Summary
Genomet är organiserat i kärnrummet i olika strukturer som kan avslöjas genom kromosomkonformationsfångstteknik. Hi-C-metoden i nukleus ger en genomomfattande samling kromatininteraktioner i Drosophila-cellinjer, som genererar kontaktkartor som kan utforskas vid megabasupplösning på begränsningsfragmentnivå.
Abstract
Genomet är organiserat i topologiskt associerande domäner (TADs) avgränsade av gränser som isolerar interaktioner mellan domäner. I Drosophila är de mekanismer som ligger till grund för TAD-bildandet och gränserna fortfarande under utredning. Tillämpningen av in-nucleus Hi-C-metoden som beskrivs här hjälpte till att dissekera funktionen av arkitektoniskt protein (AP)-bindande platser vid TAD-gränser som isolerar skårgenen. Genetisk modifiering av domängränser som orsakar förlust av APs resulterar i TAD fusion, transkriptionella defekter och långdistans topologiska förändringar. Dessa resultat gav bevis som visar bidrag av genetiska element till domän gränsbildning och genuttryck kontroll i Drosophila. Här har hi-C-metoden i nukleus beskrivits i detalj, vilket ger viktiga kontrollpunkter för att bedöma experimentets kvalitet tillsammans med protokollet. Också visas de erforderliga numrerar av sekvenseringläsningar och giltiga Hi-C parar för att analysera genomic växelverkan på olika genomic fjäll. CRISPR/Cas9-medierad genetisk redigering av regulatoriska element och högupplöst profilering av genomiska interaktioner med hjälp av detta in-nucleus Hi-C-protokoll kan vara en kraftfull kombination för undersökning av genetiska elements strukturella funktion.
Introduction
I eukaryoter delas genomet i kromosomer som upptar specifika territorier i kärnområdet under interfas1. Kromatin som bildar kromosomerna kan delas in i två huvudstater: en av tillgängliga kromatin som är transkriptionellt tillåtande, och den andra av kompakt kromatin som är transkriptionellt repressiv. Dessa kromatin tillstånd segregera och blanda sällan i kärnrummet, bildar två distinkta fack i kärnan2. På sub-megabase-skalan separerar gränser domäner för högfrekventa kromatininteraktioner, så kallade TADs, som markerar kromosomorganisation3,4,5. Hos däggdjur upptas TAD-gränserna av kohins och CCCTC-bindande faktor (CTCF)6,7,8. Det sammanhållna komplexet extruderar kromatin och stannar vid CTCF-bindande platser som kasseras i konvergent orientering i den genomiska sekvensen för att bilda stabila kromatinöglor9,10,13,14. Genetisk störning av CTCF DNA-bindande plats vid gränserna eller minskning av CTCF och kohin protein överflöd resulterar i onormala interaktioner mellan reglerande element, förlust av TAD bildas och genuttryck avreglering9,10,11,13,14.
I Drosophila, Gränserna mellan TADs upptas av flera APs, inklusive gränselement-associerade faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindande protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), suppressor av hårig vinge (SuHW) och CTCF, och berikas i aktiva histon modifieringar och Polymerase II16,17,18. Det har föreslagits att i Drosophila visas TADs som en följd av transkription13,17,19, och den exakta rollen av oberoende APs i gränsbildning och isoleringsegenskaper är fortfarande under utredning. Huruvida domäner i Drosophila är en enda följd av aggregering av regioner med liknande transkriptionstillstånd eller om APs, inklusive CTCF, bidrar till gränsbildning återstår därför att helt karakterisera. Utforskning av genomiska kontakter med hög upplösning har varit möjlig genom utveckling av kromosomkonformationsfångstteknik i kombination med nästa generations sekvensering. Hi-C protokollet beskrevs först med ligatur steget utförs "i lösning"2 i ett försök att undvika falska ligatur produkter mellan kromatin fragment. Flera studier pekade dock på insikten att den användbara signalen i data kom från ligaturprodukter som bildats vid delvis lysade atomkärnor som inte fanns i lösning20,21.
Protokollet ändrades sedan för att utföra ligaturen inuti kärnan som en del av Hi-C-experimentet med en cell22. Hi-C-protokollet i nukleos införlivades därefter i cellpopulationen Hi-C för att ge en mer konsekvent täckning över hela skalet av genomiska avstånd och producera data med mindre tekniskt brus23,24. Protokollet, som beskrivs i detalj här, är baserat på populationen i kärnan Hi-C protokoll23,24 ochanvändes för att undersöka konsekvenserna av genetiskt avlägsnande DNA-bindande motiv för CTCF och M1BP från en domängräns vid Notch gen locus i Drosophila25. Resultaten visar att en ändring av DNA-bindande motiv för APs vid gränsen har drastiska konsekvenser för Notch domänbildning, större topologiska defekter i regionerna kring Notch locus och genuttryck avreglering. Detta indikerar att genetiska element vid domängränser är viktiga för upprätthållandet av genomtopologi och genuttryck i Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fixering
- Börja med 10 miljoner Schneiders linje 2 plus (S2R+) celler för att förbereda 17,5 ml cellfjädring i Schneider medium som innehåller 10% fetala nötkreatursserum (FBS) vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt metanolfri formaldehyd för att få en slutlig koncentration på 2%. Blanda och inkubera i 10 minuter på RT, var noga med att blanda varje minut.
OBS: Formaldehyd är en farlig kemikalie. Följ lämpliga hälso- och säkerhetsbestämmelser och arbeta i rökhuven. - Släcker reaktionen genom att tillsätta glycin för att uppnå en slutlig koncentration på 0,125 M och blanda. Inkubera i 5 minuter på RT, följt av 15 min på is.
