Summary
Genomet er organiseret i det nukleare rum i forskellige strukturer, der kan afsløres gennem kromosom kropsbygningsfangstteknologier. In-nucleus Hi-C-metoden giver en genomdækkende samling af chromatininteraktioner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkort, der kan udforskes ved megabaseopløsning på begrænsningsfragmentniveau.
Abstract
Genomet er organiseret i topologisk associerende domæner (TAD'er) afgrænset af grænser, der isolerer interaktioner mellem domæner. I Drosophila undersøges de mekanismer, der ligger til grund for TAD-dannelsen og -grænserne, stadig. Anvendelsen af den in-nukleus Hi-C-metode, der er beskrevet her, bidrog til at dissekere funktionen af arkitektoniske protein (AP)-bindingssteder ved TAD-grænser, der isolerer Notch-genet. Genetisk modifikation af domænegrænser, der forårsager tab af APs, resulterer i TAD-fusion, transskriptionelle defekter og langtrækkende topologiske ændringer. Disse resultater gav dokumentation for genetiske elementers bidrag til domænegrænsedannelse og genudtrykskontrol i Drosophila. Her er in-nucleus Hi-C-metoden blevet beskrevet i detaljer, hvilket giver vigtige checkpoints til at vurdere kvaliteten af eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er de nødvendige antal sekventeringslæsninger og gyldige Hi-C-par til at analysere genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-medieret genetisk redigering af regulatoriske elementer og profilering i høj opløsning af genomiske interaktioner ved hjælp af denne in-nukleus Hi-C-protokol kan være en stærk kombination til undersøgelse af genetiske elements strukturelle funktion.
Introduction
I eukaryoter er genomet opdelt i kromosomer, der besætter specifikke områder i det nukleare rum under interfase1. Kromatin danner kromosomer kan opdeles i to hovedstater: en af tilgængelige chromatin, der er transskriptionalt eftergivende, og den anden af kompakt chromatin, der er transskriptionalt undertrykkende. Disse chromatin stater adskille og sjældent blandes i det nukleare rum, danner to forskellige rum i kernen2. På sub-megabaseskalaen adskiller grænser domæner for højfrekvente chromatininteraktioner, kaldet TAD'er, der markerer kromosomal organisation3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grænser besat af sammenhænge og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Den cohesin komplekse ekstruderer chromatin og stopper ved CTCF-bindingssteder, der bortskaffes i konvergent orientering i den genomiske sekvens for at danne stabile chromatinsløjfer9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse af CTCF DNA-bindingsstedet ved grænserne eller reduktionen af CTCF og cohesinproteintæthed resulterer i unormale interaktioner mellem regulatoriske elementer , tab afTAD-dannelseog deregulering af genekspression 9,10,11,13,14.
I Drosophila er grænserne mellem TAD'er besat af flere APs, herunder grænseelementrelateret faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindende protein (M1BP), centrosomalprotein 190 (CP190), suppressor af hårvinge (SuHW) og CTCF og beriges med aktive histoneændringer og Polymerase II16,17,18. Det er blevet foreslået, at i Drosophila vises TAD'er som en konsekvens af transskription13,17,19, og den nøjagtige rolle for uafhængige APs i grænsedannelse og isoleringsegenskaber undersøges stadig. Om domæner i Drosophila er en eneste konsekvens af sammenlægningen af regioner med lignende transskriptionsstater, eller om APs, herunder CTCF, bidrager til grænsedannelse, er således endnu ikke fuldt ud karakteriseret. Udforskning af genomiske kontakter ved høj opløsning har været mulig gennem udvikling af kromosom kropsbygningsfangstteknologier kombineret med næste generations sekventering. Hi-C-protokollen blev først beskrevet med ligationstrinnet udført "i opløsning"2 i et forsøg på at undgå falske ligationsprodukter mellem kromatinefragmenter. Flere undersøgelser pegede imidlertid på erkendelsen af, at det nyttige signal i dataene kom fra ligationsprodukter dannet ved delvist lysede kerner, der ikke var i opløsning20,21.
Protokollen blev derefter ændret til at udføre ligationen inde i kernen som en del af encellet Hi-C eksperiment22. In-nukleus Hi-C-protokollen blev efterfølgende indarbejdet i cellepopulationen Hi-C for at give en mere ensartet dækning over hele spektret af genomiske afstande og producere data med mindre teknisk støj23,24. Protokollen, der er beskrevet i detaljer her, er baseret på befolkningen i kernen Hi-C protokol23,24 og blev brugt til at undersøge konsekvenserne af genetisk fjernelse af DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domænegrænse ved Notch genet locus i Drosophila25. Resultaterne viser, at en ændring af DNA-bindende motiver for APs på grænsen har drastiske konsekvenser for Notch domæne dannelse, større topologiske defekter i regionerne omkring Notch locus, og genekspression deregulering. Dette indikerer, at genetiske elementer ved domænegrænser er vigtige for vedligeholdelsen af genomtopologi og genekspression i Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fiksering
- Start med 10 millioner Schneiders linje 2 plus (S2R+) celler til at forberede 17,5 mL af en celleaffjedring i Schneider-mediet, der indeholder 10% føtal kvægserum (FBS) ved stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes methanolfri formaldehyd for at opnå en endelig koncentration på 2 %. Bland og inkuber i 10 minutter på RT, idet du sørger for at blande hvert minut.
