Summary
Her præsenterer vi en protokol til Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en ikke-kontakt scanning sonde teknik, der tillader nanoskala billeddannelse af stereocilia bundter i levende auditive hårceller.
Abstract
Indre øre hårceller opdage lyd-induceret forskydninger og transduce disse stimuli i elektriske signaler i et hår bundt, der består af stereocilia, der er arrangeret i rækker af stigende højde. Når stereocilia afbøjes, trækker de på små (~ 5 nm i diameter) ekstracellulære spidsforbindelser, der forbinder stereocilia, som formidler kræfter til de mechanosensitive transduktionskanaler. Selv om mechanotransduktion er blevet undersøgt i levende hårceller i årtier, kan de funktionelt vigtige ultrastrukturelle detaljer i mechanotransduktionsmaskineriet ved spidsen af stereocilia (såsom tip link dynamik eller transduktionsafhængig stereocilia remodeling) stadig kun studeres i døde celler med elektronmikroskopi. Teoretisk set, scanning sonde teknikker, såsom atomare kraft mikroskopi, har nok opløsning til at visualisere overfladen af stereocilia. Men uafhængigt af billeddannelsestilstand beskadiger selv den mindste kontakt af atomprøvens mikroskopisonde med stereocilia-bundtet normalt bundtet. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for hopping sonde ion ledningskopi (HPICM) billeddannelse af levende gnaver auditive hårceller. Denne ikke-kontakt scanning sonde teknik giver tid bortfalder billeddannelse af overfladen af levende celler med en kompleks topografi, ligesom hårceller, med enkelt nanometer opløsning og uden at gøre fysisk kontakt med prøven. HPICM bruger en elektrisk strøm, der passerer gennem glas nanopipetten til at detektere celleoverfladen i nærheden af pipetten, mens et 3D-positionering piezoelektrisk system scanner overfladen og genererer sit billede. Med HPICM, var vi i stand til at billedet stereocilia bundter og links forbinder stereocilia i levende auditive hårceller i flere timer uden mærkbar skade. Vi forventer, at brugen af HPICM vil tillade direkte udforskning af ultrastrukturelle ændringer i stereocilia af levende hårceller for bedre forståelse af deres funktion.
Introduction
På trods af at stereocilia bundter i de auditive hårceller er store nok til at blive visualiseret ved optisk mikroskopi og afbøjet i levende celler i et plaster klemme eksperiment, de væsentlige strukturelle komponenter i transduktion maskiner såsom spids links kunne kun afbildes med elektronmikroskopi i døde celler. I pattedyrets auditive hårceller er transduktionsmaskineriet placeret i de nederste ender af tipledene, dvs. ved spidsen af den kortere række stereocilia1 og reguleres lokalt gennem signalering ved spidsen af stereocilia2,3. Men, label-fri billeddannelse af overfladen strukturer på dette sted i levende hårceller er ikke muligt på grund af de små størrelser af stereocilia.
Pattedyr cochlea har to typer af auditive sensoriske celler: indre og ydre hårceller. I de indre hårceller er stereocilia længere og tykkere sammenlignet med dem i de ydre hårceller4. Den første og anden række af stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus eller rotte indre hårceller. På grund af lysets diffraktion er den maksimale opløsning, der kan opnås med en etiketfri optisk mikroskopi, ca. 200 nm. Derfor visualisering af individuelle stereocilia inden for første og anden række af den indre hår celle bundt er relativt let med optisk mikroskopi. I modsætning hertil har kortere række stereocilia i de indre hårceller og alle stereocilia af de ydre hårceller diametre omkring 100-200 nm og kan ikke visualiseres med optisk mikroskopi5. På trods af de seneste fremskridt inden for superopløsningsbilleddannelse fortsætter denne grundlæggende begrænsning i enhver optisk etiketfri billedbehandling. Alle nuværende kommercielt tilgængelige superopløsningsteknikker kræver en slags fluorescerende molekyler6, hvilket begrænser deres applikationer. Ud over begrænsninger på grund af behovet for specifikke fluorescerende mærkede molekyler har eksponering for intens lysbestråling vist sig at fremkalde cellulær skade og kan påvirke cellulære processer, hvilket er en stor ulempe ved undersøgelse af levende celler7.
Vores nuværende viden om de ultrastrukturelle detaljer i hår celle stereocilia bundter er opnået for det meste med forskellige elektronmikroskopi (EM) teknikker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), transmission elektronmikroskopi (TEM), fryse-fraktur EM, og for nylig med 3D-teknikker såsom seriel skæring med fokuseret ion stråle eller kryo-EM tomografi8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Desværre kræver alle disse EM-teknikker kemisk eller kryofixing af prøven. Afhængigt af fænomenets tidsskala gør dette krav en undersøgelse af de dynamiske processer ved spidsen af stereocilia enten umulig eller meget arbejdskrævende.
Begrænset indsats er blevet gjort for at billedet hår bundter af levende hårceller med atomare kraft mikroskopi (AFM)17,18. Da AFM opererer i fysiologiske løsninger, det kunne i teorien visualisere dynamiske ændringer i stereocilia bundter af levende hårceller over tid. Problemet ligger i principperne om høj opløsning AFM, hvilket indebærer en vis fysisk kontakt mellem AFM sonden og prøven, selv i den mindst skadelige "aflytning" mode19. Når AFM sonden støder på et stereocilium, det normalt går ned mod det, beskadige strukturen af håret bundt. Som følge heraf er denne teknik ikke egnet til at visualisere levende eller endda faste hårceller bundter17,18. Problemet kan delvist afhjælpes ved hjælp af en stor kugleformet AFM-sonde, der kun pålægger hydrodynamiske kræfter på overfladen af prøven20. Men selv om en sådan sonde er ideel til at teste mekaniske egenskaber af prøven21, det giver kun en sub-mikrometer opløsning ved billeddannelse af organ corti22 og stadig gælder for prøven en kraft, der kan være betydelig for de meget følsomme stereocilia bundter.
