Summary
Bu protokol, erken evre intervertebral disk dejenerasyonunu simüle etmek için proinflamatuar, dejeneratif sığır organ kültürünün yeni bir deneysel modelini sunar.
Abstract
Semptomatik intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu (IDD) önemli bir sosyoekonomik yüktür ve iltihaplanma ve doku bozulması ile karakterizedir. Nedensel tedavilerin eksikliği nedeniyle, hastalığın ilerlemesinde rol oynayan mekanizmaları incelemek, terapötik hedefler bulmak ve hayvan modellerine olan ihtiyacı azaltmak için yenilikçi deneysel organ kültürü modellerine acil ihtiyaç vardır. Burada, IDD sırasında mevcut olan proinflamatuar ve katabolik mikroçevrimini taklit eden yeni, üç boyutlu bir organ kültürü modeli protokolü sunuyoruz.
Başlangıçta, sığır kaudal IVD'leri doku kültürü ortamında parçalandı, temizlendi ve kültürlendi. Özel yapım bir biyoreaktörde günde 2 saat dinamik fizyolojik veya patolojik yükleme uygulandı. IVD'ler dört gün boyunca bir kontrol grubuna (yüksek glikoz ortamı, fizyolojik yükleme, fosfat tamponlu salin enjeksiyonu) ve patolojik bir gruba (düşük glikoz ortamı, patolojik yükleme, tümör nekroz faktörü-alfa enjeksiyonu) atandı. IVD'lerin toplanan çekirdek pulposus hücrelerinden gen ekspresyon analizi ve şartlandırılmış organ kültürü medyasının enzime bağlı immünosorbent tahlili yapıldı.
Verilerimiz, kontrol grubuna kıyasla patolojik gruba yüklendikten sonra enflamatuar belirteçlerin daha yüksek bir ekspresyonunun ve disk yüksekliklerinin azaldığını ortaya koydu. Bu protokol IVD inflamasyon ve dejenerasyon simüle etmek için güvenilirdir ve uygulama kapsamını genişletmek için daha da genişletilebilir.
Introduction
Bel ağrısı (LBP) her yaştan bireyi etkileyebilir ve dünya çapında engellilik için önde gelen bir nedendir1,2,3. LBP ile ilişkili toplam maliyet yılda 100 milyar doları aşıyor4,5. Semptomatik intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu (IDD), iltihaplanma ve doku bozulması ile karakterize bir durum, LBP6,7'ninönemli bir nedenidir. Özellikle, IDD, IVD'nin hücre dışı matrisinin (ECM) giderek gelişen bir kırılımı ile karakterizedir, hızlandırılmış bir patolojiye, nörolojik bozukluklara ve sonunda sakatlığa yol açan birden fazla faktör tarafından indüklenir ve tetiklenir. Ayrıca, IDD proinflamatuar sitokinlerin, değiştirilmiş omurga biyomekaniklerinin, anjiogenezin ve sinir büyümesinin salınmasıyla ilişkilidir, bu da ağrı hissini arttırır, tamamen kronik LBP'ye (aktif diskopati) neden olur6,8. Bugüne kadar, tedavi seçenekleri arasında diskektomi ve bitişik omurların sonraki füzyonu, IVD protezinin implantasyonu veya IDD9hastaları için steroidal olmayan antienflamatuar ilaçlar, opioidler ve kas gevşeticiler gibi cerrahi olmayan yaklaşımlar yer almaktadır. Cerrahi ve cerrahi olmayan mevcut standart terapötik seçenekler sadece kısmen etkilidir ve alttaki biyolojik sorunu ele alamaz9,10. Erken evre dejeneratif disk hastalığı, ilk inflamatuar doku yanıtı, özellikle tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-alfa) ifadesindeki artış ile karakterizedir11. Bu erken disk değişiklikleri öncelikle disk mimarisini bozmadan hücresel düzeyde meydana gelir ve daha önce pro-enflamatuar koşullar altında beslenme eksikliği ile taklit edilebilir12. Bu nedenle, bu dejenerasyon mekanizmalarını araştırmak ve uygun terapötik hedefleri bulmak için in vivo durumun hassas simülasyonu çok önemlidir. Ek olarak, moleküler özelliklerin bu simülasyonlarında, disklerin mekanik yükleme ortamı IVD'nin patolojik ve fizyolojik değişimlerinde önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, bu yaklaşımları birleştirmek, ivd'lerin karmaşık mikroçevrimini taklit etmek için bizi bir adım öne çıkaracaktır. Şu anda, en iyi bilgimiz olan pro-enflamatuar ve beslenme ayarı ile birlikte dinamik yüklemenin yönü göz önünde bulundurularak herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.