BEMÆRK: Formaldehyd er et farligt kemikalie. Følg de relevante sundheds- og sikkerhedsbestemmelser, og arbejd i røghætten. - Sluk for reaktionen ved at tilsætte glycin for at opnå en endelig koncentration på 0,125 M og bland. Inkuber i 5 min på RT, efterfulgt af 15 min på is.
- Centrifuge i 400 × g ved RT i 5 min. og derefter i 10 min ved 4 °C supernatanten kasseres. Resuspend pellet omhyggeligt i 25 mL kold 1x fosfat-buffered saltvand.
- Centrifuge ved 400 × g i 10 min ved 4 °C, og kassér derefter supernatanten.
BEMÆRK: Hvis du fortsætter med protokollen, skal du gå til trin 2.1 for lysis; Ellers lynfryses pelletlen i flydende N2, og pelletlen opbevares ved -80 °C.
2. Lysis
- Cellerne i 1 mL iskold lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% af nonionisk overfladeaktivt middel (se materialetabellen);10 mM NaCl; 1x proteasehæmmere) opsættes igen, og volumenet justeres til 10 mL med iskold lysisbuffer. Volumen indstilles for at opnå en koncentration på 1 × 106 celler/mL. Inkuber på is i 30 minutter, bland hver 2 min ved at vende rørene.
- Kernerne centrifuges ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C, og kassér derefter forsigtigt supernatanten. Pellet 1x vaskes med 1 mL kold lysisbuffer, og den overføres til et mikrocentrifugerør. Pellet 1x vaskes med 1 mL kold 1,25x begrænsningsbuffer, og hver cellepille genbruges i 360 μL på 1,25x begrænsningsbuffer.
- Der tilsættes 11 μL natrium-dodecylsulfat (SDS) pr. rør (0,3% slutkoncentration), blandes omhyggeligt ved pipetter og inkuberes ved 37 °C i 45 minutter, ryster ved 700-950 omdrejninger i minuttet. Pipet op og ned for at forstyrre klumper et par gange under inkubation.
- SDS tilsættes ved at tilsætte 75 μL nonionisk overfladeaktivt middel (10% opløsning, se materialetabellen)pr. rør (1,6% slutkoncentration) og inkuberes ved 37 °C i 45 min. Pipet op og ned et par gange for at forstyrre klumper under inkubation.
BEMÆRK: Hvis klumper er store og vanskelige at forstyrre, skal du sænke den roterende hastighed til 400 omdrejninger i minuttet under SDS- og overfladeaktive behandlinger. Hvis klumperne er vanskelige at opdele ved pipettering, opdeles prøven i to. justere mængden af begrænsningsbuffer, SDS og overfladeaktivt middel og gå videre med gennemtrængeligheden. Drej derefter kernerne med minimal hastighed (200 × g), kassér forsigtigt supernatanten, saml prøverne i 1X-begrænsningsbuffer, og fortsæt med fordøjelsen. Der udtages en 10 μL aliquot som ufordøjet prøve (UD).
3. Enzymatisk fordøjelse
- Chromatinen fordøjes ved at tilsætte 200 enheder (U) Mbo I pr. rør og inkuberes ved 37 °C i en periode fra 4 timer til natten over, mens den roterer (950 omdrejninger i minuttet).
- Den næste dag tilsættes yderligere 50 U Mbo I pr. rør og inkuberes ved 37 °C i 2 timer, mens du roterer (950 omdrejninger i minuttet).
- Enzymet inaktiveres ved at inkubere rørene ved 60 °C i 20 min. Placer rørene på is.
BEMÆRK: Tag en 10 μL aliquot som den fordøjede prøve (D).
4. Biotinylering af DNA-ender
- For at udfylde begrænsningsfragmentets udhæng og mærke DNA-enderne med biotin tilsættes 1,5 μL hver af 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL på 0,4 mM biotin dATP 17,5 μL Tris lav-EDTA (TLE) buffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] og 10 μL af 5 U/μL Klenow (DNA polymerase I stort fragment) til alle rørene. Bland forsigtigt og inkuber i 75 min ved 37 °C. Ryst ved 700 omdrejninger i minuttet hver 10 s i 30 s. Placer alle rørene på is, mens du forbereder ligationblandingen.
5. Ligation
- Hver fordøjet chromatinblanding overføres til et separat 1 ml rør med ligationblanding (100 μL 10x ligationsbuffer, 10 μL på 10 mg/mL serumalbumin af kvæg, 15 U af T4 DNA-ligase og 425 μL dobbeltdestilleret vand [ddH2O]). Bland grundigt ved skånsom pipettering, og inkuber natten over ved 16 °C.
