Summary
הגנום מאורגן במרחב הגרעיני למבנים שונים שניתן לגלות באמצעות טכנולוגיות לכידת קונפורמציה כרומוזומית. שיטת Hi-C בגרעין מספקת אוסף רחב של אינטראקציות כרומטין בקווי תאים של Drosophila, אשר מייצר מפות מגע שניתן לחקור ברזולוציית מגה-בסיס ברמת שבר ההגבלה.
Abstract
הגנום מאורגן לתחומים המקשרים טופולוגית (TADs) המופרדים על ידי גבולות המבודדים אינטראקציות בין תחומים. בדרוסופילה, המנגנונים שבביד היווצרות TAD וגבולות עדיין נמצאים תחת חקירה. היישום של שיטת Hi-C בגרעין המתוארת כאן עזר לנתח את הפונקציה של חלבון אדריכלי (AP) -מחייב אתרים בגבולות TAD בידוד הגן חריץ. שינוי גנטי של גבולות תחום הגורמים לאובדן APs גורם היתוך TAD, פגמים תמלול, ושינויים טופולוגיים ארוכי טווח. תוצאות אלה סיפקו ראיות הממחישים את תרומתם של אלמנטים גנטיים להיווצרות גבולות תחום ובקרת ביטוי גנים בדרוסופילים. כאן, שיטת Hi-C בגרעין תוארה בפירוט, המספקת מחסומים חשובים להערכת איכות הניסוי יחד עם הפרוטוקול. כמו כן מוצגים המספרים הנדרשים של קריאות רצף וזוגות Hi-C חוקיים לניתוח אינטראקציות גנומיות בקנה מידה גנומי שונה. עריכה גנטית בתיווך CRISPR/Cas9 של אלמנטים רגולטוריים ופרופיל ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גנומיות באמצעות פרוטוקול Hi-C זה בגרעין יכול להיות שילוב רב עוצמה לחקירת התפקוד המבני של אלמנטים גנטיים.
Introduction
באאוקריוטים, הגנום מחולק לכרומוזומים התופסים שטחים ספציפיים במרחב הגרעיני במהלךאינטרפאזה 1. הכרומטין היוצר את הכרומוזומים ניתן לחלק לשני מצבים עיקריים: אחד של כרומטין נגיש כי הוא מתירני תמלול, והשני של כרומטין קומפקטי כי הוא דיכוי תמלול. מצבים כרומטין אלה מפרידים ורק לעתים רחוקות מתערבבים במרחב הגרעיני, ויוצרים שני תאים נפרדים בגרעין2. בסולם תת-בסיס, גבולות גבולות נפרדים תחומים של אינטראקציות כרומטין בתדר גבוה, הנקראות TADs, המסמנות ארגון כרומוזומלי3,4,5. ביונקים, גבולות TAD תפוסים על ידי לכידות וגורם מחייב CCCTC (CTCF)6,7,8. מתחם הלכידות מבלט כרומטין ועוצר באתרי כריכת CTCF הנזרקים בכיוון מתכנס ברצף הגנומי כדי ליצור לולאות כרומטין יציבות9,10,13,14. הפרעה גנטית של אתר כריכת DNA CTCF בגבולות או הפחתה בשפע חלבון CTCF ו cohesin גורמת אינטראקציות חריגות בין אלמנטים רגולטוריים, אובדן היווצרות TAD, הסרת פיקוח ביטויגנים 9,10,11,13,14.
בדרוסופילה, הגבולות בין ה-TADs תפוסים על ידי מספר APs, כולל גורם אלמנטי גבולי 32 kDa (BEAF-32), מוטיב 1 חלבון מחייב (M1BP), חלבון צנטריוזיal 190 (CP190), מדכא של כנף שעירה (SuHW) ו- CTCF, והם מועשרים בשינויי היסטון פעילים ופולימראז II16,17,18. הוצע כי ב Drosophila, TADs מופיעים כתוצאה של תמלול13,17,19, ואת התפקיד המדויק של APs עצמאיים היווצרות גבולות תכונות בידוד עדיין תחת חקירה. לכן, אם תחומים Drosophila הם תוצאה בלעדית של צבירת אזורים של מדינות תמלול דומות או אם APs, כולל CTCF, לתרום היווצרות גבולות נשאר להיות מאופיין במלואו. חקר מגעים גנומיים ברזולוציה גבוהה התאפשר באמצעות פיתוח טכנולוגיות לכידת קונפורמציה כרומוזומית בשילוב עם רצף הדור הבא. פרוטוקול Hi-C תואר לראשונה עם שלב קשירה שבוצע "בפתרון"2 בניסיון להימנע ממוצרי קשירה מזויפים בין שברי כרומטין. עם זאת, מספר מחקרים הצביעו על ההבנה כי האות השימושי בנתונים הגיע ממוצרי קשירה שנוצרו בגרעינים lysed חלקית שלא היו בפתרון20,21.
הפרוטוקול שונה לאחר מכן כדי לבצע את החיבור בתוך הגרעין כחלק מניסוי Hi-C של תא יחיד22. פרוטוקול Hi-C בגרעין שולב לאחר מכן באוכלוסיית התאים Hi-C כדי להניב כיסוי עקבי יותר על פני הטווח המלא של מרחקים גנומיים ולייצר נתונים עם פחות רעש טכני23,24. הפרוטוקול, המתואר בפירוט כאן, מבוסס על האוכלוסייה בגרעין פרוטוקול Hi-C23,24 ושימש כדי לחקור את ההשלכות של הסרה גנטית של מוטיבים מחייבי DNA עבור CTCF ו- M1BP מגבול תחום בלוקוס גן חריץ בדרוסופילה25. התוצאות מראות כי לשינוי מוטיבים מחייבי DNA עבור APs בגבול יש השלכות דרסטיות על היווצרות תחום Notch, פגמים טופולוגיים גדולים יותר באזורים המקיפים את לוקוס חריץ, והסרת הפיקוח על ביטוי הגנים. זה מצביע על כך אלמנטים גנטיים בגבולות התחום חשובים לשמירה על טופולוגיית הגנום וביטוי גנים ב Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קיבעון
- התחל עם 10 מיליון תאי קו 2 פלוס (S2R+) של שניידר כדי להכין 17.5 מ"ל של השעיית תא במדיום שניידר המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף פורמלדהיד ללא מתנול כדי להשיג ריכוז סופי של 2%. מערבבים ודגרה במשך 10 דקות ב RT, דואג לערבב כל דקה.
