Summary
פרוטוקול זה מציג מודל ניסיוני חדשני של תרבות איברי שור פרו-פלמטורית ומנוונת כדי לדמות ניוון דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם.
Abstract
ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD) הוא נטל חברתי-כלכלי גדול ומאופיין בדלקת והשפלת רקמות. בשל היעדר טיפולים סיבתיים, יש צורך דחוף במודלים חדשניים של תרבות איברים ניסיונית כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בהתקדמות המחלה, למצוא מטרות טיפוליות ולהפחית את הצורך במודלים של בעלי חיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול מודל תרבות איברים תלת מימדי חדשני המחקה את המיקרו-ווירון הפרו-פלמטורי והקטבולי, שקיים במהלך IDD.
בתחילה, עירויים של שור נותחו, נוקו ותרביתו במדיום תרבית הרקמות. טעינה פיזיולוגית או פתולוגית דינמית הוחלה בביוריאקטור בהתאמה אישית במשך שעתיים ביום. IVDs הוקצו לקבוצת ביקורת (מדיום גלוקוז גבוה, טעינה פיזיולוגית, הזרקת מלח אגירה פוספט) וקבוצה פתולוגית (בינוני גלוקוז נמוך, טעינה פתולוגית, נמק הגידול גורם אלפא הזרקה) במשך ארבעה ימים. ניתוח ביטוי גנים מתאי פולפוסוס גרעין שנאספו של IVDs ואנליזה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזימים של מדיית תרבות האיברים הממוזגת בוצעה.
הנתונים שלנו חשפו ביטוי גבוה יותר של סמנים דלקתיים וגובה דיסק מופחת לאחר טעינה בקבוצה הפתולוגית בהשוואה לקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה אמין כדי לדמות דלקת IVD ניוון והוא יכול להיות מורחב עוד יותר כדי להרחיב את היקף היישום שלה.
Introduction
כאבי גב תחתון (LBP) יכולים להשפיע על אנשים בכל הגילאים והוא גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1,2,3. העלות הכוללת המשויכת LBP עולה $100 מיליארד דולר בשנה4,5. ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD), מצב המאופיין בדלקת והשפלת רקמות, הוא הגורם העיקרי של LBP6,7. באופן ספציפי, IDD מאופיין על ידי פירוק מתפתח בהדרגה של המטריצה החוץ תאית של IVD (ECM), המושרה ומופעל על ידי גורמים מרובים שמובילים פתולוגיה מואצת, הפרעות נוירולוגיות, ובסופו של דבר נכות. יתר על כן, IDD קשורה לשחרור ציטוקינים proinflammatory, ביומכניקה בעמוד השדרה שונה, אנגיוגנזה, ו ingrowth עצבי, אשר מגביר את תחושת הכאב, בסך הכל גורם LBP כרונית (דיסקופתיה פעילה)6,8. עד כה, אפשרויות הטיפול כוללות כריתת דיסק והיתוך עוקב של החוליות הסמוכות, השתלת תותבת IVD, או גישות לא כירורגיות, כגון תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידים, אופיואידים, ומרפי שרירים לחולים עם IDD9. שתי האפשרויות הטיפוליות הסטנדרטיות הנוכחיות, כירורגיות ולא כירורגיות, יעילות רק בחלקן ולא מצליחות לטפל בבעיה הביולוגית הבסיסית9,10. מחלת דיסק ניוונית בשלב מוקדם מאופיינת בתגובת רקמה דלקתית ראשונית, במיוחד עלייה בביטוי נמק נמק-אלפא גידולי (TNF-alpha)11. שינויים אלה בדיסק מוקדם מתרחשים בעיקר ברמה התאית מבלי לשבש את ארכיטקטורת הדיסק, בעבר יכול להיות חיקוי על ידי מחסור תזונתי בתנאים פרו דלקתיים12. לכן, סימולציה מדויקת של מצב in vivo לחקור מנגנוני ניוון אלה ולמצוא מטרות טיפוליות מתאימות היא קריטית. בנוסף, לסימולציות אלה של תכונות מולקולריות, סביבת הטעינה המכנית של הדיסקים ממלאת תפקיד מפתח בשינויים פתולוגיים ופיזיולוגיים של IVD. כתוצאה מכך, שילוב גישות אלה יביא אותנו צעד אחד קדימה כדי לחקות את microenvironment מורכב של IVD ב vivo. כיום אין מחקרים בהתחשב בהיבט של טעינה דינמית יחד עם ההגדרה הפרו דלקתית והתזונתית למיטב ידיעתנו.
