ze duur en werkintensief. Aangezien het gebruik van diermodellen in onderzoek al lang een controverse is, is de vermindering van het aantal dieren dat nodig is om belangrijke onderzoeksvragen te beantwoorden van groot belang. Ten slotte is er momenteel geen ideaal diermodel om IDD na te bootsen in IVD-onderzoek13,14. Daarom is het noodzakelijk om een kosteneffectieve en betrouwbare vervanging vast te stellen, zoals een orgaancultuurmodel om IDD en bijbehorende ontstekings- en degeneratieve processen te simuleren. Onlangs stelde de toepassing van het huidige protocol voor de vaststelling van een pro-inflammatoir en degeneratief orgaancultuurmodel om intervertebrale schijfziekte in een vroeg stadium te simuleren ons in staat om het effect van ontstekingsremmende geneesmiddelen in de IDD-orgaancultuur te onderzoeken15.
Hier beschrijven we hoe runderintervertebrale schijven kunnen worden verkregen en de toestand van IDD in een vroeg stadium kunnen worden induceren via een katabole en pro-inflammatoire micro-omgeving veroorzaakt door directe intradiscale injectie van tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en degeneratieve belasting in een bioreactor onder lage voedingsmatige mediumomstandigheden. Figuur 1 illustreert het experimentele model en toont de bioreactor die wordt gebruikt om degeneratieve en fysiologische belastingsomstandigheden te simuleren.
Figuur 1: Illustratie van de experimentele opstelling. A: runderstaart; B: ontlede tussenwervelschijven van runderen; C: overdracht van de schijf naar een putplaat met kweekmedium; D: het laden van de simulatie in een bioreactor; E: intradiscale injectietechniek; F: IVD na injectie van PBS/trypan blauwe kleurstof om de verdeling te onthullen. IDD: tussenwervelschijfdegeneratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Er werden experimenten uitgevoerd met runderstaarten die afkomstig waren van lokale slachthuizen. De biologische materialen die in de huidige studie worden gebruikt, zijn afkomstig uit de voedselketen en vereisen geen ethische goedkeuring in de Zwitserse en Europese wetgeving.
1. Dissectie van de tussenwervelschijf van runderen
- Spoel de hele staart grondig af met leidingwater om vuil en haar op het oppervlak te verwijderen.
OPMERKING: Bij intacte, distale uiteinden kunnen maximaal 9 IVD's (coccygeal 1-9) per staart worden gebruikt voor de experimenten, afhankelijk van de gewenste grootte van de IVD's. Gezien de gewenste diameter tussen 15-20 mm, gebruikten we 12 runderstaarten met 5 IVD's per staart voor de experimenten. - Dompel de hele staart gedurende 10 minuten onder in een doos met 1% betadine-oplossing. Droog de staart kort met steriel gaas en leg deze op een steriel doekje.
OPMERKING: Bevochtig tijdens het ontleden van de schijf de staarten met ringer's oplossing bevochtigd gaas om uitdroging te voorkomen. Bewaar de staarten (of overgebleven segmenten) gewikkeld in nat gaas totdat de hele dissectieprocedure is voltooid. - Gebruik een scalpel (nr. 20) om het zachte weefsel zo volledig mogelijk uit de wervelkolom te verwijderen om de identificatie van de IVD's te vergemakkelijken. Verwijder de spineuze en transversale processen van de wervels met een botverwijderingstang.
OPMERKING: Selecteer IVD's met de gewenste diameter. In het huidige onderzoek werden IVD's met een diameterbereik van 15-20 mm gebruikt. - Snijd dwars met een bottang door het midden van elk wervellichaam om individuele bewegingssegmenten te verkrijgen. Doe bewegingssegmenten in een Petrischaal met gaas bevochtigd met de oplossing van Ringer.
