Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجا تجريبيا جديدا لثقافة الأعضاء البقرية التنكسية proinflammatory لمحاكاة انحطاط القرص الفقري في مرحلة مبكرة.
Abstract
انحطاط القرص الفقري (IVD) أعراض (IDD) هو عبء اجتماعي واقتصادي كبير ويتميز التهاب وتدهور الأنسجة. بسبب عدم وجود العلاجات المسببة ، هناك حاجة ملحة لنماذج مبتكرة تجريبية لزراعة الأعضاء لدراسة الآليات المشاركة في تطور المرض ، وإيجاد أهداف علاجية ، والحد من الحاجة إلى نماذج حيوانية. نحن هنا نقدم رواية، بروتوكول نموذج ثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد تحاكي البيئة الدقيقة proinflammatory والكاتالية، والتي هي موجودة خلال IDD.
في البداية، تم تشريح ال IVDs caudal البقرية وتنظيفها واستزراعها في وسط زراعة الأنسجة. تم تطبيق التحميل الحيوي الفسيولوجي أو المرضي في مفاعل حيوي مصنوع خصيصا لمدة ساعتين يوميا. تم تعيين IVDs إلى مجموعة مراقبة (متوسط الجلوكوز العالي ، التحميل الفسيولوجي ، حقن ملحي عازل بالفوسفات) ومجموعة مرضية (متوسط الجلوكوز المنخفض ، التحميل المرضي ، حقن عامل نخر الورم ألفا) لمدة أربعة أيام. تم إجراء تحليل التعبير الجيني من خلايا اللبوسوس النواة التي تم جمعها من IVDs و المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم لوسائط ثقافة الأعضاء المكيفة.
كشفت بياناتنا عن تعبير أعلى عن العلامات الالتهابية وانخفاض ارتفاعات القرص بعد التحميل في المجموعة المرضية مقارنة بمجموعة التحكم. هذا البروتوكول موثوق به لمحاكاة التهاب IVD وانحطاط ويمكن توسيعه لتوسيع نطاق تطبيقه.
Introduction
آلام أسفل الظهر (LBP) يمكن أن تؤثر على الأفراد من جميع الأعمار، وهو السبب الرئيسي للإعاقة في جميع أنحاء العالم1,2,3. التكلفة الإجمالية المرتبطة LBP يتجاوز 100 مليار دولار سنويا4،5. أعراض الضمور الفقري (IVD) انحطاط (IDD) ، وهي حالة تتميز التهاب وتدهور الأنسجة ، هو سبب رئيسي لLBP6،7. على وجه التحديد ، يتميز معرف الهوية بانهيار يتطور تدريجيا لمصفوفة IVD خارج الخلية (ECM) ، الناجمة والمحفزة بسبب عوامل متعددة تؤدي إلى تسارع الأمراض والاضطرابات العصبية ، والإعاقة في نهاية المطاف. وعلاوة على ذلك، ويرتبط معرف مع الإفراج عن السيتوكينات proinflammatory، غيرت الميكانيكا الحيوية العمود الفقري، تولد الأوعية، ونمو الأعصاب، مما يزيد من الإحساس بالألم، مما تسبب تماما LBP المزمن (اعتلال نشط)6،8. حتى الآن، تشمل خيارات العلاج استئصال القرص والانصهار اللاحق للفقرات المجاورة، وزرع بدلة IVD، أو النهج غير الجراحية، مثل الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية، والمواد الأفيونية، ومرخيات العضلات للمرضى الذين يعانون من الهوية9. كلا الخيارات العلاجية القياسية الحالية، الجراحية وغير الجراحية، هي فقط فعالة جزئيا وتفشل في معالجة المشكلة البيولوجية الكامنة9،10. يتميز مرض القرص التنكسية في مرحلة مبكرة من استجابة الأنسجة الالتهابية الأولية ، وخاصة زيادة في عامل نخر الورم ألفا (TNF-alpha) التعبير11. تحدث هذه التغييرات المبكرة في القرص في المقام الأول على المستوى الخلوي دون تعطيل بنية القرص ويمكن محاكاتها سابقا بسبب نقص التغذية في ظل ظروف مؤيدة للالتهابات12. لذلك ، فإن المحاكاة الدقيقة للوضع في الجسم الحي للتحقيق في آليات الانحطاط هذه وإيجاد أهداف علاجية مناسبة أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، إلى هذه المحاكاة من الخصائص الجزيئية ، وبيئة التحميل الميكانيكية للأقراص يلعب دورا رئيسيا في التغيرات المرضية والفسيولوجية من IVD. وبالتالي، فإن الجمع بين هذه النهج من شأنه أن يقودنا خطوة إلى الأمام لمحاكاة البيئة الدقيقة المعقدة لل IVDs في الجسم الحي. لا توجد حاليا دراسات النظر في جانب التحميل الديناميكي جنبا إلى جنب مع الإعداد الموالية للالتهابات والتغذية على حد علمنا.
