Summary
هنا نقدم بروتوكولا للتحقيق التنقل أيون التوصيل المجهر (HPICM)، وهي تقنية مسبار المسح الضوئي غير الاتصال الذي يسمح التصوير النانوي من حزم مجسمة في خلايا الشعر السمعية الحية.
Abstract
خلايا شعر الأذن الداخلية الكشف عن التشريد الناجم عن الصوت ونقل هذه المحفزات إلى إشارات كهربائية في حزمة الشعر التي تتكون من ستيريوسيليا التي يتم ترتيبها في صفوف من ارتفاع متزايد. عندما يتم تحويل stereocilia، فإنها سحب على صغيرة (~ 5 نانومتر في القطر) طرف خارج الخلية يربط ستيريوسيليا، والتي تنقل القوات إلى قنوات نقل حساسة ميكانيكيا. على الرغم من أن الميكانوترانسدوكشن قد درس في خلايا الشعر الحية لعقود، فإن التفاصيل الهيكلية الفائقة المهمة وظيفيا لآلات النقل الميكانيكي على نصائح من المجسمة (مثل ديناميات وصلة تلميح أو إعادة عرض المجسمة المعتمدة على النقل) لا يزال من الممكن دراستها فقط في الخلايا الميتة مع المجهر الإلكتروني. نظريا، تقنيات مسبار المسح الضوئي، مثل المجهر القوة الذرية، لديها ما يكفي من الدقة لتصور سطح المجسمة. ومع ذلك ، بغض النظر عن وضع التصوير ، حتى أدنى اتصال من مسبار المجهر القوة الذرية مع حزمة مجسمة عادة ما يضر حزمة. هنا نقدم بروتوكول مفصل للقفز التحقيق أيون التوصيل المجهري (HPICM) التصوير من خلايا الشعر السمعي القوارض الحية. تسمح تقنية مسبار المسح الضوئي غير التلامسية هذه بتصوير سطح الخلايا الحية بطيوغرافيا معقدة ، مثل خلايا الشعر ، بدقة نانومتر واحدة ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يستخدم HPICM تيارا كهربائيا يمر عبر النانوبايت الزجاجي للكشف عن سطح الخلية بالقرب من المصصة ، في حين يقوم نظام كهرومغناطيس ثلاثي الأبعاد بمسح السطح وتوليد صورته. مع HPICM ، تمكنا من تصوير حزم stereocilia والروابط التي تربط ستيريوسيليا في خلايا الشعر السمعية الحية لعدة ساعات دون ضرر ملحوظ. نتوقع أن استخدام HPICM سيسمح بالاستكشاف المباشر للتغيرات الهيكلية الفائقة في الاستريوفيلية لخلايا الشعر الحية لفهم أفضل لوظيفتها.
Introduction
على الرغم من حقيقة أن حزم المجسمة في خلايا الشعر السمعية كبيرة بما يكفي لتصورها عن طريق المجهر البصري وانحرافها في الخلايا الحية في تجربة المشبك التصحيح ، يمكن تصوير المكونات الهيكلية الأساسية لآلات النقل مثل روابط البقشيش فقط مع المجهر الإلكتروني في الخلايا الميتة. في خلايا الشعر السمعي الثديي ، تقع آلات النقل في الطرف السفلي من روابط الطرف ، أي على أطراف الصف الأقصر stereocilia1 وتنظم محليا من خلال الإشارات على نصائح من stereocilia2،3. ومع ذلك ، فإن التصوير الخالي من التسمية للهياكل السطحية في هذا الموقع في خلايا الشعر الحية غير ممكن بسبب الأحجام الصغيرة من الاستريوسيليا.
القوقعة الثديية لديها نوعين من الخلايا الحسية السمعية: خلايا الشعر الداخلية والخارجية. في خلايا الشعر الداخلية، ستيريوسيليا أطول وأكثر سمكا بالمقارنة مع تلك الموجودة في خلايا الشعر الخارجي4. الصف الأول والثاني من ستيريوسيليا يبلغ قطرها 300-500 نانومتر في الماوس أو الفئران خلايا الشعر الداخلية. نظرا لحيود الضوء ، فإن الحد الأقصى للدقة القابلة للتحقيق باستخدام مجهر بصري خال من التسمية هو حوالي 200 نانومتر. وبالتالي ، فإن تصور المجسمة الفردية داخل الصفين الأول والثاني من حزمة خلايا الشعر الداخلية أمر سهل نسبيا مع المجهر البصري. في المقابل، أقصر صف مجسمة في خلايا الشعر الداخلية وجميع مجسمة من خلايا الشعر الخارجي لها أقطار حول 100-200 نانومتر ولا يمكن تصور مع المجهر البصري5. على الرغم من التقدم الأخير في التصوير فائق الدقة ، إلا أن هذا القيد الأساسي لا يزال قائما في أي تصوير بصري خال من التسمية. جميع التقنيات المتاحة تجاريا الحالية فائقة الدقة لا تتطلب نوعا من جزيئات الفلورسنت6، مما يحد من تطبيقاتها. بالإضافة إلى القيود بسبب الحاجة إلى جزيئات محددة الموسومة الفلورسنت، وقد ثبت التعرض للإشعاع الضوء المكثف للحث على الضرر الخلوي، ويمكن أن تؤثر على العمليات الخلوية، وهو عيب كبير عند دراسة الخلايا الحية7.
وقد تم الحصول على معرفتنا الحالية من التفاصيل ultrastructural من حزم مجسمة خلايا الشعر في الغالب مع مختلف تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) ، مثل المسح المجهري الإلكتروني (SEM)، المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، تجميد كسر EM، ومؤخرا مع تقنيات 3D مثل تقسيم المسلسل مع شعاع أيون مركزة أو التصوير المقطعي cryo-EM8،9،10،11،12،13، 14،15،16. لسوء الحظ، تتطلب جميع تقنيات EM هذه إزالة كيميائية أو التبريد للعينة. اعتمادا على النطاق الزمني للظواهر ، وهذا الشرط يجعل دراسة العمليات الديناميكية في نصائح من stereocilia إما مستحيلة أو كثيفة العمالة جدا.
بذلت جهود محدودة لتصوير حزم الشعر من خلايا الشعر الحية مع المجهر القوة الذرية (AFM)17،18. منذ AFM يعمل في الحلول الفسيولوجية، فإنه يمكن، من الناحية النظرية، تصور التغيرات الديناميكية في حزم ستيريوسيليا من خلايا الشعر الحية مع مرور الوقت. تكمن المشكلة في مبادئ AFM عالية الدقة ، والتي تنطوي على اتصال جسدي معين بين مسبار AFM والعينة ، حتى في وضع "التنصت" الأقل ضررا19. عندما يواجه مسبار AFM مجسما ، فإنه عادة ما يصطدم به ، مما يضر ببنية حزمة الشعر. ونتيجة لذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لتصور العيش، أو حتى ثابتة، حزم خلايا الشعر17،18. قد يتم تخفيف المشكلة جزئيا باستخدام مسبار AFM كبير على شكل كرة يفرض فقط القوى الهيدروديناميكية على سطح العينة20. ومع ذلك ، على الرغم من أن مثل هذا المسبار مناسب بشكل مثالي لاختبار الخصائص الميكانيكية للعينة21، فإنه يوفر فقط دقة دون ميكرومتر عند تصوير جهاز Corti22 ولا يزال ينطبق على العينة قوة قد تكون كبيرة لحزم الاستريوميليا الحساسة للغاية.