Büyük hayvan modelleri potansiyel ilgili in vivo etkileşimlerinin araştırılmasına izin verse de, maliyetlidir ve yoğun çalışırlar. Ayrıca, hayvan modellerinin araştırmada kullanılması uzun zamandır tartışma konusu olduğundan, önemli araştırma sorularını yanıtlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması büyük ilgi görüyor. Son olarak, şu anda IVD araştırmasında kimliği taklit etmek için ideal bir hayvan modeli yoktur13,14. Bu nedenle, IDD ve ilişkili enflamatuar ve dejeneratif süreçleri simüle etmek için bir organ kültürü modeli gibi uygun maliyetli ve güvenilir bir değiştirme oluşturmak gerekir. Son zamanlarda, erken evre intervertebral disk hastalığını simüle etmek için proinflamatuar ve dejeneratif bir organ kültürü modelinin kurulmasına ilişkin mevcut protokolün uygulanması, anti-enflamatuar ilaçların IDD organ kültüründeki etkisini araştırmamıza izin verdi15.
Burada, düşük besleyici ortam koşullarında tümör nekroz faktör-alfanın (TNF-α) doğrudan intradiskal enjeksiyonu ve bir biyoreaktörde dejeneratif yüklemenin neden olduğu katabolik ve proinflamatuar bir mikroçevre yoluyla sığırlar arası disklerin nasıl elde edildiğini ve erken evre IDD durumunun nasıl teşvik edildiğini açıklıyoruz. Şekil 1 deneysel modeli gösterir ve dejeneratif ve fizyolojik yükleme koşullarını simüle etmek için kullanılan biyoreaktörü gösterir.
Şekil 1: Deneysel kurulumun illüstrasyonu. A: sığır kuyruğu; B: parçalanmış sığır intervertebral diskler; C: diskin kültür ortamına sahip iyi bir plakaya aktarılması; D: simülasyonun bir biyoreaktöre yüklenmesi; E: intradiskal enjeksiyon tekniği; F: DAĞıTıMı ORTAYA ÇıKARMAK İçİn PBS/trypan mavi boya enjeksiyonundan sonra IVD. IDD: intervertebral disk dejenerasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, yerel asetoirlerden elde edilen sığır kuyrukları kullanılarak gerçekleştirildi. Mevcut çalışmada kullanılan biyolojik malzemeler besin zincirinden alınmaktadır ve İsviçre ve Avrupa hukukunda etik onay gerektirmez.
1. Sığırlar arası diskin diseksiyonu
- Yüzeydeki kir ve kılları temizlemek için tüm kuyruğu musluk suyuyla iyice durulayın.
NOT: Sağlam, distal uçlu, IVD'lerin istenen boyutuna bağlı olarak deneyler için kuyruk başına en fazla 9 IVD (koksikgeal 1-9) kullanılabilir. 15-20 mm arasında istenilen çapı göz önünde bulundurarak deneyler için kuyruk başına 5 IVD ile 12 sığır kuyruğu kullandık. - Tüm kuyruğu 10 dakika boyunca% 1 betadin çözeltisi içeren bir kutuya daldırin. Kuyruğu steril gazlı bezle kısaca kurulayın ve steril bir örtüye yerleştirin.
NOT: Diskin diseksiyonu sırasında, dehidrasyonu önlemek için kuyrukları Ringer'ın çözeltisi ıslatılmış gazlı bezle nemlendirin. Tüm diseksiyon prosedürü tamamlanana kadar kuyrukları (veya kalan parçaları) ıslak gazlı bezle sarılmış olarak saklayın. - SERUM'ların tanımlanmasını kolaylaştırmak için yumuşak dokuyu kaudal omurgadan mümkün olduğunca tamamen çıkarmak için bir neşter (No. 20) kullanın. Kemik çıkarma pensesi ile omurların dikenli ve enine işlemlerini çıkarın.