على الرغم من أن النماذج الحيوانية الكبيرة تسمح بالتحقيق في التفاعلات المحتملة ذات الصلة في الجسم الحي ، إلا أنها مكلفة وتعمل بشكل مكثف. وعلاوة على ذلك، وبما أن استخدام النماذج الحيوانية في البحوث كان لفترة طويلة موضع جدل، فإن تخفيض عدد الحيوانات اللازمة للإجابة على أسئلة بحثية هامة أمر بالغ الأهمية. وأخيرا، لا يوجد حاليا نموذج حيواني مثالي لمحاكاة معرف في أبحاث IVD13،14. لذلك ، من الضروري إنشاء بديل فعال من حيث التكلفة وموثوق به ، مثل نموذج ثقافة الأعضاء لمحاكاة الهوية والعمليات الالتهابية والتنكسية المرتبطة بها. في الآونة الأخيرة ، سمح لنا تطبيق البروتوكول الحالي بشأن إنشاء نموذج ثقافة الأعضاء التنكسية والتنكسية لمحاكاة مرض القرص الفقري في مرحلة مبكرة بالتحقيق في تأثير الأدوية المضادة للالتهابات في ثقافة الجهاز IDD15.
هنا، ونحن نصف كيفية الحصول على أقراص الفقرية البقرية والحث على حالة معرف المرحلة المبكرة عن طريق البيئة الدقيقة تقويضي وبروينفلامماتوري الناجمة عن الحقن الداخلي المباشر للورم نخر عامل ألفا (TNF-α) والتحميل التنكسية في مفاعل حيوي في ظل ظروف متوسطة منخفضة التغذية. يوضح الشكل 1 النموذج التجريبي ويظهر المفاعل الحيوي المستخدم لمحاكاة ظروف التحميل التنكسية والفسيولوجية.
الشكل 1: توضيح الإعداد التجريبي. أ: ذيل البقر; ب: تشريح الأقراص الفقرية البقرية; ج: نقل القرص إلى لوحة جيدة مع الثقافة المتوسطة؛ D: تحميل المحاكاة في مفاعل حيوي؛ E: تقنية الحقن داخل الفصيلة; F: IVD بعد حقن PBS / تريبان صبغة زرقاء للكشف عن التوزيع. معرف: انحطاط القرص الفقري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب باستخدام ذيول الأبقار التي تم الحصول عليها من المسالخ المحلية. والمواد البيولوجية المستخدمة في الدراسة الحالية مأخوذة من السلسلة الغذائية ولا تتطلب أي موافقة أخلاقية في القانون السويسري والأوروبي.
1. تشريح القرص الفقري البقري
- شطف الذيل كله جيدا مع مياه الصنبور لإزالة الأوساخ والشعر على السطح.
ملاحظة: مع سليمة، ونهايات البعيدة، كحد أقصى من 9 IVDs (العصعص 1-9) لكل ذيل يمكن استخدامها للتجارب اعتمادا على الحجم المطلوب من IVDs. وبالنظر إلى القطر المطلوب بين 15-20 ملم، استخدمنا 12 ذيلا بقرية مع 5 IVDs لكل ذيل للتجارب. - تزج الذيل كله في مربع يحتوي على محلول بيتادين 1٪ لمدة 10 دقيقة. تجفيف الذيل لفترة وجيزة مع الشاش العقيم ووضعه على الستائر العقيمة.
ملاحظة: أثناء تشريح القرص، قم بترطيب الذيل باستخدام الشاش الرطب بمحلول Ringer لمنع الجفاف. تخزين ذيول (أو شرائح من اليسار) ملفوفة في الشاش الرطب حتى يتم الانتهاء من إجراء تشريح كامل. - استخدم مشرطا (رقم 20) لإزالة الأنسجة الرخوة تماما قدر الإمكان من العمود الفقري caudal لتسهيل التعرف على IVDs. إزالة العمليات الشوكية والعرضية للفقرات مع كماشة إزالة العظام.
ملاحظة: حدد IVDs مع القطر المطلوب. واستخدمت في الدراسة الحالية IVات يبلغ قطرها 15-20 ملم. - قطع عرضية مع كماشة العظام من خلال منتصف كل جسم فقري للحصول على شرائح الحركة الفردية. وضع شرائح الحركة في طبق بيتري مع الشاش مبللة مع الحل رينغر.