- Lokaliseer de IVD en wervel door palpatie en door de bewegingssegmenten voorzichtig te bewegen. Maak twee parallelle sneden met de lintzaag in de groeiplaat van de IVD's, één aan elke kant van de IVD. Identificeer de locatie van de groeiplaat door de bolle plaats van het benige eindplaatdeel (hard) naast de schijf (zacht) aan te raken en te vinden met een veiligheidsafstand van ongeveer 0,5-1 mm van de IVD naar de wervel. Zorg ervoor dat het zaagblad van de lintzaag wordt gekoeld met de oplossing van Ringer tijdens het zagen van de wervels.
- Breng IVDs over in een schone petrischaal met schoon gaas bevochtigd met de oplossing van Ringer.
OPMERKING: Het gaas moet bevochtigd en niet te nat zijn om zwelling van de IVD's te voorkomen, - Gebruik het scalpelblad om het wervellichaam (rood/roze bot), groeiplaat (wit kraakbeen) af te schrapen, laat de eindplaat intact (geelroze). Maak de twee oppervlakken vlak en parallel voor de laadprocedure. Breng geschraapte IVDs over in een verse Petrischaal met gaas bevochtigd met ringer's oplossing.
OPMERKING: Draag een kettingmailhandschoen om de hand te beschermen terwijl u de IVD vasthoudt en schraapt. - Meet de schijfhoogte en diameter met een remklauw. Reinig de bloedstolsels in het wervelbeen met de oplossing van Ringer met behulp van een straalspoelingssysteem.
- Breng de IVD's over naar 50 ml plastic buizen, één IVD per buis. Voeg 25 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 10% penicilline/streptomycine (P/S) per IVD toe en laat het 15 minuten schudden op een orbitale shaker bij kamertemperatuur.
- Aspireer het supernatant en voeg 10 ml PBS + 1% P/S per IVD toe gedurende 2 minuten om de IVD's te spoelen.
2. IVD-cultuur en belasting
- Breng schijven over naar IVD-kamers en voeg IVD-kweekmedium toe (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L hoge glucose DMEM voor de fysiologische groep en 2 g/L lage glucose DMEM voor de pathologische groep) + 1% P/S + 2% foetale kalfsserum + 1% ITS (bevat 5 μg/ml insuline, 6 μg/ml transferrine en 5 ng/ml seleninezuur) + 50 μg/ml ascorbaat-2-fosfaat + 1% niet-essentieel aminozuur + 50 μg/ml antimicrobieel agens voor primaire cellen) en in een incubator plaatsen bij 37 °C, 85% vochtigheid en 5% CO2.
- Kweek de schijven gedurende 4 dagen in een bioreactorsysteem volgens experimentele groepen16. Houd in de pathologische groep degeneratieve belastingsomstandigheden aan bij 0,32-0,5 MPa, 5 Hz gedurende 2 uur/dag. Gebruik in de fysiologische controlegroep een beladingsprotocol van 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz gedurende 2 uur/dag.
OPMERKING: Plaats de IVD's tijdens de laadprocedures in kamers met 5 ml IVD-medium. Het volume is afhankelijk van de grootte van de laadkamers van de bioreactor. Plaats de IVD's tussen de beladingsprocedures in zesputplaten met 7 ml IVD-kweekmedium voor herstel van vrije zwelling. - Voor het analyseren van de veranderingen in schijfhoogte tijdens de experimentele periode, meet u de schijfhoogte met een remklauw na IVD-dissectie (baseline) en vervolgens dagelijks na de vrije zwellingsperiode en na dynamische belasting voor de experimentele duur.
3. Intradiscale tumor necrose factor-alfa (TNF-α) injectie
- Direct na de eerste dynamische laadcyclus op dag 1 plaatst u de IVD's in een petrischaal in een verticale positie en stabiliseert u de IVD's met een pincet.
- Injecteer recombinant TNF-α (100 ng in 70 μL PBS per IVD) met een 30-gauge insulinenaald in het nucleus pulposusweefsel van de pathologische groep17. Injecteer langzaam met een snelheid van ongeveer 70 μL in 1 min.