- Centrifugera i 400 × g vid RT i 5 min och sedan i 10 min vid 4 °C. kassera supernaten. Återanvänd pelleten försiktigt i 25 ml kall 1x fosfatbuffrad saltlösning.
- Centrifugera vid 400 × g i 10 min vid 4 °C och kassera sedan supernaten.
OBS: Om du fortsätter med protokollet, gå till steg 2.1 för lys. Annars blixtfrys pelleten i vätska N2 och förvara pelleten vid -80 °C.
2. Lysis (på)2) Lysis
- Återanvänd cellerna i 1 ml iskallt lysbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% icke-joniskt tensider (se materialförteckningen);10 mM NaCl; 1x proteashämmare) och justera volymen till 10 ml med iskyld lysbuffert. Justera volymen för att erhålla en koncentration på 1 × 106 celler/ml. Inkubera på is i 30 min, blanda varannan minut genom att vända rören.
- Centrifuga kärnorna vid 300 × g i 5 min vid 4 °C och kassera sedan försiktigt supernatanten. Tvätta pelleten 1x med 1 ml kall lysbuffert och överför den till ett mikrocentrifugrör. Tvätta pelletsen 1x med 1 ml kall 1,25x begränsningsbuffert och återanvänd varje cellpellet i 360 μL 1,25x begränsningsbuffert.
- Tillsätt 11 μL 10% natriumdiddcylsulfat (SDS) per rör (0,3% slutlig koncentration), blanda försiktigt genom pipetting och inkubera vid 37 °C i 45 min, skaka vid 700-950 varv/min. Rör upp och ner för att störa klumpar några gånger under inkubation.
- Släcka SDS genom att tillsätta 75 μL icke-joniskt tensid (10% lösning, se materialförteckningen)per rör (1,6% slutlig koncentration) och inkubera vid 37 °C i 45 min, skaka vid 950 varv/min. Rör upp och ner några gånger för att störa klumpar under inkubation.
OBS: Om klumpar är stora och svåra att störa, minska vridhastigheten till 400 varv/min under SDS- och tensidbehandlingar. Om klumpar är svåra att dela upp genom pipetting, dela upp provet i två; justera volymerna av begränsningsbuffert, SDS och tensid; och fortsätt med permeabiliseringen. Snurra sedan kärnorna med minsta hastighet (200 × g), kassera försiktigt supernaten, slå ihop proverna i 1X-begränsningsbuffert och fortsätt med matsmältningen. Ta en 10 μL alikvot som det osmältade provet (UD).
3. Enzymatisk matsmältning
- Smält kromatin genom att tillsätta 200 enheter (U) Mbo I per rör och inkubera vid 37 °C under en period från 4 timmar till över natten medan du roterar (950 varv/min).
- Lägg nästa dag till ytterligare 50 U Mbo I per rör och inkubera vid 37 °C i 2 timmar medan du roterar (950 varv/min).
- Inaktivera enzymet genom att inkubera rören vid 60 °C i 20 minuter. Lägg rören på is.
OBS: Ta en 10 μL alikvot som det smälta provet (D).
4. Biotinylering av DNA-ändar
- För att fylla i restriktionsfragmentets överhäng och märka DNA-ändarna med biotin, tillsätt 1,5 μL vardera av 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL 0,4 mM biotin dATP, 17,5 μL Tris låg-EDTA-buffert (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] och 10 μL 5 U/μL Klenow (DNA-polymeras I stort fragment) till alla rör. Blanda försiktigt och inkubera i 75 min vid 37 °C. Skaka vid 700 varv/min var 10:e s i 30 s. Lägg alla rör på isen medan du förbereder ligationsblandningen.
5. Ligation
- Överför varje smält kromatinblandning till ett separat 1 ml-rör med ligationsblandning (100 μL 10x ligationsbuffert, 10 μL 10 mg/ml bovint serumalbumin, 15 U T4 DNA-ligas och 425 μL dubbeldestillerat vatten [ddH2O]). Blanda noggrant genom skonsam pipetting och inkubera över natten vid 16 °C.
6. Crosslink-reversering och DNA-rening
- Bryts ned proteiner genom att tillsätta 50 μL 10 mg/ml proteinas K per rör och inkubera vid 37 °C i 2 timmar. Vänd tvärlänkar genom att öka temperaturen till 65 °C och inkubera över natten.
- Försämra RNA genom att tillsätta 20 μL 10 mg/ml RNase A och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Utför fenol:kloroform extraktion följt av etanol nederbörd.
- Tillsätt 1 volym fenolklorid och blanda noggrant genom inversion för att få en homogen vit fas.
OBS: Fenol är en farlig kemikalie. Följ lämpliga hälso- och säkerhetsbestämmelser. Arbeta i rökhuven. - Centrifugera vid 15 000 × g i 15 min. Överför vattenfasen till ett friskt 2 ml mikrocentrifugrör. Utför en ryggextraktion av det nedre skiktet med 100 μL TLE-buffert och överför vattenfasen till samma 2 ml-rör.
- Fäll ut DNA genom att tillsätta 2 volymer 100% etylalkohol (EtOH), 0,1 volymer 3 M natriumacetat och 2 μL 20 mg/mL glykogen. Inkubera vid -20 °C under en period från 2 timmar till över natten.