- حدد موقع IVD والفقرة عن طريق الجس وتحريك أجزاء الحركة بلطف. جعل اثنين من التخفيضات موازية مع الفرقة شهدت في لوحة النمو من IVDs، واحد على كل جانب من IVD. تحديد موقع لوحة النمو عن طريق لمس والعثور على موقع محدب من الجزء نهاية عظمي (الثابت) المتاخمة للقرص (لينة) مع مسافة أمان من حوالي 0.5-1 ملم من IVD نحو الفقرة. تأكد من تبريد شفرة منشار الفرقة مع محلول Ringer أثناء قطع الفقرات.
- نقل IVDs في طبق بيتري نظيفة مع الشاش نظيفة مبللة مع الحل رينغر.
ملاحظة: يجب أن يرطب الشاش وليس رطبا جدا لمنع تورم ال IVDs ، - استخدام شفرة مشرط لكشط قبالة الجسم الفقري (الأحمر / الوردي العظام)، لوحة النمو (الغضروف الأبيض)، وترك اللوحة النهائية سليمة (الأصفر والوردي). جعل سطحين مسطحة ومتوازية لإجراء التحميل. نقل كشط IVDs إلى طبق بيتري الطازجة مع الشاش مبللة مع الحل رينغر.
ملاحظة: ارتداء قفاز chainmail لحماية اليد في حين عقد IVD وكشط. - قياس ارتفاع القرص وقطره مع الفرجار. تنظيف جلطات الدم في عظم الفقرات مع محلول رينغر باستخدام نظام المرحاض النفاث.
- نقل IVDs إلى أنابيب بلاستيكية 50 مل، IVD واحد لكل أنبوب. إضافة 25 مل من الفوسفات العازلة المالحة (PBS) + 10٪ البنسلين / ستريبتومايسين (P / S) لكل IVD وتركها تهتز لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة.
- اسبيرات supernatant وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني + 1٪ P / S لكل IVD لمدة 2 دقيقة لشطف IVDs.
2. IVD الثقافة والتحميل
- نقل الأقراص إلى غرف IVD وإضافة IVD ثقافة المتوسطة (دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM، 4.5 غرام / لتر عالية الجلوكوز DMEM للمجموعة الفسيولوجية و 2 غرام / لتر منخفض الجلوكوز DMEM للمجموعة المرضية) + 1٪ P / S + 2٪ مصل العجل الجنين + 1٪ ITS (يحتوي على 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 6 ميكروغرام/مل نقل، و5 نانوغرام/مل حمض سيلينيوس) + 50 ميكروغرام/مل أسكوربات-2-فوسفات + 1٪ حمض أميني غير أساسي + 50 ميكروغرام/مل عامل مضاد للميكروبات للخلايا الأولية) ووضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية ورطوبة 85٪ و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- ثقافة الأقراص لمدة 4 أيام داخل نظام مفاعل حيوي وفقا للمجموعات التجريبية16. في المجموعة المرضية، حافظ على ظروف التحميل التنكسية عند 0.32-0.5 ميجا باسكال، 5 هرتز لمدة 2 ساعة في اليوم. في مجموعة المراقبة الفسيولوجية، استخدم بروتوكول تحميل من 0.02-0.2 ميجا باسكال، 0.2 هرتز لمدة 2 ساعة/ يوم.
ملاحظة: ضع IVDs في غرف تحتوي على 5 مل من متوسط IVD أثناء إجراءات التحميل. يعتمد الحجم على حجم غرف التحميل في المفاعل الحيوي. بين إجراءات التحميل، ضع IVDs في لوحات سداسية الآبار مع 7 مل من متوسط ثقافة IVD لاسترداد التورم الحر. - لتحليل التغيرات في ارتفاع القرص خلال الفترة التجريبية، قم بقياس ارتفاع القرص مع الفرجار بعد تشريح IVD (خط الأساس) ثم يوميا بعد فترة التورم الحر وبعد التحميل الديناميكي للمدة التجريبية.
3. نخر الورم داخل الرحم عامل ألفا (TNF-α) حقن
- مباشرة بعد دورة التحميل الديناميكية الأولى في اليوم الأول، ضع IVDs في طبق بيتري في وضع عمودي وتثبيت IVDs مع ملاقط.
- حقن TNF-α المؤتلف (100 نانوغرام في 70 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل IVD) مع إبرة الأنسولين قياس 30 في نسيج اللب النواة من المجموعة المرضية17. حقن ببطء بسرعة 70 ميكرولتر تقريبا في 1 دقيقة.