- Trek na injectie de spuit halverwege terug in de IVD en trek aan de zuiger van de spuit om een vacuüm te creëren dat voorkomt dat de geïnjecteerde oplossing teruglekt, voordat u de naald en spuit volledig uit de IVD verwijdert.
OPMERKING: Voer een proefexperiment uit door PBS met trypanblauwe kleurstof te injecteren om de verdeling van de geïnjecteerde oplossing na het laden en de nachtcultuur te evalueren.
4. Genexpressie
- Oogst de IVD's op dag 4. Verzamel het nucleus pulposus (NP) weefsel (gelly deel in het midden van IVD) met een biopsie punch. Verzamel de buitenste annulus fibrosus (AF) met een scalpelblad (nr. 20).
OPMERKING: Verzamel voor de referentie van de uitgangswaarde op dag 0 onmiddellijk na dissectie weefsels voor RNA-extractie. - Gebruik de hoeveelheid NP- of AF-weefsel die nodig is voor genexpressieanalyse, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
OPMERKING: Voor de huidige experimenten werd ongeveer 150 mg weefsel gebruikt. De verhouding tussen RNA-isolatieoplossing en weefselmassa moet ten minste 2 ml per 100-150 mg weefsel zijn voor een efficiënte extractie. - Verteer het NP- of AF-weefsel met de verteringsoplossing (0,2% pronase in DMEM, filter gesteriliseerd) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met magnetisch roeren18.
- Flash-freeze de weefselmonsters met vloeibare stikstof en verpulveren tot een fijn poeder. Verdeel het verpulverde weefselpoeder gelijkmatig in twee buizen van 2 ml die elk 1 ml guanidinethiocyanat en fenol bevatten in een monofaseoplossing (RNA-isolatieoplossing).
- Voer de homogenisatie uit in buizen van 2 ml met de RNA-isolatieoplossing en het verpulverde weefselpoeder. Homogeniseer het weefselpoeder 5x met een roestvrijstalen bal van 8 mm en een tissue-lyzer bij 30 Hz gedurende 3 minuten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g, 4 °C en breng het supernatant over in een verse buis. De supernatanten kunnen minstens één maand bij -80 °C worden bewaard.
- Voeg 0,1 ml 1-bromo-3-chloropropaan (BCP) per 1 ml RNA-isolatieoplossing toe en schud krachtig gedurende 15 s. Bewaar het resulterende mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een orbitale shaker en centrifugeer gedurende 15 min bij 4 °C op 12.000 x g.
OPMERKING: Het RNA blijft uitsluitend in de bovenste waterfase. - Breng de waterfase over in een verse buis en neerslag RNA met 0,25 ml isopropanol en 0,25 ml zoutrijke neerslagoplossing per 1 ml RNA-isolatieoplossing die wordt gebruikt voor initiële homogenisatie. Bewaar de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een orbitale shaker en centrifugeer gedurende 8 min bij 4 °C op 12.000 x g.
OPMERKING: U kunt ook de kolomgebaseerde RNA-extractiemethode gebruiken, die over het algemeen leidt tot een hogere RNA-zuiverheid maar een lagere RNA-opbrengst. - Verwijder het supernatant en was de RNA-pellet met 1 ml 75% ethanol per 1 ml RNA-isolatieoplossing die wordt gebruikt voor initiële homogenisatie. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Verwijder de ethanolwas en droog RNA-pellet kort aan de lucht gedurende 3-5 minuten. Los het RNA op in 20 μL met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water door de oplossing een paar keer door een pipetpunt te laten lopen en gedurende 10-15 minuten bij 55-60 °C te broeden.
- Meet de absorptie bij respectievelijk 230 nm, 260 nm en 280 nm (A230, A260 en A280). A260 van 1,0 komt overeen met 40 μg/ml RNA. Er wordt een A260/A280-verhouding van 1,6-1,9 verwacht, terwijl verontreiniging resulteert in een A260/A280-verhouding van < 1,6.