- Snurra på 15 000 × g i 30 min vid 4 °C och tvätta pelletsen 2x med iskallt 70% EtOH. Torka pelletsen vid RT och återanvänd i 100 μL TLE-buffert. Kvantifiera DNA med hjälp av ett fluorogent färgämne som selektivt binder till DNA och en fluorometer enligt tillverkarens instruktioner (Materialförteckning ).
Protokollet kan pausas här. Förvara ligaturprodukter vid 4 °C på kort sikt eller vid -20 °C på lång sikt. Använd en alikvot (100 ng) av materialet som det ligaterade provet (L) för kvalitetskontroll.
- Tillsätt 1 volym fenolklorid och blanda noggrant genom inversion för att få en homogen vit fas.
7. Utvärdera Hi-C-mallkvaliteten
- Kvalitativa kontroller för matsmältning och ligatur
- Rena DNA från UD- och D-alikvoterna genom att vända korslänkarna och utför fenol:kloroformextraktion och etanolutfällning enligt beskrivningen ovan.
- Ladda 100 ng UD-, D- och L-prover i en 1,5% agarosgel. Leta efter ett utstryk centrerat runt 500 bp i D-provet jämfört med ett högmolekylviktsband för L-provet (se representativa resultat).
- Kvantitativ kontroll av rötningseffektivitet
OBS: För att bedöma rötningseffektiviteten mer exakt, använd UD- och D-proverna som mallar för att utföra kvantitativa polymeraskedjereaktioner (qPCR) med hjälp av primers utformade enligt följande.- Designa ett primerpar som förstärker ett DNA-fragment som innehåller DNA-begränsningsstället för enzymet som används för matsmältning (Mbo I i det nuvarande protokollet), kallat R i formeln i steg 7.2.3.
- Designa ett primerpar som förstärker ett kontroll-DNA-fragment som inte innehåller begränsningsplatsen för enzymet som används för matsmältning (Mbo I för det nuvarande protokollet), kallat C i formeln i steg 7.2.3.
- Använd cykeltröskelvärdena (Ct-värden) för förstärkningen för att beräkna begränsningseffektivitet enligt formeln nedan:
% begränsning = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Om CtR avser ct-värdet för fragment R, och CtC avser ct-värdet för fragmentet C för prov D och prov-UD.
OBS: Begränsningsprocenten återspeglar effektiviteten hos det restriktionsenzym som klyver det begränsade (R) DNA-fragmentet jämfört med ett kontroll (C) DNA-fragment som inte innehåller dna-området för begränsning. En begränsningseffektivitet på ≥ 80% rekommenderas.
- Upptäckt av kända interaktioner
- Utför PCR för att förstärka en intern ligaturkontroll för att undersöka kortdistans- och/eller medel- eller långdistansinteraktioner (se representativa resultat).
- Alternativt kan du designa primers för att förstärka en ligaturprodukt där primers är i framåtriktad eller omvänd orientering i intilliggande begränsningsfragment.
- Kontroll av ifyllning och biotinmärkning
- Kontrollera Hi-C-märkning och ligatureffektivitet genom förstärkning och matsmältning av en känd interaktion eller en ligaturprodukt mellan intilliggande restriktionsfragment i genomet, enligt beskrivningen ovan.
OBS: Lyckad fyllning och ligatur av Mbo I-platsen (GATC) genererar en ny plats för begränsningsenzymet Cla I (ATCGAT) vid ligaturen och regenererar Mbo I-platsen. - Smält PCR-produkten med Mbo I, Cla I eller båda. Efter att ha kört proverna på en 1,5-2% gel, uppskatta det relativa antalet 3C- och Hi-C-ligaturkorsningar genom att kvantifiera intensiteten hos snitt- och oklippta band26.
OBS: En verkningsgrad på > 70% önskas (se representativa resultat).
- Kontrollera Hi-C-märkning och ligatureffektivitet genom förstärkning och matsmältning av en känd interaktion eller en ligaturprodukt mellan intilliggande restriktionsfragment i genomet, enligt beskrivningen ovan.
8. Ultraljudsbehandling
- Ultraljudsförsona proverna för att erhålla 200-500 bp DNA-fragment. För det instrument som används i detta protokoll (se materialförteckningen),späd provet (från 5 till 10 μg) i 130 μL ddH2O per rör och ställ in instrumentet på 400 bp: fyll nivå: 10; Tullfaktor: 10 %.; Toppeffekt (w): 140; Cykler per sprängning: 200; tid(s): 80.
9. Biotinborttagning/slutreparation
OBS: Stegen nedan justeras för 5 μg Hi-C DNA.
- För att utföra biotinborttagning, överför provet (130 μL) till ett nytt mikrocentrifugrör. Tillsätt 16 μL 10x ligationsbuffert, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA-polymeras (15U) och 7 μL ddH2O (160 μL total volym). Inkubera vid 20 °C i 30 min.
- Tillsätt 5 μL 10 mM dNTP, 4 μL 10x ligationsbuffert, 5 μL T4-polynukleotidkinas (10 U/μL), 1 μL Klenow och 25 μL ddH2O (200 μL total volym). Inkubera vid 20 °C i 30 min.
10. Val av storlek
- För att välja fragment mestadels i storleksintervallet 250-550 bp, utför sekventiellt val av spri-storlek (Solid Phase Reversible Immobilization) först med 0,6x, följt av 0,90x enligt tillverkarens instruktioner, och eluera DNA med 100 μL TLE.