Scanning ionledningskopi (SICM) er en version af scanning sonde mikroskopi, der bruger et glas pipette sonde fyldt med en ledende løsning23. SICM registrerer overfladen, når pipetten nærmer sig cellen, og den elektriske strøm gennem pipetten falder. Da dette sker længe før du rører cellen, er SICM ideel til ikke-kontakt billeddannelse af levende celler i fysiologisk løsning24. Den bedste opløsning af SICM er på rækkefølgen af enkelte nanometer, som gør det muligt at løse individuelle proteinkomplekser ved plasmamembranen i en levende celle25. I lighed med andre scanningssondeteknikker er SICM imidlertid kun i stand til kun at afbilde relativt flade overflader. Vi overvandt denne begrænsning ved at opfinde hopping sonde ionledningsskala mikroskop (HPICM)26, hvor nanopipetten nærmer sig prøven på hvert billeddannelsespunkt (Figur 1A). Ved hjælp af HPICM, vi var i stand til at billedet stereocilia bundter i levende auditive hårceller med nanoskala opløsning27.
En anden grundlæggende fordel ved denne teknik er, at HPICM ikke kun er et billedbehandlingsværktøj. I modsætning til andre scanningssondeteknikker er HPICM/SICM-sonden en elektrode, der i vid udstrækning anvendes i cellefysiologi til elektriske optagelser og lokal levering af forskellige stimuli. Ionkanalaktivitet forstyrrer normalt ikke HPICM-billeddannelse, fordi den samlede strøm gennem HPICM-sonden er flere størrelsesordener større end den ekstracellulære strøm, der genereres af de største ionkanaler25. HPICM giver dog mulighed for præcis positionering af nanopipetten over en struktur af interesse og efterfølgende single-channel patch-clamp optagelse fra denne struktur28. Sådan fik vi de første foreløbige optagelser af enkeltkanalaktivitet ved spidsen af den ydre hårcelle stereocilia29. Det er værd at nævne, at selv en stor strøm gennem nanopipetten ikke kan producere væsentlige ændringer i potentialet på tværs af plasmamembranen på grund af enorme elektriske shunt af det ekstracellulære medium. Individuelle ionkanaler kan dog aktiveres mekanisk ved væskestrøm gennem nanopipetten30 eller kemisk ved lokal anvendelse af en agonist31.
I HPICM genereres billedet, når en nanopipet fortløbende nærmer sig prøven på et tidspunkt, trækker sig tilbage og derefter bevæger sig i sideretningen for at gentage tilgangen (Figur 1A). En patch klemme forstærker konstant anvender spænding på en AgCl ledning i pipetten (Figur 1B) til at generere en strøm på ~ 1 nA i badet løsning. Værdien af denne strøm, når pipetten er væk fra cellens overflade, bestemmes som referencestrøm (Iref, Figur 1C). Derefter flyttes pipetten i Z-aksen for at nærme sig prøven, indtil strømmen reduceres med et beløb, der er foruddefineret af brugeren (setpoint), normalt 0,2%-1% af Iref (Figur 1C, top trace). Systemet sparer derefter Z-værdien i dette øjeblik som prøvens højde sammen med X- og Y-koordinaterne for dette billedpunkt. Derefter trækkes pipetten væk fra overfladen (Figur 1C, bundspor) med en hastighed, der er defineret af brugeren, normalt 700-900 nm /ms. Efter tilbagetrækning flyttes pipetten (eller i vores tilfælde prøven - se figur 1B) sideværts til det næste billedpunkt, der opnås en ny referencestrømsværdi, og pipetten nærmer sig igen prøven og gentager processen. X-Y bevægelse af pipetten foretrækkes i en opretstående mikroskop setup, der typisk bruges til optagelser af hårcelle mechanotransduction strømme. I denne indstilling nærmer HPICM-sonden sig hårcellebundterne ikke fra toppen, men i en vinkel32. Den bedste opløsning af HPICM-billeddannelse opnås dog i en omvendt mikroskopopsætning (Figur 1A, B), hvor prøvens bevægelse i X-Y-retninger afkobles fra Z-bevægelse af nanopipetten, hvorved potentielle mekaniske genstande elimineres.
Ved hjælp af HPICM opnåede vi topografiske billeder af mus og rotte indre og ydre hår celle stereocilia bundter, og selv visualiseret forbindelserne mellem stereocilia, der er omkring 5 nm i diameter26,27. Succesen af hår celle bundt billeddannelse med denne teknik bygger på flere faktorer. For det første bør støjen (variansen) af nanopipetstrømmen være så lille som muligt for at muliggøre det lavest mulige setpoint for HPICM-billeddannelse. Et lavt setpunkt gør det muligt for HPICM-sonden at "fornemme" stereociliaoverfladen i en større afstand og i enhver vinkel til sondens tilgang og forbedrer overraskende nok X-Y-opløsningen af HPICM-billeddannelse (se Diskussion). For det andet bør vibrationerne og driverne i systemet reduceres til mindre end 10 nm, da de bidrager direkte til billedgenstandene. Endelig, selv om HPICM sonden og prøvestadiet flyttes i Z- og X-Y-akser af de kalibrerede feedbackstyrede piezo-aktuatorer, der har en nøjagtighed på et enkelt nanometer eller bedre, bestemmer nanopipettespidsens diameter spredning af strømmen (sensingvolumen) og dermed opløsningen (figur 1A). Derfor, før billeddannelse levende hårceller, er det vigtigt at trække de tilstrækkelige pipetter, nå den ønskede opløsning med kalibrering prøver, og opnå lav støj i registreringssystemet.