6. Crosslink vending og DNA-rensning
- Nedbryde proteiner ved at tilsætte 50 μL på 10 mg/mL Proteinase K pr. rør og inkubere ved 37 °C i 2 timer. Omvendte krydsninger ved at øge temperaturen til 65 °C og inkubere natten over.
- RNA nedbrydes ved tilsætning af 20 μL på 10 mg/mL RNase A og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Udfør phenol:chloroformekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning.
- Tilsæt 1 volumen phenol-chloroform, og bland grundigt ved inversion for at opnå en homogen hvid fase.
BEMÆRK: Phenol er et farligt kemikalie. Følg de relevante sundheds- og sikkerhedsbestemmelser. Arbejd i røghætten. - Centrifuge ved 15.000 × g i 15 min. Den vandige fase overføres til et friskt 2 mL mikrocentrifugerør. Udfør en back-extraction af det nederste lag med 100 μL TLE buffer, og overfør den vandige fase til samme 2 mL rør.
- Dna udfældes ved at tilsætte 2 mængder 100% ethylalkohol (EtOH), 0,1 volumener af 3 M natriumacetat og 2 μL på 20 mg/mL glykogen. Inkuber ved -20 °C i en periode fra 2 timer til natten over.
- Spin ved 15.000 × g i 30 min ved 4 °C, og vask pellets 2x med iskold 70% EtOH. Pellets tørres ved RT, og genbruges i 100 μL TLE buffer. Kvantificere DNA ved hjælp af en fluorogen farvestof, der binder selektivt til DNA og et fluorometer i henhold til producentens anvisninger (Tabel over materialer).
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Ligationsprodukter opbevares ved 4 °C på kort sigt eller ved -20 °C på lang sigt. Der anvendes en aliquot (100 ng) af materialet som ligatedprøve (L) til kvalitetskontrol.
- Tilsæt 1 volumen phenol-chloroform, og bland grundigt ved inversion for at opnå en homogen hvid fase.
7. Vurder kvaliteten af Hi-C-skabelonen
- Kvalitative kontrolelementer til fordøjelse og ligation
- Rense DNA fra UD og D aliquots ved at vende crosslinks, og udføre phenol:chloroform ekstraktion og ethanol nedbør som beskrevet ovenfor.
- 100 ng UD-, D- og L-prøver indlæses i en 1,5% agarosegel. Kig efter en smear centreret omkring 500 bp i D prøve versus en høj molekylvægt band for L prøve (se repræsentative resultater).
- Kvantitativ kontrol med fordøjelseseffektivitet
BEMÆRK: For at vurdere fordøjelseseffektiviteten mere præcist skal du bruge UD- og D-prøverne som skabeloner til at udføre kvantitative polymerasekædereaktioner (qPCR) ved hjælp af primere designet som følger.- Design et primerpar, der forstærker et DNA-fragment, der indeholder DNA-begrænsningsstedet for det enzym, der anvendes til fordøjelsen (Mbo I i denne protokol), kaldet R i formlen i trin 7.2.3.
- Design et primerpar, der forstærker et kontrol-DNA-fragment, der ikke indeholder begrænsningsstedet for det enzym, der anvendes til fordøjelse (Mbo I for den nuværende protokol), kaldet C i formlen i trin 7.2.3.
- Brug cyklustærskelværdierne (Ct-værdier) for forstærkningen til at beregne begrænsningseffektiviteten i henhold til nedenstående formel:
% begrænsning = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Hvis CtR refererer til Ct-værdien af fragment R, og CtC refererer til CtC-værdien af fragmentet C for prøve D og udprøven.
BEMÆRK: Begrænsningsprocenten afspejler effektiviteten af det begrænsningsenzym, der kløver det begrænsede (R) DNA-fragment sammenlignet med et kontrol (C) DNA-fragment, der ikke indeholder begrænsningens DNA-sted. En begrænsning effektivitet på ≥ 80% anbefales.
- Påvisning af kendte interaktioner
- Udfør PCR for at forstærke en intern ligationskontrol for at undersøge kortdistance- og/eller mellem- eller langdistanceinteraktioner (se repræsentative resultater).
- Alternativt kan du designe primere til at forstærke et ligationprodukt, hvor primerne er i fremad- eller bakgearretning i tilstødende begrænsningsfragmenter.
- Udfyldnings- og biotinmærkningskontrolelement
- Kontroller Hi-C-mærkning og ligationseffektivitet ved forstærkning og fordøjelse af et kendt interaktions- eller ligationsprodukt mellem tilstødende begrænsningsfragmenter i genomet som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Vellykket udfyldning og ligation af Mbo I-anlægget (GATC) genererer et nyt sted for restriktionsenzymet Cla I (ATCGAT) ved ligationskrydset og regenererer Mbo I-stedet. - Digest PCR produktet med Mbo I, Cla I, eller begge dele. Efter at have kørt prøverne på en 1,5-2% gel, anslår det relative antal 3C og Hi-C ligation vejkryds ved at kvantificere intensiteten af snittet og uslebne bånd26.