11. Biotin pulldown/A-tailing/adapter ligatur
OBS: Utför tvättarna genom att återanvända magnetpärlorna genom att virvla, rotera proverna i 3 minuter på ett roterande hjul och snurra sedan kort ner provet och placera det på magnetstativet. Låt pärlorna hålla sig till magneten, kassera supernaten och fortsätt med följande tvättsteg. Utför tvättarna vid 55 °C på ett termoblock med rotation istället för det roterande hjulet.
- Gör upp den slutliga volymen till 300 μL per prov med TLE för neddragning. Förbered buffertarna för pärlor: 1x tweenbuffert (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Interpolering), 0,5x TB, 1x No-Tween buffert (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Använd 150 μL streptavidinkopplade magnetiska pärlor (se materialförteckningen)per bibliotek. Tvätta pärlorna 2x med 400 μL 1x TB. Återanvänd sedan pärlor i 300 μL 2x NTB.
- Blanda pärlorna med 300 μL Hi-C-materialet och inkubera på RT i 30 minuter på ett roterande hjul så att biotinbindningen kan streptavidinpärlor.
- Tvätta pärlorna med 400 μL 0,5x TB och inkubera vid 55 °C i 3 min, rotera vid 750 varv/min. Tvätta pärlor i 200 μL 1x begränsningsbuffert.
- Återanvänd pärlor i 100 μL dATP-stjärtblandning (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x begränsningsbuffert, 5 μL Klenow exo- och 80 μL ddH2O). Inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Ta bort supernatanten, tvätta pärlorna 2x med 400 μL 0,5x TB genom att inkubera vid 55 °C i 3 min och rotera vid 750 varv/min.
- Tvätta pärlorna med 400 μL 1x NTB och sedan med 100 μL 1x ligationsbuffert.
- Återanvänd pärlorna i 50 μL 1x ligationsbuffert och överför suspensionen till ett nytt rör. Tillsätt 4 μL förglödgade PE-adaptrar (15 μM-lager) och 2 μL T4-ligas (400 U/μL, dvs. 800 U/rör). inkubera på RT i 2 timmar.
OBS: Förglödma adaptrarna genom att lägga till lika stora volymer av både PE 1.0- och PE 2.0-adaptrar (30 μM-lager) och inkubera i 10 minuter vid RT (se materialförteckningen). - Fånga pärlor genom att ta bort supernatanten och tvätta pärlorna 2x med 400 μL tbc. Tvätta pärlorna med 200 μL 1x NTB, sedan med 100 μL 1x begränsningsbuffert och återanvända pärlorna i 40 μL 1x begränsningsbuffert.
12. FÖRSTÄRKNING AV PCR
- Ställ in PCR på 25 μL volym med 5, 6, 7 och 8 cykler. För varje PCR använder du:
Reaktion Recept Hi-C pärlor 2,5 μL 10 μM PE PCR primer 1 (Materialförteckning) 0,75 μL 10 μM PE PCR primer 2 (Materialförteckning) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL 5x reaktionsbuffert 5 μL DNA-polymeras 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Total 25 μL Cykler Temperatur Tid 1 98 °C 30 s n cykler 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 min
13. Slutlig PCR-förstärkning
- Utför slutlig PCR-förstärkning med samma villkor som beskrivs ovan och antalet valda cykler. Dela provet med 5 μL Hi-C-pärlor som mall i 50 μL-reaktioner.
- Samla alla PCR-reaktioner och överför dem till ett nytt rör. Använd magneten för att ta bort streptavidinpärlorna och återställa supernaten (PCR-produkter). Överför pärlorna till ett nytt rör, tvätta pärlorna enligt steg 11.2.9 och förvara i 1x begränsningsbuffert vid 4 °C som backup.
- Rena PCR-produkterna med hjälp av 0,85x volymen av SPRI-pärlor enligt tillverkarens instruktioner. Elute med 30 μL TLE-buffert.
- Kvantifiera Hi-C-biblioteket med hjälp av ett fluorometriskt instrument och bekräfta bibliotekets kvalitet med chipbaserad kapillärelektrofores.
- Som en sista kvalitetskontrollpunkt, använd 1 μL av Hi-C-biblioteket som mall för att utföra en PCR-reaktion med 10 cykler med samma villkor som beskrivs i steg 12.1. Dela pcr-produkten i två mikrocentrifugrör: smält en med Cla I och lämna den andra osmält som en kontroll. Kör produkterna i en 1,5-2% agarosgel (se representativa resultat).
- Fortsätt till 50 bp eller 75 bp parkopplingssekvensering på en lämplig sekvenseringsplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedan beskrivs resultaten av ett framgångsrikt Hi-C-protokoll (se en sammanfattning av arbetsflödet för Hi-C-protokoll i figur 1A). Det finns flera kvalitetskontrollpunkter under Hi-C-experimentet i nukleus. Prov alikvoter samlades in före (UD) och efter (D) chromatin begränsning steg samt efter ligatur (L). Korslänkar var omvända, och DNA renades och körs på en agarose gel. Ett utstryk på 200-1000 bp observerades när begränsningen med Mbo I lyckades (Figur 1B). Molekylens förväntade storlek beror på det begränsade enzym som man väljer. Om ligaturen lyckades sågs ett högmolekylviktsband högst upp på gelén (figur 1B). Matsmältningseffektivitet kan också bekräftas av qPCR enligt beskrivningen i detalj i protokollet. En acceptabel matsmältningseffektivitet är 80% eller högre (Figur 1C).