I mindst et par årtier har SICM-teknikken ikke været kommercielt tilgængelig, og den har kun udviklet sig af få laboratorier i verden med det førende laboratorium af prof. Korchev i Imperial College (UK). For nylig blev flere SICM-systemer kommercielt tilgængelige (se Materialetabel), som alle er baseret på de oprindelige HPICM-principper. Men, imaging stereocilia bundter i hårcellerne kræver flere brugerdefinerede ændringer, der er teknisk udfordrende (eller endda umuligt) i de lukkede "ready-to-go" systemer. Derfor er der behov for en vis komponentintegration. Da HPICM-opsætningen repræsenterer en plasterklemmeplatform med strengere vibrations- og driftskrav og en piezodrevet bevægelse af HPICM-sonden og prøven (Figur 1D), er denne integration relativt let for enhver forsker, der er dygtig til patchfastspænding. Men en videnskabsmand uden ordentlig baggrund ville helt sikkert brug for nogle uddannelse i elektrofysiologi først. På trods af de resterende udfordringer såsom at øge hastigheden af billeddannelse (se Diskussion), har vi været i stand til at billedet stereocilia bundter i levende hårceller med nanoskala opløsning uden at beskadige dem.
Dette papir præsenterer en detaljeret protokol til at udføre en vellykket HPICM billeddannelse af de levende auditive hår celle bundter i unge postnatal rotte eller mus cochlear explants ved hjælp af vores brugerdefinerede system. De integrerede komponenter er angivet i materialetabellen. Papiret beskriver også almindelige problemer, der kan opstå, og hvordan du foretager fejlfinding af dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health. Alle dyreprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky (protokol 00903M2005).
1. Fremstilling og afprøvning af nanopipetter
- Opret et program i mikropipettrækkeren for at opnå pipetter med en modstand mellem 200 og 400 MΩ, hvilket svarer til indvendige spidsdiametre på ca. 50-70 nm. Parametrene vil afhænge af mikropipette puller. Hvis du vil have korte pipetter med ikke-fleksible fine spidser, skal du se i den operationelle manual for pulleren.
- Brug borolicatglaskapillærer med ydre/indre diametre på 1/0,58 mm og en indvendig glødetråd for at lette påfyldningen. Længden af pipetten er afgørende, fordi den bestemmer hyppigheden af pipettens laterale mekaniske resonans. Jo længere er pipetten, jo lavere er resonant frekvens og jo sværere er at undgå denne resonans.
BEMÆRK: Brugeren skal forsøge at fremstille den korteste pipette, som indehaveren kan acceptere. Længden af nanopipetter i dette eksperiment er normalt 15-25 mm (Figur 2A). - Fyld nanopipetten op til midtpunktet (Figur 2A) med en badeopløsning, enten Leibovitz L-15 eller med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 20 mM D-glukose (for at justere osmolariteten). For at undgå potentielle genstande skal du bruge den samme løsning, som vil blive brugt i badet til optagelser.
- Brug et optisk mikroskop med en forstørrelse på 10x, skal du kontrollere, om der er bobler på spidsen af pipetten (Figur 2B). Boblerne ville forhindre det nuværende flow. Det er sværere at fjerne bobler i pipetterne, der er blevet trukket flere timer før eksperimentet. Derfor anbefales det at trække nye pipetter med hvert eksperiment.
- Når pipetten er fri for bobler, monteres den i HPICM-pipetteholderen (Figur 2C).
- Prøven (vævs- eller kalibreringsstandarden) anbringes på det specialbyggede kammer, og der tilsættes 4 gtL af ovennævnte badeopløsning.
- Placer det specialbyggede kammer på HPICM-stadiet, og indfør jordelektroden i opløsningen.
- Sørg for, at den spænding, der påføres pipetten af patch clamp forstærkeren er nul.
- Flyt pipetten i Z, indtil den rører væsken.
- Indstil forstærkerforskydningen til nul, og tilføj derefter +100 mV for at kontrollere pipettestrømmen.
- Beregn pipettens modstand og diameter på grundlag af Ohms lov:
R = V/I
hvor R er modstanden (MOhm), V er den spænding, der påføres nanopipetten (mV), og jeg er den strøm, der strømmer gennem nanopipetten (nA).- Pipettens indre diameter beregnes som beskrevet andetsteds i henhold til følgende formel12:
IDTip = 1000/ √R
BEMÆRK: Den ideelle modstandsværdi er mellem 200 og 400 MΩ. Pipetter med en modstand højere end 400 MΩ kan føre til en ustabil strøm på grund af deres lille størrelse (< 50 nm indre diameter). Tværtimod er pipetter med modstand mindre end 200 MΩ for store (> 70 nm indre diameter) og ville ikke løse små funktioner. Dens anbefales at starte billeddannelse med pipetter af 200 MΩ modstand, da de er lettere at fremstille og har tendens til at give mindre elektrisk støj.
- Pipettens indre diameter beregnes som beskrevet andetsteds i henhold til følgende formel12:
2. Minimering af prøvedrivere og vibrationer
BEMÆRK: For at mindske den mekaniske støj i systemet under billeddannelse skal prøverne monteres på de specialbyggede kamre, der anvender tykke glasrutschebaner (~1,2 mm):
- Fjern glasdelen af en 50 mm glasbundet skål, så plastvæggene forbliver intakte.
- Lim plastdelen af cellekulturskålen oven på den tykke glasrutschebane med siliciumlim.
- Kalibreringsprøven monteres midt i kammeret (oven på glasrutschebanen) ved hjælp af enten siliciumlim eller tyndt dobbeltsidet tape.
- Fastgør kammeret på HPICM-stadiet ved hjælp af dobbeltsidet tape.
- Under billeddannelse skal du lukke Faraday-buret og dække det med et tæppe for at minimere elektrisk interferens og termisk drift, tilsvarende.
3.Test af opløsningen med AFM kalibreringsstandarder
BEMÆRK: Det anbefales på det kraftigste at afbilde AFM-standarder (se Materialetabel), før du billeddannelse af levende celler for at fejlfinde systemet og teste dets opløsning i X-Z-Y-akserne. Kalibreringsstandarderne har siliciumdioxidsøjler og huller i forskellige former, men faste højder/dybder (dvs. 20 eller 100 nm) på en 5 x 5 mm siliciumchip. Det anbefales at starte med kalibreringsstandarden på 100 nm for at sikre, at Z-opløsningen er under 100 nm. Efter at have opnået et vellykket billede i høj opløsning af søjlerne eller hullerne i denne kalibreringsprøve (figur 3A), skal du flytte til 20 nm-standarden. Hvis billeddannelsen af sidstnævnte standard lykkes (figur 3B), er opløsningen i Z-aksen garanteret at være under 20 nm og egnet til billeddannelse af hårcellestereocilia bundter12. Følgende trin bruges til at afbilde begge kalibreringsstandarder.