المسح المجهري توصيل أيون (SICM) هو نسخة من المسح المجهري التحقيق الذي يستخدم مسبار ماصة زجاجية مليئة محلول موصل23. يكتشف SICM السطح عندما تقترب المصصة من الخلية وينخفض التيار الكهربائي من خلال المصصة. وبما أن هذا يحدث قبل لمس الخلية ، فإن SICM مناسب بشكل مثالي للتصوير غير الاتصالي للخلايا الحية في الحل الفسيولوجي24. أفضل قرار من SICM هو على ترتيب نانومتر واحد، والذي يسمح حل مجمعات البروتين الفردية في غشاء البلازما من خلية حية25. ومع ذلك ، على غرار تقنيات مسبار المسح الأخرى ، فإن SICM قادر على تصوير الأسطح المسطحة نسبيا فقط. تغلبنا على هذا القيد عن طريق اختراع القفز مسبار أيون المجهر التوصيل (HPICM)26، الذي يقترب nanopipette العينة في كل نقطة التصوير(الشكل 1A). باستخدام HPICM، كنا قادرين على صورة حزم stereocilia في خلايا الشعر السمعية الحية مع دقة نانوية27.
ميزة أساسية أخرى لهذه التقنية هي أن HPICM ليست فقط أداة تصوير. على النقيض من تقنيات مسبار المسح الضوئي الأخرى ، فإن مسبار HPICM / SICM هو قطب كهربائي يستخدم على نطاق واسع في فسيولوجيا الخلايا للتسجيلات الكهربائية والتسليم المحلي لمختلف المحفزات. نشاط قناة أيون لا تتداخل عادة مع التصوير HPICM، لأن التيار الكلي من خلال التحقيق HPICM هو عدة أوامر من حجم أكبر من التيار خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة أكبر القنوات الأيونية25. ومع ذلك، HPICM يسمح تحديد المواقع الدقيقة للnanopipette على هيكل من الاهتمام وتسجيل التصحيح المشبك قناة واحدة لاحقة من هذا الهيكل28. هذه هي الطريقة التي حصلنا على التسجيلات الأولية الأولى من نشاط قناة واحدة في نصائح من خلية الشعر الخارجي stereocilia29. ومن الجدير بالذكر أنه حتى تيار كبير من خلال nanopipette لا يمكن أن تنتج تغييرات كبيرة في الإمكانات عبر غشاء البلازما بسبب تحويلة كهربائية هائلة من المتوسط خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تنشيط القنوات الأيونية الفردية ميكانيكيا عن طريق تدفق السائل من خلال nanopipette30 أو كيميائيا عن طريق التطبيق المحلي لناهض31.
في HPICM، يتم إنشاء الصورة عندما تقترب nanopipette من العينة بشكل تسلسلي عند نقطة واحدة، وتتراجع، ثم تتحرك في اتجاه الجانبي لتكرار النهج (الشكل 1A). مكبر للصوت المشبك التصحيح ينطبق باستمرار الجهد إلى سلك AgCl في ماصة (الشكل 1B) لتوليد تيار من ~ 1 ن أ في حل الحمام. يتم تحديد قيمة هذا التيار عندما يتم تحديد ماصة بعيدا عن سطح الخلية كتيار مرجعي (أناالمرجع، الشكل 1C). ثم ينتقل المواسير في المحور Z للاقتراب من العينة حتى يتم تقليل التيار بمقدار معرف مسبقا من قبل المستخدم (نقطة تعيين)، وعادة 0.2٪-1٪ من المرجع الأول (الشكل 1C، تتبع أعلى). ثم يحفظ النظام قيمة Z في هذه اللحظة كطول العينة، جنبا إلى جنب مع إحداثيات X و Y لنقطة التصوير هذه. ثم يتم سحب ماصة بعيدا عن السطح(الشكل 1C،تتبع أسفل) بسرعة يحددها المستخدم، وعادة 700-900 نانومتر / مللي ثانية. بعد التراجع ، يتم نقل ماصة (أو ، في حالتنا ، العينة - انظر الشكل 1B)أفقيا إلى نقطة التصوير التالية ، ويتم الحصول على قيمة مرجعية جديدة الحالية ، ويقترب المصصة مرة أخرى من العينة ، وتكرار العملية. ويفضل حركة X-Y من ماصة في إعداد المجهر تستقيم التي تستخدم عادة لتسجيلات تيارات خلية الشعر mechanotransduction. في هذا الإعداد، يقترب مسبار HPICM من حزم خلايا الشعر ليس من الأعلى ولكن بزاوية32. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل دقة للتصوير HPICM في إعداد المجهر المقلوب(الشكل 1A، B) ، حيث يتم إزالة حركة العينة في اتجاهات X-Y من حركة Z من nanopipette ، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية الميكانيكية المحتملة.
باستخدام HPICM، حصلنا على الصور الطبوغرافية من الماوس والفأر الداخلية والخارجية حزم ستيريوسيليا خلية الشعر، وحتى تصور الروابط بين ستيريوسيليا التي هي حوالي 5 نانومتر في القطر26،27. نجاح التصوير حزمة خلايا الشعر مع هذه التقنية يعتمد على عدة عوامل. أولا، يجب أن يكون الضجيج (التباين) لتيار nanopipette صغيرا قدر الإمكان للسماح بأقل نقطة تعيين ممكنة للتصوير HPICM. تسمح نقطة تعيين منخفضة للتحقيق HPICM ب "استشعار" سطح ستيريوسيليا على مسافة أكبر وفي أي زاوية لنهج المسبار ، ومن المدهش أنه يحسن دقة X-Y للتصوير HPICM (انظر المناقشة). ثانيا، ينبغي تخفيض الاهتزازات والانجرافات في النظام إلى أقل من 10 نانومتر، لأنها تسهم مباشرة في القطع الأثرية التصوير. وأخيرا، على الرغم من أن المسبار HPICM ومرحلة العينة يتم نقلها في محاور Z و X-Y بواسطة مشغلات بيزو التي يتم التحكم فيها من خلال التغذية المرتدة التي تحتوي على دقة نانومتر واحد أو أفضل، فإن قطر طرف nanopipette يحدد انتشار التيار (حجم الاستشعار) وبالتالي القرار (الشكل 1A). لذلك ، قبل تصوير خلايا الشعر الحية ، من الضروري سحب المصايب الكافية ، والوصول إلى الدقة المطلوبة مع عينات المعايرة ، وتحقيق ضوضاء منخفضة في نظام التسجيل.