NOT: İstenilen çapa sahip IVD'leri seçin. Mevcut çalışmada 15-20 mm çap aralığına sahip IVD'ler kullanılmıştır. - Tek tek hareket segmentleri elde etmek için her omur gövdesinin ortasından kemik pense ile enine kesin. Hareket parçalarını Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezli bir Petri kabına koyun.
- IVD ve omurları palpasyonla ve hareket segmentlerini hafifçe hareket ettirerek bulun. IVD'lerin büyüme plakasında testere ile iki paralel kesim yapın, IVD'nin her iki tarafında bir tane. IVD'den omurlara doğru yaklaşık 0,5-1 mm güvenlik mesafesine sahip diske (yumuşak) bitişik kemikli uç plakası kısmının dışbükey bölgesine (sert) dokunarak ve bularak büyüme plakasının yerini belirleyin. Omurları keserken bant testeresinin bıçağının Ringer'ın çözeltisi ile soğutulduğundan emin olun.
- IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış temiz gazlı bezle temiz bir Petri kabına aktarın.
NOT: Gazlı bez nemlendirilmeli ve IVD'lerin şişmesini önlemek için çok ıslak olmamalıdır, - Omur gövdesini (kırmızı/pembe kemik), büyüme plakasını (beyaz kıkırdak) kazımak için neşter bıçağını kullanın, plakayı sağlam bırakın (sarı-pembe). Yükleme işlemi için iki yüzeyi düz ve paralel hale getirin. Kazınmış IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezli taze bir Petri kabına aktarın.
NOT: IVD'yi tutarken ve kazırken eli korumak için bir zincir posta eldiveni giyin. - Disk yüksekliğini ve çapını bir kaliperle ölçün. Omur kemiğindeki kan pıhtılarını jet lavaj sistemi kullanarak Ringer'ın çözeltisi ile temizleyin.
- IVD'leri tüp başına bir IVD olmak üzere 50 mL plastik tüplere aktarın. IVD başına 25 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) + %10 Penisilin/Streptomisin (P/S) ekleyin ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika sallanarak bırakın.
- Üstnatantı aspire edin ve IVD'leri durulamak için 2 dakika boyunca IVD başına 10 mL PBS +% 1 P/ S ekleyin.
2. IVD kültürü ve yükleme
- Diskleri IVD odalarına aktarın ve IVD kültür ortamı ekleyin (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, fizyolojik grup için 4,5 g/L yüksek glikoz DMEM ve patolojik grup için 2 g/M düşük glikoz DMEM) + %1 P/S + %2 fetal baldır serumu + %1 ITS (5 μg/mL insülin içerir, 6 μg/mL transferrin ve 5 ng/mL selenious asit) + 50 μg/mL askorbat-2-fosfat + %1 esansiyel olmayan amino asit + birincil hücreler için 50 μg/mL antimikrobiyal ajan) ve 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin, %85 nem ve %5 CO2.
- Diskleri deneysel gruplara göre bir biyoreaktör sistemi içinde 4 gün boyunca kültüre edin16. Patolojik grupta, dejeneratif yükleme koşullarını 0.32-0.5 MPa, 2 saat / gün için 5 Hz'de koruyun. Fizyolojik kontrol grubunda, 2 saat / gün için 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz yükleme protokolü kullanın.
NOT: Yükleme işlemleri sırasında IVD'leri 5 mL IVD ortamı içeren bölmelere yerleştirin. Hacim, biyoreaktörün yükleme odalarının boyutuna bağlıdır. Yükleme prosedürleri arasında, SERBEST şişme geri kazanımı için IVD'leri 7 mL IVD kültür ortamına sahip altı kuyulu plakalara yerleştirin. - Deneysel dönemde disk yüksekliğindeki değişiklikleri analiz etmek için, disk yüksekliğini IVD diseksiyondan sonra (taban çizgisi) sonra ve serbest şişme döneminden sonra ve deneysel süre boyunca dinamik yüklemeden sonra günlük olarak bir kaliper ile ölçün.
3. İntradiskal tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) enjeksiyonu
- 1. gündeki ilk dinamik yükleme döngüsünden hemen sonra, IVD'leri dikey bir konumda bir Petri kabına yerleştirin ve IVD'leri bir cımbızla stabilize edin.