BEMÆRK: Der ønskes en effektivitet på > 70 % (se repræsentative resultater).
- Kontroller Hi-C-mærkning og ligationseffektivitet ved forstærkning og fordøjelse af et kendt interaktions- eller ligationsprodukt mellem tilstødende begrænsningsfragmenter i genomet som beskrevet ovenfor.
8. Sonikering
- Sonicate prøverne for at opnå 200-500 bp DNA fragmenter. For det instrument, der anvendes i denne protokol (se materialetabellen), fortyndes prøven (fra 5 til 10 μg) i 130 μL ddH2O pr. rør, og instrumentet indstilles til 400 bp: fyldniveau: 10; toldfaktor: 10%; største strømhændelse (w): 140; cyklusser pr. burst: 200; tid (r): 80.
9. Biotin fjernelse / ende reparation
BEMÆRK: Nedenstående trin justeres for 5 μg Hi-C DNA.
- For at fjerne biotinen overføres prøven (130 μL) til et friskt mikrocentrifugerør. Der tilsættes 16 μL 10x ligationsbuffer, 2 μL på 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) og 7 μL ddH2O (160 μL af det samlede volumen). Inkuber ved 20 °C i 30 min.
- Der tilsættes 5 μL på 10 mM dNTP' er, 4 μL 10x ligationsbuffer, 5 μL T4 polynukleotidkinase (10 U/μL), 1 μL Klenow og 25 μL ddH2O (200 μL samlet volumen). Inkuber ved 20 °C i 30 min.
10. Valg af størrelse
- For at vælge fragmenter for det meste i 250-550 bp størrelsesområde, udføre sekventiel solid fase reversible immobilisering (SPRI) størrelse udvælgelse først med 0,6 x, efterfulgt af 0,90x i henhold til producentens anvisninger, og elute DNA ved hjælp af 100 μL TLE.
11. Biotin pulldown/A-tailing/adapter ligation
BEMÆRK: Udfør vaskene ved at genbruge de magnetiske perler ved hvirvelstrømning, rotere prøverne i 3 minutter på et roterende hjul og derefter kortvarigt dreje prøven ned og placere den på magnetstativet. Lad perlerne klæbe til magneten, kassér supernatanten, og fortsæt med følgende vasketrin. Vask ved 55 °C på en termoblok med rotation i stedet for det roterende hjul.
- Det endelige volumen fyldes op til 300 μL pr. prøve med TLE til nedtræk. Forbered perlevaskbuffere: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Brug 150 μL streptavidin-forbundne magnetiske perler (se materialeoversigten)pr. bibliotek. Perlerne vaskes 2x med 400 μL 1x TB. Derefter genbruges perler i 300 μL 2x NTB.
- Bæger perlerne med 300 μL Hi-C materiale og inkuber ved RT i 30 minutter på et roterende hjul for at tillade biotinbinding til streptavidin perler.
- Perlerne vaskes med 400 μL 0,5x TB, og der inkuberes ved 55 °C i 3 min. Perlerne vaskes i 200 μL 1x begrænsningsbuffer.
- Bip-tailingblandingen i 100 μL (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x begrænsningsbuffer, 5 μL Klenow exo-og 80 μL ddH2O) opbrugtes. Inkuber ved 37 °C i 30 min.
- Supernatanten fjernes, perlerne vaskes 2x med 400 μL på 0,5x TB ved inkubation ved 55 °C i 3 min. og roterer ved 750 omdrejninger i minuttet.
- Perlerne vaskes med 400 μL 1x NTB og derefter med 100 μL 1x ligationsbuffer.
- Resuspend perlerne i 50 μL af 1x ligation buffer, og overføre suspensionen til et nyt rør. Der tilsættes 4 μL præ-udglødede PE-adaptere (15 μM lager) og 2 μL T4 ligase (400 U/μL, dvs. 800 U/rør). inkuberes ved RT i 2 timer.
BEMÆRK: Forglød adapterne ved at tilføje lige store mængder af både PE 1.0- og PE 2.0-adaptere (30 μM lager) og inkubere i 10 min ved RT (se materialetabellen). - Genkæl perlerne ved at fjerne supernatanten og vaske perlerne 2x med 400 μL TB. Perlerne vaskes med 200 μL 1x NTB, derefter med 100 μL 1x begrænsningsbuffer, og perlerne genbruges i 40 μL 1x begrænsningsbuffer.
12. Forstærkning af PCR
- Opsæt PCT'er på 25 μL volumen med 5, 6, 7 og 8 cyklusser. Brug for hver PCR:
Reaktion Opskrift Hi-C perler 2,5 μL 10 μM PE PCR primer 1 (Tabel over materialer) 0,75 μL 10 μM PE PCR primer 2 (Tabel over materialer) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL 5x reaktionsbuffer 5 μL DNA-polymerase 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Total 25 μL Cykler Temperatur Tidspunkt 1 98 °C 30 s n cyklusser 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 min.
