Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In-Nucleus Hi-C i Drosophila-celler

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/62106

Summary

Genomet er organisert i atomrommet i forskjellige strukturer som kan avsløres gjennom kromosomkonformasjonsfangstteknologier. Hi-C-metoden i kjernen gir en genomomfattende samling av kromatininteraksjoner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkart som kan utforskes med megabaseoppløsning på begrensningsfragmentnivå.

Abstract

Genomet er organisert i topologisk assosierende domener (TADs) avgrenset av grenser som isolerer interaksjoner mellom domener. I Drosophila er mekanismene som ligger til grunn for TAD-dannelsen og grensene fortsatt under etterforskning. Anvendelsen av hi-c-metoden som er beskrevet her, bidro til å dissekere funksjonen til arkitektoniske proteiner (AP)-bindende steder ved TAD-grenser som isolerer Notch-genet. Genetisk modifikasjon av domenegrenser som forårsaker tap av APs resulterer i TAD-fusjon, transkripsjonsfeil og langtrekkende topologiske endringer. Disse resultatene ga bevis som viste bidraget av genetiske elementer til domenegrensedannelse og genuttrykkskontroll i Drosophila. Her er hi-C-metoden beskrevet i detalj, noe som gir viktige sjekkpunkter for å vurdere kvaliteten på eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er det nødvendige antall sekvenseringslesninger og gyldige Hi-C-par for å analysere genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-mediert genetisk redigering av regulatoriske elementer og høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner ved hjelp av denne hi-C-protokollen i kjernen kan være en kraftig kombinasjon for undersøkelse av genetiske elementers strukturelle funksjon.

Introduction

I eukaryoter er genomet delt inn i kromosomer som okkuperer spesifikke territorier i atomrommet under interfase1. Kromatinet som danner kromosomene kan deles inn i to hovedtilstander: en av tilgjengelige kromatin som er transkripsjonelt tillatt, og den andre av kompakt kromatin som er transkripsjonelt undertrykkende. Disse kromatinstatene segregate og blander sjelden i atomrommet, danner to forskjellige rom i kjernen2. I skalaen sub-megabase skiller grenser domener med høyfrekvente kromatininteraksjoner, kalt TADer, som markerer kromosomal organisasjon3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grenser okkupert av cohesin og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Cohesin-komplekset ekstruderer kromatin og stopper på CTCF-bindende steder som avhendes i en konvergent orientering i den genomiske sekvensen for å danne stabile kromatinløkker9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse av CTCF DNA-bindende sted ved grensene eller reduksjon i CTCF og cohesin protein overflod resulterer i unormale interaksjoner mellom regulatoriske elementer, tap av TAD-dannelse, og genuttrykk deregulering9,10,11,13,14.

I Drosophila, Grensene mellom TADs er okkupert av flere APer, inkludert grenseelement-assosiert faktor 32 kDa (BEAF-32), Motiv 1 bindende protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), undertrykker av hårete vinge (SuHW) og CTCF, og er beriket i aktive histone modifikasjoner og Polymerase II16,17,18 ,18. Det har blitt antydet at i Drosophila vises TADs som følge av transkripsjon13,17,19, og den nøyaktige rollen til uavhengige APer i grensedannelse og isolasjonsegenskaper er fortsatt under etterforskning. Hvorvidt domener i Drosophila er en eneste konsekvens av aggregering av regioner med lignende transkripsjonstilstander eller om APs, inkludert CTCF, bidrar til grensedannelse, gjenstår å være fullt karakterisert. Utforskning av genomiske kontakter med høy oppløsning har vært mulig gjennom utvikling av kromosomkonformasjonsfangstteknologier kombinert med neste generasjons sekvensering. Hi-C-protokollen ble først beskrevet med ligation trinn utført "i løsning"2 i et forsøk på å unngå falske ligation produkter mellom kromatin fragmenter. Flere studier pekte imidlertid på erkjennelsen av at det nyttige signalet i dataene kom fra ligasjonsprodukter dannet ved delvis lysede kjerner som ikke var i løsning20,21.

Protokollen ble deretter endret for å utføre ligasjonen inne i kjernen som en del av hi-C-eksperimentet22med én celle. Hi-C-protokollen i kjernen ble senere innlemmet i cellepopulasjonen Hi-C for å gi en mer konsistent dekning over hele spekteret av genomiske avstander og produsere data med mindre teknisk støy23,24. Protokollen, beskrevet i detalj her, er basert på populasjonen i kjernen Hi-C-protokoll23,24 og ble brukt til å undersøke konsekvensene av genetisk fjerning av DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domenegrense ved Notch-genlocus i Drosophila25. Resultatene viser at endring av DNA-bindende motiver for APs ved grensen har drastiske konsekvenser for Notch-domenedannelse, større topologiske defekter i regionene rundt Notch-locus og genuttrykksderegulering. Dette indikerer at genetiske elementer ved domenegrenser er viktige for vedlikehold av genomtopologi og genuttrykk i Drosophila25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fiksering

  1. Start med 10 millioner Schneiders linje 2 pluss (S2R+) celler for å forberede 17,5 ml cellefjæring i Schneider medium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) ved romtemperatur (RT).
  2. Tilsett metanolfri formaldehyd for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2%. Bland og inkuber i 10 min på RT, pass på å blande hvert minutt.
    MERK: Formaldehyd er et farlig kjemikalie. Følg de aktuelle helse- og sikkerhetsforskriftene, og arbeid i avtrekkshetten.
  3. Slukk reaksjonen ved å tilsette glycin for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,125 M og bland. Inkuber i 5 min på RT, etterfulgt av 15 min på is.
  4. Sentrifuge i 400 × g ved RT i 5 min og deretter i 10 min ved 4 °C; kast supernatanten. Resuspend pellet forsiktig i 25 ml kald 1x fosfatbufret saltvann.
  5. Sentrifuger ved 400 × g i 10 min ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
    MERK: Hvis du fortsetter med protokollen, går du til trinn 2.1 for lysis; Ellers, flash-fryse pellet i flytende N2 og lagre pellet ved -80 °C.