- بعد الحقن، سحب الحقنة في منتصف الطريق مرة أخرى داخل IVD وسحب المكبس حقنة لخلق فراغ يمنع الحل عن طريق الحقن من تسرب مرة أخرى، قبل إزالة الإبرة والمحاقن تماما من IVD.
ملاحظة: إجراء تجربة تجريبية عن طريق حقن PBS تحتوي على صبغة زرقاء تريبان لتقييم توزيع محلول حقن بعد التحميل والثقافة بين عشية وضحاها.
4. التعبير الجيني
- حصاد IVDs في اليوم 4. جمع النواة pulposus (NP) الأنسجة (جزء هلامي في منتصف IVD) مع لكمة خزعة. جمع الليفية annulus الخارجي (AF) مع شفرة مشرط (No.20).
ملاحظة: للحصول على مرجع خط الأساس في اليوم 0، جمع الأنسجة مباشرة بعد تشريح لاستخراج الحمض النووي الريبي. - استخدم كمية NP أو أنسجة AF اللازمة لتحليل التعبير الجيني، اعتمادا على التصميم التجريبي.
ملاحظة: بالنسبة للتجارب الحالية، تم استخدام ما يقرب من 150 ملغ من الأنسجة. يجب أن تكون نسبة محلول عزل الحمض النووي الريبي إلى كتلة الأنسجة على الأقل 2 مل لكل 100-150 ملغ من الأنسجة لاستخراج فعال. - هضم NP أو AF الأنسجة مع حل الهضم (0.2٪ pronase في DMEM، تصفية تعقيم) واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع اثارة المغناطيسي18.
- فلاش تجميد عينات الأنسجة باستخدام النيتروجين السائل وسحق لمسحوق ناعم. تقسيم مسحوق الأنسجة المسحوقة بالتساوي إلى اثنين من أنابيب 2 مل كل تحتوي على 1 مل من ثيوسيانات جوانيدين وفينول في محلول أحادي الطور (حل عزل الحمض النووي الريبي).
- إجراء التجانس في أنابيب 2 مل التي تحتوي على محلول عزل الحمض النووي الريبي ومسحوق الأنسجة المسحوق. تجانس مسحوق الأنسجة 5x مع 8 مم كرة الفولاذ المقاوم للصدأ والأنسجة lyzer في 30 هرتز لمدة 3 دقائق. جهاز الطرد المركزي في 12،000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى أنبوب جديد. يمكن تخزين المضادات الفائقة عند -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
- إضافة 0.1 مل من 1-برومو-3-الكلوروبروبوان (BCP) لكل 1 مل من محلول عزل الحمض النووي الريبي ويهز بقوة لمدة 15 ق. تخزين الخليط الناتج في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري لمدة 15 دقيقة والطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يبقى الجيش الملكي النيبالي حصرا في المرحلة المائية العليا. - نقل المرحلة المائية في أنبوب جديد وعجل الجيش الملكي النيبالي مع 0.25 مل من ايزوبروبانول و 0.25 مل من محلول هطول الأمطار الملح عالية لكل 1 مل من محلول العزل الجيش الملكي النيبالي المستخدمة لتجانس الأولية. تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على شاكر المدارية والطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم طريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود والتي تؤدي عموما إلى نقاء الحمض النووي الريبي أعلى ولكن انخفاض العائد RNA. - إزالة supernatant وغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 1 مل من الإيثانول 75٪ لكل 1 مل من محلول عزل الحمض النووي الريبي المستخدمة في التجانس الأولي. جهاز طرد مركزي عند 7500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إزالة غسل الإيثانول ولفترة وجيزة الهواء الجاف بيليه الحمض النووي الريبي لمدة 3-5 دقائق. حل الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من المياه المعالجة ديثيلبيروبونات (DEPC) عن طريق تمرير الحل عدة مرات من خلال طرف ماصة واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في 55-60 درجة مئوية.
- قياس الامتصاص في 230 نانومتر، 260 نانومتر، و 280 نانومتر (A230، A260 و A280 على التوالي). A260 من 1.0 يتوافق مع 40 ميكروغرام / مل الحمض النووي الريبي. ومن المتوقع أن تبلغ نسبة A260/A280 1.6-1.9، في حين يؤدي التلوث إلى نسبة A260/A280 تبلغ 1.6 <.