הערה: פורמלדהיד הוא כימיקל מסוכן. פעל בהתאם לתקנות הבריאות והבטיחות המתאימות, ועבוד במכסה המנוע של האדים. - להרוות את התגובה על ידי הוספת גליצין כדי להשיג ריכוז סופי של 0.125 M ומערבבים. דגירה במשך 5 דקות ב RT, ואחריו 15 דקות על קרח.
- צנטריפוגה עבור 400 × גרם ב RT במשך 5 דקות ולאחר מכן במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F); להשליך את סופר-טבעי. resuspend הכדור בזהירות ב 25 מ"ל של תמיסת מלח קר 1x פוספט חוצץ.
- צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F), ולאחר מכן להשליך את supernatant.
הערה: אם תמשיך בפרוטוקול, עבור לשלב 2.1 עבור תמיס; אחרת, פלאש להקפיא את הכדור בנוזל N2 ולאחסן את הכדור ב -80 °C (80 °F).
2. ליסיס
- resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה קר כקרח (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0.2% של פעילי שטח לא יוניים (ראה את טבלת החומרים); 10 mM NaCl; מעכבי פרוטאז 1x), ולהתאים את הנפח ל 10 מ"ל עם חיץ תמוגה קר כקרח. כוונן את עוצמת הקול כדי לקבל ריכוז של 1 × 106 תאים / מ"ל. דגירה על קרח במשך 30 דקות, ערבוב כל 2 דקות על ידי היפוך הצינורות.
- צנטריפוגות הגרעינים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F), ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant. לשטוף את הכדור 1x עם 1 מ"ל של חוצץ תמוגה קרה, ולהעביר אותו צינור microcentrifuge. לשטוף את הכדור 1x עם 1 מ"ל של חיץ הגבלה 1.25x קר, ו resuspend כל גלולה תא ב 360 μL של 1.25x חוצץ הגבלה.
- הוסיפו 11 מיקרו-אל של 10% נתרן דודסיל סולפט (SDS) לכל צינור (0.3% ריכוז סופי), ערבבו בזהירות על ידי צנרת, ודגרה ב 37 °C במשך 45 דקות, רועד ב 700-950 סל"ד. צנרת למעלה ולמטה כדי לשבש גושים כמה פעמים במהלך הדגירה.
- להרוות את SDS על ידי הוספת 75 μL של פעילי שטח לא יוניים (פתרון 10%, לראות את טבלת החומרים) לכל צינור (1.6% ריכוז סופי), ודגורה ב 37 °C (45 דקות, רועד ב 950 סל"ד. צנרת למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבש גושים במהלך הדגירה.
הערה: אם גושים גדולים וקשים לשבש, להקטין את המהירות המסתובבת ל 400 סל"ד במהלך SDS וטיפולים פעילי שטח. אם קשה לפרק את הגושים על ידי צנרת, לפצל את המדגם לשניים; לכוונן את אמצעי האחסון של מאגר ההגבלות, ה-SDS ופעיל הפעילות; ולהמשיך עם ההחלמה. לאחר מכן, לסובב את הגרעינים במהירות מינימלית (200 × גרם),בזהירות להשליך את supernatant, לאגד את הדגימות יחד חוצץ הגבלה 1X, ולהמשיך עם העיכול. קח aliquot 10 μL כמו מדגם מעוקל (UD).
3. עיכול אנזימטי
- לעכל את הכרומטין על ידי הוספת 200 יחידות (U) של Mbo I לכל צינור, ודגרה ב 37 °C (37 °F) לתקופה הנעה בין 4 שעות ללילה בעת סיבוב (950 סל"ד).
- למחרת, להוסיף 50 U נוסף של Mbo I לכל צינור, ודגרה ב 37 °C (2 שעות תוך סיבוב (950 סל"ד).
- לנטרל את האנזים על ידי דגירה הצינורות ב 60 °C (60 °F) במשך 20 דקות. מניחים את הצינורות על קרח.
הערה: קח aliquot 10 μL כמו המדגם המעוכל (D).
4. ביוטינילציה של קצות DNA
- כדי למלא את רסיסי ההגבלה ולתייג את ה-DNA מסתיים בביוטין, להוסיף 1.5 μL כל אחד של 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL של 0.4 mM ביוטין dATP, 17.5 μL של טריס נמוך EDTA (TLE) חוצץ [10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0], ו 10 μL של 5 U / μL של קלנאו (DNA פולימראז אני שבר גדול) לכל הצינורות. מערבבים בזהירות ודגרה במשך 75 דקות ב 37 °C (50 °F). לנער ב 700 סל"ד כל 10 s עבור 30 s. מניחים את כל הצינורות על קרח תוך הכנת תערובת קשירה.
5. קשירה
- מעבירים כל תערובת כרומטין מעוכלת לצינור 1 מ"ל נפרד עם תערובת קשירה (100 μL של 10x חוצץ קשירה, 10 μL של 10 אלבומין סרום בקר מ"ג / מ"ל, 15 U של T4 DNA ליגאז, ו 425 μL של מים מזוקקים כפולים [ddH2O]). מערבבים היטב על ידי צנרת עדינה, ודגרה לילה ב 16 °C (50 °F).
6. היפוך הצלבה וטיהור DNA
- לדרדר חלבונים על ידי הוספת 50 μL של 10 מ"ג / מ"ל Proteinase K לכל צינור, ודגרה ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות. הפוך crosslinks על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 65 °C (65 °F) ודגרה לילה.
- להשפיל RNA על ידי הוספת 20 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase A, ודגרה ב 37 °C (7 °F) עבור 1 שעה.
- בצע פנול:מיצוי כלורופורם ואחריו משקעים אתנול.
- הוסף נפח אחד של פנול-כלורופורם, ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך כדי לקבל שלב לבן הומוגני.
הערה: פנול הוא כימי מסוכן. פעל בהתאם לתקנות הבריאות והבטיחות המתאימות. תעבדי במכסה המנוע. - צנטריפוגה ב 15,000 × גרם במשך 15 דקות. מעבירים את השלב המידי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 2 מ"ל. בצע מיצוי אחורי של השכבה התחתונה עם 100 μL של חוצץ TLE, ולהעביר את השלב מימי לתוך אותו צינור 2 מ"ל.
- ד"א מזרז על ידי הוספת 2 כרכים של 100% אלכוהול אתיל (EtOH), 0.1 כרכים של 3 M נתרן אצטט, ו 2 μL של 20 מ"ג / מ"ל גליקוגן. דגירה ב -20 מעלות צלזיוס לתקופה הנעה בין 2 שעות ללילה.