- Fastgør kalibreringsstandarden til kammeret med siliciumlim.
- Der tilsættes 4 mL HBSS til kammeret for at dække kalibreringsprøven. Fastgør derefter kammeret til XY-stadiet i HPICM-opsætningen ved hjælp af dobbeltsidet tape.
- Fastgør jordelektrodens magnetiske holder fast til scenen nær kammeret, og sænk elektroden i badopløsningen (Figur 1B).
- Monter nanopipetten i holderen, sænk den i badeopløsningen, og indstil dens strøm til ~1 nA efter de trin, der er beskrevet i afsnit 1.
- Placer nanopipetten ca. over midten af kalibreringsstandarden ved hjælp af en kursus patch-clamp manipulator. Visuel inspektion er normalt nok til denne positionering, da det område, der er omfattet af siliciumdioxidstrukturer, er relativt stort (1 x 1 mm). I modsætning til Corti explants-organet (se nedenfor) er kalibreringsstandarden uigennemsigtig, og det er derfor ikke muligt at placere en mere præcis positionering styret af optisk billeddannelse for denne prøve.
- Forøg setpointet, mens du overvåger signalet fra sensoren på Z piezo-aktuatoren på et oscilloskop i realtid. Efter at have etableret en stabil gentagelig Z-tilgangscyklus (som i figur 1C, nederst), skal du reducere setpointet til den værdi, der ligger lige over ustabilitetspunktet. Denne procedure vil sikre det optimale setpoint for netop denne nanopipette.
- Flyt pipetten ned med en hastighed på ~5 μm/s med en plasterklemmemikromanipulator, indtil den når prøven. I øjeblikket vil bundniveauet i realtidS Z-positioneringssignalet (Figur 1C) stige, hvilket indikerer, at nanopipetten trækkes tilbage på grund af "sensing" af prøveoverfladen. Enhver yderligere bevægelse af nanopipetten vil resultere i yderligere positiv forskydning af Z-positioneringssignalet.
BEMÆRK: Pas på ikke at overskride den øvre grænse for Z piezo aktuator bevægelse. - Start billedbehandling ved lav opløsning (se tabel 1). På grund af ujævn montering af AFM-standarden kan det højeste punkt i interesseområdet være ukendt. Sæt derfor amplituden af pipette tilbagetrækning (hop amplitud) til mindst 200-500 nm.
- Når det højeste punkt i prøven i billeddannelsesområdet er identificeret, skal du reducere humle amplituden. En mindre hop amplitud giver mulighed for hurtigere scanning, som foretrækkes til høj opløsning billeddannelse på grund af formindskede virkninger af driver og nedsat vibration.
- Før pipetten flyttes til et nyt X-Y-sted, trækkes den ca. 200 μm tilbage i Z-aksen for at forhindre uønskede kollisioner med prøven.
BEMÆRK: I tilfælde, hvor nanopipetten ikke er på linje med midten af kalibreringsstandarden, er det muligt, at scanningen starter lige ved overfladeegenskabernes areal. - Når interesseområdet er fundet, skal du starte billeddannelse med en højere opløsning (se tabel 1).
4. Fremstilling af specialbyggede kamre for at sikre cochlear explants
BEMÆRK: Monter cochlear explants i kamrene med specialbyggede fastspændingssystemer, der anvender enten fleksible glaspipetter (trin 4.1) (Figur 4A) eller tandtråd (trin 4.2) (Figur 4B). Glaspipettekammeret kunne steriliseres og bruges til Cortis dyrkede organer, mens tandtrådskammeret giver en mere sikker opbevaring af prøven og en kontrol over stereocilia bundt orientering under montering. Disse specialbyggede kamre skal forberedes på forhånd, men de kan rengøres og genbruges i flere billedbehandlingssessioner.
- Lav et kammer ved hjælp af fleksible glaspipetter
- Træk to tynde og fleksible glasfiber fra glas kapillærer ved hjælp af en pipette puller. Vores trak glasfiber måler typisk 1 til 2 cm i længden og er ret fleksible.
- Placer en lille dråbe af silikone elastomer på toppen af et glas coverlip. Brug dæksler på 2 cm i diameter.
- Placer enderne af to glasfiber på silikone dråbe og arrangere fibrene til at have en lille grad af adskillelse mellem dem (Figur 4A).
- Placer coverlip på en kogeplade for hurtigt at helbrede elastomeren (1 til 3 min).
- Lim dækslen på glasbunden af kammeret, der er beskrevet i afsnit 2, med en lille mængde (1-3 μL) silikoneelastomer, så den kan helbrede natten over.
- Fremstilling af et kammer ved hjælp af tandtråd:
- Fjern glasdelen af en 50 mm glasbundet skål, så plastvæggene forbliver intakte. Lim derefter plastdelen af cellekulturskålen oven på en 1,2 mm tyk glasrutschebane med siliciumlim.
- Monter en plastdæksel (6,5 x 6,5 mm) med den samme lim til midten af kammeret. Gentag derefter processen med en anden coverslip oven på den foregående.
- Monter to små wolfram eller forgyldte ledninger (12 mm længde og ~ 0,5 mm i diameter) med silicium lim, hver på modsatte sider af dækslet dias. Lim dem langt nok (> 10-15 mm) fra dækslet dias (Figur 4B).
- Adskil to tandtråd tråde og placere dem på toppen af dækslet dias og sikre dem til ledningerne ved at gøre en knude. Efterlad et lille mellemrum mellem begge tråde(Figur 4B, korte pile).