على الأقل بضعة عقود، تقنية SICM لم تكن متاحة تجاريا، وأنها قد تم تطويرها من قبل عدد قليل فقط من المختبرات في العالم مع المختبر الرائدة من البروفيسور كورشيف في الكلية الإمبراطورية (المملكة المتحدة). في الآونة الأخيرة، أصبحت العديد من أنظمة SICM متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)،وكلها تستند إلى مبادئ HPICM الأصلية. ومع ذلك ، فإن حزم التصوير المجسمة في خلايا الشعر تتطلب العديد من التعديلات المخصصة التي تشكل تحديا تقنيا (أو حتى مستحيلا) في أنظمة "الجاهزة" المغلقة. لذلك، هناك حاجة إلى بعض التكامل بين المكونات. منذ إعداد HPICM يمثل تلاعب المشبك التصحيح مع الاهتزاز أكثر صرامة ومتطلبات الانجراف وحركة بيزو يحركها من المسبار HPICM والعينة (الشكل 1D)، وهذا التكامل من السهل نسبيا لأي باحث، الذي يتقن في لقط التصحيح. ومع ذلك ، فإن عالما من دون خلفية مناسبة تحتاج بالتأكيد بعض التدريب في علم الفيزيولوجيا الكهربائية أولا. على الرغم من التحديات المتبقية مثل زيادة سرعة التصوير (انظر المناقشة)، تمكنا من تصوير حزم stereocilia في خلايا الشعر الحية بدقة نانوية دون إتلافها.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير HPICM ناجح لحزم خلايا الشعر السمعية الحية في الفئران الصغيرة بعد الولادة أو النباتات الخارجية ل قوقعة الماوس باستخدام نظامنا المخصص. يتم سرد المكونات المتكاملة في جدول المواد. كما توضح الورقة المشاكل الشائعة التي يمكن مواجهتها وكيفية استكشافها وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة كنتاكي (البروتوكول 00903M2005).
1. تصنيع واختبار nanopipettes
- إنشاء برنامج في سحب micropipette للحصول على ماصة مع مقاومة بين 200 و 400 MΩ، والذي يتوافق مع أقطار طرف الداخلية من حوالي 50-70 نانومتر. المعلمات سوف تعتمد على سحب micropipette. للحصول على ماصة قصيرة مع نصائح غرامة غير مرنة، تحقق في دليل التشغيل من سحب.
- استخدام الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate مع الخارجي / الداخلية أقطار 1/0.58 مم وخيوط داخلية لتسهيل ملء. طول ماصة أمر بالغ الأهمية لأنه يحدد وتيرة الرنين الميكانيكي الجانبي للمواصة. كلما طال أمد المصصة ، كلما كان التردد الرنان أقل وكلما كان من الصعب تجنب هذا الرنين.
ملاحظة: يجب على المستخدم محاولة تصنيع ماصة أقصر يمكن أن يقبل حامل. طول nanopipettes في هذه التجربة عادة ما يكون 15-25 ملم (الشكل 2A). - ملء nanopipette تصل إلى نقطة الوسط(الشكل 2A)مع حل حمام، إما L-15 ليبوفيتز أو مع هانك متوازنة الملح الحل (HBSS) تكملها مع 20 MM D-الجلوكوز (لضبط osmolarity). لتجنب القطع الأثرية المحتملة، استخدم نفس الحل الذي سيتم استخدامه في الحمام للتسجيلات.
- باستخدام المجهر البصري مع تكبير 10x، تحقق من وجود أي فقاعات في غيض من ماصة(الشكل 2B). الفقاعات من شأنها أن تمنع التدفق الحالي. من الصعب إزالة الفقاعات في المصاريب التي تم سحبها قبل عدة ساعات من التجربة. لذلك ، يوصى بسحب ماصة جديدة مع كل تجربة.
- مرة واحدة في ماصة خالية من فقاعات، جبل عليه في حامل ماصة HPICM (الشكل 2C).
- ضع العينة (الأنسجة أو معيار المعايرة) على الغرفة المصممة خصيصا وأضف 4 مل من محلول الحمام المذكور أعلاه.
- ضع الغرفة المصممة خصيصا على مرحلة HPICM وادخل القطب الأرضي في المحلول.
- تأكد من أن الجهد الذي يتم تطبيقه على ماصة بواسطة مكبر الصوت المشبك التصحيح هو صفر.
- حرك المصصة في Z حتى تلمس السائل.
- تعيين إزاحة مكبر للصوت إلى الصفر ثم قم بإضافة +100 mV للتحقق من تيار ماصة.
- حساب المقاومة وقطر ماصة، استنادا إلى قانون أوم:
R = V/I
حيث R هو المقاومة (MOhm)، V هو الجهد المطبق على nanopipette (mV) وأنا التيار المتدفق من خلال nanopipette (nA).- حساب القطر الداخلي للمصصة كما هو موضح في مكان آخر وفقا للصيغةالتالية 12:
معرفتلميح = 1000/ √R
ملاحظة: قيمة المقاومة المثالية بين 200 و 400 MΩ. قد تؤدي المصايب ذات المقاومة التي تزيد عن 400 MΩ إلى تيار غير مستقر بسبب صغر حجمها (< قطرها الداخلي 50 نانومتر). على العكس من ذلك، ماصة مع المقاومات أصغر من 200 MΩ كبيرة جدا (> 70 نانومتر القطر الداخلي) ولن تحل الميزات الصغيرة. من المستحسن أن تبدأ التصوير مع ماصة المقاومة MΩ 200، كما أنها أسهل لتصنيع وتميل إلى توفير أقل الضوضاء الكهربائية.
- حساب القطر الداخلي للمصصة كما هو موضح في مكان آخر وفقا للصيغةالتالية 12:
2. تقليل عينات الانجرافات والاهتزازات
ملاحظة: لتقليل الضوضاء الميكانيكية في النظام أثناء التصوير، قم بتركيب العينات على الغرف المصممة خصيصا التي تستخدم الشرائح الزجاجية السميكة (~1.2 مم):
- إزالة الجزء الزجاجي من طبق 50 ملم الزجاج القاع، وترك الجدران البلاستيكية سليمة.
- الغراء الجزء البلاستيكي من طبق ثقافة الخلية على رأس الشريحة الزجاجية سميكة مع الغراء السيليكون.
- قم بتركيب عينة المعايرة في منتصف الغرفة (أعلى الشريحة الزجاجية) باستخدام غراء السيليكون أو شريط رفيع على الوجهين.
- تأمين الغرفة بقوة على مرحلة HPICM باستخدام الشريط على الوجهين.
- أثناء التصوير، أغلق قفص فاراداي وغطيه ببطانية لتقليل التداخل الكهربائي والانجراف الحراري، في المقابل.
3.اختبار القرار مع معايير معايرة AFM
ملاحظة: يوصى بشدة بتصوير معايير AFM (راجع جدول المواد)قبل تصوير الخلايا الحية من أجل استكشاف أخطاء النظام وإصلاحه واختبار دقته في محاور X-Z-Y. معايير المعايرة لديها أعمدة ثاني أكسيد السيليكون وثقوب من أشكال مختلفة ولكن ارتفاعات ثابتة / أعماق (أي 20 أو 100 نانومتر) على رقاقة السيليكون 5 × 5 ملم. بدءا من معيار المعايرة 100 نانومتر ينصح, لضمان أن القرار Z هو أقل من 100 نانومتر. بعد تحقيق صورة ناجحة عالية الدقة للأعمدة أو الثقوب في عينة المعايرة هذه(الشكل 3A)،انتقل إلى معيار 20 نانومتر. إذا كان التصوير من هذا المعيار الأخير ناجحا (الشكل 3B)، ويضمن القرار في محور Z أن تكون أقل من 20 نانومتر ومناسبة لتصوير حزم ستيريوسيليا خلية الشعر12. يتم استخدام الخطوات التالية لتصوير كل من معايير المعايرة.