למרות מודלים בעלי חיים גדולים לאפשר את החקירה של פוטנציאל רלוונטי אינטראקציות vivo, הם יקרים ועבודה אינטנסיבית. יתר על כן, כמו השימוש במודלים בעלי חיים במחקר כבר זמן רב עניין של מחלוקת, צמצום מספר בעלי החיים הדרושים כדי לענות על שאלות מחקר חשובות הוא עניין רב. לבסוף, אין כיום מודל חיה אידיאלי לחקות IDD במחקר IVD13,14. לכן, יש צורך להקים תחליף חסכוני ואמין, כגון מודל תרבות איברים כדי לדמות IDD ותהליכים דלקתיים וניוון הקשורים. לאחרונה, היישום של הפרוטוקול הנוכחי על הקמת מודל תרבות איברים proinflammatory ניווני כדי לדמות מחלת דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם אפשר לנו לחקור את ההשפעה של תרופות אנטי דלקתיות בתרבות איברים IDD15.
כאן, אנו מתארים כיצד להשיג דיסקים בין חולייתיים שור לגרום למצב של IDD בשלב מוקדם באמצעות microenvironment קטבולי proinflammatory הנגרמת על ידי הזרקה תוך-דיסקית ישירה של נמק הגידול גורם אלפא (TNF-α) וטעינה ניוונית ב bioreactor בתנאים בינוניים מזינים נמוכים. איור 1 ממחיש את המודל הניסיוני ומציג את הביוריאקטור המשמש להדמיית תנאי טעינה ניווניים ופיזיולוגיים.
איור 1: איור של ההתקנה הניסיונית. A: זנב שור; B: דיסקים בין חולייתיים של שור מנותח; C: העברת הדיסק לצלחת היטב עם מדיום תרבות; D: טעינת הסימולציה בביוריאקטור; E: טכניקת הזרקה תוך-דיסקית; F: IVD לאחר הזרקה של צבע כחול PBS / trypan כדי לחשוף את ההפצה. IDD: ניוון דיסק בין חולייתי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בוצעו באמצעות זנבות שור שהתקבלו מבתי מטבחיים מקומיים. החומרים הביולוגיים המשמשים במחקר הנוכחי נלקחים משרשרת המזון ואינם דורשים אישור אתי בחוק השוויצרי והאירופי.
1. ניתוח של הדיסק הבין חולייתי בקר
- יש לשטוף את כל הזנב ביסודיות במי ברז כדי להסיר לכלוך ושיער על פני השטח.
הערה: עם קצוות דיסטליים שלמים, ניתן להשתמש לכל היותר ב- 9 דיסקים IVD (עצם הזנב 1-9) לכל זנב לניסויים בהתאם לגודל הרצוי של ההפריה החוץ-גופית. בהתחשב בקוטר הרצוי בין 15-20 מ"מ, השתמשנו 12 זנבות שור עם 5 IVDs לכל זנב לניסויים. - לטבול את הזנב כולו בתיבה המכילה 1% פתרון betadine במשך 10 דקות. לייבש לזמן קצר את הזנב עם גזה סטרילית ומניחים אותו על וילון סטרילי.
הערה: במהלך ניתוח הדיסק, לחות הזנבות עם הפתרון של רינגר רטוב גזה כדי למנוע התייבשות. אחסן את הזנבות (או מקטעים שמאליים) עטופים גזה רטובה עד להשלמת הליך הניתוח כולו. - השתמש אזמל (מס '20) כדי להסיר את הרקמה הרכה לחלוטין ככל האפשר מעמוד השדרה caudal כדי להקל על זיהוי של IVDs. הסר את התהליכים הסיבוביים וה רוחביים של החוליות עם צבת להסרת עצם.
הערה: בחר דיסקים חוץ-גופיים בקוטר הרצוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בהפריה חוץ גופית בקוטר של 15-20 מ"מ. - חותכים רוחבית עם צבת עצם דרך אמצע כל גוף חולייתי כדי לקבל מקטעי תנועה בודדים. שים מקטעי תנועה בצלחת פטרי עם גזה רטובה עם הפתרון של רינגר.
