Summary
Este protocolo presenta un modelo experimental nuevo de la cultura proinflamatoria, degenerativa del órgano bovino para simular la degeneración intervertebral del disco de la temprano-etapa.
Abstract
La degeneración intervertebral sintomática del disco (IVD) (IDD) es una carga socioeconómica importante y es caracterizada por la inflamación y la degradación del tejido. Debido a la falta de terapias causales, existe una necesidad urgente de modelos experimentales innovadores de cultivo de órganos para estudiar los mecanismos involucrados en la progresión de la enfermedad, encontrar dianas terapéuticas y reducir la necesidad de modelos animales. Aquí presentamos una novela, protocolo tridimensional del modelo de la cultura del órgano mímico el microambiente proinflammatory y catabólico, que está presente durante IDD.
Inicialmente, IVDs caudal bovino fue diseccionado, limpiado, y cultivado en el medio de cultivo del tejido. El cargamento fisiológico o patológico dinámico fue aplicado en un biorreactor a medida por 2 horas por día. Ivds fue asignado a un grupo de control (alto medio de la glucosa, cargamento fisiológico, inyección salina fosfato-tamponada) y a un grupo patológico (medio bajo de la glucosa, cargamento patológico, inyección de la factor-alfa de la necrosis de tumor) por cuatro días. El análisis de la expresión génica de las células pulposus recogidas del núcleo del IVDs y del análisis enzima-ligado del inmunosorbente de los medios condicionados de la cultura del órgano fue realizado.
Nuestros datos revelaron una mayor expresión de marcadores inflamatorios y alturas de disco reducidas después de la carga en el grupo patológico en comparación con el grupo control. Este protocolo es confiable para simular la inflamación y la degeneración de IVD y se puede ampliar más a fondo para ampliar su alcance del uso.
Introduction
El dolor lumbar (LUMB) puede afectar a individuos de todas las edades y es una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo1,2,3. El costo total asociado con la lumbalgia supera los $100 mil millones por año4,5. La degeneración intervertebral sintomática del disco (IVD), una condición caracterizada por la inflamación y la degradación del tejido, es una causa importante de LBP6,7. Específicamente, idd es caracterizado por una avería gradualmente de evolución de la matriz extracelular de IVD (ECM), inducida y accionada por los factores múltiples que llevan a una patología acelerada, a los desordenes neurológicos, y eventual a la inhabilidad. Además, la IDD se asocia con la liberación de citoquinas proinflamatorias, biomecánica de columna alterada, angiogénesis y crecimiento nervioso, lo que aumenta la sensación de dolor, causando en conjunto LBP crónica (discopatía activa)6,8. Hasta la fecha, las opciones de tratamiento incluyen discectomía y posterior fusión de las vértebras adyacentes, implantación de una prótesis de IVD o enfoques no quirúrgicos, como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, opioides y relajantes musculares para pacientes con IDD9. Las dos opciones terapéuticas estándar actuales, quirúrgicas y no quirúrgicas, son sólo parcialmente eficaces y no abordan el problema biológico subyacente9,10. La enfermedad degenerativa del disco en estadio temprano se caracteriza por una respuesta tisular inflamatoria inicial, especialmente un aumento en la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa)11. Estos cambios tempranos en el disco ocurren principalmente a nivel celular sin interrumpir la arquitectura del disco y previamente podrían ser imitados por la deficiencia nutricional en condiciones proinflamatorias12. Por lo tanto, la simulación precisa de la situación in vivo para investigar estos mecanismos de degeneración y encontrar dianas terapéuticas adecuadas es crucial. Además, para estas simulaciones de propiedades moleculares, el entorno de carga mecánica de los discos juega un papel clave en los cambios patológicos y fisiológicos de la IVD. En consecuencia, la combinación de estos enfoques nos traería un paso adelante para imitar el complejo microambiente de los IVDs in vivo. Actualmente no hay estudios que consideren el aspecto de la carga dinámica junto con el ajuste favorable-inflamatorio y alimenticio al mejor de nuestro conocimiento.