- إعداد مزيج رد فعل النسخ العكسي (RT) لحجم تفاعل 20 ميكرولتر. يحتوي المزيج على مزيج إنزيم RT ، مثبط ريبونوكليز ، بروتين مساعد ، التمهيديات ، dNTPs ، MgCl2، RNase الماء المجاني ، و 0.4 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي.
- طرد مركزي لفترة وجيزة أنابيب RT لخلط جميع المكونات في الجزء السفلي من الأنبوب.
- ضع العينات في أداة تدوير الحرارة. حدد البرنامج المناسب لRT. تشغيل RT لمدة 10 دقيقة في 25 درجة مئوية، تليها خطوة النسخ العكسي لمدة 120 دقيقة في 42 درجة مئوية وإبطال النسخ العكسي لمدة 5 دقائق عند 85 درجة مئوية، وتبريده إلى 4 درجة مئوية في النهاية.
- تمييع cDNA الناتجة مع تريس (هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان (تريس) - حمض الإيثيلينامينيت تراسيتراستيك (EDTA) (TE) العازلة (10 mM تريس مع EDTA 1 mM) إلى تركيز نهائي من 0.4 ميكروغرام الحمض النووي الريبي المستخدمة لRT لكل 100 ميكرولتر cDNA الحل. تخزين عينات cDNA في -20 درجة مئوية.
- قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR) باستخدام حجم تفاعل 10 ميكرولتر. يحتوي حجم التفاعل على المزيج الرئيسي (يحتوي على بوليمرات الحمض النووي ، uracil-DNA glycosylase ، dNTPs مع dUTP، مرجع سلبي ومكونات عازلة الأمثل)، التمهيدي الأمامي 45 ميكرومتر، التمهيدي العكسي 45 ميكرومتر، التحقيق 12.5 ميكرومتر (تحتوي على صبغة مراسل مرتبطة 5 'نهاية التحقيق، الموثق الأخدود طفيفة في نهاية 3 'من التحقيق، وquencher nonfluorescent في نهاية 3 'من التحقيق) ، 2 ميكرولتر من ال CDNA والمياه المعالجة من قبل DEPC.
- تشغيل عنصر تحكم داخلي (RPLP0) للقياس الكمي النسبي باستخدام الطريقة 2-ΔΔCT 19.
- إضافة عينات في التكرارات وتشغيل عنصر تحكم قالب لا بإضافة TE-المخزن المؤقت بدلا من cDNA. تشغيل PCR في الظروف القياسية (2 دقيقة في 50 درجة مئوية، 10 دقيقة في 95 درجة مئوية، 40 دورة من 15 ق في 95 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 60 درجة مئوية).
- إجراء تقدير كمي نسبي لأهداف الحمض النووي الريبي باتباع أسلوب CT المقارن. يتم حساب مقدار الحمض النووي الريبي العادي لعينة خط الأساس على أنه 2-ΔΔCT، في حين أن ΔΔCT هو الفرق بين ΔCT (CT target - CT التحكم الداخلي) للعينة و ΔCT (CT الهدف والتحكم الداخلي CT) لعينة خط الأساس.
5. تحديد كمي لمحتوى البروتين في المتوسط IVD
- جمع المتوسطة مشروطة من قبل عينات IVD لقياس محتوى البروتين في المتوسط. إجراء فحص مناعي مرتبط بالإنزيم (ELISA) وفقا لبروتوكول البروتين المستهدف.
- يتم قياس الكمية بين الأبقار interleukine-8 (IL-8) من قبل مكافحة البقر IL8 ELISA عدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تسبب التحميل التنكسية في المتوسط الجلوكوز منخفضة جنبا إلى جنب مع حقن TNF-α زيادة كبيرة في التعبير الجيني للعلامات proinflammatory interleukin 6 (IL-6) وبينلوكين 8 (IL-8) مقارنة مع مجموعة التحكم الفسيولوجية في خلايا NP بعد 4 أيام من الثقافة (الشكل 2). في المقابل، لم نلاحظ تغييرات كبيرة للجينات proinflammatory interleukin 1β (IL-1β) و TNF-α في خلايا NP (البيانات غير مبينة). وعلاوة على ذلك، لم تغير ظروف الثقافة التنكسية التعبير الجيني ل IL-6 و IL-8 في خلايا AF.