2. Lysis

  1. Resuspend cellene i 1 ml iskald lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% av ikke-ionisk overflateaktivt middel (se materialtabellen); 10 mM NaCl; 1x proteasehemmere), og juster volumet til 10 ml med iskald lysisbuffer. Juster volumet for å oppnå en konsentrasjon på 1 × 106 celler/ml. Inkuber på is i 30 min, bland hver 2 min ved å invertere rørene.
  2. Sentrifuger kjernen ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og kast deretter supernatanten forsiktig. Vask pelletsen 1x med 1 ml kald lysisbuffer, og overfør den til et mikrocentrifugerør. Vask pelletsen 1x med 1 ml kald 1,25x begrensningsbuffer, og resuspend hver cellepellet i 360 μL 1,25x begrensningsbuffer.
  3. Tilsett 11 μL 10% natrium dodecylsulfat (SDS) per rør (0,3% endelig konsentrasjon), bland forsiktig ved pipettering og inkuber ved 37 °C i 45 minutter, rist ved 700-950 o/min. Pipet opp og ned for å forstyrre klumper et par ganger under inkubasjon.
  4. Slukk SDS ved å tilsette 75 μL ikke-ionisk overflateaktivt middel (10% løsning, se materialtabellen) per rør (1,6% endelig konsentrasjon) og inkubere ved 37 °C i 45 minutter, risting ved 950 o/min. Pipet opp og ned et par ganger for å forstyrre klumper under inkubasjon.
    MERK: Hvis klumpene er store og vanskelige å forstyrre, reduserer du den roterende hastigheten til 400 o/min under SDS- og overflateaktive behandlinger. Hvis klumpene er vanskelige å dele opp ved pipettering, deler du prøven i to. justere volumene av begrensningsbuffer, SDS og overflateaktivt middel; og fortsett med permeabiliseringen. Deretter snurrer du kjernen med minimumshastighet (200 × g), kaster forsiktig supernatanten, slår sammen prøvene i 1X-begrensningsbuffer og fortsetter med fordøyelsen. Ta en 10 μL aliquot som den ufordøyde prøven (UD).

3. Enzymatisk fordøyelse

  1. Fordøye kromatin ved å legge til 200 enheter (U) av Mbo I per rør, og inkubere ved 37 °C i en periode fra 4 timer til over natten mens du roterer (950 o/min).
  2. Neste dag legger du til ytterligere 50 U Mbo I per rør, og inkuberer ved 37 °C i 2 timer mens du roterer (950 o/min).
  3. Inaktiver enzymet ved å inkubere rørene ved 60 °C i 20 minutter. Plasser rørene på isen.
    MERK: Ta en 10 μL aliquot som den fordøyde prøven (D).

4. Biotinylering av DNA-ender

  1. For å fylle ut begrensningsfragmentoverhengene og merke DNA-endene med biotin, tilsett 1,5 μL hver av 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL 0,4 mM biotin dATP, 17,5 μL Tris lav-EDTA (TLE) buffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0], og 10 μL 5 U/μL Klenow (DNA-polymerase I stort fragment) til alle rørene. Bland forsiktig og inkuber i 75 min ved 37 °C. Rist ved 700 rpm hver 10 s i 30 s. Legg alle rørene på isen mens du forbereder ligasjonsblandingen.

5. Ligasjon

  1. Overfør hver fordøyd kromatinblanding til et separat 1 ml rør med ligasjonsblanding (100 μL 10x ligationbuffer, 10 μL 10 mg/ml bovint serumalbumin, 15 U T4 liga DNA-er og 425 μL dobbeltdestillert vann [ddH2O]). Bland grundig ved skånsom pipettering, og inkuber over natten ved 16 °C.

6. Crosslink reversering og DNA-rensing

  1. Forring proteiner ved å tilsette 50 μL 10 mg/ml proteinase K per rør, og inkuber ved 37 °C i 2 timer. Reverser krysskoblinger ved å øke temperaturen til 65 °C og inkubere over natten.
  2. Forring RNA ved å tilsette 20 μL 10 mg/ml RNase A, og inkuber ved 37 °C i 1 time.
  3. Utfør fenol:kloroform ekstraksjon etterfulgt av etanol nedbør.
    1. Tilsett 1 volum fenol-kloroform, og bland grundig ved inversjon for å oppnå en homogen hvit fase.
      MERK: Fenol er et farlig kjemikalie. Følg de aktuelle helse- og sikkerhetsforskriftene. Arbeid i avtrekkshetten.
    2. Sentrifuge på 15.000 × g i 15 min. Overfør den vandige fasen til et friskt 2 ml mikrosenterrør. Utfør en tilbaketrekking av det nedre laget med 100 μL TLE-buffer, og overfør den vandige fasen til samme 2 ml rør.
    3. Utfell DNA ved å tilsette 2 volumer 100% etylalkohol (EtOH), 0,1 bind 3 M natriumacetat og 2 μL 20 mg/ml glykogen. Inkuber ved -20 °C i en periode fra 2 timer til over natten.
    4. Spinn ved 15.000 × g i 30 min ved 4 °C, og vask pelletsene 2x med iskald 70% EtOH. Tørk pelletsene ved RT, og resuspend i 100 μL TLE buffer. Kvantifisere DNA ved hjelp av et fluorogent fargestoff som binder selektivt til DNA og et fluorometer i henhold til produsentens instruksjoner (Materialfortegnelse).
      MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar ligation produkter ved 4 °C på kort sikt eller ved -20 °C på lang sikt. Bruk en aliquot (100 ng) av materialet som den ligaterte prøven (L) for kvalitetskontroll.