- Bereid een reverse transcriptase (RT) reactiemix voor op een reactievolume van 20 μL. De mix bevat RT-enzymmix, ribonucleaseremmer, helpereiwit, primers, dNTPs, MgCl2,RNase-vrij water en 0,4 μg RNA-monster.
- Centrifugeer de RT-buizen kort om alle componenten aan de onderkant van de buis te mengen.
- Plaats de monsters in het thermocyclerinstrument. Selecteer het juiste programma voor de RT. Voer de RT gedurende 10 minuten uit bij 25 °C, gevolgd door de omgekeerde transcriptiestap gedurende 120 minuten bij 42 °C en inactivering van de omgekeerde transcriptase gedurende 5 minuten bij 85 °C, afkoelen tot 4 °C aan het einde.
- Verdun het resulterende cDNA met Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TE) buffer (10 mM Tris met 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 0,4 μg RNA gebruikt voor RT per 100 μL cDNA-oplossing. Bewaar de cDNA-monsters bij -20 °C.
- Voer real-time polymerasekettingreactie (PCR) uit met een reactievolume van 10 μL. Het reactievolume bevat de mastermix (met DNA-polymerase, uracil-DNA-glycosylase, dNTPs met dUTP, passieve referentie en geoptimaliseerde buffercomponenten), voorwaartse primer 45 μM, reverse primer 45 μM, probe 12,5 μM (met een reporterkleurstof gekoppeld aan het 5'-uiteinde van de sonde, een klein groefbinder aan het 3'-uiteinde van de sonde en een niet-fluorescerende quencher aan het uiteinde van de sonde) , 2 μL cDNA en MET DEPC behandeld water.
- Voer een endogene controle (RPLP0) uit voor relatieve kwantificering met de methode 2-ΔΔCT 19.
- Voeg voorbeelden in duplicaten toe en voer een besturingselement zonder sjabloon uit door TE-buffer toe te voegen in plaats van cDNA. Voer PCR uit onder standaardomstandigheden (2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 °C, 40 cycli van 15 s bij 95 °C en 1 min bij 60 °C).
- Voer relatieve kwantificering van mRNA-doelen uit volgens de vergelijkende CT-methode. De hoeveelheid mRNA die is genormaliseerd naar het uitgangsmonster wordt berekend als 2-ΔΔCT, terwijl ΔΔΔCT het verschil is tussen de ΔCT (CT-doel-CT-endogene controle) van het monster en ΔCT (CT-doel en CT-endogene controle) van het uitgangsmonster.
5. Kwantificering van het eiwitgehalte in het IVD-medium
- Verzamel het medium dat door de IVD-monsters wordt geconditioneerd om het eiwitgehalte in het medium te meten. Voer enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) uit volgens het protocol van het doeleiwit.
- Runderinterleukine-8 (IL-8) wordt gekwantificeerd door anti-bovine IL8 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Degeneratieve belasting in een laag glucosemedium in combinatie met TNF-α injectie veroorzaakte een significante toename van de genexpressie van pro-inflammatoire markers interleukine 6 (IL-6) en interleukine 8 (IL-8) in vergelijking met de fysiologische controlegroep in NP-cellen na 4 dagen kweek (Figuur 2). Daarentegen hebben we geen significante veranderingen waargenomen voor de pro-inflammatoire genen interleukine 1β (IL-1β) en TNF-α in NP-cellen (gegevens niet getoond). Bovendien veranderden degeneratieve kweekomstandigheden de genexpressie van IL-6 en IL-8 in AF-cellen niet.
Figuur 2: Genexpressieniveaus in het nucleus pulposus (NP) weefsel en annulus fibrosus (AF) weefsels. Deze werden gemeten na 4 dagen kweek onder fysiologische of pathologische kweekconditie, genormaliseerd tot baseline (dag 0). Betekent ± betrouwbaarheidsinterval van 95% n=8, **p<0,01. Dit cijfer is gewijzigd van20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
In overeenstemming met de genexpressiebevindingen vertoonde het IL-8-eiwitgehalte in het medium na 2 dagen en 4 dagen een duidelijke toename in vergelijking met de fysiologische toestand (figuur 3). De metingen op dag 3 (na vrije zwelling of belasting) lieten echter geen significante verschillen tussen de studiegroepen zien, hoewel de resultaten hogere waarden voor de degeneratieve groep aangaven.