Aunque los modelos animales grandes permiten la investigación de posibles interacciones in vivo relevantes, son costosos y requieren mucho trabajo. Además, dado que el uso de modelos animales en la investigación ha sido durante mucho tiempo un tema de controversia, la reducción del número de animales necesarios para responder a importantes preguntas de investigación es de gran interés. Por último, actualmente no existe un modelo animal ideal para imitar el IDD en la investigacióndel IVD 13,14. Por lo tanto, es necesario establecer un reemplazo rentable y confiable, como un modelo de cultivo de órganos para simular la IDD y los procesos inflamatorios y degenerativos asociados. Recientemente, la aplicación del presente protocolo sobre el establecimiento de un modelo de cultivo de órganos proinflamatorios y degenerativos para simular la enfermedad del disco intervertebral en estadio temprano nos permitió investigar el efecto de los fármacos antiinflamatorios en el cultivo de órganos IDD15.
Aquí, describimos cómo obtener los discos intervertebrales bovinos e inducir el estado de idd de la temprano-etapa vía un microambiente catabólico y proinflammatory causado por la inyección intradiscal directa de la factor-alfa de la necrosis de tumor (TNF-α) y del cargamento degenerativo en un biorreactor bajo condiciones medias nutritivas bajas. La Figura 1 ilustra el modelo experimental y muestra el biorreactor utilizado para simular condiciones de carga degenerativas y fisiológicas.
Figura 1:Ilustración de la configuración experimental. A: cola de bovino; B: discos intervertebrales bovinos disecados; C: transferencia del disco a un pozo-plato con medio de cultivo; D: carga de la simulación en un biorreactor; E: técnica de inyección intradiscal; F: IVD después de la inyección de PBS/tinte azul tripano para revelar la distribución. IDD: degeneración del disco intervertebral. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Protocol
Los experimentos se realizaron utilizando colas de bovino obtenidas de mataderos locales. Los materiales biológicos utilizados en el presente estudio se toman de la cadena alimentaria y no requieren aprobación ética en la legislación suiza y europea.
1. Disección del disco intervertebral bovino
- Enjuague bien toda la cola con agua del grifo para eliminar la suciedad y el vello en la superficie.
NOTA: Con los extremos intactos, distales, un máximo de 9 IVDs (coccygeal 1-9) por cola se puede utilizar para los experimentos dependiendo del tamaño deseado de los IVDs. Teniendo en cuenta el diámetro deseado entre 15-20 mm, se utilizaron 12 colas bovinas con 5 IVDs por cola para los experimentos. - Sumergir toda la cola en una caja que contenga una solución de betadina al 1% durante 10 min. Seque brevemente la cola con gasa estéril y colóquela en una cortina estéril.
NOTA: Durante la disección del disco, humidifique las colas con la gasa humedeceda en solución de Ringer para evitar la deshidratación. Guarde las colas (o los segmentos sobrantes) envueltos en gasa húmeda hasta que se complete todo el procedimiento de disección. - Use un bisturí (No. 20) para eliminar el tejido blando lo más completamente posible de la columna vertebral caudal para facilitar la identificación de los IVDs. Retire los procesos espinosos y transversales de las vértebras con alicates de extracción ósea.
NOTA: Seleccione ivds con el diámetro deseado. Ivds con una gama del diámetro de 15-20 milímetros fue utilizado en el estudio actual. - Cortar transversalmente con alicates óseos a través de la mitad de cada cuerpo vertebral para obtener segmentos de movimiento individuales. Coloque segmentos de movimiento en una placa de Petri con gasa mojada con la solución de Ringer.
- Localice la IVD y la vértebra por palpación y moviendo los segmentos de movimiento suavemente. Haga dos cortes paralelos con la sierra de banda en la placa de crecimiento de los IVDs, uno a cada lado del IVD. Identifique la ubicación de la placa de crecimiento tocando y encontrando el sitio convexo de la parte ósea del endplate (dura) adyacente al disco (suave) con una distancia de seguridad de aproximadamente 0.5-1 mm desde la IVD hacia la vértebra. Asegúrese de que la hoja de la sierra de banda se enfríe con la solución de Ringer mientras corta las vértebras.
- Transfiera ivds en una placa de Petri limpia con la gasa limpia mojada con la solución del campanero.