- אתר את ה- IVD והחוליה על-ידי מישוש ועל-ידי הזזת מקטעי התנועה בעדינות. בצע שני חתכים מקבילים עם מסור הלהקה בצלחת הצמיחה של IVDs, אחד בכל צד של IVD. זהה את מיקום לוח הגדילה על-ידי נגיעה ומציאה של אתר הקמור של החלק הגרמי (קשה) הסמוך לדיסק (רך) עם מרחק בטיחות של כ- 0.5-1 מ"מ מההפריה החוץ-גופית לכיוון החוליה. ודא כי הלהב של מסור הלהקה מקורר עם הפתרון של רינגר תוך חיתוך החוליות.
- מעבירים עירוי בצלחת פטרי נקייה עם גזה נקייה רטובה בתמיסה של רינגר.
הערה: גזה צריך להיות לח ולא רטוב מדי כדי למנוע נפיחות של IVDs, - השתמש בלהב האזמל כדי לגרד את גוף החוליות (עצם אדומה /ורודה), צלחת צמיחה (סחוס לבן), להשאיר את האנדפלטה ללא פגע (צהוב-ורוד). הפוך את שני המשטחים שטוחים ומקבילים להליך הטעינה. מעבירים עירוי מגרד לצלחת פטרי טרייה עם גזה רטובה בתמיסה של רינגר.
הערה: ללבוש כפפת שרשרת כדי להגן על היד תוך החזקת IVD ושריטות. - למדוד את גובה הדיסק וקוטר עם קליפר. לנקות את קרישי הדם בעצם החוליות עם הפתרון של רינגר באמצעות מערכת שטיפת סילון.
- להעביר את IVDs לצינורות פלסטיק 50 מ"ל, אחד IVD לכל צינור. הוסף 25 מ"ל של מלוחים פוספט-אגירה (PBS) + 10% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) לכל IVD ולהשאיר אותו רועד במשך 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.
- שאפו את ה-supernatant והוסיפו 10 מ"ל של PBS + 1% P/S להפריה חוץ-גופית למשך 2 דקות כדי לשטוף את הדיסקים ההיתוך החוץ-גופיים.
2. תרבות IVD וטעינה
- העבר דיסקים לתאי IVD והוסף מדיום תרבות IVD (בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM, 4.5 g / L רמת סוכר גבוהה DMEM עבור הקבוצה הפיזיולוגית ו 2 g / L נמוך גלוקוז DMEM עבור הקבוצה הפתולוגית) + 1% P / S + 2% סרום עגל עוברי + 1% שלה (מכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 6 מיקרוגרם / מ"ל transferin, ו 5 ng / mL חומצה סלנית) + 50 מיקרוגרם / מ"ל ascorbate-2-פוספט + 1% חומצת אמינו לא חיונית + 50 מיקרוגרם / מ"ל סוכן מיקרוביאלית לתאים ראשוניים) ומניחים באינקובטור ב 37 °C (67 °F), 85% לחות ו 5% CO2.
- תרבות הדיסקים במשך 4 ימים בתוך מערכת bioreactor על פי קבוצות ניסיוניות16. בקבוצה הפתולוגית, לשמור על תנאי טעינה ניווניים ב 0.32-0.5 MPa, 5 הרץ עבור 2 שעות / יום. בקבוצת הביקורת הפיזיולוגית, השתמש בפרוטוקול טעינה של 0.02-0.2 MPa, 0.2 הרץ למשך 2 שעות ביום.
הערה: מקמו את ה-IVDs בתאים המכילים 5 מ"ל של מדיום IVD במהלך הליכי הטעינה. הנפח תלוי בגודל תאי הטעינה של הביוריאקטור. בין הליכי הטעינה, מניחים את הפריה חוץ גופית בצלחות שש בארות עם 7 מ"ל של מדיום תרבות הפריה חוץ גופית להתאוששות נפיחות חופשית. - לניתוח השינויים בגובה הדיסק במהלך תקופת הניסוי, למדוד את גובה הדיסק עם caliper לאחר ניתוח IVD (בסיס) ולאחר מכן מדי יום לאחר תקופת הנפיחות החופשית ולאחר טעינה דינמית למשך הניסוי.
3. הזרקת נמק גידול תוך-דיסקי-אלפא (TNF-α)
- מיד לאחר מחזור הטעינה הדינמי הראשון ביום הראשון, מניחים את הריויונים החוץ גופיים בצלחת פטרי במצב אנכי ומייצבים את הריונויים עם פינצטה.