7. Vurder Hi-C malkvalitet

  1. Kvalitative kontroller for fordøyelse og ligasjon
    1. Rens DNA fra UD og D aliquots ved å reversere krysskoblingene, og utfør fenol: kloroformutvinning og etanolutfelling som beskrevet ovenfor.
    2. Last inn 100 ng UD-, D- og L-prøver i en 1,5 % agarosegel. Se etter et smør sentrert rundt 500 bp i D-prøven kontra et bånd med høy molekylvekt for L-prøven (se representative resultater).
  2. Kvantitativ kontroll for fordøyelseseffektivitet
    MERK: For å vurdere fordøyelseseffektiviteten mer nøyaktig, bruk UD- og D-prøvene som maler for å utføre kvantitative polymerasekjedereaksjoner (qPCR) ved hjelp av primere designet som følger.
    1. Design et primerpar som forsterker et DNA-fragment som inneholder DNA-begrensningsstedet for enzymet som brukes til fordøyelsen (Mbo I i den nåværende protokollen), kalt R i formelen i trinn 7.2.3.
    2. Design et primerpar som forsterker et kontroll-DNA-fragment som ikke inneholder begrensningsstedet for enzymet som brukes til fordøyelsen (Mbo I for den nåværende protokollen), kalt C i formelen i trinn 7.2.3.
    3. Bruk syklusterskelverdiene (Ct-verdiene) for forsterkningen til å beregne begrensningseffektivitet i henhold til formelen vist nedenfor:
      % begrensning = 100 - 100/2{(Ctr - CtC)D - (Ctr - CtC)UD}
      Der CtR refererer til Ct-verdien for fragment R, og CtC refererer til Ct-verdien for fragment C for prøve D og prøve-UD.
      MERK: Begrensningsprosenten gjenspeiler effektiviteten til begrensningsenzymet som spalter det begrensede (R) DNA-fragmentet sammenlignet med et KONTROLL (C) DNA-fragment som ikke inneholder begrensnings-DNA-området. En begrensningseffektivitet på ≥ 80% anbefales.
  3. Påvisning av kjente interaksjoner
    1. Utfør PCR for å forsterke en intern ligationkontroll for å undersøke kortdistanse- og/eller mellom- eller langtrekkende interaksjoner (se representative resultater).
    2. Alternativt kan du designe primere for å forsterke et ligationprodukt der primerne er i fremover- eller omvendt retning i tilstøtende begrensningsfragmenter.
  4. Utfyllings- og biotinmerkingskontroll
    1. Verifiser Hi-C-merking og ligasjonseffektivitet ved forsterkning og fordøyelse av et kjent interaksjons- eller ligationprodukt mellom tilstøtende begrensningsfragmenter i genomet, som beskrevet ovenfor.
      MERK: Vellykket utfylling og ligasjon av Mbo I-nettstedet (GATC) genererer et nytt sted for begrensningsenzymet Cla I (ATCGAT) ved ligasjonskrysset og regenererer Mbo I-nettstedet.
    2. Fordøye PCR-produktet med Mbo I, Cla I eller begge deler. Etter å ha kjørt prøvene på en 1,5-2% gel, estimerer du det relative antallet 3C- og Hi-C-ligationkryss ved å kvantifisere intensiteten til kutt- og uncut-båndene26.
      MERK: Det ønskes en effektivitet på > 70 % (se representative resultater).

8. Sonikering

  1. Soniker prøvene for å få 200-500 bp DNA-fragmenter. For instrumentet som brukes i denne protokollen (se materialtabellen), fortynn prøven (fra 5 til 10 μg) i 130 μL ddH2O per rør, og sett instrumentet til å sonikere til 400 bp: fyllingsnivå: 10; pliktfaktor: 10%; topp hendelse strøm (w): 140; sykluser per utbrudd: 200; tid(er): 80.

9. Biotin fjerning / slutt reparasjon

MERK: Trinnene nedenfor er justert for 5 μg Hi-C DNA.

  1. For å utføre biotinfjerning, overfør prøven (130 μL) til et friskt mikrosenterrør. Tilsett 16 μL 10x ligasjonsbuffer, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA-polymerase (15U) og 7 μL ddH2O (160 μL totalt volum). Inkuber ved 20 °C i 30 minutter.
  2. Tilsett 5 μL 10 mM dNTPer, 4 μL 10x ligasjonsbuffer, 5 μL T4 polynukleotidkinase (10 U/μL), 1 μL Klenow og 25 μL ddH2O (200 μL totalt volum). Inkuber ved 20 °C i 30 minutter.

10. Endre størrelse på valg

  1. For å velge fragmenter for det meste i størrelsesområdet 250-550 bp, utfør sekvensiell solid fase reversibel immobilisering (SPRI) størrelsesvalg først med 0,6x, etterfulgt av 0,90x i henhold til produsentens instruksjoner, og elute DNA ved hjelp av 100 μL TLE.

11. Biotin pulldown/A-tailing/adapter ligation

MERK: Utfør vasken ved å bruke de magnetiske perlene på nytt ved å virvelere, rotere prøvene i 3 minutter på et roterende hjul, og deretter spinne ned prøven en kort stund og plassere den på magnetstativet. La perlene holde seg til magneten, kast supernatanten og fortsett med følgende vasketrinn. Utfør vasken ved 55 °C på en termoblokk med rotasjon i stedet for det roterende hjulet.