- إرفاق معيار المعايرة إلى الغرفة مع الغراء السيليكون.
- أضف 4 مل من HBSS إلى الغرفة لتغطية عينة المعايرة. ثم قم بتأمين الغرفة إلى المرحلة XY من إعداد HPICM باستخدام الشريط على الوجهين.
- المشبك حامل المغناطيسي للقطب الأرض إلى مرحلة بالقرب من الغرفة وتزج القطب في حل الحمام (الشكل 1B).
- جبل nanopipette في حامل، تزج به في حل الحمام، وتعيين تيارها إلى ~ 1 nA اتباع الخطوات المذكورة في القسم 1.
- ضع nanopipette تقريبا فوق مركز معيار المعايرة باستخدام متلاعب مشبك التصحيح بالطبع. عادة ما يكون الفحص البصري كافيا لهذا الموضع ، نظرا لأن المساحة التي تغطيها هياكل ثاني أكسيد السيليكون كبيرة نسبيا (1 × 1 مم). وعلى النقيض من جهاز كورتي explants (انظر أدناه) ، معيار المعايرة غير شفافة ، وبالتالي ، تحديد المواقع أكثر دقة تسترشد التصوير البصري غير ممكن لهذه العينة.
- زيادة نقطة تعيين أثناء رصد إشارة من أجهزة الاستشعار من المشغل بيزو Z على الذبذبة في الوقت الحقيقي. بعد إنشاء مستقرة قابلة للتكرار Z دورة النهج (كما هو الحال في الشكل 1C، أسفل) ، وانخفاض نقطة تعيين إلى القيمة التي هي فقط فوق نقطة عدم الاستقرار. هذا الإجراء من شأنه أن يضمن نقطة تعيين الأمثل لهذا nanopipette معينة.
- نقل ماصة أسفل بسرعة ~ 5 ميكرومتر / ثانية مع المشبك التصحيح micromanipulator حتى تصل إلى العينة. في هذه اللحظة، فإن المستوى السفلي من إشارة تحديد المواقع Z في الوقت الحقيقي(الشكل 1C)زيادة، مما يدل على أن يتم سحب nanopipette بسبب "الاستشعار" سطح العينة. أي حركة أخرى من nanopipette سيؤدي إلى مزيد من التحول الإيجابي للإشارة تحديد المواقع Z.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم تجاوز الحد الأعلى لحركة مشغل بيزو Z. - بدء التصوير بدقة منخفضة (انظر الجدول 1). بسبب التركيب غير المتكافئ لمعيار AFM ، قد تكون أعلى نقطة في مجال الاهتمام غير معروفة. لذلك، تعيين سعة التراجع ماصة (هوب السعة) إلى ما لا يقل عن 200-500 نانومتر.
- بمجرد تحديد أعلى نقطة للعينة في منطقة التصوير ، قلل من اتساع القفزة. تسمح سعة القفز الأصغر بالمسح الضوئي بشكل أسرع ، وهو المفضل للتصوير عالي الدقة بسبب انخفاض آثار الانجرافات وانخفاض الاهتزاز.
- قبل نقل المصصة إلى موقع X-Y جديد، اسحبه حوالي 200 ميكرومتر في محور Z لمنع أي اصطدام غير مرغوب فيه مع العينة.
ملاحظة: في الحالات التي لا يتم فيها محاذاة nanopipette مع مركز معيار المعايرة، فمن الممكن أن يبدأ المسح قبالة منطقة ميزات السطح. - بعد العثور على منطقة الاهتمام، ابدأ التصوير بدقة أعلى (انظر الجدول 1).
4. صنع غرف مصممة خصيصا لتأمين النباتات explants cochlear
ملاحظة: جبل explants cochlear في الغرف مع أنظمة لقط مصممة خصيصا التي تستخدم إما ماصة زجاجية مرنة (الخطوة 4.1) (الشكل 4A) أو خيط تنظيف الأسنان (الخطوة 4.2) (الشكل 4B). يمكن تعقيم غرفة ماصة الزجاج واستخدامها للأعضاء المستزرعة من كورتي، في حين توفر غرفة خيط تنظيف الأسنان عقد أكثر أمنا للعينة والتحكم في اتجاه حزمة ستيريوسيليا أثناء التركيب. يجب إعداد هذه الغرف المصممة خصيصا مسبقا، ولكن يمكن تنظيفها وإعادة استخدامها في العديد من جلسات التصوير.
- جعل غرفة باستخدام ماصة زجاجية مرنة
- سحب اثنين من الألياف الزجاجية رقيقة ومرنة من الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام سحب ماصة. لدينا ألياف الزجاج سحبت عادة قياس 1-2 سم في الطول ومرنة إلى حد ما.
- ضع قطرة صغيرة من الاستومر السيليكون على رأس غطاء زجاجي. استخدام الأغطية من 2 سم في القطر.
- وضع نهايات اثنين من الألياف الزجاجية على قطرة السيليكون وترتيب الألياف أن يكون درجة صغيرة من الفصل بينهما (الشكل 4A).
- ضع غطاء على طبق ساخن لعلاج الاستومر بسرعة (1 إلى 3 دقائق).
- الغراء coverlip على الجزء السفلي من الزجاج من الغرفة الموصوفة في القسم 2 باستخدام كمية صغيرة (1-3 ميكرولتر) من الاستومر السيليكون والسماح لها لعلاج بين عشية وضحاها.
- صنع غرفة باستخدام خيط تنظيف الأسنان:
- إزالة الجزء الزجاجي من طبق 50 ملم الزجاج القاع، وترك الجدران البلاستيكية سليمة. ثم الغراء الجزء البلاستيكي من طبق ثقافة الخلية على رأس شريحة زجاجية سميكة 1.2 ملم مع الغراء السيليكون.
- جبل واحد غطاء من البلاستيك (6.5 × 6.5 ملم) مع الغراء نفسه إلى وسط الغرفة. ثم كرر العملية مع coverslip آخر على رأس سابقتها.
- جبل اثنين من الأسلاك التنغستن الصغيرة أو مطلية بالذهب (12 ملم من الطول و ~ 0.5 ملم في القطر) مع الغراء السيليكون، كل واحد على طرفي نقيض من الشرائح الغطاء. الغراء لهم بعيدا بما فيه الكفاية (> 10-15 ملم) من الشرائح الغطاء(الشكل 4B).
- فصل اثنين من خيوط خيط الأسنان ووضعها على رأس الشرائح الغطاء وتأمينها إلى الأسلاك عن طريق جعل عقدة. ترك فجوة صغيرة بين كلا الخيوط(الشكل 4B، السهام القصيرة).
- تنظيف الغرف بعد كل استخدام
- إزالة الأنسجة بلطف من الغرفة باستخدام ملاقط غرامة وكشط طفيفة أي بقايا الأنسجة التي خلفتها وراءها.
- شطف الغرفة أولا مع الإيثانول 70٪ ثم بالماء المقطر.
- كرر دورة الشطف إذا لزم الأمر.
- ضع الغرفة رأسا على عقب على ورقة تصفية للسماح لها بالجفاف حتى التجربة التالية. لا تحتاج الغرف إلى تعقيم ، إلا إذا تم التخطيط لزراعة عضو كورتي بعد التصوير.