- להזריק TNF-α רקומביננטי (100 ng ב 70 μL של PBS לכל IVD) עם מחט אינסולין 30 מד לתוך רקמת פולפוסוס הגרעין של הקבוצה הפתולוגית17. להזריק לאט במהירות של כ 70 μL ב 1 דקות.
- לאחר ההזרקה, למשוך את המזרק באמצע הדרך חזרה בתוך IVD ולמשוך את בוכנה מזרק כדי ליצור ואקום המונע את הפתרון מוזרק דולף בחזרה, לפני הסרת המחט ומזרק לחלוטין מן IVD.
הערה: בצע ניסוי פיילוט על ידי הזרקת PBS המכיל צבע כחול trypan כדי להעריך את ההפצה של הפתרון מוזרק לאחר טעינה ותרבות לילה.
4. ביטוי גנים
- לקצור את IVDs ביום 4. לאסוף את רקמת פולפוסוס הגרעין (NP) (חלק ג'לי באמצע IVD) עם אגרוף ביופסיה. לאסוף את אנולוס פיברוסוס החיצוני (AF) עם להב אזמל (מס '20).
הערה: לעיון הבסיסי ביום 0, לאסוף רקמות מיד לאחר הניתוח עבור מיצוי RNA. - השתמש בכמות של רקמת NP או AF הדרושה לניתוח ביטוי גנים, בהתאם לעיצוב הניסיוני.
הערה: בניסויים הנוכחיים נעשה שימוש ברקמת מ"ג כ-150 מ"ג. היחס בין פתרון בידוד RNA למסת רקמות צריך להיות לפחות 2 מ"ל לכל 100-150 רקמת מ"ג לחילוץ יעיל. - לעכל את רקמת NP או AF עם פתרון העיכול (0.2% פרונה ב DMEM, מסנן מעוקר) ואת הדגירה במשך 1 שעה ב 37 °C (70 °F) עם ערבוב מגנטי18.
- להקפיא את דגימות הרקמה באמצעות חנקן נוזלי לרסק לאבקה דקה. מחלקים את אבקת הרקמה מרוסקת באופן שווה לשני צינורות 2 מ"ל כל אחד מכיל 1 מ"ל של guanidine thiocyanate ופנול בתמיסת מונופאז (פתרון בידוד RNA).
- בצע את הומוגניזציה בצינורות 2 מ"ל המכילים את פתרון בידוד RNA ואבקת רקמה מרוסקת. הומוגניזציה אבקת הרקמה 5x עם כדור נירוסטה 8 מ"מ ו lyzer רקמה ב 30 הרץ במשך 3 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם,4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור טרי. ניתן לאחסן את ה-supernatants ב-80°C למשך חודש לפחות.
- יש להוסיף 0.1 מ"ל של 1 ברומו-3-כלורופרופן (BCP) ל-1 מ"ל של תמיסת בידוד RNA ולנער במרץ במשך 15 שניות. לאחסן את התערובת וכתוצאה מכך בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית במשך 15 דקות צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ה- RNA נשאר אך ורק בשלב מימית העליונה. - להעביר את השלב מימית לתוך צינור טרי לזרז RNA עם 0.25 מ"ל של isopropanol ו 0.25 מ"ל של פתרון משקעים מלח גבוה לכל 1 מ"ל של פתרון בידוד RNA המשמש הומוגניזציה ראשונית. לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות על שייקר מסלולית צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: לחלופין, השתמש בשיטת מיצוי RNA מבוססת עמודה שמובילה בדרך כלל לטוהר RNA גבוה יותר אך לתפוקת RNA נמוכה יותר. - הסר את supernatant ולשטוף את גלולת RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול לכל 1 מ"ל של פתרון בידוד RNA המשמש הומוגניזציה ראשונית. צנטריפוגה ב 7,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- מוציאים את שטיפת האתנול ומורידים לזמן קצר את גלולת ה-RNA היבשה למשך 3-5 דקות. להמיס את RNA ב 20 μL של diethylpyrocarbonate (DEPC) מים שטופלו על ידי העברת הפתרון כמה פעמים באמצעות קצה פיפטה דגירה במשך 10-15 דקות ב 55-60 מעלות צלזיוס.
- למדוד את הספיגה ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, ו 280 ננומטר (A230, A260 ו A280 בהתאמה). A260 של 1.0 מתאים 40 מיקרוגרם / מ"ל RNA. יחס A260/A280 של 1.6-1.9 צפוי, בעוד שזיהום גורם ליחס A260/A280 של <1.6.