  1. Utgjør det endelige volumet til 300 μL per prøve med TLE for nedtrekk. Forbered perlevaskbufferne: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05 % Tween), 0,5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Bruk 150 μL streptavidin-koblede magnetiske perler (se materialtabellen) per bibliotek. Vask perlene 2x med 400 μL 1x TB. Deretter resuspend perler i 300 μL 2x NTB.
  3. Bland perlene med 300 μL Hi-C-materialet og inkuber på RT i 30 minutter på et roterende hjul for å tillate biotinbinding til streptavidinperler.
  4. Vask perlene med 400 μL 0,5x TB, og inkuber ved 55 °C i 3 minutter, roterende ved 750 o/min. Vask perlene i 200 μL av 1x begrensningsbuffer.
  5. Resuspend perlene i 100 μL dATP tailing mix (5 μL av 10 mM dATP, 10 μL av 10x begrensning buffer, 5 μL Klenow exo-, og 80 μL ddH2O). Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
  6. Fjern supernatanten, vask perlene 2x med 400 μL 0,5x TB ved å inkubere ved 55 °C i 3 minutter og rotere ved 750 o/min.
  7. Vask perlene med 400 μL 1x NTB og deretter med 100 μL 1x ligasjonsbuffer.
  8. Resuspend perlene i 50 μL av 1x ligation buffer, og overfør suspensjonen til et nytt rør. Tilsett 4 μL pre-annealed PE-adaptere (15 μM lager) og 2 μL T4-ligaer (400 U/μL, dvs. 800 U/rør); inkubere ved RT i 2 timer.
    MERK: For anneal adapterne ved å legge til like store volumer av både PE 1.0- og PE 2.0-adaptere (30 μM lager) og inkubere i 10 minutter på RT (se materialtabellen).
  9. Gjenfangst perlene ved å fjerne supernatanten og vaske perlene 2x med 400 μL TB. Vask perlene med 200 μL 1x NTB, deretter med 100 μL 1x restriksjonsbuffer, og bruk perlene på nytt i 40 μL 1x begrensningsbuffer.

12. PCR-forsterkning

  1. Sett opp PCR-er med 25 μL volum med 5, 6, 7 og 8 sykluser. For hver PCR bruker du:
    Reaksjon Oppskrift
    Hi-C perler 2,5 μL
    10 μM PE PCR primer 1 (Materialliste) 0,75 μL
    10 μM PE PCR primer 2 (Materialfortegner) 0,75 μL
    10 mM dNTP 0,6 μL
    5x reaksjonsbuffer 5 μL
    DNA-polymerase 0,3 μL
    ddH2O 14,65 μL
    Total 25 μL
    Sykluser Temperatur Tid
    1 98 °C 30 s
    n sykluser 98 °C 10 s
    65 °C 30 s
    72 °C 30 s
    1 72 °C 7 min

13. Endelig PCR-forsterkning

  1. Utfør endelig PCR-forsterkning med de samme betingelsene som beskrevet ovenfor og antall sykluser som er valgt. Del prøven ved hjelp av 5 μL Hi-C perler som mal i 50 μL reaksjoner.
  2. Samle alle PCR reaksjoner og overføre dem til et friskt rør. Bruk magneten til å fjerne streptavidin perler og gjenopprette supernatant (PCR-produkter). Overfør perlene til et friskt rør, vask perlene som angitt i trinn 11.2.9, og oppbevar i 1x begrensningsbuffer ved 4 °C som sikkerhetskopi.
  3. Rens PCR-produktene ved hjelp av 0,85 ganger volumet av SPRI-perlene i henhold til produsentens instruksjoner. Elute med 30 μL TLE-buffer.
  4. Kvantifisere Hi-C-biblioteket ved hjelp av et fluorometrisk instrument, og bekreft kvaliteten på biblioteket ved chip-basert kapillær elektroforese.
  5. Som et kontrollpunkt av siste kvalitet, bruk 1 μL av Hi-C-biblioteket som en mal for å utføre en PCR-reaksjon ved hjelp av 10 sykluser ved hjelp av de samme forholdene som er beskrevet i trinn 12.1. Del PCR-produktet i to mikrocentrifuge rør: fordøye den ene med Cla I og la den andre være ufordøyd som en kontroll. Kjør produktene i en 1,5-2% agarose gel (se representative resultater).
  6. Fortsett til 50 bp eller 75 bp pardelt sekvensering på en egnet sekvenseringsplattform.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nedenfor beskrives resultatene av en vellykket Hi-C-protokoll (se et sammendrag av Hi-C-protokollarbeidsflyten i figur 1A). Det er flere kvalitetskontrollpunkter under Hi-C-eksperimentet i kjernen. Prøve aliquots ble samlet inn før (UD) og etter (D) kromatin begrensning trinn samt etter ligation (L). Krysskoblinger ble reversert, og DNA ble renset og kjørt på en agarose gel. Et smør på 200-1000 bp ble observert når begrensningen med Mbo I var vellykket (Figur 1B). Den forventede størrelsen på molekylet avhenger av det valgte enzymets begrensningsenzym. Hvis ligasjonen var vellykket, ble et bånd med høy molekylvekt sett på toppen av gelen (Figur 1B). Fordøyelseseffektivitet kan også bekreftes av qPCR som beskrevet i detalj i protokollen. En akseptabel fordøyelseseffektivitet er 80 % eller høyere (figur 1C).