- ספין ב 15,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (7 °F), ולשטוף את הכדורים 2x עם קר כקרח 70% EtOH. יבש את הכדורים ב RT, ו resuspend ב 100 μL של חוצץ TLE. לכמת את ה- DNA באמצעות צבע פלואורוגני שנקשר באופן סלקטיבי ל- DNA וטראורומטר על פי הוראות היצרן (טבלת החומרים).
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחסן מוצרי קשירה ב 4 °C (5 °F) לטווח הקצר או ב -20 °C (50 °F) לטווח הארוך. השתמש aliquot (100 ng) של החומר כמו מדגם קשירה (L) עבור בקרת איכות.
- הוסף נפח אחד של פנול-כלורופורם, ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך כדי לקבל שלב לבן הומוגני.
7. הערכת איכות תבנית Hi-C
- בקרת איכות עיכול וקשירה
- לטהר DNA מן UD ו- D aliquots על ידי היפוך crosslinks, ולבצע פנול: מיצוי כלורופורם ומכלכי אתנול כמתואר לעיל.
- טען 100 ננוגרם של דגימות UD, D ו- L בג'ל אגרוז 1.5%. חפש מריחה שבמרכזה כ-500 bp במדגם D לעומת רצועת משקל מולקולרית גבוהה עבור מדגם L (ראו תוצאות מייצגות).
- בקרת כמות יעילות עיכול
הערה: כדי להעריך את יעילות העיכול בצורה מדויקת יותר, השתמש בדגימות UD ו- D כתבניות לביצוע תגובות שרשרת פולימראז כמותיות (qPCR) באמצעות פריימרים שתוכננו כדלקמן.- עצב זוג פריימר שמגביר שבר DNA המכיל את אתר הגבלת הדנ"א עבור האנזים המשמש לעיכול (Mbo I בפרוטוקול הנוכחי), הנקרא R בנוסחה בשלב 7.2.3.
- עצב זוג פריימרים המגביר שבר DNA של פקד שאינו מכיל את אתר ההגבלה עבור האנזים המשמש לעיכול (Mbo I עבור הפרוטוקול הנוכחי), הנקרא C בנוסחה בשלב 7.2.3.
- השתמש בערכי סף המחזור (ערכי Ct) של ההגברה כדי לחשב את יעילות ההגבלה בהתאם לנוסחה המוצגת להלן:
% הגבלה = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
כאשר CtR מתייחס לערך ה- Ct של קטע R, ו- CtC מתייחס לערך ה- Ct של קטע C עבור דגימת D ו- UD לדוגמה.
הערה: אחוז ההגבלה משקף את היעילות של אנזים ההגבלה המבקע את שבר ה- DNA המוגבל (R) בהשוואה לשבר DNA של פקד (C) שאינו מכיל את אתר ה- DNA של ההגבלה. מומלץ להתייעלות הגבלה של ≥ 80%.
- זיהוי אינטראקציות ידועות
- בצע PCR כדי להגביר פקד קשירה פנימי כדי לבחון אינטראקציות לטווח קצר ו/או לטווח בינוני או ארוך (ראה תוצאות מייצגות).
- לחלופין, עצב פריימרים להגברת מוצר קשירה שבו הפריימרים נמצאים בכיוון קדימה-קדימה או הפוך-הפוך בקטעי הגבלה סמוכים.
- בקרת מילוי וביוטין
- אמת את יעילות הסימון והקשירה של Hi-C על-ידי הגברה ועיכול של אינטראקציה ידועה או מוצר קשירה בין שברי הגבלה סמוכים בגנום, כמתואר לעיל.
הערה: מילוי וקשירה מוצלחים של אתר Mbo I (GATC) מייצר אתר חדש עבור אנזים ההגבלה Cla I (ATCGAT) בצומת קשירה ומחדש את אתר Mbo I. - לעכל את מוצר PCR עם Mbo I, Cla I, או שניהם. לאחר הפעלת הדגימות על ג'ל 1.5-2%, להעריך את המספר היחסי של 3C ו- Hi-C קשירה צמתים על ידי כימות את עוצמת הרצועות לחתוך uncuts26.
הערה: יש צורך ביעילות של > 70% (ראו תוצאות מייצגות).
- אמת את יעילות הסימון והקשירה של Hi-C על-ידי הגברה ועיכול של אינטראקציה ידועה או מוצר קשירה בין שברי הגבלה סמוכים בגנום, כמתואר לעיל.
8. סוניקציה
- Sonicate הדגימות כדי להשיג 200-500 bp שברי DNA. עבור המכשיר המשמש בפרוטוקול זה (ראה טבלת החומרים), לדלל את המדגם (מ 5 עד 10 מיקרוגרם) ב 130 μL של ddH2O לכל צינור, ולהגדיר את המכשיר sonicate ל 400 bp: רמת מילוי: 10; גורם חובה: 10%; עוצמת אירוע שיא (w): 140; מחזורים לכל פרץ: 200; זמן (ים): 80.
9. הסרת ביוטין / תיקון קצה
הערה: השלבים המוצגים להלן מותאמים עבור 5 מיקרוגרם של DNA Hi-C.
- כדי לבצע הסרת ביוטין, להעביר את המדגם (130 μL) לתוך צינור microcentrifuge טרי. הוסף 16 μL של 10x חיץ קשירה, 2 μL של 10 mM dATP, 5 μL של T4 DNA פולימראז (15U), ו 7 μL של ddH2O (160 μL של נפח כולל). דגירה ב 20 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
- הוסף 5 μL של 10 mM dNTPs, 4 μL של 10x מאגר קשירה, 5 μL של T4 polynucleotide kinase (10 U / μL), 1 μL של Klenow, ו 25 μL של ddH2O (200 μL של נפח כולל). דגירה ב 20 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
10. בחירת גודל
- כדי לבחור קטעים בעיקר בטווח הגודל של 250-550 bp, בצעו תחילה את בחירת הגודל הפיך של פאזה מוצקה (SPRI) עם 0.6x, ואחריה 0.90x בהתאם להוראות היצרן, וחליקו את ה- DNA באמצעות 100 μL של TLE.