För att bedöma Hi-C-ligatureffektiviteten i detalj kan primers utformas för att förstärka en intern ligaturproduktkontroll där primersna är i framåtriktad eller omvänd orientering i angränsande begränsningsfragment. Alternativt kan primers utformas för att förstärka kända interaktioner. Figur 2A visar förstärkningen av en känd medeldistansinteraktion (300 kb) i Drosophila25. Hi-C ligatur produkter (där biotin märkning, fyll-i och ligatur inträffade framgångsrikt) kan uppskattas genom matsmältningen av PCR produkten återhämtade sig i förstärkningen. Efter ifyllning och ligatur kommer Hi-C amplicons att innehålla en ny Cla I-begränsningsplats på den ursprungliga Mbo I-webbplatsen, som bevaras vid trubbig ligatur. Om begränsningen med Cla I inte är fullständig kommer fyllnadsreaktionen och biotinmärkningen att vara ineffektiv. En matsmältningseffektivitet på mer än 70% rekommenderas för att undvika att ha en stor andel icke-användbara läsningar för biblioteken efter sekvensering (Figur 2A, jämför Cla I-matsmältningen av 3C jämfört med Hi-C-mallen).
För att fastställa ett tillräckligt antal PCR-förstärkningscykler för att förstärka det slutliga Hi-C-biblioteket inrättades PCR-reaktioner med 2,5 μL av ett givet bibliotek på pärlor, enligt beskrivningen i protokollet. Antalet PCR-cykler för den slutliga förstärkningen är en cykel mindre än antalet cykler för vilka utstryket är synligt (figur 2B). I detta fall valdes 4 cykler av PCR amplifiering. Som en sista kvalitetskontroll, en aliquot av Hi-C biblioteket förstärktes och smältes med Cla I. Bibliotekets matsmältningsnivå (en minskning av utstryksstorleken) anger överflödet av giltiga Hi-C-par och återspeglar andelen användbara läsningar som kommer att erhållas från biblioteket (figur 2C). Ett förhållande mellan det övre storleksområdet (fastställt av storleken i UD-provet) och det nedre storleksområdet i både UD- och D-proverna bör ge ett förhållande > 1 för UD och ett förhållande ≤ 1 för det smälta provet om Cla I-matsmältningen är effektiv.
Efter parkopplingssekvensering bearbetades FASTQ-filerna(tabell 1)med HiCPro28 och den genererade statistiken ritades med MultiQC28. Ett alternativt verktyg till HiCPro är HiCUP30-pipelinen som ger liknande resultat (visas inte). Figur 3 och tabell 2 visar detaljerad statistisk information om de sekvenserade läsningarna. Fullständig läsjustering och justering efter trimning rapporteras. Dessa två kategorier motsvarar korrekt justerade läsningar som kommer att användas i efterföljande analys för att hitta giltiga Hi-C-par. Kategorin justering efter trimning avser läsningar som sträcker sig över ligaturkorsningen, som inte var justerade i det första steget och trimmas vid ligationsplatsen för att sedan justera deras 5" extremitet tillgenomet 28 (Figur 3B,C och Tabell 2). Kontaktstatistiken visar att Hi-C-biblioteket var av hög kvalitet med 82,2% giltiga par och 7,6% icke-användbara läsningar som faller i samma fragment självcirkel, samma fragment dinglande ändar, omligation, filtrerade par och dumpade parkategorier (Figur 3A, Figur 3Doch Tabell 2). Dessutom är antalet PCR-dubbletter mycket lågt, vilket indikerar att bibliotekets komplexitet är hög och att PCR-cyklerna introducerade minimala artefakter (figur 3E och tabell 2).
Med hjälp av de unika giltiga Hi-C-paren utfördes grundläggande analys av parfördelningen med HiCPro27. Detta experiment gav 46,5% unika CIS-kontakter ≤ 20 kbp, 47,1% unika CIS-kontakter > 20 kbp och 5,8% unika transkontakter (Figur 3D). Fördelningen av cis till trans giltiga par motsvarade de resultat som förväntades för ett framgångsrikt Hi-C-experiment med de flesta interaktioner som upptäckts inom samma kromosom. En stor andel transkontakter indikerar ineffektiv fixering. Med hjälp av hi-C giltiga par från HiCPro27normaliserades matriser genom iterativ korrigering och eigenvector nedbrytning (ICE)30, och 1 kb och 5 kb upplösning matriser genererades med HiCPlotter30,31,32. Normaliserade kontaktmatriser vid upplösningen 1 kb och 5 kb presenteras för skårgenloket i Drosophila (figur 4A, figur 4Coch figur 4D). I figur 4Akan skårgenloket ses tillsammans med APs, domän l och II, samt histonmodifieringar längs locus(figur 4A och tabell 1). Utformningen av borttagningen CRISPR-Cas9 omfattade motiven CTCF och M1BP(figur 4B).
Vid borttagning av den region som innehåller både CTCF- och M1BP DNA-bindande platser vid 5' gränsen för skårlokan (5pN-delta343, tabell 1), kan en dramatisk förändring av kromatinkontakter observeras med förlust av interaktioner inuti skårlokan och förstärkning av kontakter med den uppströms TAD jämfört med den vilda typen (WT) (Figur 4C,D). Slutligen visar figur 4E ett detaljerat panorama över WT- och mutantinteraktionsprofiler på begränsningsfragmentnivån från UTR-genen Notch, vilket visar en minskning av andelen kontakter som görs med notchgenlokan och en ökning av kontakterna med den uppströms domänen. De virtuella 4C-vyerna av Notch genen 5' UTR erhölls med HiC-Pro27. Ett alternativt verktyg är Hi-C-andra-ändar kvantifiering som finns i SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Alla resultat som presenteras i figur 4 erhölls genom tillämpning av hi-C-protokollet i WT och mutanta S2R+ Drosophila-celler, enligt beskrivningen av Arzate-Mejía et al.25.