For å vurdere Hi-C-ligation effektivitet i detalj, primere kan utformes for å forsterke en intern ligation produktkontroll der primere er i fremover-fremover eller omvendt reversere retning i tilstøtende begrensning fragmenter. Alternativt kan primere utformes for å forsterke kjente interaksjoner. Figur 2A viser forsterkning av en kjent mellomdistanse (300 kb) interaksjon i Drosophila25. Hi-C ligation produkter (der biotin merking, fill-in, og ligation skjedde vellykket) kan estimeres ved fordøyelsen av PCR-produktet gjenvunnet i forsterkning. Etter utfylling og ligasjon vil Hi-C-amlikoner inneholde et nytt Cla I-begrensningssted på det opprinnelige Mbo I-nettstedet, som er bevart ved stump ligasjon. Hvis begrensningen med Cla I ikke er fullført, vil utfyllingsreaksjonen og biotinmerkingen være ineffektiv. En fordøyelseseffektivitet på mer enn 70% anbefales for å unngå å ha en stor andel av ikke-nyttige lesninger for bibliotekene etter sekvensering (Figur 2A, sammenlign Cla I-fordøyelsen av 3C versus Hi-C-malen).

For å bestemme et tilstrekkelig antall PCR-forsterkningssykluser for å forsterke det endelige Hi-C-biblioteket, ble PCR-reaksjoner satt opp ved hjelp av 2,5 μL av et gitt bibliotek på perler, som beskrevet i protokollen. Antall PCR-sykluser for den endelige forsterkningen er én syklus som er mindre enn antall sykluser som smøringen er synlig for (figur 2B). I dette tilfellet ble 4 sykluser med PCR-forsterkning valgt. Som et kontrollpunkt av endelig kvalitet ble et aliquot av Hi-C-biblioteket forsterket og fordøyd med Cla I. Nivået på fordøyelsen av biblioteket (en reduksjon i smørestørrelsen) indikerer overflod av gyldige Hi-C-par og gjenspeiler andelen nyttige lesninger som vil bli hentet fra biblioteket (Figur 2C). Et forhold mellom det øvre størrelsesområdet (bestemt av størrelsen som finnes i UD-prøven) og det nederste størrelsesområdet i både UD- og D-prøver, bør produsere et forhold > 1 for UD og et forhold ≤ 1 for den fordøyde prøven hvis Cla I-fordøyelsen er effektiv.

Etter parbasert sekvensering ble FASTQ-filene (tabell 1) behandlet ved hjelp av HiCPro28 og den genererte statistikken tegnet inn ved hjelp av MultiQC28. Et alternativt verktøy til HiCPro er HiCUP30-rørledningen som gir lignende resultater (ikke vist). Figur 3 og tabell 2 viser detaljert statistisk informasjon om de sekvenserte avlesningene. Full lesejustering og justering etter at trimming er rapportert. Disse to kategoriene tilsvarer justerte lesinger som vil bli brukt i etterfølgende analyse for å finne gyldige Hi-C-par. Kategorien justering etter trimming refererer til lesninger som spenner over ligasjonskrysset, som ikke ble justert i det første trinnet, og som trimmes på ligation-området for deretter å justere 5' ekstremitet til genomet28 (Figur 3B, C og Tabell 2). Kontaktstatistikken viser at Hi-C-biblioteket var av høy kvalitet med 82,2 % gyldige par og 7,6 % ikke-nyttige lesninger som falt inn i kategoriene selvsirkel med samme fragment, dangling med samme fragment, ny ligation, filtrerte par og dumpet parkategorier (Figur 3A, Figur 3Dog Tabell 2). Videre er antall PCR-duplikater svært lavt, noe som indikerer at bibliotekets kompleksitet er høy, og at PCR-syklusene introduserte minimale artefakter (Figur 3E og Tabell 2).

Ved hjelp av de unike gyldige Hi-C-parene ble grunnleggende analyse av pardistribusjonen utført ved hjelp av HiCPro27. Dette eksperimentet ga 46,5 % unike cis-kontakter ≤ 20 kbp, 47,1 % unike CIS-kontakter > 20 kbp og 5,8 % unike transkontakter (figur 3D). Fordelingen av cis til trans gyldige par korresponderte med resultatene som forventes for et vellykket Hi-C-eksperiment med de fleste interaksjonene som oppdages innenfor samme kromosom. En høy andel transkontakter indikerer ineffektiv fiksering. Ved hjelp av Hi-C-gyldige par fra HiCPro27ble matriser normalisert av iterativ korreksjon, og eigenvector-dekomponering (ICE)30og 1 kb og 5 kb oppløsning matriser ble generert ved hjelp av HiCPlotter30,31,32. Normaliserte kontaktmatriser med oppløsning på 1 kB og 5 kB presenteres for Notch-genet i Drosophila (figur 4A, figur 4Cog figur 4D). I figur 4Akan notch-genet ses sammen med APs, domene l og II, samt histone modifikasjoner langs locus (Figur 4A og Tabell 1). Utformingen av CRISPR-Cas9-slettingen involverte motivet til CTCF og M1BP (figur 4B).

Ved sletting av regionen som inneholder både CTCF og M1BP DNA-bindende steder ved 5' grensen til Notch locus (5pN-delta343, tabell 1), kan en dramatisk endring i kromatinkontakter observeres med tap av interaksjoner inne i Notch locus og gevinst av kontakter med oppstrøms TAD sammenlignet med villtype (WT) (Figur 4C,D). Til slutt viser figur 4E et detaljert panorama av WT- og mutantinteraksjonsprofiler på begrensningsfragmentnivået fra Notch-genet 5' UTR, som viser en nedgang i andelen kontakter som er gjort med Notch-genlocus og en økning i kontakter med oppstrømsdomenet. De virtuelle 4C-visningene av Notch-genet 5' UTR ble oppnådd ved hjelp av HiC-Pro27. Et alternativt verktøy er Hi-C andre ender kvantifisering tilgjengelig i SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Alle resultatene som ble presentert i figur 4 ble oppnådd ved å bruke Hi-C-protokollen i WT- og mutant S2R+ Drosophila-celler, som beskrevet av Arzate-Mejía et al.25.