NOTA: La gasa debe estar humedeceda y no demasiado húmeda para prevenir la hinchazón de los IVDs, - Use la hoja del bisturí para raspar el cuerpo vertebral (hueso rojo/rosado), la placa de crecimiento (cartílago blanco), deje el endplate intacto (amarillo-rosado). Haga que las dos superficies sean planas y paralelas para el procedimiento de carga. Transfiera los IVDs raspados a una placa de Petri fresca con la gasa mojada con la solución del campanero.
NOTA: Use un guante de correo de cadena para proteger la mano mientras sostiene el IVD y raspa. - Mida la altura y el diámetro del disco con una pinza. Limpie los coágulos de sangre en el hueso de las vértebras con la solución de Ringer usando un sistema de lavado a chorro.
- Transfiera los IVDs a 50 mL de tubos de plástico, un IVD por tubo. Agregue 25 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 10% de penicilina/estreptomicina (P/S) por IVD y déjela temblando durante 15 minutos en una coctelera orbital a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS + 1% P/S por IVD durante 2 min para enjuagar los IVDs.
2. Cultivo y carga de IVD
- Transferir discos a cámaras de IVD y añadir medio de cultivo de IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4.5 g/L de DMEM de alta glucosa para el grupo fisiológico y 2 g/L de DMEM de glucosa baja para el grupo patológico) + 1% P/S + 2% suero de ternero fetal + 1% ITS (contiene 5 μg/mL de insulina, 6 μg/mL de transferrina y 5 ng/mL de ácido selenious) + 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato + 1% de aminoácido no esencial + 50 μg/mL de agente antimicrobiano para células primarias) y colocarlos en una incubadora a 37 °C, 85% y humedad 5% CO2.
- Cultivo de los discos durante 4 días dentro de un sistema biorreactor según grupos experimentales16. En el grupo patológico, mantener condiciones de carga degenerativas a 0.32-0.5 MPa, 5 Hz durante 2 h/día. En el grupo de control fisiológico, utilice un protocolo de carga de 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz durante 2 h/día.
NOTA: Coloque los IVDs en cámaras que contengan 5 mL de medio IVD durante los procedimientos de carga. El volumen depende del tamaño de las cámaras de carga del biorreactor. Entre los procedimientos de carga, coloque los IVDs en placas de seis pozos con 7 mL de medio de cultivo de IVD para la recuperación de hinchazón libre. - Para analizar los cambios en la altura del disco durante el período experimental, mida la altura del disco con una pinza después de la disección ivd (línea de base) y luego diariamente después del período de hinchazón libre y después de la carga dinámica durante la duración experimental.
3. Inyección intradiscal del factor-alfa de la necrosis de tumor (TNF-α)
- Directamente después del primer ciclo de carga dinámica en el día 1, coloque los IVDs en una placa de Petri en una posición vertical y estabilice los IVDs con una pinza.
- Inyecte TNF-α recombinante (100 ng en 70 μL de PBS por IVD) con una aguja de insulina de calibre 30 en el tejido pulposo del núcleo del grupo patológico17. Inyecte lentamente a una velocidad de aproximadamente 70 μL en 1 min.
- Después de la inyección, tire de la jeringa a la mitad del IVD y tire del émbolo de la jeringa para crear un vacío que evite que la solución inyectada se escape hacia atrás, antes de retirar la aguja y la jeringa completamente del IVD.
NOTA: Realice un experimento piloto inyectando PBS que contiene tinte azul tripano para evaluar la distribución de la solución inyectada después de la carga y el cultivo nocturno.
4. Expresión génica
- Cosechar los IVDs el día 4. Recoja el tejido pulposo del núcleo (NP) (parte gelly en el medio de IVD) con un punzón de la biopsia. Recoger el anillo externo fibroso (AF) con una hoja de bisturí (No.20).
NOTA: Para la referencia basal en el día 0, recoger los tejidos inmediatamente después de la disección para la extracción de ARN. - Utilice la cantidad de tejido NP o AF necesaria para el análisis de expresión génica, dependiendo del diseño experimental.
NOTA: Para los actuales experimentos, el tejido del magnesio aproximadamente 150 fue utilizado. La proporción de solución de aislamiento de ARN a la masa tisular debe ser de al menos 2 mL por tejido de 100-150 mg para una extracción eficiente. - Digerir el tejido NP o AF con la solución de digestión (pronasa al 0,2% en DMEM, filtro esterilizado) e incubar durante 1 h a 37 °C con agitación magnética18.