- הכן תערובת תגובת תעתיק הפוך (RT) לנפח תגובה של 20 μL. התערובת מכילה תערובת אנזימים RT, מעכב ריבונוקלאאז, חלבון עוזר, פריימרים, dNTPs, MgCl2, מים ללא RNase, ו 0.4 מיקרוגרם של דגימת RNA.
- בקצרה צנטריפוגה צינורות RT לערבב את כל הרכיבים בתחתית הצינור.
- מניחים את הדגימות בכלי התרמוציקלר. בחר את התוכנית המתאימה עבור RT. הפעל את RT במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס, ואחריו את שלב שעתוק הפוך במשך 120 דקות ב 42 °C (69 °F) ו הפעלת תעתיק הפוך במשך 5 דקות ב 85 °C (69 °F), קירור אותו עד 4 °C (70 °F) בסוף.
- לדלל את cDNA וכתוצאה מכך עם Tris(hydroxymethyl)aminomethane (טריס)-אתילנדיאמין-טראאצטי חומצה (EDTA) (TE) מאגר (10 מ"מ טריס עם 1 מ"מ EDTA) לריכוז סופי של 0.4 מיקרוגרם RNA המשמש RT לכל 100 μL cDNA פתרון. אחסן את דגימות ה- cDNA ב- -20 °C (69 °F).
- בצע תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) באמצעות נפח תגובה של 10 μL. נפח התגובה מכיל את תערובת האב (המכילה פולימראז DNA, גליציזלאז uracil-DNA, dNTPs עם dUTP, הפניה פסיבית ורכיבי חיץ ממוטבים), פריימר קדמי 45 מיקרומטר, פריימר הפוך 45 מיקרומטר, בדיקה 12.5 מיקרומטר (המכיל צבע כתב המקושר לקצה 5 ' של החללית, קלסר חריץ קטין בקצה 3 'של החללית, ו qucentencher nonfluores בקצה 3 ' של החללית) , 2 μL cDNA ומים שטופלו DEPC.
- הפעל בקרה אנדוגנית (RPLP0) לכימות יחסי עם שיטת 2-ΔΔCT 19.
- הוסף דוגמאות בכפילויות והפעל פקד ללא תבנית על-ידי הוספת מאגר TE במקום cDNA. הפעל PCR בתנאים סטנדרטיים (2 דקות ב 50 °C (60 °F), 10 דקות ב 95 °C (65 °F), 40 מחזורים של 15 s ב 95 °C (65 °F), ו 1 דקות ב 60 °C (60 °F).
- בצע כימות יחסי של מטרות mRNA בהתאם לשיטת CT השוואתית. כמות mRNA מנורמל לדגימה הבסיסית מחושבת כ 2-ΔΔCT, ואילו ΔΔCT הוא ההבדל בין ΔCT (יעד CT - בקרת אנדוגני CT) של מדגם ΔCT (יעד CT ובקרה אנדוגנית CT) של המדגם הבסיסי.
5. כימות תכולת החלבון במדיום IVD
- לאסוף את בינוני מותנה על ידי דגימות IVD כדי למדוד את תכולת החלבון במדיום. בצע בדיקה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזימים (ELISA) בהתאם לפרוטוקול של חלבון המטרה.
- שור interleukine-8 (IL-8) הוא כימות על ידי אנטי שור IL8 ELISA ערכה על פי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טעינה ניוונית במדיום גלוקוז נמוך בשילוב עם הזרקת TNF-α גרמו לעלייה משמעותית בביטוי הגנים של סמנים פרו-פלמולמטיים אינטרלוקין 6 (IL-6) ואינטרלוקין 8 (IL-8) בהשוואה לקבוצת הביקורת הפיזיולוגית בתאי NP לאחר 4 ימי תרבות (איור 2). לעומת זאת, לא ראינו שינויים משמעותיים עבור הגנים הפרוינפלמטוריים אינטרלוקין 1β (IL-1β) ו- TNF-α בתאי NP (נתונים שאינם מוצגים). יתר על כן, תנאי תרבות ניוונית לא שינו את ביטוי הגנים של IL-6 ו IL-8 בתאי AF.