Figuur 3: Kwantificering van het pro-inflammatoire eiwit IL-8 afgifte in het IVD kweekmedium na vrije zwellingscultuur (FS) en dynamische belasting (Load). De resultaten worden weergegeven als de oorspronkelijke concentraties in ng/ml in het medium zonder normalisatie. Gemiddelde ± betrouwbaarheidsinterval van 95%, n=8, **p<0,01. Dit cijfer is gewijzigd van20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
De schijfhoogte (DH) verandert genormaliseerd in de DH na dissectie in figuur 4. Terwijl dh-reducties na belasting hogere waarden (d.w.z. meer hoogtevermindering) voor de degeneratieve groep aan het licht brachten in vergelijking met de fysiologische groepen, werden er geen verschillen in schijfhoogtewinsten na de vrije zwellingsperiode waargenomen tussen de studiegroepen. Dit gaf aan dat het verschil in schijfhoogteveranderingen tussen de pathologische en fysiologische groep hoger was na de beladingsprocedure. Bovendien waren de verschillen na 1 dag minder uitgesproken in vergelijking met de metingen op dag 2 en 3, wat wijst op een progressief effect van de degeneratieve en inflammatoire aandoeningen.
Figuur 4: Schijfhoogteveranderingen genormaliseerd naar de basiswaarden (na dissectie). Gemiddelde ± betrouwbaarheidsinterval van 95%. FS: vrijzwellen. N=10, ***p<0.001. Dit cijfer is gewijzigd van20. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben hier een gedetailleerd protocol gegeven om degeneratieve en inflammatoire IVDD te simuleren. Dit protocol kan worden toegepast voor gedetailleerde onderzoeken van ontstekingsroutes die leiden tot de destructieve effecten op de schijf. Bovendien kan het protocol helpen bij het bepalen van veelbelovende therapeutische doelen die betrokken zijn bij de progressie van de ziekte.
We hebben onlangs laten zien dat humane recombinante TNF-α ontstekingen kan veroorzaken in zowel runder- als menselijke NP-cellen21, wat in overeenstemming is met andere studies in het veld die bevestigen dat TNF-α kan worden gebruikt voor ontstekingssimulatie in IVD-cellen22,23. In deze studie werd een dosis van 100 ng TNF-α per IVD gebruikt om ontstekingen op te wekken. Deze dosis vertoonde een effectieve inductie van ontstekingsmarkers bij toepassing in combinatie met degeneratieve belasting en beperkte voeding15,20. In een recente studie met TNF-α als enige initiatiefactor van IVD-degeneratie, is een drempel van 100 ng TNF-α / cm3 schijfvolume bepaald als een effectieve dosis voor de inductie van inflammatoire en degeneratieve veranderingen in de IVD21. Er wordt gesuggereerd dat de TNF-α dosis die wordt gebruikt om ontstekingen te veroorzaken, moet worden genormaliseerd tot het volume van de schijf voor reproduceerbare effecten. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat het injectiemateriaal goed in het IVD wordt verspreid en dat deze injectie in latere experimenten voldoende reproduceerbaar is. Aangezien de injectiedruk tussen individuen kan variëren, kunnen er verschillende verdelingen van het materiaal tussen dezelfde studiegroepen in verschillende experimenten zijn. Een benadering die we kozen om de gelijke verdeling te onderzoeken, was het gebruik van PBS verdunde trypan blauwe injecties. Het wordt aanbevolen om de injectietechniek te standaardiseren, bijvoorbeeld met injectiepompen en vooraf gedefinieerde en reproduceerbare injectiesnelheden. Zoals eerder is aangetoond, heeft één enkele naaldpunctie met 22-gauge, 25-gauge of 30-gauge naalden in de IVD geen effect veroorzaakt dat interageerde met studieresultaten20,21,24,25. Het wordt aanbevolen om de schijfgrootte te overwegen voor het volume van de te injecteren stof en voor de naaldgrootte die voor injectie wordt gebruikt. Verder wordt aanbevolen een enkele injectie te gebruiken om te voorkomen dat potentiële degeneratieve effecten veroorzaakt door meervoudige ringvormige injecties21,26worden veroorzaakt .