- Patolojik grubun çekirdek pulposus dokusuna 30-gauge insülin iğnesi ile rekombinant TNF-α (IVD başına 70 μL PBS'de100ng) enjekte edin. 1 dakikada yaklaşık 70 μL hızında yavaşça enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, şırıngayı IVD'nin yarısına kadar çekin ve iğneyi ve şırıngayı IVD'den tamamen çıkarmadan önce enjekte edilen çözeltinin geri sızmasını önleyen bir vakum oluşturmak için şırınga pistonu çekin.
NOT: Yükleme ve geceleme kültüründen sonra enjekte edilen çözeltinin dağılımını değerlendirmek için trypan mavi boya içeren PBS enjekte ederek bir pilot deney gerçekleştirin.
4. Gen ifadesi
- 4. günde IVD'leri hasat edin. Çekirdek pulposus (NP) dokusunu (IVD'nin ortasında jelli kısım) biyopsi zımbası ile toplayın. Dış annulus fibrosus 'u (AF) neşter bıçağıyla (No.20) toplayın.
NOT: 0. günde taban çizgisi referansı için, RNA ekstraksiyonu için diseksiyondan hemen sonra dokuları toplayın. - Deneysel tasarıma bağlı olarak gen ekspresyon analizi için gereken NP veya AF dokusu miktarını kullanın.
NOT: Mevcut deneyler için yaklaşık 150 mg doku kullanılmıştır. Verimli ekstraksiyon için RNA izolasyon çözeltisinin doku kütlesine oranı 100-150 mg doku başına en az 2 mL olmalıdır. - NP veya AF dokusunu sindirim çözeltisi ile sindirin (DMEM'de% 0.2 pronaz, filtre sterilize) ve manyetik karıştırma ile 37 ° C'de 1 saat kuluçkaya yatır18.
- Sıvı nitrojen kullanarak doku örneklerini flash-freeze ve ince bir toz toz haline getirin. Toz haline getirilmiş doku tozunu, monofaz çözeltisinde (RNA izolasyon çözeltisi) her biri 1 mL guanidin tiyosiyanat ve fenol içeren iki adet 2 mL tüpe eşit olarak bölün.
- Homojenizasyonu RNA izolasyon çözeltisi ve toz haline getirilmiş doku tozu içeren 2 mL tüplerde gerçekleştirin. Doku tozlarını 8 mm paslanmaz çelik bilye ve 30 Hz'de bir doku-lyzer ile 3 dakika boyunca homojenize edin. 12.000 x g,4 °C'de 10 dakika santrifüj ve süpernatantı taze bir tüpe aktarın. Süpernatantlar en az bir ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
- 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına 0,1 mL 1-bromo-3-kloropropan (BCP) ekleyin ve 15 sn boyunca kuvvetlice çalkalayın. Elde ettiği karışımı oda sıcaklığında 15 dakika yörüngesel çalkalayıcıda ve santrifüjü 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika saklayın.
NOT: RNA sadece üst sulu fazda kalır. - Sulu fazı taze bir tüpe aktarın ve ilk homojenizasyon için kullanılan 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına 0,25 mL izopropanol ve 0,25 mL yüksek tuz çökeltme çözeltisi ile RNA'yı çökeltin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda ve santrifüjde 12.000 x g'da 4 °C'de 8 dakika saklayın.
NOT: Alternatif olarak, genellikle daha yüksek RNA saflığına ancak daha düşük RNA verimine yol açan sütun tabanlı RNA çıkarma yöntemini kullanın. - Süpernatant çıkarın ve RNA peletini ilk homojenizasyon için kullanılan 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına% 75 etanol 1 mL ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüj.
- Etanol yıkamayı çıkarın ve 3-5 dakika boyunca kısa bir süre hava kuru rna pelet. Çözeltiyi bir pipet ucundan birkaç kez geçirerek ve 55-60 ° C'de 10-15 dakika kuluçkaya yatırarak RNA'yı 20 μL dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış suda çözün.
- Absorbansı 230 nm, 260 nm ve 280 nm (sırasıyla A230, A260 ve A280) olarak ölçün. 1.0'ın A260'ı 40 μg/mL RNA'ya karşılık gelir. 1,6-1,9 A260/A280 oranı beklenirken, kontaminasyon 1,6 < A260/A280 oranı ile sonuçlanır.