איור 2: רמות ביטוי גנים ברקמת פולפוסוס הגרעין (NP) וברקמות אנולוס פיברוסוס (AF). אלה נמדדו לאחר 4 ימים של תרבות במצב תרבותי פיזיולוגי או פתולוגי, מנורמל לקו הבסיס (יום 0). פירושו ± 95% רווח בר-סמך n=8, **p<0.01. נתון זה השתנהמ- 20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בהתאם לממצאי ביטוי הגנים, תכולת החלבון IL-8 במדיום הראתה עלייה ניכרת לאחר יומיים ו-4 ימים בהשוואה למצב הפיזיולוגי(איור 3). עם זאת, המדידות ביום 3 (לאחר נפיחות חופשית או טעינה) לא גילו הבדלים משמעותיים בין קבוצות המחקר, אם כי התוצאות הצביעו על ערכים גבוהים יותר עבור הקבוצה הניוונית.
איור 3: כימות החלבון הפרו-דלקתי IL-8 משחרר במדיום תרבות הפריה חוץ גופית לאחר תרבות נפיחות חופשית (FS) וטעינה דינמית (Load). התוצאות מוצגות כריכוזים המקוריים ב- ng/mL במדיום ללא נורמליזציה. ממוצע ± 95% רווח בר-סמך, n=8, **p<0.01. נתון זה השתנהמ- 20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
גובה הדיסק (DH) משתנה ל-DH לאחר הניתוח באיור 4. בעוד הפחתות DH לאחר הטעינה גילו ערכים גבוהים יותר (כלומר, הפחתת גובה רבה יותר) עבור הקבוצה הניוונית בהשוואה לקבוצות הפיזיולוגיות, לא נראו הבדלים ברווחי גובה הדיסק לאחר תקופת הנפיחות החופשית בין קבוצות המחקר. הדבר הצביע על כך שההבדל בשינויים בגובה הדיסק בין הקבוצה הפתולוגית לקבוצה הפיזיולוגית היה גבוה יותר לאחר הליך הטעינה. יתר על כן, ההבדלים היו פחות בולטים לאחר יום אחד לעומת המדידות בימים 2 ו -3, המציין השפעה מתקדמת של התנאים הניווניים והדלקתיים.
איור 4: שינויי גובה הדיסק מנורמלים לערכי התוכנית הבסיסית (לאחר הניתוח). ממוצע ± 95% רווח בר-סמך. FS: נפיחות חופשית. N =10, ***p<0.001. נתון זה השתנהמ- 20. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיפקנו כאן פרוטוקול מפורט כדי לדמות IVDD ניווני ודלקתי. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור בדיקות מפורטות של מסלולים דלקתיים המובילים להשפעות ההרסניות על הדיסק. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לעזור לקבוע מטרות טיפוליות מבטיחות המעורבות בהתקדמות המחלה.
לאחרונה הראינו כי TNF-α רקומביננטי אנושי יכול לגרום לדלקת הן בתאי שור והן בתאי NP אנושיים21, וזה בהתאם למחקרים אחרים בתחום המאשרים כי TNF-α יכול לשמש לסימולציה דלקת בתאי IVD22,23. במחקר הנוכחי, מנה של 100 ננוגרם TNF-α לכל IVD שימש כדי לגרום לדלקת. מינון זה הראה אינדוקציה יעילה של סמנים דלקתיים כאשר מיושמים בשילוב עם טעינה ניוונית ותזונה מוגבלת15,20. במחקר שנערך לאחרונה באמצעות TNF-α כגורם החניכה היחיד של ניוון IVD, סף של 100 ננוגרם TNF-α / cm3 נפח דיסק נקבעה כמינון יעיל עבור אינדוקציה של שינויים דלקתיים ניווניים בהפריה חוץ גופית21. הוא הציע כי המינון TNF-α המשמש כדי לגרום לדלקת צריך להיות מנורמל לנפח של הדיסק עבור השפעות לשחזור. יתר על כן, יש להבטיח כי יש חלוקה טובה של חומר ההזרקה בהפריה חוץ גופית וכי זריקה זו תהיה לשחזור כראוי בניסויים הבאים. כמו לחץ הזרקה עשוי להשתנות בין אנשים, ייתכנו הפצות שונות של החומר בין אותן קבוצות מחקר בניסויים שונים. גישה אחת שבחרנו לבחון את החלוקה השווה הייתה שימוש בזריקות כחולות מדוללות של PBS. מומלץ לתקנן את טכניקת ההזרקה, למשל, עם משאבות הזרקה וקצבי הזרקה מוגדרים מראש הניתנים לשחזור. כפי שהוצג קודם לכן, נקב מחט אחד יחיד עם 22-מד, 25-מד, או 30-מד מחטים לתוך IVD לא לגרום להשפעה כי אינטראקציה עם תוצאות המחקר20,21,24,25. מומלץ לשקול את גודל הדיסק עבור נפח החומר להיות מוזרק ועל גודל המחט המשמש להזרקה. כמו כן, מומלץ להשתמש בזריקה אחת כדי למנוע גרימת השפעות ניווניות פוטנציאליות הנגרמות על ידי זריקות טבעתיות מרובות21,26.