- Rengør kamrene efter hver brug
- Fjern forsigtigt vævet fra kammeret ved hjælp af fine pincet og skrab eventuelt vævsrester, der er efterladt.
- Skyl kammeret først med 70% ethanol og derefter med destilleret vand.
- Gentag skyllecyklussen, hvis det er nødvendigt.
- Placer kammeret på hovedet på et filterpapir for at lade det tørre indtil næste eksperiment. Kamrene behøver ikke at blive steriliseret, medmindre dyrkning af Cortis organ er planlagt efter billeddannelsen.
5. Dissekere gnaverorganet i Corti
- Udfør dissektion af de unge postnatal cochlear explants som beskrevet i detaljer andre steder13.
- Ved HPICM-billeddannelse dissekeres Cortis organ fra mus mellem postnatal dag 3 og 6 (P3-6) og fra rotter mellem postnatal dag 3 og 8 (P3-8).
BEMÆRK: Ældre hårceller er mere modtagelige for skaden under dissektion og kan derfor ikke bruges i timelange tid bortfalder HPICM billeddannelse. - Glem ikke at fjerne brystmembranen før HPICM-billeddannelse.
- Umiddelbart efter dissektionen fastgøres vævet i et af de i afsnit 4 beskrevne kamre, enten under de fleksible glaspipetter eller under de to tandtrådsstrenge (figur 4). Fyld disse kamre med 4 mL af rumtemperaturbadopløsningen (for at minimere bobledannelse).
6. Billeddannelse af de auditive hårceller
- Monter kammeret med et friskisoleret organ af Corti på X-Y piezo-scenen ved hjælp af dobbeltsidet tape, og sørg for, at det er fast fastgjort for at minimere kammerdrift i X- og Y-akser (Figur 1B).
- Følg trinene i afsnit 1 for at placere en ny nanopipette og kontrollere, om der er den korrekte pipettemodstand.
- Brug patch clamp mikromanipulator, position nanopipette over håret celle regionen, mens observere organ Corti explant i en omvendt mikroskop.
- Kontroller, om systemet er stabilt med et setpoint på 0,5 % eller lavere ved at registrere realtidsstrømmen og Z-positioneringssignalet på oscilloskopet (som i figur 1C). Hvis Z-signalet ikke er stabilt, skal du forsøge at reducere cutofffrekvensen for patchklemmens filter. Det kan dog ikke være lavere end svartiden for Z piezo aktuator (for at undgå pipettekollision med prøven på grund af forsinkede strømaflæsninger).
BEMÆRK: I praksis viser det sig, at 5 kHz-indstillingen af dette filter er optimal. Det er bedre at udskifte nanopipetten, hvis Z-signalet stadig er ustabilt. - Når en stabil optagelse er opnået, skal du bestemme det optimale setpunkt og nærme prøven med HPICM-pipetten som beskrevet i trin 3.6-3.7 ovenfor.
- For det første skal du udføre lavopløsningsbilleddannelse (se tabel 1) ved hjælp af en hop amplitud på mindst 6 til 8 μm. For at forestille høje strukturer såsom hår celle stereocilia bundter, sørg for, at hop amplituden er nok til at undgå kollision med disse strukturer.
BEMÆRK: Hvis hop amplituden ikke er nok, vil pipetten ikke være i stand til at hoppe over et stereocilium, og der vil være en forestående kollision. Kollisionen af HPICM-sonden med et stereocilium kan beskadige hårbundtet. Derfor, i tilfælde, hvor højden af stereocilia bundtet er usikker, skal du bruge en større hop amplitud. - Bliv fortrolig med topografien i Cortis orgel ved først at udføre og/eller studere billeder, der er opnået ved scanning af elektronmikroskopi (Figur 5).
BEMÆRK: Hvis HPICM-billedet er ensartet med højder, der er mindre end 1 μm i hvert billedpunkt, scanner pipetten sandsynligvis glasbunden og ikke vævet. Alternativt kan pipetten "lande" på en anden region af cochlear explant, væk fra hårcellerne. - Hvis pipetten skal flyttes til et nyt X-Y-sted, skal du trække den ca. 500 nm tilbage for at undgå kollisioner med høje træk i vævet. Gentag HPICM-billeddannelse med lav opløsning, indtil området af interesse med hårcellerne er fundet.
- Når interesseområdet er fundet, skal du starte billeddannelse med en højere opløsning (se tabel 1). Prøv at bruge mindre end 15 min, når billeddannelse en hel hår bundt.
BEMÆRK: Hårcellebundterne i det levende væv er ikke stadig, men kan ændre deres orientering, for eksempel på grund af formændringer i de underliggende understøttende celler. Derfor kan billederne udstille bevægelsesgenstande, hvis billederhvervelsen er for langsom. - Endnu en gang skal du bestemme de højeste funktioner i billederne med lav opløsning før den faldende hop amplitude til billeddannelse i høj opløsning. For et område af interesse, der dækker hele hår celle bundt, reducere hop amplitud til 4-5 μm, mens for en relativt lille og "flad" region i bundtet (f.eks 2 x 2 μm) reducere hop amplituden endnu mere, ned til mindre end 1 μm, hvilket øger hastigheden og opløsningen af billeddannelse.
7. Billedbehandling
BEMÆRK: Billedartefakter er almindelige i HPICM-billeddannelse. Nogle af dem kan korrigeres af parametre for billedopsamling, mens andre kræver efterbehandling enten med en specialiseret SICM-fremviser eller med mere generelle databehandlingsprogrammer som ImageJ eller MatLab. Her beskriver vi de mest almindelige genstande, og hvordan vi løser dem med SICM-fremviser.
- Udfør hældningskorrektion
BEMÆRK: Det er ikke indlysende for en nybegynder, men det menneskelige øje kan ikke løse submikrometerstørrelsesfunktioner på overfladen af en celle, hvis billeddannelsesområdet har en samlet hældning af samme eller større størrelse (Figur 3A,B, til venstre). Derfor er det nødvendigt at bestemme den gennemsnitlige hældning af et afbildet område (ved at montere HPICM 3D-billeddata på et enkelt plan) og trække det fra HPICM-billedet (Figur 3A,B, midten).- Klik på Åbn for at åbne et billede med SICM-fremviser.