- Flash-congelar las muestras de tejido utilizando nitrógeno líquido y pulverizar a un polvo fino. Divida el polvo de tejido pulverizado por igual en dos tubos de 2 mL cada uno que contenga 1 mL de tiocianato de guanidina y fenol en una solución monofásica (solución de aislamiento de ARN).
- Realizar la homogeneización en tubos de 2 mL que contengan la solución de aislamiento de ARN y el polvo de tejido pulverizado. Homogeneizar el polvo de tejido 5x con una bola de acero inoxidable de 8 mm y un lyzer de tejido a 30 Hz durante 3 min. Centrífuga a 12.000 x g,4 °C durante 10 min y transferir el sobrenadante a un tubo fresco. Los sobrenadantes se pueden almacenar a -80 °C durante al menos un mes.
- Añadir 0,1 mL de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 mL de solución de aislamiento de ARN y agitar vigorosamente durante 15 s. Guarde la mezcla resultante a temperatura ambiente en una coctelera orbital durante 15 min y la centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
NOTA: El ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa superior. - Transfiera la fase acuosa a un tubo fresco y precipite el ARN con 0,25 mL de isopropanol y 0,25 mL de solución de alta precipitación salina por 1 mL de solución de aislamiento de ARN utilizada para la homogeneización inicial. Guarde las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos en una coctelera orbital y la centrifugadora a 12.000 x g durante 8 min a 4 °C.
NOTA: Alternativamente, utilice el método de extracción de ARN basado en columnas que generalmente conduce a una mayor pureza de ARN pero un menor rendimiento de ARN. - Retire el sobrenadante y lave el pellet de ARN con 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de solución de aislamiento de ARN utilizada para la homogeneización inicial. Centrífuga a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el lavado de etanol y seque brevemente al aire pellet de ARN durante 3-5 min. Disuelva el ARN en 20 μL de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) pasando la solución unas cuantas veces a través de una punta de pipeta e incubando durante 10-15 min a 55-60 °C.
- Mida la absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm (A230, A260 y A280 respectivamente). A260 de 1,0 corresponde a 40 μg/mL de ARN. Se espera una relación A260/A280 de 1,6-1,9, mientras que la contaminación da lugar a una relación A260/A280 de <1,6.
- Prepare una mezcla de reacción de transcriptasa inversa (RT) para un volumen de reacción de 20 μL. La mezcla contiene mezcla de enzimas RT, inhibidor de la ribonucleasa, proteína ayudante, cebadores, dNTPs, MgCl2,agua libre de ARNasa y 0,4 μg de muestra de ARN.
- Centrifugar brevemente los tubos RT para mezclar todos los componentes en la parte inferior del tubo.
- Coloque las muestras en el instrumento termociclor. Seleccione el programa apropiado para el RT. Ejecute el RT durante 10 min a 25 °C, seguido del paso de transcripción inversa durante 120 min a 42 °C y la inactivación de la transcriptasa inversa durante 5 min a 85 °C, enfriándola hasta 4 °C al final.
- Diluir el ADNc resultante con tampón tris(hidroximetil)aminometano (Tris)-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (TE) (10 mM Tris con 1 mM EDTA) hasta una concentración final de 0,4 μg de ARN utilizado para RT por 100 μL de solución de ADNc. Almacene las muestras de ADNc a -20 °C.
- Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real utilizando un volumen de reacción de 10 μL. El volumen de reacción contiene la mezcla maestra (que contiene ADN polimerasa, uracilo-ADN glicosilasa, dNTPs con dUTP, referencia pasiva y componentes tampón optimizados), cebador delantero 45 μM, cebador inverso 45 μM, sonda 12,5 μM (que contiene un tinte reportero vinculado al extremo 5' de la sonda, un aglutinante de ranura menor en el extremo 3' de la sonda y un quencher no fluorescente en el extremo 3' de la sonda) , 2 μL de ADNc y agua tratada con DEPC.
- Ejecutar un control endógeno (RPLP0) para la cuantificación relativa con el método 2-ΔΔCT 19.
- Agregue muestras por duplicados y ejecute un control sin plantilla agregando TE-buffer en lugar de cDNA. Ejecutar PCR en condiciones estándar (2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C).