الشكل 2: مستويات التعبير الجيني في نواة اللب (NP) الأنسجة والأنسجة الليفية annulus (AF). تم قياس هذه بعد 4 أيام من الثقافة في ظل حالة الثقافة الفسيولوجية أو المرضية ، وتطبيعها إلى خط الأساس (اليوم 0). يعني ± 95٪ ثقة الفاصل الزمني ن = 8، ** ع<0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتماشيا مع نتائج التعبير الجيني، أظهر محتوى البروتين IL-8 في الوسط زيادة ملحوظة بعد يومين و4 أيام مقارنة بالحالة الفسيولوجية(الشكل 3). ومع ذلك، لم تكشف القياسات في اليوم الثالث (بعد التورم أو التحميل الحر) عن أي اختلافات كبيرة بين مجموعات الدراسة، على الرغم من أن النتائج أشارت إلى قيم أعلى للمجموعة التنكسية.
الشكل 3: تحديد كمي للبروتين الموالي للالتهابات IL-8 الإفراج في المتوسطة ثقافة IVD بعد ثقافة تورم الحرة (FS) وتحميل ديناميكي (تحميل). تظهر النتائج على أنها التركيزات الأصلية في نانوغرام / مل في الوسط دون تطبيع. متوسط ± 95٪ فترة الثقة، n = 8، **p<0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم عرض التغييرات ارتفاع القرص (DH) تطبيع إلى DH بعد تشريح في الشكل 4. في حين كشفت تخفيضات DH بعد التحميل عن قيم أعلى (أي تقليل أكبر في الارتفاع) للمجموعة التنكسية مقارنة بالمجموعات الفسيولوجية ، لم تظهر أي اختلافات في مكاسب ارتفاع القرص بعد فترة التورم الحر بين مجموعات الدراسة. وهذا يشير إلى أن الفرق في تغيرات ارتفاع القرص بين المجموعة المرضية والفسيولوجية كان أعلى بعد إجراء التحميل. وعلاوة على ذلك، كانت الاختلافات أقل وضوحا بعد يوم واحد مقارنة بالقياسات في اليومين 2 و 3، مما يشير إلى تأثير تدريجي للظروف التنكسية والالتهابية.
الشكل 4: تغيير ارتفاع القرص تسويتها لقيم الأساس (بعد تشريح). متوسط ± فاصل الثقة بنسبة 95٪. FS: تورم حر. N = 10 ، *** ع <0.001. وقد تم تعديل هذا الرقم من20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا قدمنا بروتوكول مفصل لمحاكاة الأمراض التنكسية والالتهابية IVDD. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإجراء فحوصات مفصلة للمسارات الالتهابية مما يؤدي إلى الآثار المدمرة على القرص. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد البروتوكول في تحديد الأهداف العلاجية الواعدة التي ينطوي عليها تطور المرض.
أظهرنا مؤخرا أن الإنسان المؤتلف TNF-α يمكن أن يسبب التهاب في كل من الأبقار والخلايا البشرية NP21, وهو وفقا لدراسات أخرى في هذا المجال تؤكد أن TNF-α يمكن استخدامها لمحاكاة التهاب في خلايا IVD22,23. في هذه الدراسة، تم استخدام جرعة من 100 نانوغرام TNF-α لكل IVD للحث على الالتهاب. وأظهرت هذه الجرعة التعريفي الفعال من علامات التهابية عند تطبيقها في تركيبة مع تحميل التنكسية والتغذية محدودة15,20. في دراسة حديثة باستخدام TNF-α كعامل بدء الوحيد من انحطاط IVD, عتبة 100 نانوغرام TNF-α / سم3 وقد تم تحديد حجم القرص كجرعة فعالة لتحريض التغيرات الالتهابية والتنكسية في IVD21. ويقترح أن الجرعة TNF-α المستخدمة للحث على التهاب ينبغي تطبيع لحجم القرص للآثار استنساخها. وعلاوة على ذلك، ينبغي ضمان وجود توزيع جيد لمواد الحقن في ال IVD وأن هذه الحقنة ستكون قابلة للتكرار بشكل كاف في التجارب اللاحقة. وبما أن ضغط الحقن قد يختلف بين الأفراد، فقد تكون هناك توزيعات مختلفة للمواد بين نفس مجموعات الدراسة في تجارب مختلفة. نهج واحد اخترنا لدراسة التوزيع المتساوي كان استخدام PBS المخفف تريبان الحقن الزرقاء. فمن المستحسن لتوحيد تقنية الحقن, على سبيل المثال, مع مضخات الحقن ومعدلات الحقن محددة سلفا وقابلة للاستنساخ. كما هو مبين سابقا، ثقب إبرة واحدة واحدة مع 22 قياس، 25 قياس، أو الإبر قياس 30 في IVD لم يسبب تأثير التي تفاعلت مع نتائجالدراسة 20،21،24،25. من المستحسن النظر في حجم القرص لحجم المادة التي سيتم حقنها وحجم الإبرة المستخدمة للحقن. علاوة على ذلك، فمن المستحسن استخدام حقنة واحدة لتجنب إحداث آثار التنكسية المحتملة الناجمة عن الحقن الحلقية متعددة21،26.