Bild 1:Nukleus Hi-C-rötnings- ochligaturkontroller. Celler är korskopplade med formaldehyd, vilket resulterar i kovaleenta kopplingar mellan kromatinsegment (DNA-fragment: rosa, lila) och proteiner. Kromatin smälts med ett restriktionsenzym (representerat av sax), i detta exempel, Mbo I. De resulterande klibbiga ändarna fylls i med nukleotider inklusive en biotinylerad dATP (Mörkblå ringar). DNA renas och de biotinylerade korsningarna berikas med hjälp av streptavidinbelagda magnetiska pärlor (grå cirklar). Interagerande fragment identifieras genom nästa generations, parparade sekvensering. (B) Hi-C-kvalitetskontroller för matsmältning och ligatur för två biologiska replikat (Hi-C 1 och Hi-C 2). Hi-C bibliotek löstes på en 1,5% agarose gel. Båda smälte, D, biblioteken körs som ett utstryk runt 600 bp. Ligated prover, Lig, körs som ett ganska tätt band större än 10 kb som liknar de osmälta UD-proverna. Skillnaderna i signalstyrka beror på ojämna mängder laddat DNA på gelén. C)Kvantitativ kontroll av hi-C-rötning genom kvantitativ polymeraskedjereaktion för samma två biologiska replikat som iB(Hi-C 1 och Hi-C 2) med hjälp av de gränsvärden för cykeltröskeln som anges i protokollet. En framgångsrik matsmältning har ≥ 80% begränsning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:In-nucleus Hi-C-fyllnads- och trubbiga ligationskontroller. En känd interaktion mellan fragment som ligger 300 kb från varandra i kromosom X användes som en kontroll och förstärktes med hjälp av de primers som anges med svarta pilar (se toppen av schemat i (B), primer 1 (vänster), primer 2 (höger), tabell 1), vilket genererar en 347 bp amplicon. Hi-C ligatur produkter kan särskiljas från de som produceras i ett 3C experiment genom matsmältning av ligaturen webbplats. Hi-C korsningar smältes av Cla I på den ursprungliga Mbo I platsen, som detta bildas på trubbigt slut ligatur. Hi-C och 3C korsningar smältes med Mbo I som begränsningsplatsen regenererar vid ligatur (vänster om gelén). Däremot smältes 3C-korsningar inte av Cla I på Mbo I-platsen, utan endast av Mbo I. Jämför matsmältningsprofilen för Hi-C- och 3C-produkterna med Cla I. Ett 53 bp fragment erhölls genom att smälta Hi-C-produkten (på grund av begränsning av Cla I-webbplatsen som bildas på Mbo I-webbplatsen och begränsning av en Cla I-webbplats som redan finns i regionen). Detta fragment observerades inte i 3C-produkten matsmältningen eftersom den enda Cla I-webbplatsen som fanns tillgänglig var den som redan fanns i regionen. (B) Efter PCR-förstärkning av Hi-C-biblioteket med olika PCR-cykler, produkterna köras på en 1,5% agarose gel. Ett utstryk på 400-1000 bp förväntades och observerades. Lämpliga nummercykler för den slutliga förstärkning pcr bör tas som antalet omedelbart lägre än det vid vilket ett utstryk bara är synligt. C)Sista biblioteket Cla I matsmältning. En del av det sista biblioteket förstärktes och smältes med Cla I. Storleksminskningen av utstryket bekräftade att en stor del av molekylerna i biblioteket var giltiga Hi-C-par. Densitometrisk analys av denna gel kan utföras för att erhålla ett förhållande mellan FN- och D-proverna, enligt vad som beskrivs i avsnittet representativa resultat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:HiC-Pro-statistik för Hi-C-biblioteket. (A) Schematisk representation av giltiga Hi-C-par och de olika typerna av icke-giltiga par som kan produceras under experimentet och filtreras bort av HiCPro27 (Tabell 2). Dessa inkluderar läsningar som faller i sammanhängande sekvenser, dinglande ändar, samma fragment, självcirkel, re-ligations och PCR-dubbletter. (B) Kartstatistik. Läsningar som inte kan justeras visas (grå) och båda helt justerade läsningar och läsningar som justerats efter trimning visas i blått respektive ljusblått. Dessa två kategorier representerar de användbara läsningar som beaktas i efterföljande analyser. C)Ihopparningsstatistik. Multijusterade läsningar (mörkorange) representerar läsningar som är justerade i flera regioner i genomet. Unikt justerade (mörkblå) läsningar representerar de läspar som är justerade en gång i genomet, och singletons (ljusorange) representerar läspar där bara en genomisk region sekvenserades i båda läsningarna. (D) Filtreringsstatistik. Giltiga läspar (blå) representerar framgångsrika Hi-C-ligaturprodukter enligt beskrivningen i (A). Självfragment självcirklar (ljusrosa) är icke-användbara läsningar eftersom de representerar samma genomiska fragment som visas i (A). Samma fragment dinglande ändar (orange) representerar läsningar där ett enda begränsningsfragment sekvenserades. Filtrerade och dumpade par (bruna) är också icke-användbara läsningar som har fel storlek eller för vilka ligaturprodukten inte kunde rekonstrueras. Slutligen representerar omligationsläsningar (röd) läsningar där två intilliggande fragment omdelades, vilket ger icke-användbar information. (E) Giltig kontaktfördelning av läspar i genomet. Unika cis-kontakter (blå) är vanligare än unika transkontakter (gröna). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Hi-C kontaktmatriser och virtuell 4C-analys av WT- och mutantA S2R+-celler. (A) Hi-C normaliserad värmekarta för en 50 kb region vid 1-kb upplösning centrerad i notch gen locus. TAD-separationspoäng32 för locus visas, tillsammans med uppdelningen av skårlokan i två topologiska domäner (domän 1 och domän 2). ChIP-seq-data för APs, RNA Pol II och histonmärken för S2/S2R+ celler34,35,36,37 visas under värmekartan ( Tabell1). Positionerna för notchdomän 1-gränserna markeras i ljusgrönt. B)Schematisk representation av B1-gränsen CRISPR mutant. Den gröna rektangeln anger den borttagna regionen på 343 bp. Sax indikerar sgRNAs som används för CRISPR-medierad genomredigering. Motivbindningsplatser för APs visas som rutor för CTCF och M1BP. Topptoppar för DNA-bindande APs som visas i( A) anges också35. (C) Hi-C normaliserade värmekartor med en upplösning på 1 kb som täcker en region på 50 kb centrerad i hack för WT och mutantcellerna. Vänster, Hi-C värmekartor av log2 skillnader i interaktions frekvens mellan WT och mutant celler. (D) Hi-C normaliserade värmekartor som täcker en region på 250 kb centrerad i hack med 5 kb upplösning för WT- och mutantceller. Vänster, Hi-C värmekartor av log2 skillnader i interaktions frekvens mellan WT och mutant celler. (E) Virtual-4C för WT- och mutantceller med hjälp av 5' UTR för skåra som synvinkel. Procentandelen interaktioner mellan synvinkeln och regionerna inom uppströms kirredomain-2, Notch domän 1, Notch domän 2 och nedströms DNC domänen för både WT och mutant celler visas25. Förkortningar: WT = vild typ; TAD = topologiskt associerad domän; ChIP = kromatinimmunprecipitation; AP = arkitektoniskt protein; RNA Pol = RNA-polymeras; S2R+ = S2 receptor plus; sg RNA = enkelriktad RNA; UTR = oöversatt region. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Experiment | Prov | GEO Anslutningsnummer |
| Chips | CP190 (på 190) | GSM1015404 |
| Chips | SuHW (på ryska) | GSM1015406 |
| Chips | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Chips | CTCF (ctcf) | GSM1015410 |
| Chips | Ibf1 (ibf1) | GSM1133264 |
| Chips | Ibf2 (ibf2) | GSM1133265 |
| Chips | BEAF32 (PÅ ANDRA SIDAN) | GSM1278639 |
| Chips | Pita | GSM1313420 |
| Chips | ZIPIC (DRAGKEDJA) | GSM1313421 |
| Chips | RNA PolII | GSM2259975 |
| Chips | H3K4me1 (på 5550)/2004 | GSM2259983 |
| Chips | H3K4me3 (på 3K4me3) | GSM2259985 |
| Chips | H3K27ac (på 27) | GSM2259987 |
| Chips | MSL2 (på andra sätt) | GSM2469507 |
| Chips | H4K16ac (på 50000) | GSM2469508 |
| Chips | M1BP (M1BP) | GSM2706055 |
| Chips | GAF (gaf) | GSM2860390 |
| Chips | Inmatning | GSM1015412 |
| Hej-C | S2R+ WT-celler | GSE136137 |
| Hej-C | S2R+ 5pN-delta343 celler | GSE136137 |
Tabell 1: Geo-anslutningsnummer.
| HiC-Pro statistik | Läser | Procent |
| Mappningsstatistik | ||
| Fullständiga läsjusteringar | 131515921 | 82.20% |
| Trimmade läsjusteringar | 16408309 | 10.30% |
| Det gick inte att justera | 12110964 | 7.60% |
| Para ihop statistik | ||
| Unikt justerad | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Multijusterad | 57700021 | 36.90% |
| Filtrera statistik | ||
| Giltiga par | 71373989 | 90.12% |
| Samma fragment: Självcirkel | 2340697 | 2.90% |
| Samma fragment: Dinglande ändar | 2578783 | 3.20% |
| Filtrerade par | 2773043 | 3.50% |
| Dumpade par | 196565 | 0.20% |
| Kontakta statistik | ||
| Unikt: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Unikt: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Unikt: trans | 4133602 | 5.80% |
| Duplicera läspar | 398400 | 0.60% |
Tabell 2: HiC-Pro-statistik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hi-C-metoden i nukleos som presenteras här har möjliggjord detaljerad utforskning av Drosophila genomtopologi med hög upplösning, vilket ger en bild av genomiska interaktioner i olika genomiska skalor, från kromatinöglor mellan regulatoriska element som promotors och förstärkare till TADs och stor fackidentifiering25. Samma teknik har också tillämpats effektivt på däggdjursvävnader med vissa modifieringar33. Till exempel, vid bearbetning av en vävnad istället för en encellig suspension, så sållas vävnaden genom ett 70 μm-filter, och lyssteget utförs samtidigt som materialet homogeniseras med hjälp av en Dounce-homogenisator. Dessutom, eftersom däggdjursgenomet är 25x större än Drosophila-genomet, är antalet giltiga läspar som behövs för att bygga matriser med 1-5 kb upplösning större. Hi-C-metoden i nukleus skiljer sig från den ursprungliga Hi-C-metoden2 i sitt undvikande av kärnlys med 1% SDS vid 65 °C före ligatur, vilket bevarar kärnintegriteten och genom att ligatera i 1 ml istället för 7 ml23,24.