13. Endelig forstærkning af PCR
- Udfør den endelige PCR-forstærkning under de samme betingelser som beskrevet ovenfor og antallet af valgte cyklusser. Prøven opdeles ved hjælp af 5 μL hi-C perler som skabelon i 50 μL reaktioner.
- Saml alle PCR-reaktioner, og overfør dem til et friskrør. Brug magneten til at fjerne streptavidin perler og inddrive supernatant (PCR produkter). Perlerne overføres til et friskrør, perlerne vaskes som angivet i trin 11.2.9, og der opbevares 1x begrænsningsbuffer ved 4 °C som backup.
- Purificer PCR-produkterne ved hjælp af 0,85x SPRI-perlernes volumen i henhold til producentens anvisninger. Elute med 30 μL TLE buffer.
- Kvantificer Hi-C biblioteket ved hjælp af et fluormetrisk instrument, og bekræft bibliotekets kvalitet ved chipbaseret kapillærelektroforese.
- Som et sidste kvalitetskontrolpunkt skal du bruge 1 μL af Hi-C-biblioteket som skabelon til at udføre en PCR-reaktion ved hjælp af 10 cyklusser under de samme betingelser, der er beskrevet i trin 12.1. Del PCR-produktet op i to mikrocentrifugerør: Forsvind det ene med Cla I, og lad det andet være ufordøjet som kontrol. Kør produkterne i en 1,5-2% agarose gel (se repræsentative resultater).
- Fortsæt til 50 bp eller 75 bp parret-end sekventering på en passende sekventering platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nedenfor beskrives resultaterne af en vellykket Hi-C-protokol (se en oversigt over Hi-C-protokolarbejdsgangen i Figur 1A). Der er flere kvalitetskontrol checkpoints under in-kernen Hi-C eksperiment. Prøve aliquots blev indsamlet før (UD) og efter (D) kromatin begrænsning trin samt efter ligation (L). Crosslinks blev vendt, og DNA blev renset og kørt på en agarose gel. En smøre på 200-1000 bp blev observeret, når begrænsning med Mbo I var en succes(Figur 1B). Molekylets forventede størrelse afhænger af det foretrukne restriktionsenzym. Hvis ligationen var vellykket, blev der set et højt molekylvægtbånd øverst på gelen (Figur 1B). Fordøjelseseffektiviteten kan også bekræftes af qPCR som beskrevet i detaljer i protokollen. En acceptabel fordøjelseseffektivitet er 80 % eller højere (figur 1C).
For at kunne foretage en detaljeret vurdering af hi-C-ligationens effektivitet kan primere udformes med henblik på at forstærke en intern ligationproduktkontrol, hvor primerne er i fremadgående eller omvendt retning i tilstødende begrænsningsfragmenter. Alternativt kan primere designes til at forstærke kendte interaktioner. Figur 2A viser forstærkningen af en kendt mellemdistanceinteraktion (300 kb) i Drosophila25. Hi-C ligationsprodukter (hvor biotinmærkningen, udfyldningen og ligationen fandt sted med succes) kan anslås ved fordøjelsen af pcr-produktet, der genvindes i forstærkningen. Efter udfyldning og ligation vil Hi-C amplicons indeholde et nyt Cla I-begrænsningssted på det oprindelige Mbo I-sted, som bevares ved stump ligation. Hvis begrænsningen med Cla I ikke er fuldstændig, vil udfyldningsreaktionen og biotinmærkningen være ineffektiv. En fordøjelseseffektivitet på mere end 70% anbefales for at undgå at have en stor del af ikke-nyttige læsninger til bibliotekerne efter sekventering (Figur 2A, sammenlign Cla I fordøjelsen af 3C versus Hi-C skabelonen).
For at bestemme et tilstrækkeligt antal PCR-forstærkningscyklusser til at forstærke det endelige Hi-C-bibliotek blev PCR-reaktioner oprettet ved hjælp af 2,5 μL af et givet bibliotek på perler som beskrevet i protokollen. Antallet af PCR-cyklusser for den endelige forstærkning er en cyklus mindre end antallet af cyklusser, for hvilke udtværingen er synlig (Figur 2B). I dette tilfælde blev der valgt 4 cyklusser af PCR-forstærkning. Som en sidste kvalitet checkpoint, en aliquot af Hi-C biblioteket blev re-forstærket og fordøjet med Cla I. Bibliotekets fordøjelsesniveau (et fald i smørestørrelsen) angiver overfloden af gyldige Hi-C-par og afspejler andelen af nyttige læsninger, der vil blive opnået fra biblioteket (Figur 2C). Et forhold mellem det øvre størrelsesområde (bestemt af den størrelse, der er til stede i UD-prøven) og bundstørrelsesområdet i både UD- og D-prøverne, bør give et forhold > 1 for UD og et forhold ≤ 1 for den fordøjede prøve, hvis Cla I-fordøjelsen er effektiv.