11. ביוטין משיכה/ A-tailing / מתאם קשירה
הערה: בצע את הכביסות על ידי שימוש חוזר של החרוזים המגנטיים על ידי מערבולת, לסובב את הדגימות במשך 3 דקות על גלגל מסתובב, ולאחר מכן לסובב בקצרה את המדגם ולהניח אותו על המעמד המגנטי. אפשר לחרוזים להיצמד למגנט, להשליך את הסופר-טבעי ולהמשיך עם שלב הכביסה הבא. בצע את הכביסות ב 55 °C (55 °F) על בלוק תרמו עם סיבוב במקום הגלגל המסתובב.
- האיפור את הנפח הסופי עד 300 μL לדגימה עם TLE עבור משיכה למטה. הכן את מאגרי שטיפת החרוזים: 1x חוצץ טווין (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 מ"מ EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x חוצץ ללא טווין (NTB) (5 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 0.5 מ"מ EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- השתמש ב- 150 μL של חרוזים מגנטיים הקשורים לסטרפטווידין (ראה טבלת החומרים) לכל ספריה. לשטוף את החרוזים 2x עם 400 μL של 1x TB. לאחר מכן resuspend חרוזים ב 300 μL 2x NTB.
- מערבבים את החרוזים עם חומר 300 μL Hi-C ודגרה ב RT במשך 30 דקות על גלגל מסתובב כדי לאפשר כריכת ביוטין לחרוזים סטרפטווידין.
- לשטוף את החרוזים עם 400 μL של 0.5x TB, ודגורה ב 55 °C (55 °F) במשך 3 דקות, מסתובב ב 750 סל"ד. לשטוף את החרוזים ב 200 μL של 1x מאגר הגבלה.
- Resuspend החרוזים ב 100 μL של תערובת זנב dATP (5 μL של 10 mM dATP, 10 μL של 10x חוצץ הגבלה, 5 μL של Klenow exo-, ו 80 μL של ddH2O). דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
- הסר את supernatant, לשטוף את החרוזים 2x עם 400 μL של 0.5x TB על ידי דגירה ב 55 °C (55 °F) במשך 3 דקות ומסתובב ב 750 סל"ד.
- לשטוף את החרוזים עם 400 μL של 1x NTB ולאחר מכן עם 100 μL של 1x חיץ קשירה.
- resuspend החרוזים ב 50 μL של חוצץ קשירה 1x, ולהעביר את המתלה לצינור חדש. הוסף 4 μL של מתאמי PE חישול מראש (15 μM מלאי) ו 2 μL של ligase T4 (400 U / μL, כלומר, 800 U / tube); דגירה ב RT במשך 2 שעות.
הערה: לפני חישול המתאמים על ידי הוספת נפחים שווים של מתאמי PE 1.0 ו- PE 2.0 (מלאי 30 מיקרומטר) ודגרה במשך 10 דקות ב- RT (ראה טבלת החומרים). - לכבוש מחדש את החרוזים על ידי הסרת supernatant ולשטוף את החרוזים 2x עם 400 μL של שחפת. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 1x NTB, ולאחר מכן עם 100 μL של 1x מאגר הגבלה, ו respend החרוזים ב 40 μL של 1x מאגר הגבלה.
12. הגברת PCR
- הגדר PCRs של נפח μL 25 עם 5, 6, 7 ו 8 מחזורים. עבור כל PCR, השתמש ב:
מתכון תגובה חרוזי היי-סי 2.5 μL 10 μM PE PCR פריימר 1 (טבלת חומרים) 0.75 μL 10 μM PE PCR פריימר 2 (טבלת חומרים) 0.75 μL 10 מ"מ dNTP 0.6 μL מאגר תגובה 5x 5 μL פולימראז DNA 0.3 μL ddH2O 14.65 μL סך 25 μL מחזורים טמפרטורה זמן 1 98 °C (77 °F) שנות ה-30 n מחזורים 98 °C (77 °F) שנות ה-10 65 °C (75 °F) שנות ה-30 72 °C (72 °F) שנות ה-30 1 72 °C (72 °F) 7 דקות
13. הגברה סופית של PCR
- בצע הגברה סופית של PCR באמצעות אותם תנאים כמתואר לעיל ומספר המחזורים שנבחרו. פצל את המדגם באמצעות 5 μL של חרוזי Hi-C כתבנית בתגובות μL 50.
- לאסוף את כל תגובות PCR ולהעביר אותם לצינור טרי. השתמש במגנט כדי להסיר את חרוזי סטרפטבידין ולשחזר את supernatant (מוצרי PCR). העבר את החרוזים לצינור טרי, לשטוף את החרוזים כפי שצוין בשלב 11.2.9, ולאחסן במאגר הגבלה 1x ב 4 °C (70 °F) כגיבוי.
- לטהר את מוצרי PCR באמצעות 0.85x את נפח חרוזים SPRI על פי הוראות היצרן. Elute עם 30 μL של חוצץ TLE.
- לכמת את ספריית Hi-C באמצעות מכשיר פלואורומטרי, ולאשר את איכות הספרייה על ידי אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב.
- כנקודת ביקורת באיכות האחרונה, השתמש ב- 1 μL של ספריית Hi-C כתבנית לביצוע תגובת PCR באמצעות 10 מחזורים באמצעות אותם תנאים המתוארים בשלב 12.1. חלק את מוצר ה- PCR לשני צינורות microcentrifuge: לעכל אחד עם Cla I ולהשאיר את השני לא מעוכל כמו שליטה. הפעל את המוצרים בג'ל אגרוז 1.5%-2% (ראו תוצאות מייצגות).
- המשך לרצף רצף משויך של 50 bp או 75 bp בפלטפורמת ריצוף מתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתואר להלן התוצאות של פרוטוקול Hi-C מוצלח (ראה סיכום של זרימת העבודה של פרוטוקול Hi-C באיור 1A). ישנם מספר מחסומי בקרת איכות במהלך ניסוי Hi-C בגרעין. עליקוטים לדוגמה נאספו לפני (UD) ואחרי (D) שלב הגבלת הכרומטין וכן לאחר קשירה (L). הקישורים התהפכו, והדנ"א טוהר ורץ על ג'ל אגרוז. מריחה של 200-1000 bp נצפתה כאשר הגבלה עם Mbo הייתי מוצלח(איור 1B). הגודל הצפוי של המולקולה תלוי באנזים ההגבלה של בחירה. אם החיבור הצליח, רצועת משקל מולקולרית גבוהה נראתה בחלק העליון של הג'ל (איור 1B). יעילות העיכול יכולה להיות מאושרת גם על ידי qPCR כמתואר בפירוט בפרוטוקול. יעילות עיכול מקובלת היא 80% ומעלה(איור 1C).