- Vælg fanen Billedkorrektion.
- Vælg fanen Ret hældning.
- Tryk på knappen Korrekt hældning for at få en automatiseret hældningskorrektion.
- Udfør linjejustering
BEMÆRK: Som tidligere nævnt udgør mekaniske og/eller termiske drifter samt cellebevægelsesgenstande et betydeligt problem i HPICM-billeddannelse. En lille drift med en hastighed på mindre end et mikrometer i minuttet er normalt ikke mærkbar i en almindelig patch klemme setup. Men det kunne producere artefakter af flere snese nanometer i HPICM billeddannelse, som er betydeligt større end opløsningen af HPICM. Derfor er det ikke ualmindeligt at støde på pludselige spring i Z-aksen mellem to tilstødende HPICM-scanningslinjer under billeddannelse. Dette kan korrigeres ved at analysere forskelle mellem start (og/eller slutning) Z-værdier i disse tilstødende scanningslinjer.- Klik på Åbn for at åbne et billede med SICM-fremviser.
- Vælg fanen Billedkorrektion.
- Vælg fanen Ret hældning.
- Vælg bredden på de linjer, der skal justeres. Tryk på knappen ButtonDestripeLineFit for at få en automatisk linjejusteringskorrektion.
- Udfør støjreduktion
BEMÆRK: Mens du får billeder med HPICM, kan små udsving i nanopipetstrømmen føre til, at nanopipetten stopper langt fra prøvens overflade, især med lave setpoints. Det resulterer i udseendet af små hvide prikker i billedet. For at rette denne billedartefakt er det nødvendigt at identificere billeddannelsespunkterne med Z-værdien betydeligt større end naboernes og erstatte denne værdi med et gennemsnit af naboerne. Dette gøres ved hjælp af et justerbart medianfilter.- Klik på Åbn for at åbne et billede med SICM-fremviser.
- Vælg fanen Billedbehandling.
- Vælg fanen Støjreduktion.
- Angiv thresholdfilteret (μm) for de pixel, der skal fjernes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres i dette papir kan bruges til at visualisere eventuelle levende celler med kompleks topografi. Efter disse trin, vi rutinemæssigt få billeder af levende rotte auditiv hår celle bundter (Figur 6B,D). På trods af at have lavere X-Y opløsning i forhold til SEM-billeder, kan vores HPICM-billeder med succes løse de forskellige rækker af stereocilia, formen af stereocilia tips, og selv de små links (~ 5 nm i diameter) forbinder tilstødende stereocilia (Figur 6F). Derudover har HPICM-billeder oplysninger i 3D, som SEM-billeder mangler. I betragtning af den ikke-kontaktmæssige karakter af denne type billeddannelsesteknik var vi også i stand til at udføre kontinuerlig time-lapse HPICM-billeddannelse af den samme hårcellebundt i flere timer (dvs. 5-6 timer regelmæssigt) uden at beskadige bundtets sammenhængskraft (Figur 7). Således hpicm udviser et stort potentiale for studiet af dynamiske strukturelle ændringer af hårcelle bundter over tid.
Selvom vi leverer flere intervaller for pipettestørrelse, nuværende setpoint, lav- og højopløsningsparametre og hop amplituder, skal hver bruger muligvis optimere deres indstillinger lidt for at få vellykkede HPICM-billeder af levende hårcellebundter. Mindre setpoints giver billeder i bedre kvalitet. Men med et meget lavt setpunkt kan systemet fortolke små udsving i strømmen som støder på celleoverfladen, og dette vil føre til den "hvide prik" støj i billedet (Figur 8A). På samme måde kan store hop amplituder øge pipettens laterale resonans og også producere støjende pixels (Figur 8B). Hvis humlegraden derimod er for lille, eller setpunktet er for højt, kan nanopipetten kollidere med prøven og føre til billeddannelsesgenstande eller endda beskadige hårbundtet (Figur 8C, D). Vi anbefaler, at du udfører billeddannelsen ved lavere opløsning, mens du justerer alle disse parametre for at minimere skader på prøven eller på nanopipetten.