Enkele beperkingen van het huidige model moeten worden aangepakt. Het laden van de IVD's vereist toegang tot bioreactoren, die momenteel niet op grote schaal beschikbaar zijn in veel laboratoria die aan IDD werken. De behoefte aan preklinische IVD-degeneratiemodellen neemt echter toe. Orgaancultuurmodellen brengen ethische voordelen met zich mee om de behoefte aan diermodellen te verminderen, en de eenmalige investering in bioreactorkosten zou betaalbaar kunnen zijn gezien de reproduceerbaarheid van de degeneratieve stimulatie en de verlaging van de kosten in verband met dierproeven. Toch kunnen sommige in vivo interacties, zoals de rol van het immuunsysteem, niet worden gesimuleerd met het meegeleverde orgaancultuurmodel. Bovendien kunnen de meting van zenuwsignalen en de evaluatie van pijn die mogelijk zou zijn in diermodellen momenteel niet worden overwogen met het huidige model. Er werden enkele zorgen geuit over de vraag of de mechanische eigenschappen van staart-IVD's vergelijkbaar zouden kunnen zijn met menselijke IVD's, aangezien de rechtopstaande wervelkolompositie uniek is bij mensen28. Anatomische en moleculaire eigenschappen van runderstaart-IVD's, zoals celdichtheid, gebrek aan notochordale cellen, biochemische samenstelling29,30en mechanische eigenschappen van boviene caudale IVD's, zoals bewegingsbereik in flexie, extensie, torsie enbuigen 31, lijken erg op menselijke IVD's. Met name menselijke IVD's krijgen de laatste tijd steeds meer aandacht voor orgaancultuurmodellen28. Menselijke cadaverische IVD's in ex vivo-modellen worden als zeer efficiënt beschouwd omdat ze soortverschillen kunnen vermijden die klinisch relevanter zijn32. In tegenstelling tot runder-IVD-staarten die uit de slachthuizen zijn verkregen, zou dit transplantatie van menselijke IVD's 24 uur na de dood en dus ethische goedkeuring volgens de plaatselijke orgaantransplantatiewettenvereisen 28. De huidige methode kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten.
Een groot voordeel van de techniek in vergelijking met andere methoden van ex vivo culturen is de combinatie van intradiscal injectie, pathologische medium omstandigheden en schadelijke belasting om het vroege stadium van degeneratieve schijven beter te simuleren. Walter et al.23 gebruikten TNF-alpha in het medium van dynamisch geladen runder-IVD's in plaats van injectie in de IVD's en vertoonden een verhoogd transport van TNF-alpha van het medium naar de nucleus pulposus in vergelijking met de annulus fibrosus, wat in overeenstemming is met onze resultaten. Omdat we de vroege stadia van IDD wilden simuleren, die op cellulair niveau optreden zonder grote verstoringen van de schijfarchitectuur12,kozen we de TNF-alfaconcentraties op basis van eerdere orgaancultuurstudies met TNF-alfa in het medium om de vroege stadia van IDD12 , 22,23te simuleren . Het gebruik van andere inflammatoire stimulerende middelen en hogere concentraties TNF-alfa kan worden getest om de gewenste degeneratieve schijftoestand te simuleren, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Hogere concentraties TNF-alfa kunnen het gebrek aan systemische immuunregulerende feedback tijdens schijfdegeneratie beter compenseren, zoals voorgesteld door Ponnappan et al.12 Het gebruik van schadelijke mediumcondities met lage glucose was gebaseerd op eerder werk waaruit bleek dat voedingsbeperkende media en blootstelling aan TNF-alfa moleculaire veranderingskenmerken nabootsen die beschikbaar zijn in vroege schijfdegeneratietoestand12,27. Zo combineert de aanpak het bewijs van eerdere studies in één ex vivo orgaancultuurmodel van vroege degeneratieve schijfziekte.