Figure 1
Figur 1: Hi-C-fordøyelses- og ligasjonskontrollene i kjernen. (A) Oversikt over Hi-C-protokollen. Celler er kryssbundet med formaldehyd, noe som resulterer i kovalente koblinger mellom kromatinsegmenter (DNA-fragmenter: rosa, lilla) og proteiner. Kromatin fordøyes med et begrensningsenzym (representert av saks), i dette eksemplet Mbo I. De resulterende klebrige endene er fylt med nukleotider, inkludert en biotinylert dATP (mørkeblå sirkler). DNA renses, og de biotinylerte kryssene berikes ved hjelp av streptavidinbelagte magnetiske perler (grå sirkler). Interagerende fragmenter identifiseres ved neste generasjons, parkoblede sekvensering. (B) Hi-C fordøyelses- og ligasjonskvalitetskontroller for to biologiske replikeringer (Hi-C 1 og Hi-C 2). Hi-C biblioteker ble løst på en 1,5% agarose gel. Begge fordøyd, D, biblioteker kjører som et smør rundt 600 bp. Ligatede prøver, Lig, kjører som et ganske stramt bånd større enn 10 kb som ligner på de ufordøyde UD-prøvene. Forskjellene i signalstyrke skyldes ujevne mengder lastet DNA på gelen. (C) Hi-C fordøyelse kvantitativ kontroll ved kvantitativ polymerase kjede reaksjon for de samme to biologiske replikerer som i (B) (Hi-C 1 og Hi-C 2) ved hjelp av syklus terskelverdier som beskrevet i protokollen. En vellykket fordøyelse har ≥ 80% begrensning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Hi-C-utfyllings- og stump-end ligation-kontroller. (A) Utfyllings- og biotinmerkingsvurdering. En kjent interaksjon mellom fragmenter som ligger 300 kb fra hverandre i kromosom X ble brukt som en kontroll og forsterket ved hjelp av primerne angitt med svarte piler (se toppen av ordningen i (B), primer 1 (venstre), primer 2 (høyre), tabell 1), genererer en 347 bp amplicon. Hi-C ligation produkter kan skille seg fra de som produseres i et 3C-eksperiment ved fordøyelsen av ligation stedet. Hi-C-veikryss ble fordøyd av Cla I på det opprinnelige Mbo I-nettstedet, da dette dannet seg ved stump ligasjon. Hi-C- og 3C-kryss ble fordøyd med Mbo I da begrensningsstedet regenererer ved ligasjon (til venstre for gelen). Derimot ble 3C-kryss ikke fordøyd av Cla I på Mbo I-nettstedet, men bare av Mbo I. Sammenlign fordøyelsesprofilen til Hi-C- og 3C-produktene ved hjelp av Cla I. Et fragment på 53 bp ble oppnådd ved å fordøye Hi-C-produktet (på grunn av begrensning av Cla I-nettstedet dannet på Mbo I-nettstedet og begrensning av et Cla I-nettsted som allerede er til stede i regionen). Dette fragmentet ble ikke observert i 3C-produktfordøyelsen, da det eneste Cla I-nettstedet som var tilgjengelig var det som allerede var til stede i regionen. (B) Etter PCR-forsterkning av Hi-C-biblioteket ved hjelp av forskjellige PCR-sykluser, ble produktene kjørt på en 1,5% agarose gel. Det var forventet et smør på 400-1000 bp og observert. De riktige tallsyklusene for den endelige forsterknings-PCR bør tas som tallet umiddelbart lavere enn det der et smør bare er synlig. (C) Endelig bibliotek Cla I fordøyelsen. En aliquot av det endelige biblioteket ble forsterket og fordøyd med Cla I. Størrelsesreduksjonen av smøret bekreftet at en stor del av molekylene i biblioteket var gyldige Hi-C-par. Densitometrisk analyse av denne gelen kan utføres for å oppnå et forhold mellom FN- og D-prøvene, som beskrevet i avsnittet om representative resultater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: HiC-Pro-statistikk for Hi-C-biblioteket. (A) Skjematisk representasjon av gyldige Hi-C-par og de forskjellige typene ikke-gyldige par som kan produseres under eksperimentet og filtreres ut av HiCPro27 (Tabell 2). Disse inkluderer lesninger som faller inn i sammenhengende sekvenser, dangling ender, samme fragment, selvsirkel, re-ligations, og PCR duplikater. (B) Kartleggingsstatistikk. Leseoperasjoner som ikke ble justert, vises (grått), og både fullstendig justerte leseoperasjoner og lesinger som er justert etter beskjæring, vises i henholdsvis blått og lyseblått. Disse to kategoriene representerer de nyttige lesningene som vurderes i etterfølgende analyser. (C) Sammenkoblingsstatistikk. Multijusterte leseoperasjoner (mørk oransje) representerer lyder som er justert i flere områder i genomet. Unikt justerte (mørkeblå) lesninger representerer leseparene som er justert én gang i genomet, og singletoner (lyse oransje) representerer lesepar der bare ett genomisk område ble sekvensert i begge lesningene. (D) Filtrere statistikk. Gyldige lesepar (blå) representerer vellykkede Hi-C-ligationprodukter som beskrevet i (A). Selvfragmenter selvsirkler (lys rosa) er ikke-nyttige lesninger, da de representerer det samme genomiske fragmentet som vises i (A). Ender med samme fragmentdangling (oransje) representerer lesninger der et enkelt begrensningsfragment ble sekvensert. Filtrerte og dumpede par (brune) er også ikke-nyttige lesninger som har feil størrelse eller som ligationproduktet ikke kunne rekonstrueres for. Til slutt representerer re-ligation reads (red) lesninger der to tilstøtende fragmenter ble re-ligated, og dermed produsere ikke-nyttig informasjon. (E) Gyldige lesepar kontaktdistribusjon i genomet. Unike cis-kontakter (blå) er hyppigere enn unike transkontakter (grønn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Hi-C-kontaktmatriser og virtuell 4C-analyse av WT- og mutant S2R+-celler. (A) Hi-C normalisert varmekart av en 50 kb region ved 1 kb oppløsning sentrert i Notch gen locus. TAD-separasjonsresultat32 for locus vises, sammen med partisjonering av Notch-locus i to topologiske domener (Domene 1 og Domene 2). ChIP-seq-data for APer, RNA Pol II og histonemerker for S2/S2R+-cellene34,35,36,37 vises under varmekartet ( Tabell1). Posisjonene til Notch-domene 1-grensene er uthevet i lysegrønn. (B) Skjematisk representasjon av B1-grense CRISPR mutant. Det grønne rektangelet angir det slettede området på 343 bp. Saks indikerer sgRNAer som brukes til CRISPR-mediert genomredigering. Motivbindingssteder for APer vises som bokser for CTCF og M1BP. Topptopper for DNA-bindende APer vist i (A) er også angitt35. (C) Hi-C normaliserte varmekart med en oppløsning på 1 kB som dekker en region på 50 kB sentrert i Notch for WT- og mutantcellene. Venstre, Hi-C-varmekart over log2-forskjellene i interaksjonsfrekvens mellom WT og mutantceller. (D) Hi-C normaliserte varmekart som dekker et område på 250 kB sentrert i Notch med 5 kB oppløsning for WT- og mutantceller. Venstre, Hi-C-varmekart over log2-forskjellene i interaksjonsfrekvens mellom WT og mutantceller. (E) Virtual-4C for WT- og mutantceller som bruker 5' UTR of Notch som synspunkt. Prosentandelen av interaksjoner mellom synspunktet og områdene i oppstrøms kirredomain-2, Notch-domene 1, Notch-domene 2 og nedstrøms dnc-domenet for både WT- og mutantceller vises25. Forkortelser: WT = vill type; TAD = topologisk tilknyttet domene; ChIP = kromatin immunoprecipitation; AP = arkitektonisk protein; RNA Pol = RNA polymerase; S2R+ = S2 reseptor pluss; sg RNA = enkeltfører RNA; UTR = ikke-oversatt område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksperiment Eksempel GEO-tiltredelsesnummer
Flis CP190 GSM1015404
Flis SuHW GSM1015406
Flis Mod(mdg4) GSM1015408
Flis CTCF GSM1015410
Flis Ibf1 GSM1133264
Flis Ibf2 GSM1133265
Flis BEAF32 GSM1278639
Flis Pita GSM1313420
Flis ZIPIC GSM1313421
Flis RNA PolII GSM2259975
Flis H3K4me1 GSM2259983
Flis H3K4me3 GSM2259985
Flis H3K27ac GSM2259987
Flis MSL2 GSM2469507
Flis H4K16ac GSM2469508
Flis M1BP GSM2706055
Flis GAF GSM2860390
Flis Innspill GSM1015412
Hi-C S2R+ WT-celler GSE136137
Hi-C S2R+ 5pN-delta343 celler GSE136137