כדי להעריך בפירוט את יעילות קשירת Hi-C, ניתן לעצב פריימרים כדי להגביר בקרת מוצר קשירה פנימית שבה הפריימרים נמצאים בכיוון קדימה-קדימה או הפוך-הפוך בקטעי הגבלה סמוכים. לחלופין, פריימרים יכולים להיות מתוכננים כדי להגביר אינטראקציות ידועות. איור 2A מציג את ההגברה של אינטראקציה ידועה לטווח בינוני (300 kb) בדרוסופילה25. מוצרי קשירה Hi-C (שבו סימון ביוטין, מילוי, קשירה התרחשו בהצלחה) ניתן להעריך על ידי עיכול של מוצר PCR התאושש בהגברה. לאחר מילוי וקשירה, מגברי Hi-C יכילו אתר הגבלת Cla I חדש באתר Mbo I המקורי, אשר נשמר על קשירה קהה. אם ההגבלה עם Cla I לא תושלם, תגובת המילוי וסימון הביוטין לא יהיו יעילים. יעילות עיכול של יותר מ-70% מומלצת כדי להימנע מחלק גדול של קריאות לא שימושיות עבור הספריות לאחר הרצף(איור 2A,השווה את העיכול Cla I של 3C לעומת תבנית Hi-C).
כדי לקבוע מספר הולם של מחזורי הגברה PCR כדי להגביר את ספריית Hi-C הסופית, תגובות PCR הוגדרו באמצעות 2.5 μL של ספריה נתונה על חרוזים, כמתואר בפרוטוקול. מספר מחזורי ה-PCR להגברה הסופית הוא מחזור אחד קטן ממספר המחזורים שעבורם ההכפשה גלויה(איור 2B). במקרה זה, 4 מחזורים של הגברת PCR נבחרו. כמחסום באיכות סופית, עלי של ספריית Hi-C הוגבר מחדש מתעכל עם Cla I. רמת העיכול של הספרייה (ירידה בגודל הכתם) מציינת את השפע של זוגות Hi-C תקפים ומשקפת את שיעור הקריאות השימושיות שיתקבלו מהספרייה(איור 2C). יחס של טווח הגודל העליון (נקבע לפי הגודל הקיימ במדגם UD) וטווח הגודל התחתון בדגימות UD ו- D אמורים לייצר יחס > 1 עבור ה- UD ויחס ≤ 1 לדגימה המעוכלת אם העיכול של Cla I יעיל.
לאחר רצף הקצה המשויך, קבצי FASTQ (טבלה 1) עובדו באמצעות HiCPro28 והסטטיסטיקה שנוצרה שותווה באמצעות MultiQC28. כלי חלופי ל- HiCPro הוא צינור HiCUP30 המניב תוצאות דומות (לא מוצג). איור 3 וטבלה 2 מציגים את המידע הסטטיסטי המפורט של הקריאות המרצף. יישור ויישור מלא של קריאה לאחר החיתוך מדווחים. שתי קטגוריות אלה תואמות לקריאות מיושרות בהצלחה שישמשו בניתוח הבא כדי למצוא זוגות Hi-C חוקיים. קטגוריית היישור לאחר החיתוך מתייחסת לקריאות המשתרעות על פני צומת קשירה, שלא היו מיושרות בשלב הראשון וגוזרות באתר קשירה כדי ליישר מחדש את הגפיים בגובה 5' לגנום28 (איור 3B, C וטבלה 2). הסטטיסטיקה של אנשי הקשר מראה כי ספריית Hi-C הייתה באיכות גבוהה עם 82.2% זוגות תקפים ו-7.6% קריאות לא שימושיות שנפלו לאותו עיגול עצמי, קצוות תלויים באותו קטע, קשירה מחדש, זוגות מסוננים וקטגוריות זוגות שנזרקו(איור 3A, איור 3D וטבלה 2). יתר על כן, מספר כפילויות PCR הוא נמוך מאוד, המציין כי מורכבות הספרייה גבוהה, וכי מחזורי PCR הציגו חפצים מינימליים (איור 3E ושולחן 2).
באמצעות זוגות Hi-C חוקיים ייחודיים, בוצע ניתוח בסיסי של הפצת הזוג באמצעות HiCPro27. ניסוי זה הניב 46.5% אנשי קשר ייחודיים של cis ≤ 20 kbp, 47.1% אנשי קשר ייחודיים cis > 20 kbp, ו 5.8% אנשי קשר טרנס ייחודיים(איור 3D). התפלגות cis לזוגות תקפים טרנס תואמת את התוצאות הצפויות לניסוי Hi-C מוצלח עם רוב האינטראקציות שזוהו באותו כרומוזום. שיעור גבוה של מגעים טרנסים מצביע על קיבעון לא יעיל. באמצעות זוגות חוקיים Hi-C מ HiCPro27, מטריצות היו מנורמלות על ידי תיקון איטרטיבי ופירוק eigenvector (ICE)30, ו 1 kb ו 5 kb מטריצות רזולוציה נוצרו באמצעות HiCPlotter30,31,32. מטריצות מגע מנורמלות ברזולוציה של 1 kb ו- 5 kb מוצגות עבור לוקוס הגנים Notch בדרוסופילה (איור 4A, איור 4C ואיור 4D). באיור 4א' ניתן לראות את לוקוס הגנים חריץ יחד עם ה- APs, תחום l ו- II, כמו גם שינויים בהסטון לאורך הלוקוס (איור 4A ושולחן 1). העיצוב של מחיקת CRISPR-Cas9 כלל את המוטיב של CTCF ו- M1BP (איור 4B).
עם מחיקת האזור המכיל הן אתרים של כריכת DNA CTCF והן M1BP בגבול 5 ' של לוקוס חריץ (5pN-delta343, טבלה 1), ניתן לראות שינוי דרמטי במגעי הכרומטין עם אובדן אינטראקציות בתוך לוקוס חריץ ורווח של מגעים עם TAD במעלה הזרם בהשוואה לסוג הפראי (WT) (איור 4C,D). לבסוף, איור 4E מציג פנורמה מפורטת של פרופילי אינטראקציה עם WT ומוטנטים ברמת קטע ההגבלה מהגן Notch 5' UTR, ומראה ירידה בשיעור המגעים שנעשו עם לוקוס הגנים Notch ועלייה במגעים עם התחום במעלה הזרם. התצוגות הווירטואליות של גן 4C של גן חריץ 5 ' UTR הושגו באמצעות HiC-Pro27. כלי חלופי הוא כימות הקצוות האחרים של Hi-C הזמין ב- SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. כל התוצאות שהוצגו באיור 4 התקבלו על ידי יישום פרוטוקול Hi-C בגרעין בתאי WT ומוטנט S2R+ Drosophila, כפי שתואר על ידי Arzate-Mejía ואח '25.