5. تشريح الجهاز القوارض من كورتي
- إجراء تشريح للنباتات القوقعة بعد الولادة الشباب كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر13.
- للتصوير HPICM، تشريح الجهاز كورتي من الفئران بين اليومين بعد الولادة 3 و 6 (P3-6)، ومن الفئران بين أيام ما بعد الولادة 3 و 8 (P3-8).
ملاحظة: خلايا الشعر القديمة هي أكثر عرضة للتلف أثناء تشريح، وبالتالي، لا يمكن استخدامها لساعات طويلة الفاصل HPICM التصوير. - لا تنسى إزالة الغشاء التكفيري قبل التصوير HPICM.
- مباشرة بعد تشريح، وتأمين الأنسجة في واحدة من الغرف الموصوفة في القسم 4، إما وضعه تحت ماصة زجاجية مرنة أو تحت خيوط خيط الأسنان اثنين(الشكل 4). قبل ملء هذه الغرف مع 4 مل من غرفة درجة حرارة حمام الحل (لتقليل تشكيل فقاعة).
6. تصوير خلايا الشعر السمعية
- جبل الغرفة مع جهاز معزول حديثا من كورتي على المرحلة بيزو X-Y باستخدام الشريط على الوجهين وتأكد من أنه مؤمن بقوة للحد من الانجراف غرفة في محاور X و Y (الشكل 1B).
- اتبع الخطوات في القسم 1 لوضع nanopipette جديدة وتحقق من المقاومة ماصة الصحيح.
- باستخدام التصحيح المشبك micromanipulator، موقف nanopipette على منطقة خلايا الشعر، في حين مراقبة الجهاز من كورتي explant في المجهر مقلوب.
- تحقق مما إذا كان النظام مستقرا مع نقطة تعيين 0.5٪ أو أقل عن طريق تسجيل إشارة تحديد المواقع الحالية وZ في الوقت الحقيقي على الذبذبة (كما هو الحال في الشكل 1C). إذا كانت إشارة Z غير مستقرة، فحاول تقليل تردد قطع فلتر التمرير المنخفض لمكبر المشبك التصحيحي. ومع ذلك، فإنه لا يمكن أن يكون أقل من وقت الاستجابة من مشغل بيزو Z (لتجنب الاصطدام ماصة مع العينة بسبب تأخر القراءات الحالية).
ملاحظة: في الممارسة العملية، تم العثور على إعداد 5 كيلوهرتز لهذا المرشح ليكون الأمثل. فمن الأفضل أن تحل محل nanopipette، إذا Z-إشارة لا تزال غير مستقرة. - بمجرد تحقيق تسجيل مستقر، حدد نقطة الإعداد المثلى واقترب من العينة باستخدام ماصة HPICM كما هو موضح في الخطوات 3.6-3.7 أعلاه.
- أولا، إجراء تصوير منخفض الدقة (انظر الجدول 1)،باستخدام سعة قفزة لا تقل عن 6 إلى 8 ميكرومتر. لتصوير الهياكل الطويلة مثل حزم ستيريوسيليا خلايا الشعر، تأكد من أن اتساع هوب يكفي لتجنب الاصطدام مع هذه الهياكل.
ملاحظة: إذا كانت السعة هوب غير كافية، فإن ماصة لن تكون قادرة على القفز فوق ستيريوسيليوم وسيكون هناك اصطدام وشيك. قد يؤدي اصطدام مسبار HPICM مع ستيريوسيليوم إلى تلف حزمة الشعر. لذلك ، في الحالات التي يكون فيها ارتفاع حزمة stereocilia غير مؤكد ، استخدم سعة قفزة أكبر. - تعرف على تضاريس جهاز كورتي من خلال إجراء و / أو دراسة الصور التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي(الشكل 5).
ملاحظة: إذا كانت صورة HPICM موحدة مع ارتفاعات أصغر من 1 ميكرومتر في كل نقطة تصوير، فمن المرجح أن تقوم المصصة بمسح الجزء السفلي الزجاجي وليس الأنسجة. بدلا من ذلك، قد ماصة "الأرض" على منطقة مختلفة من اكسبلانت قوقعة، بعيدا عن خلايا الشعر. - إذا كان ماصة يحتاج إلى نقلها إلى موقع جديد X-Y, التراجع عن ذلك حوالي 500 نانومتر لتجنب الاصطدامات مع أي ميزات طويل القامة داخل الأنسجة. كرر التصوير HPICM منخفضة الدقة حتى يتم العثور على المنطقة ذات الاهتمام مع خلايا الشعر.
- بعد العثور على المنطقة ذات الاهتمام، ابدأ التصوير بدقة أعلى (انظر الجدول 1). حاول قضاء أقل من 15 دقيقة عند تصوير حزمة شعر كاملة.
ملاحظة: حزم خلايا الشعر في الأنسجة الحية لا تزال غير أنها قد تغير اتجاهها، على سبيل المثال، بسبب تغيرات الشكل في الخلايا الداعمة الأساسية. لذلك، قد تعرض الصور قطعا يدوية للحركة إذا كان اكتساب الصورة بطيئا جدا. - مرة أخرى، حدد أطول الميزات في الصور منخفضة الدقة قبل تقليل سعة القفز للتصوير عالي الدقة. لمنطقة الاهتمام التي تغطي حزمة خلايا الشعر بأكملها، والحد من اتساع هوب إلى 4-5 ميكرومتر، في حين لمنطقة صغيرة نسبيا و "شقة" داخل حزمة (على سبيل المثال، 2 × 2 ميكرومتر) خفض اتساع هوب أبعد من ذلك، وصولا الى أقل من 1 ميكرومتر، وبالتالي زيادة سرعة ودقة التصوير.
7. معالجة الصور
ملاحظة: القطع الأثرية التصوير شائعة في التصوير HPICM. يمكن تصحيح بعضها بواسطة معلمات الحصول على الصور ، في حين يتطلب البعض الآخر معالجة ما بعد إما مع عارض SICM متخصص أو مع برامج معالجة بيانات أكثر عمومية مثل ImageJ أو MatLab. هنا نصف القطع الأثرية الأكثر شيوعا وكيف نصلحها مع عارض SICM.
- تنفيذ تصحيح الميل
ملاحظة: ليس من الواضح للمبتدئين، ولكن العين البشرية لا يمكن حل ميزات حجم دون ميكرومتر على سطح الخلية، إذا كانت منطقة التصوير لديه منحدر العام من حجم يساوي أو أكبر(الشكل 3A،B،اليسار). لذلك ، من الضروري تحديد متوسط انحدار منطقة مصورة (عن طريق تركيب بيانات صورة HPICM ثلاثية الأبعاد إلى مستوى واحد) وطرحها من صورة HPICM(الشكل 3A،B، الأوسط).- انقر فوق فتح لفتح صورة باستخدام عارض SICM.
- حدد علامة التبويب تصحيح الصورة.
- حدد علامة التبويب "الانحدار الصحيح".
- اضغط على الزر "تصحيح المنحدر" لتصحيح منحدر تلقائي.