Efter parret rækkefølge blev FASTQ-filerne (Tabel 1) behandlet ved hjælp af HiCPro28 og de genererede statistikker afbildet ved hjælp af MultiQC28. Et alternativt værktøj til HiCPro er HiCUP30-rørledningen, der giver lignende resultater (ikke vist). Figur 3 og tabel 2 viser de detaljerede statistiske oplysninger om de rækkefølge, der er anført i tabel 2. Fuld læsejustering og justering efter trimning rapporteres. Disse to kategorier svarer til korrekt justerede læsninger, der vil blive brugt i efterfølgende analyse til at finde gyldige Hi-C-par. Justerings-efter-trimningskategorien henviser til læsninger, der spænder over ligationsklænet, som ikke blev justeret i første trin og trimmes på ligationsstedet for derefter at justere deres 5' ekstremitet til genomet28 (Figur 3B, C og tabel 2). Kontaktstatistikken viser, at Hi-C-biblioteket var af høj kvalitet med 82,2% gyldige par og 7,6% ikke-nyttige læsninger, der faldt ind i samme fragments selvcirkel, samme fragment dinglende ender, re-ligation, filtrerede par og dumpede parkategorier (Figur 3A, Figur 3Dog Tabel 2). Desuden er antallet af PCR-dubletter meget lavt, hvilket indikerer, at bibliotekets kompleksitet er høj, og at PCR-cyklusserne introducerede minimale artefakter (Figur 3E og Tabel 2).
Ved hjælp af de entydige gyldige Hi-C-par blev der udført en grundlæggende analyse af parfordelingen ved hjælp af HiCPro27. Dette eksperiment gav 46,5% unikke CIS kontakter ≤ 20 kbp, 47,1% unikke CIS kontakter > 20 kbp, og 5,8% unikke trans kontakter (Figur 3D). Fordelingen af cis til trans-gyldige par svarede til de forventede resultater for et vellykket Hi-C-eksperiment med de fleste af de interaktioner, der blev opdaget inden for samme kromosom. En stor del af transkontakterne indikerer ineffektiv fiksering. Ved hjælp af gyldige Hi-C-par fra HiCPro27blev matricer normaliseret ved iterativ korrektion, og eigenvector decomposition (ICE)30og 1 kb og 5 kb opløsningsmatrixer blev genereret ved hjælp af HiCPlotter30,31,32. Normaliserede kontaktmatrixer ved opløsning på 1 kb og 5 kb præsenteres for Notch-gen locus i Drosophila (Figur 4A, Figur 4Cog Figur 4D). I figur 4Akan Notch-gen locus ses sammen med APs, domæne l og II samt histoneændringer langs locus(figur 4A og tabel 1). Designet af CRISPR-Cas9 sletningen omfattede motivet CTCF og M1BP (Figur 4B).
Ved sletning af den region, der indeholder både CTCF- og M1BP DNA-bindingssteder ved 5's grænse af Notch locus (5pN-delta343, Tabel 1), kan der observeres en dramatisk ændring i chromatinkontakter med tab af interaktioner inde i Notch-locus og gevinst af kontakter med upstream TAD sammenlignet med den vilde type (WT) (Figur 4C, D). Endelig viser figur 4E et detaljeret panorama over WT- og mutantinteraktionsprofiler på begrænsningsfragmentniveau fra Notch-genet 5' UTR, der viser et fald i andelen af kontakter med Notch-gen locus og en stigning i kontakterne med upstream-domænet. De virtuelle 4C-visninger af Notch-genet 5 'UTR blev opnået ved hjælp af HiC-Pro27. Et alternativt værktøj er Hi-C andre ender kvantificering findes i SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Alle resultaterne i figur 4 blev opnået ved at anvende Hi-C-protokollen i WT og mutant S2R+ Drosophila-celler som beskrevet af Arzate-Mejía et al.25.