איור 1:פקדי עיכול וקשירה בגרעין Hi-C. (A)סקירה כללית של פרוטוקול Hi-C. תאים מקושרים עם פורמלדהיד, וכתוצאה מכך קשרים קוולנטיים בין מקטעי כרומטין (שברי DNA: ורוד, סגול) וחלבונים. כרומטין מתעכל עם אנזים הגבלה (המיוצג על ידי מספריים), בדוגמה זו, Mbo I. הקצוות הדביקים המתקבלים מלאים בנוקלאוטידים כולל dATP ביוטיניל (עיגולים כחולים כהים). הדנ"א מטוהר, וצמתים ביו-טיניליים מועשרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטאבין (עיגולים אפורים). מקטעי אינטראקציה מזוהים על-ידי הדור הבא, רצף של קצה מזווג. (B)בקרת איכות עיכול וקשירה Hi-C עבור שני שכפולים ביולוגיים (Hi-C 1 ו- Hi-C 2). ספריות היי-C נפתרו על ג'ל אגרוז של 1.5%. שניהם מתעכלים, D, ספריות פועלות כהכפשה סביב 600 bp. דגימות ligated, Lig, לרוץ כמו רצועה הדוקה למדי גדול מ 10 kb דומה דגימות UD מעוקל. ההבדלים בעוצמת האות נובעים מכמויות לא אחידות של דנ"א טעון על הג'ל. (C)בקרת כמותית עיכול Hi-C על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותי עבור אותם שני העתקים ביולוגיים כמו ב (B) (Hi-C 1 ו- Hi-C 2) באמצעות ערכי סף המחזור כמפורט בפרוטוקול. עיכול מוצלח ≥ 80% הגבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בקרת מילוי וקשירה בוטה של Hi-C בגרעין. אינטראקציה ידועה בין שברים הממוקמים ב- 300 kb זה מזה בכרומוזום X שימשה כפקד ומוגברת באמצעות הפריימרים המצוינים בחצים שחורים (ראה חלק עליון של הערכה ב-( B), פריימר 1 (משמאל), פריימר 2 (מימין), טבלה 1), יצירת אמפליסון של 347 bp. ניתן להבחין בין מוצרי קשירה Hi-C לבין אלה המיוצרים בניסוי 3C על ידי עיכול של אתר קשירה. צמתים Hi-C מתעכלו על ידי Cla I באתר Mbo I המקורי, כמו זה נוצר על קשירה קהה קצה. צמתים Hi-C ו- 3C עוכלו עם Mbo I כאשר אתר ההגבלה מתחדש עם קשירה (משמאל לג'ל). לעומת זאת, צמתים 3C לא עוכלו על ידי Cla I באתר Mbo I, אלא רק על ידי Mbo I. השווה את פרופיל העיכול של מוצרי Hi-C ו- 3C באמצעות Cla I. קטע של 53 bp הושג על ידי עיכול מוצר Hi-C (בשל הגבלת אתר Cla I שהוקם באתר Mbo I והגבלה של אתר Cla I שכבר קיים באזור). קטע זה לא נצפה בעיכול המוצר 3C כמו אתר Cla I היחיד זמין היה אחד שכבר היה נוכח באזור. (B)לאחר הגברת PCR של ספריית Hi-C באמצעות מחזורי PCR שונים, המוצרים היו לרוץ על ג'ל אגרוז 1.5%. מריחה של 400-1000 bp היה צפוי ונצפה. מחזורי המספר המתאימים עבור ההגברה הסופית PCR צריך להילקח כמו המספר מיד נמוך יותר מזה שבו מריחה הוא רק גלוי. (ג)הספרייה הסופית Cla I העיכול. עלילה של הספרייה הסופית הוגברה מחדש מתעכלת עם Cla I. הפחתת הגודל של הכתם אישרה כי חלק גדול מהמולקולות בספרייה היו זוגות Hi-C תקפים. ניתוח צפיפות של ג'ל זה יכול להתבצע כדי לקבל יחס בין דגימות האו"ם ו- D, כמפורט בסעיף התוצאות הייצוגיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3:סטטיסטיקת HiC-Pro של ספריית Hi-C. (A)ייצוג סכמטי של זוגות Hi-C תקפים וסוגים שונים של זוגות לא חוקיים שניתן לייצר במהלך הניסוי ולסונן על ידי HiCPro27 (טבלה 2). אלה כוללים קריאות הנופלות לרצפים רציפים, קצוות תלויים, אותו שבר, מעגל עצמי, קשירה מחדש וכפילויות PCR. (ב)סטטיסטיקת מיפוי. קריאות שלא הצליחו ליישר מוצגות (אפור), ושתי הקריאות והקריאות המיושרות במלואן מיושרות לאחר החיתוך מוצגות בכחול וכחול בהיר, בהתאמה. שתי קטגוריות אלה מייצגות את הקריאות השימושיות הנחשבים לנתחים הבאים. (ג)סטטיסטיקת שיוך. קריאות מרובות יישור (כתום כהה) מייצגות קריאות המיושרות באזורים מרובים בגנום. קריאות מיושרות באופן ייחודי (כחול כהה) מייצגות את זוגות הקריאה המיושרים פעם אחת בגנום, וסינגלטון (כתום בהיר) מייצג זוגות קריאה שבהם רצף אזור גנומי אחד בלבד בשתי הקריאות. (D)סטטיסטיקת סינון. זוגות קריאה חוקיים (כחולים) מייצגים מוצרי קשירה מוצלחים של Hi-C כמתואר ב-( A). עיגולים עצמיים של שבר עצמי (ורוד בהיר) אינם שימושיים מכיוון שהם מייצגים את אותו שבר גנומי המוצג ב -A). קצוות תלויים זהים (כתום) מייצגים קריאות שבהן רצף מקטע הגבלה יחיד. זוגות מסוננים וזרוקים (חום) הם גם קריאות לא שימושיות בגודל שגוי או שלא ניתן לשחזר את מוצר הקשירה. לבסוף, קריאות קשירה מחדש (אדום) מייצגות קריאות שבהן שני קטעים סמוכים נקשרו מחדש, ובכך הפיקו מידע לא שימושי. (ה)התפלגות אנשי קשר חוקיים של זוגות קריאה בגנום. אנשי קשר ייחודיים של CIS (כחול) שכיחים יותר מאשר אנשי קשר טרנסיים ייחודיים (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מטריצות