- تنفيذ محاذاة الخط
ملاحظة: كما ذكر من قبل، تمثل الانجرافات الميكانيكية و/أو الحرارية وكذلك القطع الأثرية لحركة الخلايا مشكلة كبيرة في التصوير HPICM. الانجراف الصغيرة مع سرعة أقل من ميكرومتر في الدقيقة الواحدة عادة ما لا يكون ملحوظا في الإعداد المشبك التصحيح العادية. ومع ذلك ، يمكن أن تنتج قطعا أثرية من عدة عشرات من النانومتر في التصوير HPICM ، وهو أكبر بكثير من قرار HPICM. لذلك، فإنه ليس من غير المألوف أن تواجه قفزات مفاجئة في المحور Z بين خطين فحص HPICM المجاورة أثناء التصوير. يمكن تصحيح ذلك عن طريق تحليل الاختلافات بين بدء (و/أو إنهاء) قيم Z في خطوط المسح المجاورة هذه.- انقر فوق فتح لفتح صورة باستخدام عارض SICM.
- حدد علامة التبويب تصحيح الصورة.
- حدد علامة التبويب "الانحدار الصحيح".
- اختر عرض الخطوط التي سيتم محاذاتها. اضغط على الزر ButtonDestripeLineFit لتصحيح محاذاة سطر تلقائي.
- تنفيذ الحد من الضوضاء
ملاحظة: أثناء الحصول على الصور باستخدام HPICM، يمكن أن تؤدي التقلبات الصغيرة في تيار nanopipette إلى توقف nanopipette بعيدا عن سطح العينة، خاصة مع نقاط تعيين منخفضة. وينتج عن ذلك ظهور نقاط بيضاء صغيرة في الصورة. من أجل تصحيح هذه القطعة الأثرية التصوير ، فمن الضروري تحديد نقاط التصوير مع قيمة Z أكبر بكثير من تلك التي من الجيران واستبدال هذه القيمة مع متوسط الجيران. ويتم ذلك بواسطة عامل تصفية وسيط قابل للتعديل.- انقر فوق فتح لفتح صورة باستخدام عارض SICM.
- حدد علامة التبويب معالجة الصور.
- حدد علامة التبويب الحد من الضوضاء.
- تعيين عامل التصفية Threshold (μm) لوحدات البكسل التي سيتم إزالتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام البروتوكول المعروض في هذه الورقة لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة. بعد هذه الخطوات، نحصل بشكل روتيني على صور لحزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران (الشكل 6B، D). على الرغم من وجود انخفاض دقة X-Y بالمقارنة مع صور SEM ، يمكن لصور HPICM لدينا حل الصفوف المختلفة من الاستريوفيليا ، وشكل نصائح ستيريوسيليا ، وحتى الروابط الصغيرة (~ 5 نانومتر في القطر) التي تربط ستيريوسيليا المجاورة(الشكل 6F). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي صور HPICM على معلومات في 3D تفتقر إليها صور SEM. ونظرا لطبيعة عدم الاتصال من هذا النوع من تقنية التصوير، كنا أيضا قادرة على إجراء التصوير المستمر HPICM الفاصل الزمني من حزمة خلايا الشعر نفسه لعدة ساعات (أي 5-6 ساعة بانتظام) دون الإضرار تماسك حزمة(الشكل 7). وهكذا، يعرض HPICM إمكانات كبيرة لدراسة التغيرات الهيكلية الديناميكية لحزم خلايا الشعر مع مرور الوقت.
على الرغم من أننا نقدم العديد من النطاقات لحجم ماصة، setpoint الحالي، المعلمات منخفضة وعالية الدقة، والسعة هوب، قد يحتاج كل مستخدم لتحسين إعداداتها قليلا للحصول على صور HPICM ناجحة من حزم خلايا الشعر الحية. تنتج نقاط setpoints الأصغر صورا ذات جودة أفضل. ومع ذلك ، مع نقطة تعيين منخفضة جدا ، قد يفسر النظام تقلبات صغيرة في التيار على أنها تواجه سطح الخلية وهذا سيؤدي إلى ضوضاء "النقطة البيضاء" في الصورة(الشكل 8A). وبالمثل، قد السعة هوب كبيرة زيادة الرنين الجانبي للمصصة وأيضا إنتاج بكسل صاخبة(الشكل 8B). في المقابل، إذا كانت سعة الهوب صغيرة جدا أو كانت نقطة الإعداد عالية جدا، فقد تصطدم النانوبايت بالعينة وتؤدي إلى تصوير القطع الأثرية أو حتى تلف حزمة الشعر(الشكل 8C،D). نوصي بإجراء التصوير بدقة أقل مع تعديل كل هذه المعلمات لتقليل الضرر الذي لحق بالعينة أو بالنانوبايت.
الشكل 1: مبادئ القفز على مجهر التوصيل الأيوني (HPICM). (أ) تيار كهربائي يمر عبر nanopipette يولد "حجم الاستشعار" في غيض من ماصة. لتصوير الهياكل المعقدة مثل حزم ستيريوسيليا خلية الشعر، يقترب ماصة نحو سطح الخلية من فوق ويتراجع بعد الكشف عن السطح. بعد نقل الجانبية في كل خطوة، ماصة يستمر "هوب" فوق العينة توليد صورة الخلية. لاحظ أن السعة هوب يجب أن تكون كافية للمصصة إلى "تسلق" إلى ستيريوسيليوم. تعمل سعة القفزة المصورة على المسح الضوئي من اليسار إلى اليمين (من الأصغر إلى أطول ستيريوسيليوم ، يشار إليه بسهم). ومع ذلك ، فهي صغيرة جدا للمسح الضوئي من اليمين إلى اليسار عندما يلتقي المصصة بأطول ستيريوسيليوم أولا. (ب) الإعداد التجريبي. يتم تركيب غرفة مصنوعة خصيصا مع جهاز كورتي إكسبلانت على مرحلة تحديد موضع XY مع فتحة لمراقبة المجهر البصري. يتم نقل nanopipette بواسطة مشغل بيزو Z فائق السرعة منفصل. لوضع nanopipette على المنطقة ذات الاهتمام، يتم تركيب مشغل Z على micromanipulator التقليدية (لا يظهر) جنبا إلى جنب مع التصحيح المشبك مكبر للصوت headstage. يتم تركيب القطب الأرضي على حامل مغناطيسي وإدخاله في الحمام. (ج) التسجيلات التمثيلية للتيار ماصة(أعلى تتبع) و Z موقف ماصة (تتبع أسفل) أثناء التصوير. عندما يكون ماصة بعيدا عن سطح الخلية، يتم تحديد القيمة المرجعية للتيار يمر عبر ماصة (أناالمرجع). ثم يتم نقل ماصة نحو العينة (النهج). عندما يلتقي "حجم الاستشعار" بسطح الخلية، يبدأ تيار المصصة في التناقص. يتم إصدار الأمر للسحب عندما يصل النقصان الحالي إلى نقطة تعيين ، والتي عادة ما تكون 0.2٪ - 1٪ من المرجع I. (د) مخططات المعدات التي تحتاج إلى إضافتها إلى إعداد المشبك التصحيح التقليدية للتصوير HPICM. يسجل مكبر الصوت المشبك التصحيح مخصصة تيار nanopipette (I) التي يتم استخدامها من قبل وحدة تحكم SICM في وضع HPICM لتوليد إشارات الأمر إلى محاور Xو Yو Z. يوفر مكبر صوت الأجهزة الإزاحة والتحجيم وتصفية التمرير المنخفض لهذه الإشارات ، إذا لزم الأمر. لسوء الحظ، لا يمكن تطبيق إشارات X/Y/Z من وحدة التحكم مباشرة على مشغلات بيزو بسبب الأخطاء الكبيرة الناجمة عن الغشاء النجمي والزحف المتأصلة في خزف بيزو. لذلك، كل مشغل بيزو (مرحلة الترجمة)لديه المدمج في استشعار الحركة التي ترسل إشارة التغذية المرتدة إلى وحدة تحكم النسبية المتكاملة المشتقة (PID) أن الأشكال المسبقة إشارة الأمر لتصحيح لهذه الأخطاء. لاحظ أن محاور X و Y البطيئة نسبيا يمكن أن تستخدم وحدات تحكم PID التي تم إنشاؤها في مكبر صوت piezo، بينما يتطلب محور Z أسرع وحدة تحكم PIDسريعة مخصصة . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيع Nanopipette وملء. (أ) ما يقرب من 2 سم طويلة nanopipette مليئة الحل intrapipette (HBSS). (ب) صورة للفقاعة (السهم) التي تتشكل عادة بعد ملء ماصة. الفقاعة عادة ما يتحرك بعيدا في غضون دقائق قليلة من إضاءة المجهر (المجهر الرقمي LCD في 10x). (ج) شنت nanopipette في الرأس SICM. يشير السهم إلى القطب AgCl داخل ماصة. لاحظ أن حامل ماصة هو الفضة رسمت وعلى الارض لتقليل التقاط الكهربائية الإشعاعية من المحرك بيزو Z. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصوير معايير معايرة AFM لتحديد الاستقرار الكافي وعزل الاهتزاز والضوضاء الكهربائية في النظام. (أ) صور أولية (يسار) وصور بعد المعالجة (وسط) وصور ثلاثية الأبعاد (يمين) لمعيار معايرة HS-100MG. يتم عرض التشكيل الجانبي السطحي للمعيار تخطيطيا في الأعلى. وبما أن المعيار لا يتم محاذاته بشكل عمودي تماما على النانوبايت ، فإن تصحيح منحدر ما بعد المعالجة مطلوب للكشف عن الميزات الرأسية الصغيرة للعينة. (ب)صور خام مماثلة (يسار) وصور بعد المعالجة (وسط) وصور ثلاثية الأبعاد (يمين) لمعيار معايرة HS-20MG الذي يحتوي على مسافات بادئة عميقة أصغر حجما يبلغ عمقها 20 نانومتر. لاحظ أن تدرج الرمادي بكسل في صورة HPICM يشير إلى ارتفاع العينة في تلك المرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تركيب الجهاز من كورتي explant. (أ) يقام explant من قبل اثنين من الأنابيب الزجاجية التي يتم لصقها على طبق بيتري الزجاج القاع. (ب)يتم تأمين explant بواسطة اثنين من خيوط خيط الأسنان (السهام القصيرة) في غرفة التصوير حسب الطلب. Inset يظهر صورة مكبرة من الجهاز كورتي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التنقل في مسبار HPICM إلى منطقة خلايا الشعر. (أ) صورة SEM من explant قوقعة عرض صفوف الداخلية (IHCs) والخارجي (OHCs) خلايا الشعر وأنواع متميزة من الخلايا الداعمة. (ب) صورة HPICM ممثل للخلايا في الجهاز كوليكر. (ج) صورة HPICM لخلايا هنسن. لاحظ أن هذين النوعين من الخلايا الداعمة لها أشكال متميزة جدا، مما يساعد على تحديد ما إذا كان مسبار HPICM قد هبط إلى منطقة شعاعية أو محيطية لخلايا الشعر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: المقارنة بين المسح المجهري الإلكتروني (SEM) والقفز مجهر توصيل أيونات التحقيق (HPICM) تصوير حزم المجسمة في خلايا الشعر الداخلية القوارض الشباب بعد الولادة. (A, C) توفر صور SEM دقة دون نانومتر لتفاصيل السطح ولكن في الخلايا الثابتة والمتقلصة بسبب تجفيف النقاط الحرجة. بالإضافة إلى ذلك، لا تسمح صور SEM بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد. (B, D) صور HPICM (يسار) لديها دقة أسوأ (~ 5-10 نانومتر) ولكن يتم الحصول عليها في الخلايا الحية ، والسماح بالتصوير الفاصل الزمني ، وتحمل معلومات عن الارتفاعات الدقيقة ، مما يسمح بإعادة البناء والقياسات ثلاثية الأبعاد (يمين). (E,F) وصلات خارج الخلية بين stereocilia واضحة في كل من SEM (E) و HPICM (F) صور (الأسهم). أعمار الخلايا: أ، فأرة اليوم التالي للولادة 5 (P5)؛ ب، P6 الفئران؛ C، P8 الماوس؛ D، P5 الفئران؛ E، P7 الماوس؛ و F، P5 الفئران. في كافة الصور HPICM، يشير تدرج الرمادي بكسل ارتفاع العينة في تلك المرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: مرور الوقت المستمر HPICM التصوير من حزمة stereocilia. (أ) لمحة عامة عن حزمة خلايا الشعر الداخلية من الفئران P5 تظهر متميزة أقصر صف stereocilia. (ب)تصوير الفاصل الزمني للمنطقة ذات الاهتمام المشار إليها في (أ) على مدار ست ساعات. لاحظ أنه على النقيض من تجربة مخيم التصحيح النموذجية ، لا تظهر خلايا الشعر أي علامات على التدهور لعدة ساعات في المختبر. ويرجع ذلك إلى تشريح دقيق وعدم وجود أي اضطرابات ميكانيكية في الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: القطع الأثرية الشائعة أثناء التصوير باستخدام HPICM. (أ) تأثير نقطة تعيين منخفضة جدا. صور HPICM منخفضة الدقة لنفس حزم خلايا الشعر الداخلية الحية في فئران P3 المكتسبة مع نقطة تعيين 0.05٪ (يسار) و 0.07٪ (يمين). لاحظ ضوضاء نقطة بيضاء تختفي مع نقطة تعيين أعلى. (ب) تأثير سعة هوب عالية جدا. يظهر ضجيج النقطة البيضاء أيضا في صورة HPICM لحزمة خلايا الشعر الداخلية للفئران P7 التي تم الحصول عليها بسعة قفزة كبيرة 5.8 ميكرومتر (يسار). يختفي هذا الضجيج عندما يتم تصوير نفس الحزمة مع اتساع هوب من 3.4 ميكرومتر (يمين) بسبب انخفاض الاهتزازات في النظام. (ج) انخفاض جدا هوب السعة النتائج في الاصطدام من التحقيق HPICM إلى ستيريوسيليا وسحبها (السهام على اللوحة اليسرى). زيادة اتساع هوب فقط بما فيه الكفاية ل "تسلق" stereocilia يلغي هذه القطعة الأثرية (يمين) ولكن قد تزيد أيضا من وقت التصوير، مما أدى إلى انجراف ملحوظ (خطوط عمودية في اللوحة اليمنى). حزمة Stereocilia من خلية الشعر الخارجي الحية من الفئران P7. (D) نقطة تعيين عالية جدا يسبب شكل مربع من نصائح ستيريوسيليا (السهام) في صورة HPICM (يسار)، مرة أخرى بسبب اصطدام nanopipette إلى ستيريوسيليا. يؤدي تقليل نقطة تعيين (مع انخفاض متزامن في سعة الأمل للقضاء على الضوضاء البيضاء) إلى تحسين التصوير (إلى اليمين). حزمة Stereocilia من خلية الشعر الداخلية الحية من الفئران P6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| دقة | منطقة الصورة (μm) | الدقة الجانبية (نانومتر) | الوقت لكل صورة (دقائق) |
| منخفض | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| منخفض | 10×10 | ≥156 | ≤15 |
| منخفض | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| عال | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| عال | 10×10 | ≤110 | ≤15 |
| عال | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
الجدول 1: الأوقات النموذجية للتصوير باستخدام HPICM حسب حجم منطقة التصوير ودقة المسح الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحصول على صور HPICM ناجحة، يحتاج المستخدمون إلى إنشاء نظام منخفض الضوضاء والاهتزاز منخفضة وتصنيع ماصة المناسبة. نوصي بشدة باستخدام معايير معايرة AFM لاختبار استقرار النظام قبل محاولة إجراء أي تصوير للخلايا الحية. بمجرد اختبار دقة النظام ، يمكن للمستخدمين النظر في تصوير الجهاز الثابت لعينات كورتي للتعرف على إعدادات التصوير قبل محاولة أي تصوير للخلايا الحية.