Dit protocol kan op verschillende manieren verder worden verbeterd. De duur en omvang van de belastings- en vrije-zwellingsperiode kan worden gekozen op basis van het gewenste studieplan. Langetermijneffecten van inflammatoire of degeneratieve stimulaties op schijfdegeneratie zijn van groot klinisch belang en kunnen worden bereikt met het huidige protocol. We gebruikten alleen geselecteerde genen die als zeer relevant werden beschouwd voor de vroege toestand van IDD11. Aanvullende validatie van dit model kan een verruimde beoordeling van genen en eiwitten omvatten, zoals omics-benaderingen. Bijgevolg kunnen andere ontstekingsfactoren worden onderzocht in combinatie met de degeneratieve belasting, afhankelijk van de gewenste degeneratieve toestand. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat lipopolysaccharide-injecties ontstekingen in de IVD33stimuleren . Een vergelijking van verschillende inflammatoire stimulerende middelen kan worden bereikt met het huidige protocol om het meest geschikte inflammatoire stimulerende middel voor de gewenste studievraag te vinden. We hebben veranderingen van geselecteerde inflammatoire markers (IL-6, IL-8), anabole markers (aggrecan, collageen) en katabole markers (matrix metallopeptidases, een disintegrine en metalloproteinases met trombospondin motieven) met het huidige protocol20geëvalueerd. Aangezien het hele genexpressieprofiel zou kunnen veranderen, kunnen toekomstige onderzoeken RNA-sequencingtechnieken van de volgende generatie omvatten om nieuwe biomarkers voor schijfdegeneratiediagnostiek en therapeutische doelen voor vroege biologische interventie te bepalen. Bovendien kunnen andere methodologieën, zoals histologie, immunohistochemische kleuring, biochemische metingen van extracellulaire matrixcomponenten (zoals glycosaminoglycanen, GAG's) en dynamische druktests worden uitgevoerd om de biologische, biochemische en biomechanische eigenschappen van IVD's met het huidige model verder te analyseren. Een andere mogelijke analytische manier zou zijn om de impact op buitenste AF- en NP-weefsel afzonderlijk te analyseren door bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α en MKX te gebruiken als genexpressiemarkers voor de buitenste AF34,35. De Spine Research Interest Group op de jaarlijkse ORS-vergadering 2014 in New Orleans adviseerde na gezonde NP fenotypische markers: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan/collagen II ratio >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 en CD2436. De NP-markergenen bBrachyury/T en bSecreted frizzled-related protein 2 waren het meest overtuigende scheidende NP van binnenste en buitenste AF-weefsel in het runder-IVD34. Bovendien werd gemeld dat het sGAG-gehalte van het NP aanzienlijk hoger was in vergelijking met de buitenste AF34.
Concluderend, dit nieuwe pro-inflammatoire en degeneratieve IVD-orgaancultuurmodel biedt relevante voorwaarden om IDD in een vroeg stadium te simuleren in een zeer relevante 3D-micro-omgeving. Zeker, het huidige protocol kan verder worden aangepast aan de doelstellingen van de onderzoeker. Bovendien is ons model in staat om het aantal benodigde studiedieren te verminderen en weerspiegelt het dus volledig de 3R-principes van verminderen, vervangen, verfijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door AO Foundation en AOSpine International. Babak Saravi kreeg fellowship steun van de German Spine Foundation en de German Osteoarthritis Foundation. Gernot Lang werd ondersteund door het Berta-Ottenstein-programma voor gevorderde clinicuswetenschappers, faculteit geneeskunde, Universiteit van Freiburg, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