מגע Hi-C וניתוח וירטואלי של 4C של תאי WT ומוטנט S2R+. (A)מפת חום מנורמלת Hi-C של אזור של 50 kb ברזולוציה של 1 kb שבמרכזה לוקוס הגנים Notch. ציון הפרדת TAD32 עבור הלוקוס מוצג, יחד עם חלוקת לוקוס חריץ לשני תחומים טופולוגיים (תחום 1 ותחום 2). נתוני ChIP-seq עבור APs, RNA Pol II וסימני histone עבור תאי S2/S2R+34,35,36,37 מוצגים מתחת למפת החום ( טבלה1). מיקומם של גבולות תחום חריץ 1 מודגש בירוק בהיר. (B)ייצוג סכמטי של מוטציית קריספר גבול B1. המלבן הירוק מציין את אזור 343 bp שנמחק. מספריים מציינים sgRNAs המשמש לעריכת גנום בתיווך CRISPR. אתרי איגוד מוטיב עבור APs מוצגים כתיבות עבור CTCF ו- M1BP. פסגות שיא עבור APs מחייב DNA המוצגים ב -A) מסומנים גם35. (C)מפת חום מנורמלת Hi-C ברזולוציה של 1 kb המכסה אזור של 50 kb שבמרכזו חריץ עבור WT ותאי המוטציה. משמאל, מפת חום Hi-C של יומן 2 הבדלים בתדירות אינטראקציה בין WT ותאים מוטנטיים. (D)מפת חום מנורמלת Hi-C המכסה אזור של 250 kb הממורכז ב- Notch ברזולוציה של 5 kb עבור WT ותאים מוטנטיים. משמאל, מפת חום Hi-C של יומן 2 הבדלים בתדירות אינטראקציה בין WT ותאים מוטנטיים. (E)וירטואלי-4C עבור WT ותאים מוטנטיים באמצעות 5 ' UTR של Notch כנקודת מבט. אחוזי האינטראקציות בין נקודת המבט והאזורים בתוך קירדומיין-2במעלה הזרם , קבוצת מחשבים Notch 1, קבוצת מחשבים Notch 2 ותחום dnc במורד הזרם עבור תאים WT ומוטנטים מוצגים25. קיצורים: WT = סוג פראי; TAD = תחום הקשור לטופולוגית; ChIP = כרומטין immunoprecipitation; AP = חלבון אדריכלי; RNA Pol = RNA פולימראז; S2R+ = קולטן S2 פלוס; sg RNA = RNA מדריך יחיד; UTR = אזור לא מתורגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ניסוי | לדוגמה | מספר גישה גיאוגרפית |
| צ'יפ | CP190 | GSM1015404 |
| צ'יפ | סוהו | GSM1015406 |
| צ'יפ | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| צ'יפ | CTCF | GSM1015410 |
| צ'יפ | Ibf1 | GSM1133264 |
| צ'יפ | Ibf2 | GSM1133265 |
| צ'יפ | BEAF32 | GSM1278639 |
| צ'יפ | פיתה | GSM1313420 |
| צ'יפ | זיסיק | GSM1313421 |
| צ'יפ | RNA PolII | GSM2259975 |
| צ'יפ | H3K4me1 | GSM2259983 |
| צ'יפ | H3K4me3 | GSM2259985 |
| צ'יפ | H3K27ac | GSM2259987 |
| צ'יפ | MSL2 | GSM2469507 |
| צ'יפ | H4K16ac | GSM2469508 |
| צ'יפ | M1BP | GSM2706055 |
| צ'יפ | גף | GSM2860390 |
| צ'יפ | קלט | GSM1015412 |
| היי-סי. | תאי WT S2R+ | GSE136137 |
| היי-סי. | S2R+ 5pN-delta343 תאים | GSE136137 |
טבלה 1: מספרי גישה גיאוגרפית.
| סטטיסטיקת HiC-Pro | קורא | אחוז |
| סטטיסטיקת מיפוי | ||
| יישור קריאה מלא | 131515921 | 82.20% |
| יישור קריאה גזוז | 16408309 | 10.30% |
| יישור נכשל | 12110964 | 7.60% |
| סטטיסטיקת שיוך | ||
| מיושר באופן ייחודי | 79428455 | 50.90% |
| יחידון | 19063418 | 12.20% |
| מיושר מרובה | 57700021 | 36.90% |
| סטטיסטיקת סינון | ||
| זוגות חוקיים | 71373989 | 90.12% |
| אותו שבר: עיגול עצמי | 2340697 | 2.90% |
| אותו שבר: קצוות תלויים | 2578783 | 3.20% |
| זוגות מסוננים | 2773043 | 3.50% |
| זוגות שנזרקו | 196565 | 0.20% |
| סטטיסטיקת אנשי קשר | ||
| ייחודי: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| ייחודי: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| ייחודי: טרנס | 4133602 | 5.80% |
| זוגות קריאה כפולים | 398400 | 0.60% |
טבלה 2: סטטיסטיקת HiC-Pro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת Hi-C בגרעין המוצגת כאן אפשרה חקירה מפורטת של טופולוגיית הגנום של Drosophila ברזולוציה גבוהה, ומספקת תצוגה של אינטראקציות גנומיות בקנה מידה גנומי שונים, החל מלולאות כרומטין בין אלמנטים רגולטוריים כגון מקדמים ומשפרים ועד TADs וזיהוי תאים גדולים25. אותה טכנולוגיה יושמה גם ביעילות על רקמות יונקים עם כמה שינויים33. לדוגמה, בעת עיבוד רקמה במקום השעיה של תא בודד, הרקמה מסוננת באמצעות מסנן 70 מיקרומטר, ואת שלב התמוגה מבוצע תוך הומוגניזציה של החומר באמצעות homogenizer Dounce. בנוסף, מכיוון שהגנום של היונקים גדול פי 25 מגנום Drosophila, מספר זוגות הקריאה החוקיים הדרושים לבניית מטריצות ברזולוציה של 1-5 kb גדול יותר. שיטת Hi-C בגרעין שונה משיטת Hi-C המקורית2 בהימנעותה מליזה גרעינית עם 1% SDS ב-65 °C לפני קשירה, ובכך שומרת על שלמות הגרעין, ועל ידי קשירה ב-1 מ"ל במקום 7 מ"ל23,24.