Figur 1: Principper for hoppende sondeionledningsmikroskopi (HPICM). (A) En elektrisk strøm, der passerer gennem nanopipetten, genererer et "sensingvolumen" på spidsen af pipetten. For at afbilde komplekse strukturer som hårcellestereocilia bundter, pipetten nærmer sig celleoverfladen ovenfra og trækker sig tilbage efter at have opdaget overfladen. Efter en lateral bevægelse ved hvert trin fortsætter pipetten med at "hoppe" over prøven, der genererer billedet af cellen. Bemærk, at humle amplituden skal være tilstrækkelig til, at pipetten kan "klatre" til et stereocilium. Illustreret hop amplitud ville arbejde for venstre mod højre scanning (fra mindste til en højeste stereocilium, angivet med en pil). Det er dog for lille til højre mod venstre scanning, når pipetten møder det højeste stereocilium først. (B) Eksperimentel opsætning. Et skræddersyet kammer med corti explant-orglet er monteret på et XY nanopositioneringsstadium med en blænde til optisk mikroskopiobservation. Nanopipetten flyttes af en separat ultrahurtig Z piezo-aktuator. For at placere nanopipetten over interesseområdet er Z-aktuatoren monteret på en konventionel mikromanipulator (ikke vist) sammen med plasterklemmens forstærker headstage. Jordelektrode monteres på en magnetisk holder og indsættes i badet. (C) Repræsentative optagelser af pipettestrømmen (topspor) og Z-positionen af pipetten (bundspor) under billeddannelsen. Når pipetten er væk fra celleoverfladen, bestemmes referenceværdien for den strøm, der passerer gennem pipetten (Iref). Derefter flyttes pipetten mod prøven (tilgang). Når "sensingvolumen" møder celleoverfladen, begynder pipettestrømmen at falde. Kommandoen for tilbagetrækning udstedes, når det aktuelle fald når et setpoint, som typisk er 0,2% - 1% af jegref. (D) Skemaer over det udstyr, der skal føjes til en konventionel patch clamp setup til HPICM billedbehandling. En dedikeret patch clamp forstærker registrerer nanopipette strøm (I), der bruges af SICM controller i HPICM-tilstand til at generere kommandosignaler til X, Yog Z akser. Instrumentering forstærker giver offset, skalering, og lav pass filtrering til disse signaler, hvis det er nødvendigt. Desværre kan X/Y/Z-signaler fra controlleren ikke påføres direkte på piezo-aktuatorerne på grund af store fejl forårsaget af hysterese og krybende, der er iboende for piezokeramik. Derfor har hver piezo aktuator (oversættelse fase) en indbygget bevægelsessensor, der sender feedback signal til proportional-integral-afledte (PID) controller, der præ-former kommandosignalet til at korrigere for disse fejl. Bemærk, at relativt langsomme X- og Y-akser kan bruge PID-controllere, der er indbygget i piezoforstærkeren, mens en hurtigere Z-akse kræver en dedikeret hurtig PID-controller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Nanopipette fabrikation og påfyldning. (A) En ca. 2 cm lang nanopipette fyldt med intrapipetteopløsningen (HBSS). (B) Et billede af boblen (pilen), der typisk dannes efter påfyldning af pipetten. Boblen normalt bevæger sig væk inden for få minutter af mikroskop belysning (en LCD digitalt mikroskop på 10x). (C) En nanopipette monteret i SICM-hovedet. Pilen peger på AgCl-elektroden inde i pipetten. Bemærk, at pipetteholderen er sølvmalet og jordet for at minimere strålende elektrisk afhentning fra Z piezo-aktuatoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billeddannelse af AFM kalibreringsstandarder for at bestemme tilstrækkelig stabilitet, vibrationsisolering og elektrisk støj i systemet. (A) Rå (venstre), efterbehandlede (midterste) og 3D (højre) billeder af HS-100MG kalibreringsstandarden. Standardens overfladeprofil vises skematisk øverst. Da standarden aldrig er justeret perfekt vinkelret på nanopipetten, er efterbehandlingshældningskorrektionen nødvendig for at afsløre små lodrette træk ved prøven. (B) Lignende rå (venstre), efterbehandlede (midten) og 3D (højre) billeder af HS-20MG kalibrering standard, der har mindre, 20-nm dybe indrykninger. Bemærk, at gråtoneskalaen af en pixel i et HPICM-billede angiver prøvens højde på det pågældende tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Montering af Cortis organ explant. (A) Explant holdes af to glas pipetter, der er limet til glasbundet Petriskål. (B) Explant er sikret ved to tandtråd tråde (korte pile) i en skræddersyet billedbehandling kammer. Indsat viser forstørret billede af cortis orgel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Navigation af HPICM-sonden til hårcelleområdet. (A) SEM-billede af den cochlear explant, der viser rækker af indvendige (IHCs) og ydre (OHCs) hårceller og forskellige typer af understøttende celler. (B) Repræsentativt HPICM-billede af cellerne i Kollikers organ. (C) Et HPICM-billede af Hensens celler. Bemærk, at disse to typer af bærende celler har meget forskellige former, som hjælper med at afgøre, om HPICM sonden landede til et område, der er radial eller perifert til hårcellerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Sammenligning mellem scanning af elektronmikroskopi (SEM) og hoppende ionledningsmikroskopi (HPICM) af stereocilia bundter i unge postnatal gnaver indre hårceller. (A,C) SEM-billeder giver sub-nanometer opløsning af overfladedetaljerne, men i de celler, der er faste og skrumpet på grund af kritisk punkttørring. Derudover tillader SEM-billeder ikke 3D-analyse. (B,D) HPICM-billeder (venstre) har en dårligere opløsning (~ 5-10 nm), men de opnås i levende celler, tillader tid bortfalder billeddannelse, og bære oplysninger om nøjagtige højder, som giver mulighed for 3D-rekonstruktion og målinger (højre). (E,F) Ekstracellulære forbindelser mellem stereocilia er tydelige i både SEM (E) og HPICM (F) billeder (pile). Celle aldre: A, postnatal dag 5 (P5) mus; B, P6 rotte; C, P8 mus; D, P5 rotte; E, P7 mus; og F, P5 rotte. I alle HPICM-billeder angiver gråtoner af en pixel højden på prøven på det pågældende tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kontinuerlig tid bortfalder HPICM-billeddannelse af stereocilia bundt. (A) En oversigt over en indre hårcelle bundt fra P5 rotte viser forskellige kortere række stereocilia. (B) Tidsforsenende billeddannelse i det pågældende område i (A) i løbet af seks timer. Bemærk, at i modsætning til en typisk patch camp eksperiment, hårcellerne viser ingen tegn på forringelse i flere timer in vitro. Dette skyldes omhyggelig dissektion og fraværet af mekaniske forstyrrelser i cellen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Almindelige genstande under billedbehandling med HPICM. (A) Effekten af et for lavt setpunkt. HPICM-billeder med lav opløsning af de samme levende indre hårcellebundter i P3-mus, der er erhvervet med setpoint 0,05 % (venstre) og 0,07 % (højre). Bemærk en hvid prikstøj, der forsvinder med et højere setpoint. (B) Effekt af en for høj hop amplitude. Hvid prikstøj optræder også i et HPICM-billede af et P7-rotteindhåret hårcellebundt, der er opnået med en stor hop amplitud på 5,8 μm (venstre). Denne støj forsvinder, når den samme bundt er afbildet med hop amplituden på 3,4 μm (højre) på grund af faldet i vibrationer i systemet. (C) For lav humle amplitud resulterer i kollidering af HPICM sonden til stereocilia og trække dem (pile på venstre panel). Forøgelse af hop amplituden lige nok til at "klatre over" stereocilia eliminerer denne artefakt (højre), men kan også øge billeddannelsestiden, hvilket resulterer i en mærkbar drift (lodrette linjer i højre panel). Stereocilia bundt af en levende ydre hår celle fra P7 rotte. (D) For højt setpunkt forårsager en kvadreret form af stereociliaspidser (pile) i et HPICM-billede (til venstre) igen på grund af kollidering af nanopipetten til stereocilia. Faldende setpoint (med samtidig fald i håb amplituden for at fjerne hvid støj) forbedrer billeddannelse (højre). Stereocilia bundt af en levende indre hår celle fra P6 rotte. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Opløsning | Billedområde (μm) | Sideopløsning (nm) | Tid pr. billede (minutter) |
| Lav | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| Lav | 10×10 | ≥156 | ≤15 |
| Lav | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| Høj | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| Høj | 10×10 | ≤110 | ≤15 |
| Høj | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
Tabel 1: Typiske tidspunkter for HPICM-billeddannelse afhængigt af billedbehandlingsområdets størrelse og scanningsopløsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå vellykkede HPICM-billeder skal brugerne etablere et system med lav støj og lav vibration og fremstille passende pipetter. Vi anbefaler på det kraftigste, at der anvendes AFM-kalibreringsstandarder for at teste systemets stabilitet, før du forsøger at udføre strømbilleddannelse. Når opløsningen af systemet er testet, brugere kan overveje billeddannelse fast organ corti prøver til at blive fortrolig med billeddannelse indstillinger, før du forsøger nogen levende celle billeddannelse.