- 20 μL reaksiyon hacmi için ters transkriptaz (RT) reaksiyon karışımı hazırlayın. Karışım RT enzim karışımı, ribonikleaz inhibitörü, yardımcı protein, primerler, dNTP'ler, MgCl2, RNaz içermeyen su ve 0.4 μg RNA örneği içerir.
- Tüpün altındaki tüm bileşenleri karıştırmak için RT tüplerini kısaca santrifüjlayın.
- Numuneleri termosikler cihazına yerleştirin. RT için uygun programı seçin. RT'yi 25 °C'de 10 dakika çalıştırın, ardından 42 °C'de 120 dakika boyunca ters transkripsiyon adımı ve 85 °C'de 5 dakika boyunca ters transkriptazın devre dışı bırakılması, sonunda 4 °C'ye kadar soğutun.
- Elde edilen cDNA'yı Tris (hidroksimetil)aminometan (Tris)-etileniaminetetraasetik asit (EDTA) (TE) tamponu (1 mM EDTA ile 10 mM Tris) ile 100 μL cDNA çözeltisi başına RT için kullanılan 0,4 μg RNA nihai konsantrasyona seyreltin. CDNA örneklerini -20 °C'de saklayın.
- 10 μL reaksiyon hacmi kullanarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. Reaksiyon hacmi ana karışımı içerir (DNA polimeraz, urasil-DNA glikosilaz içerir, dUTP, pasif referans ve optimize tampon bileşenlerine sahip dNTP'ler), ileri astar 45 μM, ters astar 45 μM, prob 12,5 μM (probun 5' ucuna bağlı bir muhabir boyası, probun 3' ucunda küçük bir oluk bağlayıcısı ve probun 3' ucunda bir floresan olmayan quencher içerir) , 2 μL cDNA ve DEPC arıtıcı su.
- 2-ΔΔCT yöntemi19ile göreli niceleme için endojen bir denetim (RPLP0) çalıştırın.
- Yinelenenlere örnekler ekleyin ve cDNA yerine TE arabelleği ekleyerek şablon denetimi çalıştırmayın. PCR'yi standart koşullarda çalıştırın (50 °C'de 2 dk, 95 °C'de 10 dk, 95 °C'de 15 sn'lik 40 döngü ve 60 °C'de 1 dk).
- Karşılaştırmalı BT yöntemini izleyerek mRNA hedeflerinin göreli nicelemesini gerçekleştirin. Taban çizgisi örneğine normalleştirilen mRNA miktarı 2-ΔΔCTolarak hesaplanırken, ΔΔCT, numunenin ΔCT (CT hedefi- CT endojen kontrolü) ile taban çizgisi örneğinin ΔCT (CT hedefi ve CT endojen kontrolü) arasındaki farktır.
5. IVD ortamında protein içeriğinin ölçülmesi
- Ortamdaki protein içeriğini ölçmek için IVD örnekleri tarafından koşullandırılmış ortamı toplayın. Hedef proteinin protokolüne göre enzime bağlı immünorbent test (ELISA) gerçekleştirin.
- Sığır interlökin-8 (IL-8), üreticinin talimatına göre sığır karşıtı IL8 ELISA kiti ile ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Düşük glikoz ortamında dejeneratif yükleme, TNF-α enjeksiyonu ile birlikte proinflamatuar belirteçlerin interlökin 6 (IL-6) ve interlökin 8 (IL-8) gen ekspresyonunun 4 günlük kültürden sonra NP hücrelerindeki fizyolojik kontrol grubuna göre önemli ölçüde artmasına neden oldu (Şekil 2). Buna karşılık, NP hücrelerinde proinflamatuar genler interlökin 1β (IL-1β) ve TNF-α için önemli değişiklikler gözlemlemedik (veriler gösterilmedi). Ayrıca, dejeneratif kültür koşulları AF hücrelerinde IL-6 ve IL-8'in gen ekspresyonlarını değiştirmedi.
Şekil 2: Çekirdek pulposus (NP) dokusunda ve annulus fibrosus (AF) dokularında gen ekspresyon düzeyleri. Bunlar fizyolojik veya patolojik kültür durumu altında 4 günlük kültürden sonra ölçüldü, taban çizgisine normalleştirildi (gün 0). %95 güven aralığı ± anlamına gelir n=8, **p<0.01. Bu rakam20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gen ekspresyon bulguları ile uyumlu olarak, ortamdaki IL-8 protein içeriği fizyolojik duruma göre 2 gün 4 gün sonra belirgin bir artış göstermiştir (Şekil 3). Bununla birlikte, 3. günde yapılan ölçümler (serbest şişme veya yüklemeden sonra) çalışma grupları arasında önemli bir fark olmadığını ortaya koydu, ancak sonuçlar dejeneratif grup için daha yüksek değerler gösterdi.