تختلف نقطة الإعداد المثلى للتصوير بين ماصة مختلفة ، اعتمادا على الشكل الفردي لنصائحها (غير معروف حتى يتم فحصها عن طريق المجهر الإلكتروني) وعلى كمية الأوساخ المرفقة بالطرف ، والتي لا يمكن التنبؤ بها أيضا. وينبغي التخلص من Nanopipettes مع نقطة تعيين الأمثل أعلى من 0.7٪.
أثناء تصوير الخلايا الحية ، تزداد كمية الغبار والحطام في المحلول خارج الخلية بمرور الوقت. كل هذه الجسيمات يمكن أن ينتهي في غيض من ماصة، مما تسبب في انخفاض في التيار ويجعل من المستحيل مواصلة مسح الأنسجة - الصورة سوف تتحول بيضاء تماما منذ ردود الفعل سوف "أعتقد" أن nanopipette هو دائما في محيط العينة. إذا حدث هذا، فمن المستحسن أن تتراجع ماصة في Z-محور من تلك المنطقة من الأنسجة. هذا التراجع يمكن أن يزيل "القذارة". إذا كان ماصة لا تزال قذرة، فمن الضروري تغيير ماصة والانتقال إلى منطقة مختلفة من العينة. ثم، يمكن للمستخدم الاستمرار في مسح الأنسجة.
اعتبارا من اليوم ، فإن القيد الأكثر أهمية من HPICM هو مقدار الوقت اللازم لالتقاط صورة بدقة عالية أثناء العمل مع عينات مع التضاريس المعقدة. اعتمادا على الدقة المطلوبة، يمكن أن تستغرق الصور ما يصل إلى نصف ساعة أو أكثر. في الصور التي تم الحصول عليها لأكثر من خمس عشرة دقيقة ، قد يصبح الانجراف واضحا وقد يتم تغيير هياكل محددة ويصعب التمييز بينها. يحدث هذا لأن الخلايا الحية تتحرك باستمرار أو تغير شكلها بمرور الوقت. لتصور الأحداث الجزيئية والتغيرات في هياكل الخلايا مع مرور الوقت ، هناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الدقة الزمنية للHPICM11.
يمثل ضجيج تيار nanopipette قيدا آخر لأنه يحدد نقطة تعيين يمكن تحقيقها عمليا. التيار الذي تم إنشاؤه بواسطة nanopipette في الحل يخفف بسرعة (عكسي يتناسب مع المسافة المكعبة من طرف ماصة) ، وبالتالي إنشاء "حجم الاستشعار" ، والتي لا يمكن للnanopipette "الشعور" السطح. لقد سبق لنا أن وضعت نموذجا لهذه الظاهرة وأظهرت أن يتم تحديد القرار الجانبي للمسبار SICM من قبل المقطع العرضي من هذا "حجم الاستشعار" مع سطح الخلية، والتي يمكن أن تكون صغيرة للغاية في نقاط تعيين منخفضة25. هذا مهم بشكل خاص لتصوير روابط طرف خلية الشعر التي يبلغ قطرها ~ 5 نانومتر12،33. للوهلة الأولى ، فإن ماصة مع أصغر قطر الداخلية يؤدي إلى دقة أفضل للتصوير HPICM. وهذا صحيح حقا لمصبوبات كبيرة نسبيا (>50 نانومتر). ومع ذلك، خفض القطر الداخلي للnanopipette أدناه ~ 50 نانومتر النتائج في زيادة كبيرة بشكل غير متناسب من الضوضاء ماصة، وبالتالي، وفقدان القرار في setpoints منخفضة التي تعتبر ضرورية لحزم stereocilia التصوير. وحتى اليوم، لا نعرف كيف نحل هذه المشكلة ونعمل على إيجاد الحل المناسب.
باختصار، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتصور حزم المجسمة في خلايا الشعر السمعية الحية للثدييات مع HPICM. أكبر مزايا HPICM هي: 1) قدرتها على تصور الهياكل النانوية الخالية من التسمية على سطح الخلايا الحية دون لمسها؛ و (2) قدرتها على تصور الهياكل النانوية الخالية من التسميات على سطح الخلايا الحية دون لمسها؛ و(2) قدرتها على تصور الهياكل النانوية الخالية من الملصقات على سطح الخلايا الحية دون لمسها؛ و'2' قدرتها على تصور الهياكل النانوية الخالية من الملصقات على سطح الخلايا و2) للتحقيق في وظيفة هذه الهياكل مع التسجيلات المشبك التصحيح و / أو تسليم النانو المحلية من المحفزات الميكانيكية أو الكيميائية. على حد علمنا، هذه المزايا هي فريدة من نوعها لHPICM. بالطبع، هناك بعض العيوب. أولا ، بسبب القيود المفروضة على ارتفاع الهياكل التي سيتم تصويرها ، قد لا تكون HPICM مناسبة لتصوير الهياكل الطويلة للغاية ، مثل حزم الاستريوسيليا من خلايا الشعر الدهليزية في أمبولا الثدييات. ثانيا، لا يزال HPICM يتطور ويلزم إدخال المزيد من التحسينات على سرعة التصوير وحله. ومع ذلك ، فإن المبادئ المادية ل HPICM وتجربتنا الخاصة تشير إلى أنه ممكن. نحن نعتقد أن HPICM سوف توفر بيانات فريدة من نوعها عن وظيفة مجمعات البروتين الفردية على سطح ستيريوسيليا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور يوري كورشيف (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) على الدعم والمشورة على المدى الطويل في جميع مراحل المشروع. كما نشكر الدكتورين بافل نوفاك وأندرو شيفتشوك (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) وكذلك أوليغ بيلوف (المركز الوطني للبحوث السمعية، روسيا) على مساعدتهما في تطوير البرمجيات. تم دعم الدراسة من قبل NIDCD / NIH (R01 DC008861 و R01 DC014658 إلى G.I.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