Det optimale setpoint til billeddannelse varierer mellem forskellige pipetter, afhængigt af den individuelle form af deres spidser (det er ukendt, indtil det undersøges af elektronmikroskopi) og på mængden af snavs, der er fastgjort til spidsen, hvilket også er uforudsigeligt. Nanopipetter med et optimalt setpoint på over 0,7 % bør kasseres.
Under billeddannelse af levende celler øges mængden af støv og snavs i den ekstracellulære opløsning over tid. Alle disse partikler kan ende på spidsen af pipetten, hvilket forårsager en reduktion i strømmen og gør det umuligt at fortsætte med at scanne vævet - billedet bliver helt hvidt, da feedbacken vil "tænke", at nanopipetten altid er i nærheden af prøven. Hvis dette sker, anbefales det at trække pipetten i Z-aksen tilbage fra det pågældende område af vævet. Denne tilbagetrækning kunne rydde "dirtiness". Hvis pipetten stadig er snavset, er det nødvendigt at ændre pipetten og flytte til et andet område af prøven. Derefter kan brugeren fortsætte med at scanne vævet.
Fra i dag er den mest væsentlige begrænsning af HPICM den tid, der kræves for at tage et billede i høj opløsning, mens du arbejder med prøver med kompleks topografi. Afhængigt af den ønskede opløsning kan billeder tage op til en halv time eller mere. I billeder erhvervet i mere end femten minutter kan afdriften blive tydelig, og specifikke strukturer kan flyttes og sværere at skelne. Dette sker, fordi de levende celler konstant bevæger sig eller ændrer deres form over tid. For at visualisere molekylære hændelser og ændringer i cellernes strukturer over tid er der behov for yderligere udvikling for at optimere den tidsmæssige opløsning af HPICM11.
Støjen fra nanopipettestrømmen repræsenterer en anden begrænsning, fordi den sætter det minimale praktisk opnåelige setpoint. Den strøm, der genereres af nanopipetten i opløsningen, dæmper hurtigt (omvendt proportional med den kubiske afstand fra pipettespidsen) og etablerer derved et "sensingvolumen", ud over hvilken nanopipetten ikke kan "fornemme" overfladen. Vi har tidligere udviklet en model af dette fænomen og viste, at sicm-sondens laterale opløsning bestemmes af tværsnit af dette "sensing volume" med celleoverfladen, som kan være ekstremt lille ved lave setpoints25. Dette er især vigtigt for billeddannelse hår celle tip links, der har en diameter på ~ 5 nm12,33. Ved første øjekast ville pipetterne med mindre indvendig diameter resultere i bedre opløsning af HPICM-billeddannelse. Dette gælder faktisk for relativt store pipetter (>50 nm). Men faldende den indre diameter af nanopipetten under ~ 50 nm resulterer i utilportelt stor stigning i pipette støj og dermed tab af opløsning på lave setpoints, der er afgørende for billeddannelse stereocilia bundter. Fra i dag ved vi ikke, hvordan vi løser dette problem, og vi arbejder på at finde den rigtige løsning.
Sammenfattende præsenterer dette papir en detaljeret protokol til visualisering af stereocilia bundter i levende pattedyr auditive hårceller med HPICM. De største fordele ved HPICM er: i) dets evne til at visualisere etiketfrie nanoskalastrukturer på overfladen af levende celler uden at røre ved dem; og ii) at sondere disse strukturers funktion med patch clamp-optagelser og/eller lokal nanoskalalevering af mekaniske eller kemiske stimuli. Så vidt vi ved, er disse fordele unikke for HPICM. Selvfølgelig er der nogle ulemper. For det første, på grund af begrænsninger på højden af de strukturer, der skal afbildes, HPICM kan ikke være egnet til billeddannelse ekstremt høje strukturer, såsom stereocilia bundter af de vestibulære hårceller i pattedyr ampullae. For det andet er HPICM stadig under udvikling, og der er behov for yderligere forbedringer i billeddannelseshastigheden og opløsningen. Men de fysiske principper for HPICM og vores egne erfaringer tyder på, at det er muligt. Vi tror på, at HPICM vil give unikke data om funktionen af individuelle proteinkomplekser på stereociliaoverfladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) for den langsigtede støtte og rådgivning i alle faser af projektet. Vi takker også Drs. Pavel Novak og Andrew Shevchuk (Imperial College, UK) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rusland) for deres hjælp til softwareudvikling. Undersøgelsen blev støttet af NIDCD/NIH (R01 DC008861 og R01 DC014658 til G.I.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