Şekil 3: Serbest şişme kültürü (FS) ve dinamik yükleme (Yük) sonrasında IVD kültür ortamında pro-enflamatuar protein IL-8 salınımının nicelleştirilmesi. Sonuçlar, normalleşme olmadan ortamda ng/mL'deki orijinal konsantrasyonlar olarak gösterilir. Ortalama ± %95 güven aralığı, n=8, **p<0.01. Bu rakam20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Diseksiyondan sonra DH olarak normalleştirilen disk yüksekliği (DH) değişiklikleri Şekil 4'te gösterilmiştir. Yükleme sonrası DH azalmaları fizyolojik gruplara göre dejeneratif grup için daha yüksek değerler (yani daha fazla yükseklik azalması) ortaya çıkarken, çalışma grupları arasında serbest şişlik döneminden sonra disk yüksekliği kazanımlarında herhangi bir farklılık görülmedi. Bu, yükleme işleminden sonra patolojik ve fizyolojik grup arasındaki disk yüksekliği değişimlerindeki farkın daha yüksek olduğunu gösterdi. Ayrıca, farklılıklar 2 ve 3. günlerdeki ölçümlere kıyasla 1 gün sonra daha az belirgindi ve bu da dejeneratif ve enflamatuar durumların ilerleyici bir etkisini gösteriyordu.
Şekil 4: Disk yüksekliği temel değerlere normalleştirilmiş olarak değişir (diseksiyondan sonra). Ortalama ± %95 güven aralığı. FS: serbest şişlik. N=10, ***s<0.001. Bu rakam20'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada dejeneratif ve inflamatuar IVDD'yi simüle etmek için ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu protokol, disk üzerindeki yıkıcı etkilere yol açan enflamatuar yolların ayrıntılı muayeneleri için uygulanabilir. Ayrıca, protokol hastalığın ilerlemesinde rol oynayan umut verici terapötik hedefleri belirlemeye yardımcı olabilir.
Son zamanlarda gösterdik ki insan rekombinant TNF-α hem sığır hem de insan NP hücrelerinde iltihaplanmaya neden olabilir21TNF-α IVD hücrelerinde iltihap simülasyonu için kullanılabileceğini doğrulayan alandaki diğer çalışmalara uygunolarak 22,23. Bu çalışmada inflamasyonu indük etmek için IVD başına 100 ng TNF-α dozu kullanılmıştır. Bu doz, dejeneratif yükleme ve sınırlı beslenme ile birlikte uygulandığında enflamatuar belirteçlerin etkili indüksiyonunu gösterdi15,20. IVD dejenerasyonunun tek başlangıç faktörü olarak TNF-α kullanılarak yapılan yeni bir çalışmada, IVD 21'deki inflamatuar ve dejeneratif değişikliklerin indüksiyonu için etkili bir doz olarak100ng TNF-α / cm3 disk hacmi eşiği belirlenmiştir. İltihaplanmaya neden olmak için kullanılan TNF-α dozunun tekrarlanabilir etkiler için diskin hacmine normalleştirilmesi önermektedir. Ayrıca, ENJEKSIYON malzemesinin IVD'de iyi bir dağılımının olması ve bu enjeksiyonun sonraki deneylerde yeterince tekrarlanabilir olması sağlanmalıdır. Enjeksiyon basıncı bireyler arasında değişebileceğinden, farklı deneylerde aynı çalışma grupları arasında malzemenin farklı dağılımları olabilir. Eşit dağılımı incelemek için seçtiğimiz bir yaklaşım PBS seyreltilmiş trippan mavi enjeksiyonları kullanmaktı. Enjeksiyon tekniğinin, örneğin enjeksiyon pompaları ve önceden tanımlanmış ve tekrarlanabilir enjeksiyon oranları ile standart hale yapılması önerilir. Daha önce gösterildiği gibi, IVD'ye 22-gauge, 25-gauge veya 30-gauge iğneler ile tek bir iğne delinmesi, çalışma sonuçları20 , 21,24,25ile etkileşime giren bir etkiye neden olmadı. Enjekte edilecek maddenin hacmi ve enjeksiyon için kullanılan iğne boyutu için disk boyutunun göz önünde bulundurulmasının önerilir. Ayrıca, birden fazla tekil enjeksiyondan kaynaklanan potansiyel dejeneratif etkileri önlemek için tek bir enjeksiyon kullanılması önerilir21,26.