Figur 1: In-nucleus Hi-C fordøjelses- og ligationskontrolelementer. Cellerne er krydsbundet med formaldehyd, hvilket resulterer i kovalent forbindelse mellem chromatin segmenter (DNA fragmenter: pink, lilla) og proteiner. Chromatin fordøjes med et restriktionsenzym (repræsenteret ved saks), i dette eksempel Mbo I. De resulterende klæbrige ender er fyldt med nukleotider, herunder en biotinyleret dATP (mørkeblå cirkler). DNA renses, og de biotinylerede knudepunkter beriges ved hjælp af streptavidin-coatede magnetiske perler (grå cirkler). Interagerende fragmenter identificeres ved næste generations, parrede rækkefølge. (B) Kvalitetskontrol af fordøjelsen og ligationen af to biologiske replikater (Hi-C 1 og Hi-C 2). Hi-C biblioteker blev løst på en 1,5% agarose gel. Begge fordøjet, D, biblioteker køre som en smøre omkring 600 bp. Ligated prøver, Lig, køre som en temmelig stram band større end 10 kb svarende til ufordøjet UD prøver. Forskellene i signalstyrke skyldes ujævne mængder indlæst DNA på gelen. (C) Kvantitativ kontrol med hi-C-nedbrydning ved kvantitativ polymerasekædereaktion for de samme to biologiske replikater som i litraB) (Hi-C 1 og Hi-C 2) ved hjælp af cyklustærskelværdierne som beskrevet i protokollen. En vellykket fordøjelse har ≥ 80% begrænsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: In-kerner Kvalitetskontroller for udfyldning og stump ligation. En kendt interaktion mellem fragmenter placeret 300 kb fra hinanden i kromosom X blev brugt som en kontrol og forstærket ved hjælp af primere angivet med sorte pile (se toppen af ordningen i (B), primer 1 (venstre), primer 2 (højre), Tabel 1), generere en 347 bp amplicon. Hi-C ligationsprodukter kan skelnes fra dem, der produceres i et 3C-forsøg ved fordøjelse af ligationstedet. Hi-C vejkryds blev fordøjet af Cla I på den oprindelige Mbo I site, da dette dannes ved stump-end ligation. Hi-C og 3C vejkryds blev fordøjet med Mbo I som begrænsning site regenererer ved ligation (til venstre for gelen). I modsætning hertil blev 3C vejkryds ikke fordøjet af Cla I på Mbo I-stedet, men kun af Mbo I. Sammenlign fordøjelsesprofilen for Hi-C- og 3C-produkterne ved hjælp af Cla I. Der blev opnået et 53 basisfragment ved at fordøje Hi-C-produktet (på grund af begrænsningen af det Cla I-anlæg, der blev dannet på Mbo I-anlægget, og begrænsningen af et Cla I-anlæg, der allerede var til stede i regionen). Dette fragment blev ikke observeret i 3C-produkt fordøjelsen, da det eneste tilgængelige Cla I-sted var det, der allerede var til stede i regionen. (B) Efter PCR-forstærkning af Hi-C-biblioteket ved hjælp af forskellige PCR-cyklusser blev produkterne kørt på en 1,5% agarosegel. En smøre på 400-1000 bp var forventet og observeret. De relevante talcyklusser for den endelige forstærkning af PCR bør tages som det tal, der er umiddelbart lavere end det, hvor en udtværing er lige synlig. (C)Endelig bibliotek Cla I fordøjelsen. En aliquot af det endelige bibliotek blev forstærket og fordøjet med Cla I. Størrelsesreduktionen af smøre bekræftede, at en stor del af molekylerne i biblioteket var gyldige Hi-C-par. Densitometrisk analyse af denne gel kan udføres for at opnå et forhold mellem FN- og D-prøverne, som beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: HiC-Pro-statistikker fra Hi-C-biblioteket. Disse omfatter læser falder i sammenhængende sekvenser, dinglende ender, samme fragment, selvcirkel, re-ligations, og PCR dubletter. (B) Kortlægning af statistikker. Læsninger, der ikke kunne justeres, vises (grå), og begge fuldt justerede læsninger og læsninger justeret efter trimning vises i henholdsvis blå og lyseblå. Disse to kategorier repræsenterer de nyttige læsninger, der overvejes i efterfølgende analyser. (C)Parringsstatistik. Multijusterede læsninger (mørk orange) repræsenterer læsninger, der er justeret i flere områder i genomet. Unikt justerede (mørkeblå) læsninger repræsenterer de læsepar, der er justeret en gang i genomet, og singletons (lyse orange) repræsenterer læsepar, hvor kun en genomisk region blev sekventeret i begge læsninger. (D) Filtrering af statistikker. Gyldige læsepar (blå) repræsenterer vellykkede Hi-C ligationsprodukter som beskrevet i (A). Selvfragmentets selvcirkler (lyserød) er ikke-nyttige læsninger, da de repræsenterer det samme genomiske fragment, der er vist i (A). Samme fragment dinglende ender (orange) repræsenterer læser, hvor en enkelt begrænsning fragment blev sekventeret. Filtrerede og dumpede par (brune) er også ikke-nyttige aflæsninger, der har den forkerte størrelse, eller for hvilke ligationproduktet ikke kunne rekonstrueres. Endelig repræsenterer re-ligation (rød) læses, hvor to tilstødende fragmenter blev re-ligated, hvilket giver ikke-nyttige oplysninger. (E)Gyldig kontaktfordeling af læsepar i genomet. Unikke CIS-kontakter (blå) er