10- يلزم معالجة بعض القيود المفروضة على هذا النموذج. ويتطلب تحميل ال IVDs الوصول إلى المفاعلات الحيوية، التي لا تتوفر حاليا على نطاق واسع في العديد من المختبرات التي تعمل على ال IDD. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى نماذج انحطاط IVD قبل السريرية آخذة في الارتفاع. وتجلب نماذج زراعة الأعضاء فوائد أخلاقية للحد من الحاجة إلى النماذج الحيوانية، ويمكن أن يكون الاستثمار لمرة واحدة في تكاليف المفاعل الحيوي في متناول الجميع بالنظر إلى إمكانية إعادة إنتاج التحفيز التنكسي، والتخفيضات في التكاليف المرتبطة بالتجارب الحيوانية. ومع ذلك ، لا يمكن محاكاة بعض التفاعلات في الجسم الحي ، مثل دور الجهاز المناعي ، مع نموذج ثقافة الأعضاء المقدمة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن حاليا النظر في قياس الإشارات العصبية وتقييم الألم الذي يمكن أن يكون ممكنا في النماذج الحيوانية مع النموذج الحالي. وأثيرت بعض المخاوف حول ما إذا كانت الخصائص الميكانيكية لل IVDs الذيل يمكن أن تكون قابلة للمقارنة مع IVDs الإنسان كما وضع العمود الفقري تستقيم فريدة من نوعها في البشر28. الخصائص التشريحية والجزيئية لل IVDs ذيل البقري، مثل كثافة الخلية، وعدم وجود خلايا نوتوشوردال، وتكوين الكيميائيةالحيوية 29،30،والخصائص الميكانيكية لل IVDs caudal البقري، مثل مجموعة من الحركة في المرن، وتمديد، والتواء، والانحناء31 هي مشابهة جدا ل IVDs الإنسان. وتجدر الإشارة إلى أن IVDs الإنسان كسب المزيد والمزيد من الاهتمام في الآونة الأخيرة لنماذج ثقافة الجهاز28. وتعتبر IVDs الجثث البشرية في نماذج الجسم الحي السابق كفاءة عالية لأنها يمكن أن تجنب الاختلافات الأنواع التي هي أكثر ذات الصلةسريريا 32. وعلى النقيض من ذيول IVD البقري التي تم الحصول عليها من المسالخ ، فإن هذا يتطلب زرع IVDs البشرية 24 ساعة بعد الوفاة ، وبالتالي الموافقة الأخلاقية بعد قوانين زرع الأعضاء المحلية28. ويمكن أيضا تكييف الطريقة الحالية بسهولة مع الأنواع الأخرى.
ميزة رئيسية واحدة من هذه التقنية بالمقارنة مع أساليب أخرى من الثقافات الجسم الحي السابق هو مزيج من الحقن داخل الفصيلة، والظروف المتوسطة المرضية، والتحميل الضارة لمحاكاة المرحلة المبكرة من الأقراص التنكسية أفضل. استخدم والتر وآخرون23 TNF-alpha في وسط IVDs البقري المحمل ديناميكيا بدلا من الحقن في IVDs وأظهر زيادة نقل TNF-alpha من الوسط إلى اللب النواة مقارنة بالأورام الليفية النولوس ، والتي تتوافق مع نتائجنا. كما كنا نهدف إلى محاكاة المراحل المبكرة من معرف, الذي يحدث على المستوى الخلوي دون اضطرابات كبيرة في العمارة أقراص12, اخترنا تركيزات TNF-ألفا استنادا إلى دراسات سابقة ثقافة الجهاز باستخدام TNF-ألفا في المتوسط لمحاكاة المراحل المبكرة من معرف12,22,23. ويمكن اختبار استخدام المنشطات الالتهابية الأخرى وتركيزات أعلى من TNF-ألفا لمحاكاة حالة القرص التنكسية المطلوبة اعتمادا على مسألة الدراسة. تركيزات أعلى من TNF-ألفا قد تعوض بشكل أفضل عدم وجود ردود الفعل التنظيمية المناعية الجهازية موجودة خلال انحطاط القرص كما اقترح بوناببان وآخرون.12 واستند استخدام الظروف المتوسطة الضارة مع انخفاض الجلوكوز على العمل السابق تبين أن وسائل الإعلام الحد من الناحية التغذوية والتعرض لTNF-ألفا يحاكي خصائص التغيير الجزيئي التي تتوفر في وقت مبكر حالة انحطاط القرص12,27. وهكذا، فإن النهج يجمع بين الأدلة التي قدمتها الدراسات السابقة في نموذج واحد ثقافة الجهاز السابق في الجسم الحي من مرض القرص التنكسية في وقت مبكر.
ويمكن زيادة تحسين هذا البروتوكول بعدة طرق. يمكن اختيار مدة ومدى فترة التحميل والتورم الحر بناء على خطة الدراسة المطلوبة. الآثار طويلة الأجل للتحفيزات الالتهابية أو التنكسية على انحطاط القرص هي ذات أهمية سريرية عالية ويمكن تحقيقها مع البروتوكول الحالي. استخدمنا فقط جينات مختارة تعتبر ذات صلة عالية للدولة المبكرة من معرف11. ويمكن أن يشمل التحقق الإضافي من صحة هذا النموذج تقييما موسعا للجينات والبروتينات، مثل نهج الاقتصادات الاقتصادية. وبالتالي ، يمكن التحقيق في عوامل التهابية أخرى بالاشتراك مع التحميل التنكسي ، اعتمادا على الحالة التنكسية المطلوبة. على سبيل المثال، وقد ثبت حقن شحم الدهون لتحفيز التهاب في IVD33. يمكن إجراء مقارنة بين المنشطات الالتهابية المختلفة مع البروتوكول الحالي للعثور على المنشطات الالتهابية الأنسب لمسألة الدراسة المطلوبة. لقد قمنا بتقييم التغييرات من علامات التهابية مختارة (IL-6، IL-8)، علامات الابتنائية (aggrecan، الكولاجين)، وعلامات تقويضية (مصفوفة metallopeptidases، disintegrin و metalloproteinases مع زخارف thrombospondin) مع البروتوكول الحالي20. وبما أن ملف التعبير الجيني بأكمله قد يتغير، يمكن أن تشمل الفحوص المستقبلية تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي من الجيل التالي لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة لتشخيص انحطاط القرص والأهداف العلاجية للتدخل البيولوجي المبكر. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء منهجيات أخرى، مثل الأنسجة، والتلوين الكيميائي المناعي، والقياسات الكيميائية الحيوية لمكونات المصفوفة خارج الخلية (مثل الجليكوسامينوغليكانات، و GAGs)، والاختبارات الضاغطة الديناميكية لمواصلة تحليل الخصائص البيولوجية والبيوكيميائية والميكاميكية الحيوية لل IVDs مع النموذج الحالي. وهناك طريقة تحليلية أخرى ممكنة هي تحليل التأثير على الأنسجة الخارجية AF وNP بشكل منفصل باستخدام bCol1a1 و Col1a2 و CD146 و SM22α و MKX كعلامات تعبير جيني لل AFالخارجي 34و35. أوصت مجموعة الاهتمام بأبحاث العمود الفقري في الاجتماع السنوي ORS لعام 2014 في نيو أورليانز باتباع علامات NP الظاهرية الصحية: HIF-1alpha و GLUT-1 ونسبة aggrecan/collagen II >20 وShh وBrachyury وKRT18/19 وCA12 وCD2436. وكانت الجينات علامة NP bBrachyury / T وbSecreted البروتين ذات الصلة تجعد 2 الأكثر إقناعا فصل NP من الأنسجة AF الداخلية والخارجية في IVD البقري34. وعلاوة على ذلك، أفيد بأن محتوى الفريق الوطني لغاغ في نهاية المطاف أعلى بكثير مقارنة بالمحتوى الخارجي AF34.
في الختام ، يوفر هذا النموذج الجديد لثقافة الجهاز proinflammatory والتنكسية IVD الظروف ذات الصلة لمحاكاة معرف المرحلة المبكرة في محيط صغير ثلاثي الأبعاد وثيق الصلة. ومن المؤكد أنه يمكن تعديل هذا البروتوكول وفقا لأهداف المحقق. وعلاوة على ذلك، نموذجنا قادر على تقليل عدد الحيوانات الدراسة اللازمة، وبالتالي يعكس تماما مبادئ 3R للحد، واستبدال، وصقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة AO وOSpine الدولية. تلقى باباك سارافي دعم الزمالة من المؤسسة الألمانية للعمود الفقري والمؤسسة الألمانية لهشاشة العظام. تم دعم جيرنوت لانغ من قبل برنامج بيرتا-أوتنشتاين للعلماء السريريين المتقدمين، كلية الطب، جامعة فرايبورغ، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