Mevcut modelin bazı sınırlamalarının ele alınması gerekir. IVD'lerin yüklenmesi, şu anda IDD üzerinde çalışan birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunmayan biyoreaktörlere erişim gerektirir. Bununla birlikte, preklinik IVD dejenerasyon modellere olan ihtiyaç artmaktadır. Organ kültürü modelleri, hayvan modellerine olan ihtiyacı azaltmanın etik faydalarını getirir ve dejeneratif stimülasyonun tekrarlanabilirliği ve hayvan deneyleriyle ilişkili maliyetlerdeki azalmalar göz önüne alındığında biyoreaktör maliyetlerine tek seferlik yatırım uygun olabilir. Bununla birlikte, bağışıklık sisteminin rolü gibi bazı in vivo etkileşimler, sağlanan organ kültürü modeli ile simüle edilemez. Ayrıca, sinir sinyallerinin ölçümü ve hayvan modellerinde mümkün olacak ağrının değerlendirilmesi şu anda mevcut modelle düşünülemez. Kuyruk IVD'lerinin mekanik özelliklerinin insan IVD'leri ile karşılaştırılabilir olup olmadığı konusunda bazı endişeler dile getirildi, çünkü dik omurga pozisyonu insanlarda benzersizdir28. Hücre yoğunluğu, notochordal hücre eksikliği, biyokimyasal bileşim29,30 ve sığır kaudal IVD'lerin bükülme, uzatma, burulma vebükülme 31hareket aralığı gibi mekanik özellikleri gibi sığır kuyruğu IVD'lerin anatomik ve moleküler özellikleri insan IVD'lerine çok benzer. Özellikle, insan IVD'leri son zamanlarda organ kültürü modelleri için giderek daha fazla ilgi görüyor28. Ex vivo modellerindeki insan kadavra IVD'leri, klinik olarak daha alakalı olan tür farklılıklarını önleyebilecekleri için oldukça verimli olarak kabul edilir32. Abattoirlerden elde edilen sığır IVD kuyruklarının aksine, bu, insan IVD'lerinin 24 saat ölüm sonrası naklini ve böylece yerel organ nakli yasalarını takiben etik onayıgerektirecektir 28. Mevcut yöntem diğer türlere de kolayca uyarlanabilir.
Tekniğin diğer ex vivo kültür yöntemlerine kıyasla en büyük avantajlarından biri, dejeneratif disklerin erken evresini daha iyi simüle etmek için intradiskal enjeksiyon, patolojik orta koşullar ve zararlı yüklemenin kombinasyonudur. Walter ve ark.23, IVD'lere enjeksiyon yerine dinamik olarak yüklenen sığır IVD'leri ortamında TNF-alfa kullandı ve sonuçlarımıza uygun olan annulus fibrosusuna kıyasla TNF-alfanın ortamdan çekirdeğe pulposus'a daha fazla taşındığı görüldü. Disk mimarisinde büyük bozulmalar olmadan hücresel düzeyde meydana gelen IDD'nin erken aşamalarını simüle etmeyi hedeflediğimiz için12, TNF-alfa konsantrasyonlarını,12 , 22,23kimliklerinin erken aşamalarını simüle etmek için ortamda TNF-alfa kullanarak önceki organ kültürü çalışmalarına dayanarak seçtik. Çalışma sorusuna bağlı olarak istenen dejeneratif disk durumunu simüle etmek için diğer inflamatuar uyarıcıların ve daha yüksek TNF-alfa konsantrasyonlarının kullanımı test edilebilir. Daha yüksek TNF-alfa konsantrasyonları, Ponnappan ve ark. 12 Tarafından önerildiği gibi disk dejenerasyonu sırasında mevcut olan sistemik bağışıklık düzenleyici geri bildirimlerin eksikliğini daha iyi telafi edebilir.12 Düşük glikozlu zararlı ortam koşullarının kullanımı, beslenmeyle sınırlanan medya ve TNF-alfa maruziyetinin erken disk dejenerasyonu durumunda mevcut olan moleküler değişim özelliklerini taklit ettiğini gösteren önceki çalışmalara dayanıyordu12,27. Bu nedenle, yaklaşım erken dejeneratif disk hastalığının bir ex vivo organ kültürü modelinde önceki çalışmaların sağladığı kanıtları birleştirir.