יש לטפל במגבלות מסוימות של המודל הנוכחי. הטעינה של IVDs דורש גישה bioreactors, אשר אינם זמינים כיום נרחב במעבדות רבות עובד על IDD. עם זאת, הצורך במודלים פרה-קוליניים של ניוון הפריה חוץ-ממדית עולה. מודלים של תרבות האיברים מביאים יתרונות אתיים של צמצום הצורך במודלים של בעלי חיים, וההשקעה החד פעמית בעלויות הביוריאקטור יכולה להיות סבירה בהתחשב בשחזור הגירוי הניווני, ובהפחתת העלויות הכרוכות בניסויים בבעלי חיים. עם זאת, כמה אינטראקציות vivo, כגון התפקיד של המערכת החיסונית, לא ניתן לדמות עם מודל תרבות האיברים שסופק. יתר על כן, מדידת אותות עצביים והערכת כאב המתאפשר במודלים של בעלי חיים אינם יכולים כיום להילקח בחשבון עם המודל הנוכחי. כמה חששות הועלו אם המאפיינים המכאניים של עירוי זנב יכול להיות דומה עם עירויים אנושיים כמו עמדת עמוד השדרה זקוף הוא ייחודי בבני אדם28. תכונות אנטומיות ומולקולריות של עירוי זנב שור, כגון צפיפות תאים, חוסר תאים notochordal, הרכב ביוכימי29,30, ותכונות מכניות של עירויים caudal שור, כגון טווח התנועה כיפוף, הרחבה, פיתול, וכיפוף31 דומים מאוד עירויים אנושיים. יש לציין, IVDs אנושי להרוויח יותר ויותר תשומת לב לאחרונה עבור מודלים תרבות איברים28. IVD cadaveric אנושי במודלים ex vivo נחשבים יעילים מאוד כפי שהם יכולים למנוע הבדלים מינים אשר רלוונטיים יותר קלינית32. בניגוד לזנבות IVD שור המתקבלים מבתי המטבחיים, זה ידרוש השתלה של עירויים אנושיים 24 שעות לאחר המוות, ולכן, אישור אתי בעקבות חוקי השתלת איברים מקומיים28. השיטה הנוכחית יכולה גם להיות מותאמת בקלות למינים אחרים.
אחד היתרונות העיקריים של הטכניקה בהשוואה לשיטות אחרות של תרבויות ex vivo הוא השילוב של הזרקה תוך-דיסקית, תנאים בינוניים פתולוגיים וטעינה מזיקה כדי לדמות טוב יותר את השלב המוקדם של דיסקים ניווניים. וולטר ואח'23 השתמשו TNF-אלפא במדיום של IVDs שור טעון באופן דינמי במקום הזרקה לתוך IVDs והראה הובלה מוגברת של TNF-אלפא מן המדיום לתוך פולפוסוס הגרעין לעומת אנולוס פיברוסוס, אשר בהתאם לתוצאות שלנו. כפי שהתכוונו לדמות את השלבים המוקדמים של IDD, המתרחשת ברמה התאית ללא שיבושים משמעותיים של ארכיטקטורת הדיסקים12, בחרנו בריכוזי TNF-אלפא המבוססים על מחקרי תרבות איברים קודמים באמצעות TNF-אלפא באמצעי כדי לדמות את השלבים המוקדמים של IDD12,22,23. השימוש בממריצים דלקתיים אחרים וריכוזים גבוהים יותר של TNF-אלפא יכול להיבדק כדי לדמות את מצב הדיסק הניווני הרצוי בהתאם לשאלת המחקר. ריכוזים גבוהים יותר של TNF-אלפא עשויים לפצות טוב יותר על היעדר פידבקים רגולטוריים מערכתיים החיסון נוכח במהלך ניוון דיסק כפי שהוצע על ידי Ponnappan et al.12 השימוש בתנאים בינוניים מזיקים עם גלוקוז נמוך התבסס על עבודה קודמת מראה כי הגבלת תזונה מדיה וחשיפה TNF-אלפא מחקה מאפייני שינוי מולקולרי אשר זמינים במצב ניוון דיסק מוקדם12,27. לכן, הגישה משלבת את הראיות שסופקו על ידי מחקרים קודמים במודל אחד של תרבות איברים אקס ויוו של מחלת דיסק ניוונית מוקדמת.