- Realizar la cuantificación relativa de los objetivos de ARNm siguiendo el método comparativo de TC. La cantidad de ARNm normalizada a la muestra basal se calcula como 2-ΔΔCT, mientras que ΔΔCT es la diferencia entre el ΔCT (CT target- CT control endógeno) de la muestra y ΔCT (CT target y CT endógeno control) de la muestra basal.
5. Cuantificación del contenido de proteínas en el medio ivd
- Recoger el medio condicionado por las muestras de IVD para medir el contenido de proteína en el medio. Realizar ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) según el protocolo de la proteína diana.
- La interleucina-8 bovina (IL-8) se cuantifica mediante el kit ELISA IL8 anti-bovino de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
La carga degenerativa en medio de glucosa baja combinada con la inyección de TNF-α provocó un aumento significativo de la expresión génica de los marcadores proinflamatorios interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8 (IL-8) en comparación con el grupo control fisiológico en células NP después de 4 días de cultivo(Figura 2). Por el contrario, no se observaron cambios significativos para los genes proinflamatorios interleucina 1β (IL-1β) y TNF-α en las células NP (datos no mostrados). Además, las condiciones degenerativas de la cultura no alteraron la expresión génica de IL-6 e IL-8 en células del AF.
Figura 2: Niveles de expresión génica en el tejido del núcleo pulposo (NP) y en los tejidos del fibroso anular (FA). Éstos fueron medidos después de 4 días de cultura bajo condición fisiológica o patológica de la cultura, normalizados a la línea de fondo (día 0). Medias ± intervalo de confianza del 95% n=8, **p<0.01. Esta cifra se ha modificado de20. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
De acuerdo con los hallazgos de expresión génica, el contenido de proteína IL-8 en el medio mostró un marcado aumento después de 2 días y 4 días en comparación con la condición fisiológica(Figura 3). Sin embargo, las mediciones en el día 3 (después de la hinchazón libre o la carga) no revelaron diferencias significativas entre los grupos de estudio, aunque los resultados indicaron valores más altos para el grupo degenerativo.
Figura 3: Cuantificación de la liberación de la proteína proinflamatoria IL-8 en el medio de cultivo de IVD después del cultivo de hinchazón libre (FS) y la carga dinámica (Carga). Los resultados se muestran como las concentraciones originales en ng/mL en el medio sin normalización. Media ± intervalo de confianza del 95%, n=8, **p<0,01. Esta cifra se ha modificado de20. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Los cambios de altura del disco (DH) normalizados al DH después de la disección se muestran en la Figura 4. Considerando que las reducciones del DH después del cargamento revelaron valores más altos (es decir, más reducción de la altura) para el grupo degenerativo comparado a los grupos fisiológicos, no se consideró ningunas diferencias en aumentos de la altura del disco después del período de la libre-hinchazón entre los grupos de estudio. Esto indicó que la diferencia en los cambios de altura del disco entre el grupo patológico y fisiológico fue mayor después del procedimiento de carga. Además, las diferencias fueron menos pronunciadas después de 1 día en comparación con las mediciones en los días 2 y 3, lo que indica un efecto progresivo de las condiciones degenerativas e inflamatorias.
Figura 4:Cambios en la altura del disco normalizados a los valores basales (después de la disección). Media ± intervalo de confianza del 95%. FS: hinchazón libre. N=10, ***p<0.001. Esta cifra se ha modificado de20. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para simular IVDD degenerativo e inflamatorio. Este protocolo se puede aplicar para las examinaciones detalladas de los caminos inflamatorios que llevan a los efectos destructivos sobre el disco. Además, el protocolo puede ayudar a determinar dianas terapéuticas prometedoras implicadas en la progresión de la enfermedad.
Recientemente demostramos que el TNF-α recombinante humano podría inducir inflamación tanto en células NP bovinas como humanas21,lo que está de acuerdo con otros estudios en el campo que confirman que el TNF-α puede ser utilizado para la simulación de la inflamación en célulasIVD 22,23. En el actual estudio, una dosis de 100 ng TNF-α por IVD fue utilizada para inducir la inflamación. Esta dosis mostró inducción efectiva de marcadores inflamatorios cuando se aplicó en combinación con carga degenerativa y nutrición limitada15,20. En un estudio reciente utilizando TNF-α como único factor de iniciación de la degeneración de la IVD, se ha determinado un umbral de 100 ng de volumen de disco TNF-α /cm3 como una dosis efectiva para la inducción de cambios inflamatorios y degenerativos en la IVD21. Se sugiere que la dosis TNF-α usada para inducir la inflamación se debe normalizar al volumen del disco para los efectos reproducibles. Además, debe garantizarse que haya una buena distribución del material de inyección en el IVD y que esta inyección sea adecuadamente reproducible en experimentos posteriores. Como la presión de inyección puede variar entre individuos, puede haber diferentes distribuciones del material entre los mismos grupos de estudio en diferentes experimentos. Un enfoque que elegimos para examinar la distribución equitativa fue el uso de pbs diluido trypan inyecciones azules. Se recomienda estandarizar la técnica de inyección, por ejemplo, con bombas de inyección y tasas de inyección predefinidas y reproducibles. Como se mostró anteriormente, una sola punción con agujas de calibre 22, calibre 25 o calibre 30 en la IVD no causó un efecto que interactuara con los resultados del estudio20,21,24,25. Se recomienda considerar el tamaño del disco para el volumen de la sustancia que se va a inyectar y para el tamaño de la aguja utilizado para la inyección. Además, se recomienda utilizar una sola inyección para evitar la inducción de posibles efectos degenerativos causados por múltiples inyecciones anulares21,26.
Es necesario abordar algunas limitaciones del modelo actual. La carga de los IVDs requiere acceso a biorreactores, que actualmente no están ampliamente disponibles en muchos laboratorios que trabajan en IDD. Sin embargo, la necesidad de modelos preclínicos de degeneración ivd está aumentando. Los modelos de cultivo de órganos aportan beneficios éticos de reducir la necesidad de modelos animales, y la inversión única en costos de biorreactor podría ser asequible teniendo en cuenta la reproducibilidad de la estimulación degenerativa y las reducciones en los costos asociados con los experimentos con animales. Sin embargo, algunas interacciones in vivo, como el papel del sistema inmune, no se pueden simular con el modelo de cultivo de órganos proporcionado. Por otra parte, la medición de las señales nerviosas y la evaluación del dolor que sería posible en modelos animales actualmente no se pueden considerar con el modelo actual. Se plantearon algunas preocupaciones sobre si las propiedades mecánicas de los dispositivos de in vitro de cola podrían ser comparables con los dispositivos de in vitro humanos, ya que la posición vertical de la columna vertebral es única en los seres humanos28. Las propiedades anatómicas y moleculares de los IVDs de cola bovina, como la densidad celular, la falta de células notolodales, la composición bioquímica29,30,y las propiedades mecánicas de los IVDs caudales bovinos, como el rango de movimiento en flexión, extensión, torsión yflexión 31 son muy similares a los IVDs humanos. En particular, los IVDs humanos ganan cada vez más atención recientemente para los modelos de cultivo de órganos28. Los IVDs cadavéricos humanos en modelos ex vivo se consideran altamente eficientes, ya que pueden evitar diferencias de especies que son más relevantes clínicamente32. A diferencia de las colas de ivd bovinas obtenidas de los mataderos, esto requeriría el trasplante de IVDs humanos 24 h post mortem y, por lo tanto, la aprobación ética siguiendo las leyes locales de trasplante deórganos 28. El método actual también se puede adaptar fácilmente a otras especies.
Una ventaja importante de la técnica comparada a otros métodos de culturas ex vivo es la combinación de inyección intradiscal, de condiciones medias patológicas, y de carga perjudicial para simular el primero tiempo de discos degenerativos mejor. Walter y col.23 utilizaron TNF-alfa en el medio de IVDs bovinos dinámicamente cargados en vez de la inyección en los IVDs y mostraron el transporte creciente de la TNF-alfa del medio en el pulposus del núcleo comparado al fibrosus del anillo, que está de acuerdo con nuestros resultados. Como nos propusimos simular las primeras etapas de la IDD, que se produce a nivel celular sin mayores interrupciones de la arquitectura de los discos12,elegimos las concentraciones de TNF-alfa basadas en estudios previos de cultivo de órganos utilizando TNF-alfa en el medio para simular las primeras etapas de idd12,22,23. El uso de otros estimulantes inflamatorios y de concentraciones más altas de TNF-alfa se podía probar para simular el estado degenerativo deseado del disco dependiendo de la pregunta del estudio. Concentraciones más altas de TNF-alfa pueden compensar mejor la falta de retroalimentación reguladora inmune sistémica presente durante la degeneración del disco según lo propuesto por Ponnappan y otros12 El uso de condiciones medias perjudiciales con la bajo-glucosa fue basado en el trabajo anterior que mostraba que los medios alimenticio que limitaban y la exposición a la TNF-alfa imitan las características moleculares del cambio que están disponibles en estado temprano de la degeneración del disco12,27. Por lo tanto, el enfoque combina las pruebas proporcionadas por estudios anteriores en un modelo de cultivo de órganos ex vivo de la enfermedad degenerativa temprana del disco.
Este protocolo se puede mejorar aún más de varias maneras. La duración y la extensión del período de carga y de hinchazón libre se pueden elegir en función del plan de estudio deseado. Los efectos a largo plazo de estímulos inflamatorios o degenerativos sobre la degeneración del disco son de alto interés clínico y se pueden lograr con el protocolo actual. Sólo se utilizaron genes seleccionados considerados altamente relevantes para el estado temprano de IDD11. La validación adicional de este modelo podría incluir una evaluación ampliada de genes y proteínas, como los enfoques ómicos. En consecuencia, otros factores inflamatorios podrían ser investigados en combinación con la carga degenerativa, dependiendo del estado degenerativo deseado. Por ejemplo, se ha demostrado que las inyecciones de lipopolisacárido estimulan la inflamación en laIVD 33. Una comparación de diversos estimulantes inflamatorios se puede lograr con el actual protocolo para encontrar el estimulante inflamatorio más apropiado para la pregunta deseada del estudio. Hemos evaluado cambios de marcadores inflamatorios seleccionados (IL-6, IL-8), marcadores anabólicos (aggrecan, colágeno) y marcadores catabólicos (metalopéptidos de matriz, disintegrina y metaloproteinasas con motivos de trombospondina) con el presente protocolo20. Como todo el perfil de expresión génica podría cambiar, los exámenes futuros podrían incluir técnicas de secuenciación de ARN de próxima generación para determinar nuevos biomarcadores para el diagnóstico de degeneración de disco y dianas terapéuticas para la intervención biológica temprana. Además, otras metodologías, tales como histología, coloración immunohistochemical, medidas bioquímicas de los componentes extracelulares de la matriz (tales como glycosaminoglycans, GAGs), y pruebas compresivas dinámicas se pueden realizar para analizar más lejos las propiedades biológicas, bioquímicas, y biomecánicas de IVDs con el actual modelo. Otra posible forma analítica sería analizar por separado el impacto en el tejido externo de AF y NP utilizando bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α y MKX como marcadores de expresión génica para el AF externo34,35. El Grupo de Interés de Investigación de columna vertebral en la Reunión Anual de ORS 2014 en Nueva Orleans recomendó los siguientes marcadores fenotípicos NP saludables: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan / colágeno II relación >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 y CD2436. Los genes marcadores de NP bBrachyury/T y bSecreted frizzled-related protein 2 fueron los más convincentes separando el NP del tejido AF interno y externo en la IVDbovina 34. Además, el contenido del sGAG del NP fue divulgado para ser perceptiblemente más alto comparado al AF externo34.
En conclusión, este nuevo modelo de cultivo de órganos de IVD proinflamatorio y degenerativo proporciona condiciones relevantes para simular el IDD en etapa temprana en un microambiente 3D altamente relevante. Ciertamente, el presente protocolo puede modificarse aún más de acuerdo con los objetivos del investigador. Además, nuestro modelo es capaz de reducir el número de animales de estudio necesarios y, por lo tanto, refleja totalmente los principios 3R de reducir, reemplazar, refinar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación AO y AOSpine International. Babak Saravi recibió apoyo de becas de la Fundación Alemana de la Columna Vertebral y la Fundación Alemana de Osteoartritis. Gernot Lang recibió el apoyo del Programa Berta-Ottenstein para Científicos Clínicos Avanzados de la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo (Alemania).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
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