Tabell 1: GEO-tiltredelsesnumre.

HiC-Pro-statistikk Leser Prosent
Kartlegging av statistikk
Fullstendig lesing av justeringer 131515921 82.20%
Befestede lesejusteringer 16408309 10.30%
Kan ikke justere 12110964 7.60%
Statistikk for paring
Unikt justert 79428455 50.90%
Singleton 19063418 12.20%
Flere justerte 57700021 36.90%
Filtrere statistikk
Gyldige par 71373989 90.12%
Samme fragment: Selvsirkel 2340697 2.90%
Samme fragment: Dangling Ends 2578783 3.20%
Filtrerte par 2773043 3.50%
Dumpede par 196565 0.20%
Statistikk for kontakt
Unik: cis ≤ 20 kbp 33108815 46.50%
Unik: cis > 20 kbp 33539888 47.10%
Unik: trans 4133602 5.80%
Dupliserte lesepar 398400 0.60%

Tabell 2: HiC-Pro-statistikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den in-nukleus Hi-C-metoden som presenteres her, har tillatt detaljert utforskning av Drosophila genomtopologi ved høy oppløsning, og gir utsikt over genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer, fra kromatinløkker mellom regulatoriske elementer som promotorer og forsterkere til TADs og stor romidentifikasjon25. Den samme teknologien har også blitt effektivt brukt på pattedyrvev med noen modifikasjoner33. For eksempel, når du behandler et vev i stedet for en encellet suspensjon, siktes vevet gjennom et 70 μm filter, og lysistrinnet utføres mens du homogeniserer materialet ved hjelp av en Dounce homogenisator. I tillegg, ettersom pattedyrgenomet er 25 ganger større enn Drosophila-genomet, er antall gyldige lesepar som trengs for å bygge 1-5 kb oppløsning matriser større. Hi-C-metoden i kjernen er forskjellig fra den opprinnelige Hi-C-metoden2 i unngåelse av kjernefysisk lysis med 1% SDS ved 65 °C før ligasjon, og dermed bevare kjernefysisk integritet, og ved ligating i 1 ml i stedet for 7 ml23,24.