Protokollet har några viktiga steg för att säkerställa hög effektivitet. Det första steget som kan införa matsmältning och fylla-i ineffektivitet är bildandet av klumpar under 0,3% SDS permeabilisering och tensidbehandlingar. Om klumpar är stora och svåra att störa, bör den roterande hastigheten minskas till 400 rpm under SDS och tensidbehandlingar. Om klumpar förblir svåra att dela upp genom pipetting, bör provet delas i två genom att justera volymerna med begränsningsbuffert, SDS och icke-jonisk tensid innan det fortsätter med permeabiliseringen. Därefter ska kärnorna centrifugeras med minsta hastighet (200 × g),supernatanten kasseras försiktigt och proverna poolas tillsammans i 450 μL 1x begränsningsbuffert innan de fortsätter med matsmältningen. För det andra är uppskattningen av matsmältningseffektivitet viktig för att ge tillräckligt med DNA-fragment för fyllning och ligatur. Om det vid kvalitativ bedömning visar sig att matsmältningen är ineffektiv, bör en andra omgång matsmältning utföras med begränsningsenzymet under en period som sträcker sig från 4 h till över natten.
För det tredje är uppskattningen av ligatureffektiviteten viktig. Om ligationen vid kvalitativ bedömning befinns vara ineffektiv (dvs. i stället för högmolekylviktsbandet observeras ett utstryk som liknar det som observerats för det smälta provet), bör ligaturen upprepas genom centrifugering av kärnan vid 200 × g och återanvända dem i ligationsblandning med färska 10x ligaturbuffert och ligas. För det fjärde bör andelen Hi-C-giltiga produkter uppskattas genom att smälta en PCR-amplicon av en förväntad interaktion med Cla I (för Mbo I original matsmältning). Effektiv förstärkning och matsmältning av ampliconen av den förväntade interaktionen bekräftar framgångsrik ligatur och bildandet av Hi-C-korsningar. Om amplicon matsmältning inte är effektiv, majoriteten av molekylerna kommer att vara 3C istället för Hi-C produkter, och detta bör beaktas om biblioteket kommer att sekvenseras. Detta kan också bekräftas genom att utföra det sista biblioteket Cla I matsmältningskontroll, som beskrivs i avsnittet representativa resultat. Slutligen är valet av det lägre antalet PCR-cykler viktigt för att undvika PCR-dubbletter. Om andelen dubbletter av läsparet vid sekvensering befinns vara hög, bör antalet PCR-cykler minskas ytterligare.
Denna in-nucleus Hi-C-teknik har vissa begränsningar. Först representerar protokollet som beskrivs här Hi-C-experimentet som utförs för en cellpopulation. Därför representerar signalen om frekvensen av genomiska kontakter miljontals genom med varierande individuella konformationer. För att få uppsättningen genomiska kontakter från ett enda genom rekommenderas ett encelligt Hi-C-experiment22. För det andra är Hi-C baserat på ligatur av proximala DNA-fragment. Således, om genomiska regioner är en del av ett stort proteinkromatinkomplex, kan avståndet mellan fragment hindra ligatur. Det har till exempel visat sig att transkontakter är dåligt representerade i Hi-C38. Dessutom avslutas Hi-C med parad sekvensering, vilket hämtar par genomiska kontakter. Flera DNA-fragment kan dock samtidigt interagera i samma kromatinkomplex. För att erhålla identiteten hos flera DNA-fragment i ett kromatinkomplex kan alternativa sekvenseringsmetoder tillämpas på Hi-C39, eller olika experimentella strategier kan användas där ligatur inte utförs38,40,41. Slutligen, även om Hi-C mäter genomiska kontakter, avslöjar det inte identiteten på de proteiner som förmedlar interaktionerna. Alternativa metoder måste tillämpas för att identifiera de genomiska interaktioner som förmedlas av ett visst protein av intresse42 eller identiteten hos proteinens ensemble vid specifika genomiskaelement 43.
Sammanfattningsvis, med ett högkvalitativt Hi-C-experiment som det som beskrivs här för Drosophila-genomet (tabell 2), kan matriser byggas med ett brett spektrum av upplösningar (från 1, 5 kb, 50 kb eller lägre; se figur 4). Om en viss region i genomet måste utvärderas på begränsningsfragmentnivå kan data dessutom användas för att bygga ett virtuellt 4C-landskap med önskad synvinkel (t.ex. notchgenen 5' UTR i figur 4E). Hi-C-verktyget i SeqMonk är ett mycket användarvänligt alternativ som möjliggör visualisering av detta landskap. Att tillämpa 4C-kvantifieringsverktyget, även en del av SeqMonk, på detta landskap kan ge statistiskt signifikanta kontakter.
Tillämpningen av hi-C-experimentet i nukleos som beskrivs här på en samling mutanta cellinjer med ändrade AP DNA-bindande platser vid TAD-gränserna (figur 4) visade att genetiska element behövs vid gränserna för att strukturera Drosophila-genomet i domäner och upprätthålla genuttrycksreglering som helt diskuteras av Arzate-Mejía et al.25. Genetisk redigering av regulatoriska element med CRISPR/Cas9-systemet, i kombination med högupplöst profilering av genomiska interaktioner med hjälp av hi-C-protokollet i nukleos som beskrivs här, kan därför vara en kraftfull strategi för att testa genetiska elements strukturella funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) bidragsnummer 207319 och Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) anslagsnummer 303068. A.E.-L. är en masterstudent med stöd av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU-nummer 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