פרוטוקול זה ניתן לשפר עוד יותר במספר דרכים. ניתן לבחור את משך תקופת הטעינה וההתנפחות החופשית על סמך תוכנית הלימודים הרצויה. השפעות ארוכות טווח של גירויים דלקתיים או ניווניים על ניוון דיסק הם בעלי עניין קליני גבוה וניתן להשיגם באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. השתמשנו רק בגנים נבחרים הנחשבים רלוונטיים מאוד למצב המוקדם של IDD11. אימות נוסף של מודל זה יכול לכלול הערכה מורחבת של גנים וחלבונים, כגון גישות omics. כתוצאה מכך, גורמים דלקתיים אחרים יכולים להיחקר בשילוב עם הטעינה הניוונית, בהתאם למצב הניוון הרצוי. לדוגמה, זריקות lipopolysaccharide הוכחו לעורר דלקת בהפריה חוץ גופית33. השוואה של ממריצים דלקתיים שונים יכולה להתבצע עם הפרוטוקול הנוכחי כדי למצוא את הממריץ הדלקתי המתאים ביותר לשאלת המחקר הרצויה. הערכנו שינויים של סמנים דלקתיים נבחרים (IL-6, IL-8), סמנים אנבוליים (צבירה, קולגן) וסמנים קטבוליים (מטריצה metallopeptidases, disintegrin ו metalloproteinases עם מוטיבים תרומבוספונדין) עם הפרוטוקול הנוכחי20. ככל שפרופיל ביטוי הגנים כולו עשוי להשתנות, בדיקות עתידיות עשויות לכלול טכניקות רצף RNA מהדור הבא כדי לקבוע סמנים ביולוגיים חדשניים לאבחון ניוון דיסקים ויעדים טיפוליים להתערבות ביולוגית מוקדמת. יתר על כן, מתודולוגיות אחרות, כגון היסטולוגיה, כתמים אימונוהיסטוכימיים, מדידות ביוכימיות של רכיבי מטריצה חוץ-תאית (כגון גליקוסאמינוגליקנים, GAGs), ובדיקות דחיסה דינמיות יכולות להתבצע כדי לנתח עוד יותר את המאפיינים הביולוגיים, הביוכימיים והביומכניים של דיסקים תוך IVD עם המודל הנוכחי. דרך אנליטית אפשרית נוספת תהיה לנתח בנפרד את ההשפעה על רקמת AF ו- NP החיצונית באמצעות bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α ו- MKX כסמני ביטוי גנים עבור AFהחיצוני 34,35. קבוצת עניין מחקר עמוד השדרה בכנס השנתי 2014 ORS בניו אורלינס מומלץ בעקבות סמנים פנוטיפיים NP בריא: HIF-1alpha, GLUT-1, צבירה / קולגן II יחס >20, ששש, ברכיורי, KRT18/19, CA12, ו CD2436. הגנים סמן NP bBrachyury / T ו bחלבון מקורזל הקשורות 2 היו משכנע ביותר הפרדת NP מרקמת AF הפנימית והחיצונית ב IVD שור34. יתר על כן, התוכן sGAG של NP דווח להיות גבוה באופן משמעותי בהשוואה AF החיצוני34.
לסיכום, מודל חדש זה של תרבות איברים פרו-אינפורמטיבית וניוון להפריה חוץ גופית מספק תנאים רלוונטיים כדי לדמות IDD בשלב מוקדם במיקרו-וירוס תלת-ממדי רלוונטי ביותר. אין ספק שניתן לשנות עוד יותר את הפרוטוקול הנוכחי בהתאם למטרות החוקר. יתר על כן, המודל שלנו הוא מסוגל להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים מחקר ובכך משקף לחלוטין את עקרונות 3R של להפחית, להחליף, לחדד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן AO ו- AOSpine הבינלאומי. באבאק סראבי זכה לתמיכת מלגות מקרן עמוד השדרה הגרמנית וקרן דלקת מפרקים ניוונית גרמנית. גרנוט לאנג נתמך על ידי תוכנית ברטה-אוטנשטיין למדענים קליניים מתקדמים, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