Bu protokol birkaç şekilde daha da geliştirilebilir. Yükleme ve serbest şişme süresinin süresi ve kapsamı istenilen çalışma planına göre seçilebilir. İnflamatuar veya dejeneratif stimülasyonların disk dejenerasyonu üzerindeki uzun vadeli etkileri yüksek klinik ilgi alanına sahiptir ve mevcut protokol ile gerçekleştirilebilir. Sadece IDD11'inerken durumu için son derece alakalı olduğu düşünülen seçilmiş genleri kullandık. Bu modelin ek doğrulanması, omik yaklaşımları gibi genlerin ve proteinlerin geniş bir değerlendirmesini içerebilir. Sonuç olarak, istenen dejeneratif duruma bağlı olarak, dejeneratif yükleme ile birlikte diğer enflamatuar faktörler araştırılabilir. Örneğin, lipopolisakkarit enjeksiyonlarının IVD33'teiltihabı uyardığı gösterilmiştir. İstenilen çalışma sorusu için en uygun enflamatuar uyarıcıyı bulmak için mevcut protokolle farklı enflamatuar uyarıcıların karşılaştırılması yapılabilir. Seçilen enflamatuar belirteçlerin (IL-6, IL-8), anabolik belirteçlerin (aggrecan, kollajen) ve katabolik belirteçlerin (matris metallopeptidazlar, trombospondin motifli bir disintegrin ve metalloproteinaz) değişikliklerini bugünkü protokol20ile değerlendirdik. Tüm gen ekspresyon profili değişebileceğinden, gelecekteki incelemeler disk dejenerasyon tanısı için yeni biyobelirteçleri ve erken biyolojik müdahale için terapötik hedefleri belirlemek için yeni nesil RNA dizileme tekniklerini içerebilir. Ayrıca, histoloji, immünohistokimyasal boyama, hücre dışı matris bileşenlerinin biyokimyasal ölçümleri (glikozaminojlikanlar, GAG'ler gibi) ve dinamik basınç testleri gibi diğer metodolojiler, IVD'lerin biyolojik, biyokimyasal ve biyomekanik özelliklerini mevcut modelle daha fazla analiz etmek için yapılabilir. Başka bir olası analitik yol, dış AF34 , 35için gen ifade belirteçleri olarak bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α ve MKX kullanarak dış AF ve NP dokusu üzerindeki etkiyi ayrı ayrı analiz etmek olacaktır. New Orleans'taki 2014 Yıllık ORS Toplantısı'nda Omurga Araştırma İlgi Grubu, sağlıklı NP fenotipik belirteçleri takiben önerildi: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan/collagen II oranı >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 ve CD2436. NP belirteç genleri bBrachyury/T ve bSecreted frizzled ile ilişkili protein 2, NP'yi sığır IVD34'tekiiç ve dış AF dokusundan ayıran en ikna edici genlerdi. Ayrıca, NP'nin sGAG içeriğinin dış AF34'ekıyasla önemli ölçüde daha yüksek olduğu bildirilmiştir.
Sonuç olarak, bu yeni proinflamatuar ve dejeneratif IVD organ kültürü modeli, son derece alakalı bir 3D mikroçevrimde erken aşama IDD'yi simüle etmek için ilgili koşulları sağlar. Elbette, mevcut protokol müfettişin hedeflerine göre daha da değiştirilebilir. Ayrıca, modelimiz gerekli çalışma hayvanlarının sayısını azaltabilir ve böylece 3R azaltma, değiştirme, rafine etme ilkelerini tamamen yansıtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma AO Foundation ve AOSpine International tarafından desteklendi. Babak Saravi, Alman Omurga Vakfı ve Alman Osteoartrit Vakfı'ndan burs desteği aldı. Gernot Lang, Almanya Freiburg Üniversitesi Tıp Fakültesi İleri Klinisyen Bilim adamları için Berta-Ottenstein-Programı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