Protokollen har noen viktige trinn for å sikre høy effektivitet. Det første trinnet som kan introdusere fordøyelse og utfylling ineffektivitet er dannelsen av klumper under 0,3% SDS permeabilisering og overflateaktive behandlinger. Hvis klumpene er store og vanskelige å forstyrre, bør den roterende hastigheten reduseres til 400 rpm under SDS og overflateaktive behandlinger. Hvis klumpene forblir vanskelige å dele opp ved pipettering, bør prøven deles i to ved å justere volumene med begrensningsbuffer, SDS og det ikke-ioniske overflateaktive middelet før du fortsetter med permeabiliseringen. Deretter skal kjernene sentrifugeres med minimumshastighet (200 × g), supernatanten kastes forsiktig, og prøvene samles sammen i 450 μL 1x begrensningsbuffer før du fortsetter med fordøyelsen. For det andre er estimering av fordøyelseseffektivitet viktig for å gi nok DNA-fragmenter for utfylling og ligasjon. Hvis fordøyelsen ved kvalitativ vurdering viser seg å være ineffektiv, bør en andre runde fordøyelse utføres med begrensningsenzymet i en periode fra 4 timer til over natten.

For det tredje er estimering av ligasjonseffektivitet viktig. Hvis ligationen ved kvalitativ vurdering viser seg å være ineffektiv (dvs. i stedet for det høye molekylvektbåndet, observeres et smør som ligner det som er observert for den fordøyde prøven), bør ligationen gjentas ved å sentrifugere kjernene ved 200 × g og resuspendere dem i ligasjonsblanding ved hjelp av fersk 10x ligation buffer og ligase. For det fjerde bør prosentandelen av Hi-C-gyldige produkter estimeres ved å fordøye en PCR-amplikon av en forventet interaksjon med Cla I (for Mbo I original fordøyelse). Effektiv forsterkning og fordøyelse av forsterkningen av forventet interaksjon bekrefter vellykket ligasjon og dannelse av Hi-C-kryss. Hvis amplicon fordøyelsen ikke er effektiv, vil flertallet av molekylene være 3C i stedet for Hi-C-produkter, og dette bør tas i betraktning om biblioteket vil bli sekvensert. Dette kan også bekreftes ved å utføre det endelige biblioteket Cla I fordøyelseskontroll, som beskrevet i den representative resultatseksjonen. Til slutt er valg av lavere antall PCR-sykluser viktig for å unngå PCR-duplikater. Hvis det ved sekvensering viser seg at prosentandelen av duplikater av lesepar er høy, bør antall PCR-sykluser reduseres ytterligere.

Denne hi-C-teknikken i kjernen har noen begrensninger. For det første representerer protokollen som er beskrevet her Hi-C-eksperimentet utført for en cellepopulasjon. Derfor representerer signalet om frekvensen av genomiske kontakter millioner av genomer med variable individuelle konformasjoner. For å få settet med genomiske kontakter fra et enkelt genom, anbefales et encellet Hi-C-eksperiment22. For det andre er Hi-C basert på ligasjon av proksimale DNA-fragmenter. Således, hvis genomiske regioner er en del av et stort protein-kromatinkompleks, kan avstanden mellom fragmenter hindre ligasjon. Det har for eksempel vist seg at transkontakter er dårlig representert i Høy-C38. Videre avsluttes Hi-C med parret sekvensering, og henter dermed par genomiske kontakter. Imidlertid kan flere DNA-fragmenter samtidig samhandle i samme kromatinkompleks. For å oppnå identiteten til flere DNA-fragmenter i et kromatinkompleks, kan alternative sekvenseringsmetoder brukes på Hi-C39, eller forskjellige eksperimentelle strategier kan brukes der ligasjon ikke utføres38,40,41. Til slutt, selv om Hi-C måler genomiske kontakter, avslører den ikke identiteten til proteinene som formidler interaksjonene. Alternative metoder må brukes for å identifisere de genomiske interaksjonene formidlet av et bestemt protein av interesse42 eller identiteten til ensemblet av proteiner ved spesifikke genomiske elementer43.

Til slutt, med et Hi-C-eksperiment av høy kvalitet som det som er beskrevet her for Drosophila-genomet (Tabell 2), kan matriser bygges med et bredt spekter av oppløsninger (fra 1, 5 kb, 50 kb eller lavere; se figur 4). I tillegg, hvis en bestemt region av genomet må evalueres på begrensningsfragmentnivå, kan dataene brukes til å bygge et virtuelt 4C-landskap av ønsket synspunkt (f.eks. Notch-genet 5' UTR i figur 4E). Hi-C andre ender verktøyet i SeqMonk er et veldig brukervennlig alternativ som muliggjør visualisering av dette landskapet. Bruk av 4C kvantifiseringsverktøyet, også en del av SeqMonk, på dette landskapet kan gi statistisk signifikante kontakter.

Ved å bruke in-nucleus Hi-C-eksperimentet beskrevet her på en samling mutante cellelinjer med endrede AP DNA-bindende steder ved TAD-grensene (Figur 4) avslørte at genetiske elementer er nødvendig ved grensene for å strukturere Drosophila-genomet i domener og opprettholde genuttrykksregulering som fullt ut diskutert av Arzate-Mejía et al.25. Dermed kan genetisk redigering av regulatoriske elementer med CRISPR / Cas9-systemet, kombinert med høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner ved hjelp av kjernen Hi-C-protokollen beskrevet her, være en kraftig strategi for å teste den strukturelle funksjonen til genetiske elementer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskuddsnummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskuddsnummer 303068. A.E.-L. er en masterstudent støttet av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Tags

Genetikk Utgave 175 Kromatin Genome 3D-organisasjon rom topologisk assosierende domener
In-Nucleus Hi-C i Drosophila-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Esquivel-López, A.,More

Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter