Summary
Dieses Protokoll stellt ein neuartiges experimentelles Modell der proinflammatorischen, degenerativen Rinderorgankultur vor, um die Bandscheibendegeneration im Frühstadium zu simulieren.
Abstract
Die symptomatische Bandscheibendegeneration (IDD) ist eine große sozioökonomische Belastung und durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet. Aufgrund des Mangels an ursächlichen Therapien besteht ein dringender Bedarf an innovativen experimentellen Organkulturmodellen, um die Mechanismen des Fortschreitens der Krankheit zu untersuchen, therapeutische Ziele zu finden und den Bedarf an Tiermodellen zu reduzieren. Wir präsentieren hier ein neuartiges, dreidimensionales Organkulturmodellprotokoll, das die proinflammatorische und katabole Mikroumgebung nachahmt, die während der IDD vorhanden ist.
Zunächst wurden bovine Kaud-IVDs im Gewebekulturmedium seziert, gereinigt und kultiviert. Dynamische physiologische oder pathologische Belastung wurde in einem maßgeschneiderten Bioreaktor für 2 Stunden pro Tag angewendet. IVDs wurden vier Tage lang einer Kontrollgruppe (hohes Glukosemedium, physiologische Belastung, phosphatgepufferte Kochsalzinjektion) und einer pathologischen Gruppe (niedriges Glukosemedium, pathologische Belastung, Tumornekrosefaktor-Alpha-Injektion) zugeordnet. Es wurde eine Genexpressionsanalyse aus gesammelten Nucleus pulposus-Zellen der IVDs und ein enzymgebundener Immunsorbent-Assay der konditionierten Organkulturmedien durchgeführt.
Unsere Daten zeigten eine höhere Expression von Entzündungsmarkern und reduzierte Bandscheibenhöhen nach belastung in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Protokoll ist zuverlässig, um IVD-Entzündungen und -Degenerationen zu simulieren und kann weiter erweitert werden, um seinen Anwendungsbereich zu erweitern.
Introduction
Rückenschmerzen (LBP) können Menschen jeden Alters betreffen und sind weltweit eine der Hauptursachen fürBehinderungen 1,2,3. Die gesamtkosten im Zusammenhang mit LBP übersteigen 100 Milliarden US$Dollar pro Jahr4,5. Symptomatische Bandscheibendegeneration (IVD) (IDD), eine Erkrankung, die durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet ist, ist eine Hauptursache für LBP6,7. Insbesondere ist IDD durch einen sich allmählich entwickelnden Zusammenbruch der extrazellulären Matrix (ECM) der IVD gekennzeichnet, der durch mehrere Faktoren induziert und ausgelöst wird, die zu einer beschleunigten Pathologie, neurologischen Störungen und schließlich zu einer Behinderung führen. Darüber hinaus ist IDD mit der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, veränderter Wirbelsäulenbiomechanik, Angiogenese und Nerveningrowth verbunden, was das Schmerzempfinden erhöht und insgesamt chronische LBP (aktive Diskopathie) verursacht6,8. Bisher umfassen die Behandlungsmöglichkeiten die Diskektomie und die anschließende Fusion der benachbarten Wirbel, die Implantation einer IVD-Prothese oder nicht-chirurgische Ansätze wie nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, Opioide und Muskelrelaxantien für Patienten mit IDD9. Beide derzeitigen Standardtherapieoptionen, chirurgische und nicht-chirurgische, sind nur teilweise wirksam und gehen nicht auf das zugrunde liegende biologische Problem ein9,10. Eine degenerative Bandscheibenerkrankung im Frühstadium ist durch eine anfängliche entzündliche Gewebereaktion gekennzeichnet, insbesondere durch eine Zunahme der Tumornekrosefaktor-alpha -Expression (TNF-alpha)11. Diese frühen Bandscheibenveränderungen treten hauptsächlich auf zellulärer Ebene auf, ohne die Bandscheibenarchitektur zu stören und konnten zuvor durch Nährstoffmangel unter entzündungsfördernden Zuständen nachgeahmt werden12. Daher ist eine präzise Simulation der In-vivo-Situation entscheidend, um diese Degenerationsmechanismen zu untersuchen und geeignete therapeutische Ziele zu finden. Zusätzlich zu diesen Simulationen molekularer Eigenschaften spielt die mechanische Belastungsumgebung der Scheiben eine Schlüsselrolle bei pathologischen und physiologischen Veränderungen der IVD. Folglich würde uns die Kombination dieser Ansätze einen Schritt nach vorne bringen, um die komplexe Mikroumgebung von IVDs in vivo nachzuahmen. Es gibt derzeit keine Studien, die den Aspekt der dynamischen Belastung zusammen mit dem entzündungsfördernden und ernährungsphysiologischen Setting nach bestem Wissen und Gewissen berücksichtigen.
Große Tiermodelle erlauben zwar die Untersuchung potentiell relevanter in vivo Wechselwirkungen, sind aber kostspielig und arbeitsintensiv. Da der Einsatz von Tiermodellen in der Forschung seit langem umstritten ist, ist die Reduzierung der Anzahl der Tiere, die zur Beantwortung wichtiger Forschungsfragen benötigt werden, von großem Interesse. Schließlich gibt es derzeit kein ideales Tiermodell, um IDD in der IVD-Forschung nachzuahmen13,14. Daher ist es notwendig, einen kostengünstigen und zuverlässigen Ersatz zu etablieren, z. B. ein Organkulturmodell, um IDD und damit verbundene entzündliche und degenerative Prozesse zu simulieren. Vor kurzem ermöglichte uns die Anwendung des vorliegenden Protokolls zur Etablierung eines proinflammatorischen und degenerativen Organkulturmodells zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium, die Wirkung entzündungshemmender Medikamente in der IDD-Organkultur zu untersuchen15.
Hier beschreiben wir, wie man Bovin-Bandscheiben erhält und den Zustand der IDD im Frühstadium über eine katabole und proinflammatorische Mikroumgebung induziert, die durch direkte intradiskale Injektion von Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und degenerative Belastung in einem Bioreaktor unter niedrigen Nährmediumbedingungen verursacht wird. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Modell und zeigt den Bioreaktor, mit dem degenerative und physiologische Belastungsbedingungen simuliert werden.
Abbildung 1: Abbildung des Versuchsaufbaus. A: Rinderschwanz; B: sezierte Bandscheiben von Rindern; C: Übertragung der Scheibe auf eine Well-Platte mit Kulturmedium; D: Laden der Simulation in einen Bioreaktor; E: intradiskale Injektionstechnik; F: IVD nach Injektion von PBS/Trypanblaufarbstoff, um die Verteilung aufzudecken. IDD: Bandscheibendegeneration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
Die Experimente wurden mit Rinderschwänzen aus lokalen Schlachthöfen durchgeführt. Die in der aktuellen Studie verwendeten biologischen Materialien stammen aus der Nahrungskette und bedürfen keiner ethischen Zulassung im schweizerischen und europäischen Recht.
1. Dissektion der Bandscheibe des Rinds
- Spülen Sie den ganzen Schwanz gründlich mit Leitungswasser ab, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen.
HINWEIS: Bei intakten, distalen Enden können je nach gewünschter Größe der IVDs maximal 9 IVDs (Steißbein 1-9) pro Schwanz für die Experimente verwendet werden. Unter Berücksichtigung des gewünschten Durchmessers zwischen 15-20 mm haben wir für die Experimente 12 Rinderschwänze mit 5 IVDs pro Schwanz verwendet. - Tauchen Sie den ganzen Schwanz für 10 Minuten in eine Schachtel mit 1% igen Betadinlösung. Trocknen Sie den Schwanz kurz mit steriler Gaze ab und legen Sie ihn auf einen sterilen Vorhang.
HINWEIS: Befeuchten Sie während der Dissektion der Scheibe die Schwänze mit Ringers lösungsbenetzter Gaze, um Austrocknung zu verhindern. Lagern Sie die Schwänze (oder übrig gebliebenen Segmente) in nasser Gaze eingewickelt, bis der gesamte Seziervorgang abgeschlossen ist. - Verwenden Sie ein Skalpell (Nr. 20), um das Weichgewebe so vollständig wie möglich von der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querprozesse der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange.
HINWEIS: Wählen Sie IVDs mit dem gewünschten Durchmesser aus. In der aktuellen Studie wurden IVDs mit einem Durchmesserbereich von 15-20 mm verwendet. - Schneiden Sie quer mit einer Knochenzange durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um individuelle Bewegungssegmente zu erhalten. Legen Sie Bewegungssegmente in eine Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist.
- Lokalisieren Sie ivD und Wirbel durch Palpation und durch sanftes Bewegen der Bewegungssegmente. Machen Sie zwei parallele Schnitte mit der Bandsäge in der Wachstumsplatte der IVDs, einen auf jeder Seite der IVD. Identifizieren Sie die Position der Wachstumsplatte, indem Sie die konvexe Stelle des knöchernen Endplattenteils (hart) neben der Scheibe (weich) mit einem Sicherheitsabstand von etwa 0,5-1 mm vom IVD zum Wirbel berühren und finden. Stellen Sie sicher, dass das Blatt der Bandsäge beim Schneiden der Wirbel mit Ringers Lösung gekühlt wird.
- Übertragen Sie IVDs in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist.
HINWEIS: Die Gaze sollte angefeuchtet und nicht zu nass sein, um ein Anschwellen der IVDs zu verhindern. - Verwenden Sie die Skalpellklinge, um den Wirbelkörper (rot / rosa Knochen), die Wachstumsplatte (weißer Knorpel) abzukratzen, lassen Sie die Endplatte intakt (gelb-rosa). Machen Sie die beiden Flächen flach und parallel für den Ladevorgang. Übertragen Sie geschabte IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist.
HINWEIS: Tragen Sie einen Kettenhemdhandschuh, um die Hand zu schützen, während Sie die IVD halten und abkratzen. - Messen Sie die Scheibenhöhe und den Durchmesser mit einem Bremssattel. Reinigen Sie die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit Ringers Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.
- Übertragen Sie die IVDs auf 50 ml Kunststoffröhrchen, eine IVD pro Röhrchen. Fügen Sie 25 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 10% Penicillin / Streptomycin (P / S) pro IVD hinzu und lassen Sie es 15 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur schütteln.
- Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 10 ml PBS + 1% P / S pro IVD für 2 minuten hinzu, um die IVDs zu spülen.
2. IVD-Kultur und -Beladung
- Übertragen Sie die Scheiben in IVD-Kammern und fügen Sie IVD-Kulturmedium hinzu (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM mit hohem Glukosegehalt für die physiologische Gruppe und 2 g/L DMEM mit niedrigem Glukosegehalt für die pathologische Gruppe) + 1% P/S + 2% fetales Kalbsserum + 1% ITS (enthält 5 μg/ml Insulin, 6 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Selennsäure) + 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat + 1% nicht essentielle Aminosäure + 50 μg/ml antimikrobielles Mittel für Primärzellen) und in einen Inkubator bei 37 °C, 85 % Feuchtigkeit und 5 % CO2legen.
- Kulturieren Sie die Bandscheiben für 4 Tage innerhalb eines Bioreaktorsystems nach experimentellen Gruppen16. In der pathologischen Gruppe degenerative Belastungsbedingungen bei 0,32-0,5 MPa, 5 Hz für 2 h / Tag beibehalten. Verwenden Sie in der physiologischen Kontrollgruppe ein Ladeprotokoll von 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz für 2 h / Tag.
HINWEIS: Positionieren Sie die IVDs während der Ladevorgänge in Kammern mit 5 ml IVD-Medium. Das Volumen hängt von der Größe der Ladekammern des Bioreaktors ab. Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit 7 ml IVD-Kulturmedium zur Erholung der freien Quellung. - Zur Analyse der Änderungen der Bandscheibenhöhe während des Versuchszeitraums messen Sie die Scheibenhöhe mit einem Bremssattel nach IVD-Dissektion (Baseline) und dann täglich nach der freien Quellperiode und nach dynamischer Belastung für die experimentelle Dauer.
3. Intradiskale Injektion des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α)
- Direkt nach dem ersten dynamischen Ladezyklus an Tag 1 legen Sie die IVDs in eine Petrischale in vertikaler Position und stabilisieren die IVDs mit einer Pinzette.
- Rekombinante TNF-α (100 ng in 70 μL PBS pro IVD) mit einer 30-Gauge-Insulinnadel in das Nucleus pulposus-Gewebe der pathologischen Gruppe17injizieren. Langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 70 μL in 1 min injizieren.
- Ziehen Sie die Spritze nach der Injektion auf halbem Weg zurück in die IVD und ziehen Sie den Spritzenkolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung zurückläuft, bevor Sie die Nadel und die Spritze vollständig aus der IVD entfernen.
HINWEIS: Führen Sie ein Pilotexperiment durch, indem Sie PBS mit trypanblauem Farbstoff injizieren, um die Verteilung der injizierten Lösung nach dem Laden und der Kultur über Nacht zu bewerten.
4. Genexpression
- Ernte die IVDs an Tag 4. Sammeln Sie das Nucleus pulposus (NP) Gewebe (geliger Teil in der Mitte der IVD) mit einem Biopsiestempel. Sammeln Sie den äußeren Annulus fibrosus (AF) mit einer Skalpellklinge (Nr. 20).
HINWEIS: Für die Ausgangsreferenz am Tag 0 sammeln Sie Gewebe unmittelbar nach der Dissektion für die RNA-Extraktion. - Verwenden Sie die Menge an NP- oder AF-Gewebe, die für die Genexpressionsanalyse benötigt wird, abhängig vom experimentellen Design.
HINWEIS: Für die vorliegenden Experimente wurden ca. 150 mg Gewebe verwendet. Das Verhältnis von RNA-Isolationslösung zu Gewebemasse sollte für eine effiziente Extraktion mindestens 2 ml pro 100-150 mg Gewebe betragen. - Verdauen Sie das NP- oder AF-Gewebe mit der Aufschlusslösung (0,2% Pronase in DMEM, Filter sterilisiert) und inkubieren Sie es für 1 h bei 37 °C unter magnetischem Rühren18.
- Die Gewebeproben mit flüssigem Stickstoff einfrieren und zu einem feinen Pulver pulverisieren. Teilen Sie das pulverisierte Gewebepulver gleichmäßig in zwei 2-ml-Röhrchen mit jeweils 1 ml Guanidinthiocyanat und Phenol in einer Monophasenlösung (RNA-Isolationslösung).
- Führen Sie die Homogenisierung in 2 ml Röhrchen durch, die die RNA-Isolationslösung und das pulverisierte Gewebepulver enthalten. Homogenisieren Sie das Gewebepulver 5x mit einer 8 mm Edelstahlkugel und einem Tissue-Lyzer bei 30 Hz für 3 min. Zentrifuge bei 12.000 x g,4 °C für 10 min und den Überstand in ein frisches Rohr überführen. Die Überstände können bei -80 °C für mindestens einen Monat gelagert werden.
- 0,1 ml 1-Brom-3-chlorpropan (BCP) pro 1 ml RNA-Isolationslösung hinzufügen und 15 s kräftig schütteln. Lagern Sie die resultierende Mischung bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler für 15 min und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
HINWEIS: Die RNA verbleibt ausschließlich in der oberen wässrigen Phase. - Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und fallen Sie RNA mit 0,25 ml Isopropanol und 0,25 ml Hochsalzausfällungslösung pro 1 ml RNA-Isolationslösung aus, die für die anfängliche Homogenisierung verwendet wird. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Orbitalschüttler und einer Zentrifuge bei 12.000 x g für 8 min bei 4 °C.
HINWEIS: Alternativ können Sie die säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode verwenden, die im Allgemeinen zu einer höheren RNA-Reinheit, aber einer geringeren RNA-Ausbeute führt. - Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol pro 1 ml RNA-Isolationslösung, die für die anfängliche Homogenisierung verwendet wird. Zentrifuge bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Ethanol waschen und RNA-Pellet 3-5 min kurz an der Luft trocknen. Lösen Sie die RNA in 20 μL diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser auf, indem Sie die Lösung einige Male durch eine Pipettenspitze geben und 10-15 min bei 55-60 °C inkubieren.
- Messen Sie die Absorption bei 230 nm, 260 nm und 280 nm (A230, A260 bzw. A280). A260 von 1,0 entspricht 40 μg/ml RNA. Es wird ein A260/A280-Verhältnis von 1,6-1,9 erwartet, während die Kontamination zu einem A260/A280-Verhältnis von <1,6 führt.
- Bereiten Sie eine Reverse Transkriptase (RT) Reaktionsmischung für ein Reaktionsvolumen von 20 μL vor. Die Mischung enthält RT-Enzymmischung, Ribonuklease-Inhibitor, Helferprotein, Primer, dNTPs, MgCl2,RNase-freies Wasser und 0,4 μg RNA-Probe.
- Zentrifugieren Sie kurz die RT-Röhrchen, um alle Komponenten am Boden des Rohres zu mischen.
- Legen Sie die Proben in das Thermocycler-Instrument. Wählen Sie das passende Programm für den RT. Führen Sie den RT für 10 min bei 25 °C aus, gefolgt vom umgekehrten Transkriptionsschritt für 120 min bei 42 °C und der Inaktivierung der Reverse Transkriptase für 5 min bei 85 °C, wobei er am Ende auf 4 °C abgekühlt wird.
- Verdünnen Sie die resultierende cDNA mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) (TE)-Puffer (10 mM Tris mit 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 0,4 μg RNA, die für RT pro 100 μL cDNA-Lösung verwendet wird. Lagern Sie die cDNA-Proben bei -20 °C.
- Führen Sie eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem Reaktionsvolumen von 10 μL durch. Das Reaktionsvolumen enthält die Mastermischung (enthält DNA-Polymerase, Uracil-DNA-Glykosylase, dNTPs mit dUTP, passive Referenz- und optimierte Pufferkomponenten), Forward Primer 45 μM, Reverse Primer 45 μM, Sonde 12,5 μM (enthält einen Reporterfarbstoff, der mit dem 5'-Ende der Sonde verbunden ist, ein kleines Rillenbindemittel am 3'-Ende der Sonde und einen nicht fluoreszierenden Quencher am 3'-Ende der Sonde) , 2 μL cDNA und DEPC-behandeltes Wasser.
- Führen Sie eine endogene Kontrolle (RPLP0) zur relativen Quantifizierung mit der 2-ΔΔCT-Methode 19durch.
- Fügen Sie Beispiele in Duplikaten hinzu, und führen Sie ein Steuerelement ohne Vorlage aus, indem Sie TE-Buffer anstelle von cDNA hinzufügen. Führen Sie die PCR unter Standardbedingungen durch (2 min bei 50 °C, 10 min bei 95 °C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C).
- Führen Sie eine relative Quantifizierung von mRNA-Targets nach der vergleichenden CT-Methode durch. Die Menge an mRNA, die auf die Baseline-Probe normalisiert wird, wird als 2-ΔΔCTberechnet, während ΔΔCT die Differenz zwischen der ΔCT (CT Target- CT endogene Kontrolle) der Probe und ΔCT (CT Target und CT endogene Kontrolle) der Baseline-Probe ist.
5. Quantifizierung des Proteingehalts im IVD-Medium
- Sammeln Sie das von den IVD-Proben konditionierte Medium, um den Proteingehalt im Medium zu messen. Führen Sie einen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) gemäß dem Protokoll des Zielproteins durch.
- Bovine Interleukine-8 (IL-8) wird durch ein Anti-Bovine IL8 ELISA Kit gemäß der Herstelleranweisung quantifiziert.
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Representative Results
Die degenerative Belastung in niedrigem Glukosemedium in Kombination mit TNF-α-Injektion verursachte nach 4 Tagen Kultur eine signifikante Erhöhung der Genexpression der proinflammatorischen Marker Interleukin 6 (IL-6) und Interleukin 8 (IL-8) im Vergleich zur physiologischen Kontrollgruppe in NP-Zellen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine signifikanten Veränderungen für die proinflammatorischen Gene Interleukin 1β (IL-1β) und TNF-α in NP-Zellen (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus veränderten degenerative Kulturbedingungen die Genexpression von IL-6 und IL-8 in AF-Zellen nicht.
Abbildung 2: Genexpressionsniveaus im Nucleus pulposus (NP) Gewebe und Annulus fibrosus (AF) Gewebe. Diese wurden nach 4 Tagen Kultur unter physiologischem oder pathologischem Kulturzustand gemessen, normalisiert auf den Ausgangswert (Tag 0). Bedeutet ± 95%-Konfidenzintervall n=8, **p<0,01. Diese Zahl wurde von20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In Übereinstimmung mit den Genexpressionsergebnissen zeigte der IL-8-Proteingehalt im Medium nach 2 Tagen und 4 Tagen einen deutlichen Anstieg im Vergleich zum physiologischen Zustand (Abbildung 3). Die Messungen an Tag 3 (nach freischwellender oder belastung) zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Studiengruppen, obwohl die Ergebnisse höhere Werte für die degenerative Gruppe anzeigten.
Abbildung 3: Quantifizierung der entzündungsfördernden Protein-IL-8-Freisetzung im IVD-Kulturmedium nach freier Quellkultur (FS) und dynamischer Belastung (Load). Die Ergebnisse werden als die ursprünglichen Konzentrationen in ng/ml im Medium ohne Normalisierung dargestellt. Mittelwert ± 95%-Konfidenzintervall, n=8, **p<0,01. Diese Zahl wurde von20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Änderungen der Disc-Höhe (DH), die nach der Dissektion auf den DH normalisiert sind, sind in Abbildung 4 dargestellt. Während DH-Reduktionen nach belastung höhere Werte (d.h. mehr Höhenreduktion) für die degenerative Gruppe im Vergleich zu den physiologischen Gruppen ergaben, wurden keine Unterschiede in der Bandscheibenhöhenzunahme nach der freien Quellperiode zwischen den Studiengruppen beobachtet. Dies deutete darauf hin, dass der Unterschied in den Bandscheibenhöhenänderungen zwischen der pathologischen und physiologischen Gruppe nach dem Belastungsvorgang höher war. Darüber hinaus waren die Unterschiede nach 1 Tag im Vergleich zu den Messungen an den Tagen 2 und 3 weniger ausgeprägt, was auf eine fortschreitende Wirkung der degenerativen und entzündlichen Zustände hindeutet.
Abbildung 4:Änderungen der Disc-Höhe normalisiert auf die Basiswerte (nach Dissektion). Mittelwert ± 95%-Konfidenzintervall. FS: frei anschwellend. N=10, ***p<0,001. Diese Zahl wurde von20geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir haben hier ein detailliertes Protokoll zur Simulation degenerativer und entzündlicher IVDD zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll kann für detaillierte Untersuchungen von Entzündungswegen angewendet werden, die zu den zerstörerischen Auswirkungen auf die Bandscheibe führen. Darüber hinaus kann das Protokoll helfen, vielversprechende therapeutische Ziele zu bestimmen, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass humane rekombinante TNF-α Entzündungen sowohl in rindern als auch in menschlichen NP-Zellen auslösen können21, was mit anderen Studien auf diesem Gebiet in Einklang steht, die bestätigen, dass TNF-α zur Entzündungssimulation in IVD-Zellen verwendet werden kann22,23. In der vorliegenden Studie wurde eine Dosis von 100 ng TNF-α pro IVD verwendet, um Entzündungen zu induzieren. Diese Dosis zeigte eine wirksame Induktion von Entzündungsmarkern, wenn sie in Kombination mit degenerativer Belastung und begrenzter Ernährung angewendet wurde15,20. In einer aktuellen Studie mit TNF-α als alleinigem Initiationsfaktor der IVD-Degeneration wurde ein Schwellenwert von 100 ng TNF-α / cm3 Bandscheibenvolumen als wirksame Dosis für die Induktion entzündlicher und degenerativer Veränderungen in der IVD21bestimmt. Es wird vorgeschlagen, dass die TNF-α Dosis, die zur Induktion von Entzündungen verwendet wird, auf das Volumen der Bandscheibe normalisiert werden sollte, um reproduzierbare Effekte zu erzielen. Weiterhin sollte sichergestellt werden, dass eine gute Verteilung des Injektionsmaterials im IVD vorliegt und diese Injektion in nachfolgenden Versuchen ausreichend reproduzierbar ist. Da der Injektionsdruck zwischen den Individuen variieren kann, kann es in verschiedenen Experimenten zu unterschiedlichen Verteilungen des Materials zwischen denselben Studiengruppen geben. Ein Ansatz, den wir gewählt haben, um die gleichmäßige Verteilung zu untersuchen, war die Verwendung von PBS-verdünnten Trypanblau-Injektionen. Es empfiehlt sich, die Einspritztechnik beispielsweise mit Einspritzpumpen und vordefinierten und reproduzierbaren Einspritzraten zu standardisieren. Wie bereits gezeigt, bewirkte eine einzelne Nadelpunktion mit 22-Gauge-, 25-Gauge- oder 30-Gauge-Nadeln in die IVD keinen Effekt, der mit den Studienergebnissen20,21,24,25interagierte. Es wird empfohlen, die Bandscheibengröße für das Volumen der zu injizierenden Substanz und für die für die Injektion verwendete Nadelgröße zu berücksichtigen. Darüber hinaus wird empfohlen, eine einzige Injektion zu verwenden, um mögliche degenerative Wirkungen zu vermeiden, die durch mehrere ringförmige Injektionen verursacht werden21,26.
Einige Einschränkungen des vorliegenden Modells müssen angegangen werden. Die Beladung der IVDs erfordert den Zugang zu Bioreaktoren, die derzeit in vielen Laboren, die an IDD arbeiten, nicht weit verbreitet sind. Der Bedarf an präklinischen IVD-Degenerationsmodellen steigt jedoch. Organkulturmodelle bringen ethische Vorteile, wenn der Bedarf an Tiermodellen reduziert wird, und die einmalige Investition in Bioreaktorkosten könnte angesichts der Reproduzierbarkeit der degenerativen Stimulation und der Mit tierversuchen verbundenen Kosten erschwinglich sein. Dennoch können einige In-vivo-Interaktionen, wie die Rolle des Immunsystems, mit dem bereitgestellten Organkulturmodell nicht simuliert werden. Darüber hinaus kann die Messung von Nervensignalen und die Bewertung von Schmerzen, die in Tiermodellen möglich wären, mit dem aktuellen Modell derzeit nicht berücksichtigt werden. Es wurden einige Bedenken geäußert, ob die mechanischen Eigenschaften von Schwanz-IVDs mit menschlichen IVDs vergleichbar sein könnten, da die aufrechte Wirbelsäulenposition beim Menschen einzigartig ist28. Anatomische und molekulare Eigenschaften von Bovine Tail IVDs, wie Zelldichte, Mangel an Notochordalzellen, biochemische Zusammensetzung29,30und mechanische Eigenschaften von Bovine caudal IVDs, wie Bewegungsumfang bei Flexion, Extension, Torsion undBiegung 31 sind menschlichen IVDs sehr ähnlich. Bemerkenswert ist, dass menschliche IVDs in letzter Zeit immer mehr Aufmerksamkeit für Organkulturmodellegewinnen 28. Menschliche Leichen-IVDs in Ex-vivo-Modellen gelten als hocheffizient, da sie Artenunterschiede vermeiden können, die klinisch relevanter sind32. Im Gegensatz zu Bovin-IVD-Schwänzen, die aus den Schlachthöfen gewonnen werden, würde dies eine Transplantation von menschlichen IVDs 24 h post mortem und damit eine ethische Zulassung nach lokalen Organtransplantationsgesetzen erfordern28. Die vorliegende Methode kann auch leicht an andere Arten angepasst werden.
Ein großer Vorteil der Technik im Vergleich zu anderen Methoden von Ex-vivo-Kulturen ist die Kombination von intradiskaler Injektion, pathologischen Medienbedingungen und schädlicher Belastung, um das Frühstadium degenerativer Bandscheiben besser zu simulieren. Walter et al.23 verwendeten TNF-alpha im Medium dynamisch beladener Rinder-IVDs anstelle der Injektion in die IVDs und zeigten einen erhöhten Transport von TNF-alpha aus dem Medium in den Nucleus pulposus im Vergleich zum Annulus fibrosus, was unseren Ergebnissen entspricht. Da wir die frühen Stadien der IDD simulieren wollten, die auf zellulärer Ebene ohne größere Störungen der Scheibenarchitektur12auftritt, wählten wir die TNF-alpha-Konzentrationen basierend auf früheren Organkulturstudien mit TNF-alpha im Medium, um die frühen Stadien von IDD12 , 22,23zu simulieren . Die Verwendung anderer entzündlicher Stimulanzien und höhere Konzentrationen von TNF-alpha konnten getestet werden, um den gewünschten degenerativen Bandscheibenzustand je nach Studienfrage zu simulieren. Höhere Konzentrationen von TNF-alpha können das Fehlen systemischer immunregulatorischer Rückkopplungen während der Bandscheibendegeneration besser kompensieren, wie von Ponnappan et al.vorgeschlagen. 12 Die Verwendung schädlicher mittlerer Bedingungen mit niedrigem Glukosegehalt basierte auf früheren Arbeiten, die zeigten, dass ernährungsphysiologisch begrenzende Medien und die Exposition gegenüber TNF-alpha molekulare Veränderungsmerkmale nachahmen, die im frühen Bandscheibendegenerationszustand verfügbar sind12,27. Somit kombiniert der Ansatz die Evidenz früherer Studien in einem Ex-vivo-Organkulturmodell für frühe degenerative Bandscheibenerkrankungen.
Dieses Protokoll kann auf verschiedene Arten weiter verbessert werden. Dauer und Ausmaß der Belastungs- und Freischwellungszeit können anhand des gewünschten Studienplans gewählt werden. Langzeitwirkungen entzündlicher oder degenerativer Stimulationen auf die Bandscheibendegeneration sind von hohem klinischem Interesse und können mit dem aktuellen Protokoll erreicht werden. Wir haben nur ausgewählte Gene verwendet, die für den frühen Zustand von IDD11als hochrelevant gelten. Eine zusätzliche Validierung dieses Modells könnte eine erweiterte Bewertung von Genen und Proteinen umfassen, z. B. Omics-Ansätze. Folglich konnten je nach gewünschtem degenerativen Zustand weitere Entzündungsfaktoren in Kombination mit der degenerativen Belastung untersucht werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Lipopolysaccharid-Injektionen Entzündungen in der IVD33stimulieren. Ein Vergleich verschiedener Entzündungsstimulanzien kann mit dem vorliegenden Protokoll durchgeführt werden, um das am besten geeignete Entzündungsstimulans für die gewünschte Studienfrage zu finden. Wir haben Veränderungen ausgewählter Entzündungsmarker (IL-6, IL-8), anaboler Marker (Aggrecan, Kollagen) und kataboler Marker (Matrixmetallopeptidasen, ein Disintegrin und Metalloproteinasen mit Thrombospondinmotiven) mit dem vorliegenden Protokoll20bewertet. Da sich das gesamte Genexpressionsprofil ändern könnte, könnten zukünftige Untersuchungen RNA-Sequenzierungstechniken der nächsten Generation umfassen, um neue Biomarker für die Diagnostik der Bandscheibendegeneration und therapeutische Ziele für eine frühe biologische Intervention zu bestimmen. Darüber hinaus können andere Methoden wie Histologie, immunhistochemische Färbung, biochemische Messungen extrazellulärer Matrixkomponenten (wie Glykosaminoglykane, GAGs) und dynamische Drucktests durchgeführt werden, um die biologischen, biochemischen und biomechanischen Eigenschaften von IVDs mit dem vorliegenden Modell weiter zu analysieren. Ein weiterer möglicher analytischer Weg wäre die separate Analyse der Auswirkungen auf äußeres AF- und NP-Gewebe unter Verwendung von bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α und MKX als Genexpressionsmarker für den äußeren AF34,35. Die Spine Research Interest Group empfahl auf der ORS-Jahrestagung 2014 in New Orleans folgende gesunde NP-phänotypische Marker: HIF-1alpha, GLUT-1, Aggrecan/Kollagen II-Verhältnis >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 und CD2436. Die NP-Markergene bBrachyury/T und bSecreted frizzled-related protein 2 waren die überzeugendsten Trenn-NP vom inneren und äußeren AF-Gewebe im Rinder-IVD34. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der sGAG-Gehalt des NP im Vergleich zum äußeren AF34signifikant höher ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neuartige proinflammatorische und degenerative IVD-Organkulturmodell relevante Bedingungen bietet, um IDD im Frühstadium in einer hochrelevanten 3D-Mikroumgebung zu simulieren. Sicherlich kann das vorliegende Protokoll entsprechend den Zielen des Ermittlers weiter modifiziert werden. Darüber hinaus ist unser Modell in der Lage, die Anzahl der benötigten Studientiere zu reduzieren und spiegelt somit die 3R-Prinzipien des Reduzierens, Ersetzens, Verfeinerns vollständig wider.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der AO Foundation und AOSpine International unterstützt. Babak Saravi erhielt Fellowship-Unterstützung von der Deutschen Wirbelsäulenstiftung und der Deutschen Arthrose-Stiftung. Gernot Lang wurde unterstützt durch das Berta-Ottenstein-Programm für Advanced Clinician Scientists, Medizinische Fakultät, Universität Freiburg, Deutschland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
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