לפרוטוקול יש כמה צעדים מרכזיים כדי להבטיח יעילות גבוהה. הצעד הראשון שיכול להכניס עיכול וחוסר יעילות מילוי הוא היווצרות של גושים במהלך 0.3% SDS permeabilization וטיפולים פעילי שטח. אם הגושים גדולים וקשים לשבש, יש להקטין את המהירות המסתובבת ל-400 סל"ד במהלך SDS וטיפולי פעילי שטח. אם הגושים נשארים קשים להתפרק על ידי pipetting, המדגם צריך להיות מפוצל לשניים על ידי התאמת הנפחים עם חוצץ הגבלה, SDS, ואת פעילי השטח שאינם יוניים לפני שתמשיך עם permeabilization. לאחר מכן, הגרעינים צריכים להיות צנטריפוגות במהירות מינימלית (200 × גרם),supernatant מושלך בקפידה, ואת הדגימות התאגדו יחד 450 μL של חוצץ הגבלה 1x לפני שתמשיך עם העיכול. שנית, ההערכה של יעילות העיכול חשובה כדי לספק מספיק שברי DNA למילוי וקשירה. אם על פי הערכה איכותית, העיכול נמצא לא יעיל, סיבוב שני של עיכול צריך להתבצע עם אנזים ההגבלה לתקופה הנעה בין 4 שעות ללילה.
שלישית, חשובה הערכת יעילות הקשירה. אם בהערכה איכותית, הקשר נמצא לא יעיל (כלומר, במקום רצועת המשקל המולקולרי הגבוהה, מריחה דומה לזו שנצפתה עבור המדגם המעוכל), יש לחזור על הקשר על ידי צנטריפוגוג גרעין ב 200 × גרם ו resuspending אותם בתערובת קשירה באמצעות חיץ קשירה 10x טרי ligase. רביעית, יש להעריך את אחוז המוצרים התקפיים של Hi-C על ידי עיכול אמפלייקון PCR של אינטראקציה צפויה עם Cla I (עבור Mbo I עיכול מקורי). ההגברה והעיכול היעילים של האמפליקון של האינטראקציה הצפויה מאשרים קשירה מוצלחת ויצירת צמתים Hi-C. אם עיכול אמפליסון אינו יעיל, רוב המולקולות יהיו 3C במקום מוצרי Hi-C, וזה צריך להילקח בחשבון אם הספרייה תהיה רצף. זה יכול להיות מאושר גם על ידי ביצוע הספרייה הסופית בקרת העיכול Cla I, כמתואר בסעיף התוצאות הייצוגיות. לבסוף, הבחירה של המספר הנמוך יותר של מחזורי PCR חשוב כדי למנוע כפילויות PCR. אם בעת הרצף, אחוז כפילויות זוג הקריאה נמצא גבוה, יש להקטין עוד יותר את מספר מחזורי ה- PCR.
לטכניקת היי-סי בגרעין יש כמה מגבלות. ראשית, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג את ניסוי Hi-C המבוצע עבור אוכלוסיית תאים. לכן, האות של תדירות המגעים הגנומיים מייצג מיליוני גנומים עם קונפורמציות אישיות משתנות. כדי להשיג את קבוצה של מגעים גנומיים מגנום יחיד, ניסוי Hi-C של תא יחיד22 מומלץ. שנית, Hi-C מבוסס על קשירה של שברי DNA פרוקסימליים. לכן, אם אזורים גנומיים הם חלק מתסביך חלבון-כרומטין גדול, המרחק בין שברים עלול לעכב את הקשר. לדוגמה, הוכח כי אנשי קשר טרנסים מיוצגים בצורה גרועה ב- Hi-C38. יתר על כן, Hi-C מסיים עם רצף בסוף מזווג, ובכך אחזור זוגות של מגעים גנומיים. עם זאת, מספר שברי DNA יכולים בו זמנית לקיים אינטראקציה באותו קומפלקס כרומטין. כדי להשיג את זהותם של שברי DNA מרובים בקומפלקס כרומטין, ניתן ליישם שיטות רצף חלופיות על Hi-C39, או אסטרטגיות ניסיוניות שונות שבהן קשירה אינה מבוצעת38,40,41. לבסוף, למרות ש-Hi-C מודד מגעים גנומיים, הוא אינו חושף את זהות החלבונים המתווכים את האינטראקציות. שיטות חלופיות יש ליישם כדי לזהות את האינטראקציות הגנומיות בתיווך חלבון מסוים של עניין42 או את זהות הרכב החלבונים באלמנטים גנומיים ספציפיים43.
לסיכום, עם ניסוי Hi-C באיכות גבוהה כמו זה המתואר כאן עבור הגנום Drosophila (טבלה 2),מטריצות ניתן לבנות במגוון רחב של רזולוציות (מ 1, 5 kb, 50 kb ומטה; ראה איור 4). בנוסף, אם יש להעריך אזור מסוים בגנום ברמת קטע ההגבלה, ניתן להשתמש בנתונים כדי לבנות נוף וירטואלי של 4C של נקודת המבט הרצויה (למשל, הגן Notch 5' UTR באיור 4E). כלי הקצוות האחרים של Hi-C ב- SeqMonk הוא אפשרות ידידותית מאוד למשתמש המאפשרת הדמיה של נוף זה. החלת כלי הכימות 4C, גם הוא חלק מ- SeqMonk, על נוף זה יכולה להניב מגעים משמעותיים סטטיסטית.
החלת הניסוי בגרעין Hi-C המתואר כאן לאוסף של קווי תאים מוטנטיים עם אתרי כריכת DNA AP שהשתנו בגבולות TAD (איור 4) גילתה כי יש צורך באלמנטים גנטיים בגבולות כדי לבנות את הגנום של דרוזופילה בתחומים וקיום ויסות ביטוי גנים כפי שנדון במלואו על ידי Arzate-Mejía et al.25. לפיכך, עריכה גנטית של אלמנטים רגולטוריים עם מערכת CRISPR/Cas9, בשילוב עם פרופיל ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גנומיות באמצעות פרוטוקול Hi-C בגרעין המתואר כאן, יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לבדיקת התפקוד המבני של אלמנטים גנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית התמיכה הטכנולוגית והמחקרית של UNAM (PAPIIT) במספר מענקים בשנת 207319 ובמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACyT-FORDECyT) מספר מענק 303068. א.א.ל. הוא סטודנט לתואר שני הנתמך על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACyT) מספר CVU 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