hyppigere end unikke transkontakter (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hi-C kontakt matricer og virtuel 4C analyse af WT og mutant S2R + celler. (A) Normaliseret hi-C-varmekort for et 50 kb-område med en opløsning på 1 kb centreret i Notch-genets locus. TAD separation score32 for locus er vist, sammen med opdelingen af Notch locus i to topologiske domæner (Domain 1 og Domain 2). ChIP-seq-data for APs, RNA Pol II og histonemærker for S2/S2R+-celler34,35,36,37 er vist under varmekortet ( Tabel1). Placeringen af Notch domæne 1 grænser er fremhævet i lysegrøn. (B) Skematisk repræsentation af B1-grænse-CRISPR-mutant. Det grønne rektangel angiver det slettede 343 bp-område. Saks angiver sgRNA'er, der bruges til CRISPR-medieret genomredigering. Motivbindende steder for APs vises som bokse for CTCF og M1BP. Toptopmøder for DNA-bindende OP'er vist i (A) er også angivet35. (C) Normaliserede hi-C-varmekort ved 1 kb opløsning, der dækker et område på 50 kb centreret i Notch for WT og de mutante celler. Venstre, Hi-C heatmaps af log2 forskelle i interaktion frekvens mellem WT og mutant celler. (D) Normaliserede hi-C-varmekort, der dækker et 250 kb område centreret i Notch ved 5 kb opløsning for WT- og mutantceller. Venstre, Hi-C heatmaps af log2 forskelle i interaktion frekvens mellem WT og mutant celler. (E) Virtual-4C for WT og mutant celler ved hjælp af 5 'UTR af Notch som synspunkt. Procentdelen af interaktioner mellem synspunktet og regionerne i opstrøms kirredomain-2, Notch-domæne 1, Notch-domæne 2 og downstream-dncdomænet for både WT- og mutantceller vises25. Forkortelser: WT = vild type; TAD = topologisk associeret domæne; ChIP = chromatin immunoprecipitation; AP = arkitektonisk protein; RNA Pol = RNA-polymerase; S2R+ = S2-receptor plus; sg RNA = enkelt guide RNA; UTR = uoversat region. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperiment | Prøve | GEO's tiltrædelsesnummer |
| Jeton | CP190 | GSM1015404 |
| Jeton | SuHW | GSM1015406 |
| Jeton | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Jeton | CTCF | GSM1015410 |
| Jeton | Ibf1 | GSM1133264 |
| Jeton | Ibf2 | GSM1133265 |
| Jeton | BEAF32 | GSM1278639 |
| Jeton | Pita | GSM1313420 |
| Jeton | ZIPIC | GSM1313421 |
| Jeton | RNA PolII | GSM2259975 |
| Jeton | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Jeton | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Jeton | H3K27ac | GSM2259987 |
| Jeton | MSL2 | GSM2469507 |
| Jeton | H4K16ac | GSM2469508 |
| Jeton | M1BP | GSM2706055 |
| Jeton | GAF | GSM2860390 |
| Jeton | Indgang | GSM1015412 |
| Hi-C | S2R+-WT-celler | GSE136137 |
| Hi-C | S2R+ 5pN-delta343 celler | GSE136137 |
Tabel 1: GEO's tiltrædelsesnumre.
| HiC-Pro-statistik | Læser | Procentdel |
| Statistik for tilknytning | ||
| Justering af fuld læsning | 131515921 | 82.20% |
| Trimmet læse Justeringer | 16408309 | 10.30% |
| Det lykkedes ikke at justere | 12110964 | 7.60% |
| Statistik for parring | ||
| Entydigt justeret | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Flere justerede | 57700021 | 36.90% |
| Filtrering af statistik | ||
| Gyldige par | 71373989 | 90.12% |
| Samme fragment: Selvcirkel | 2340697 | 2.90% |
| Samme fragment: Dinglende ender | 2578783 | 3.20% |
| Filtrerede par | 2773043 | 3.50% |
| Dumpede par | 196565 | 0.20% |
| Kontaktstatistik | ||
| Unik: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Unik: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Unik: trans | 4133602 | 5.80% |
| Duplikerede læsepar | 398400 | 0.60% |
Tabel 2: HiC-Pro-statistikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in-nukleus Hi-C-metode, der præsenteres her, har gjort det muligt detaljeret udforskning af Drosophila-genomtopologien i høj opløsning, hvilket giver et overblik over genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer, fra kromatinsløjfer mellem regulerende elementer som initiativtagere og forstærkere til TAD'er og identifikation af store rum25. Den samme teknologi er også blevet anvendt effektivt på pattedyrvæv med nogle modifikationer33. For eksempel, når man behandler et væv i stedet for en enkeltcellesaffjedring, sigtes vævet gennem et 70 μm filter, og lysis-trinnet udføres, mens materialet homogeniseres ved hjælp af en Dounce homogenisator. Da pattedyrsgenomet er 25x større end Drosophila-genomet, er antallet af gyldige læsepar, der er nødvendige for at bygge 1-5 kb opløsningsmatrixer, større. Hi-C-metoden i kernen adskiller sig fra den oprindelige Hi-C-metode2 ved at undgå nuklear lysis med 1% SDS ved 65 °C før ligationen, hvorved den nukleare integritet bevares, og ved at ligating i 1 mL i stedet for 7 mL23,24.
Protokollen har nogle vigtige skridt til at sikre høj effektivitet. Det første skridt, der kan introducere fordøjelse og fill-in ineffektivitet er dannelsen af klumper i løbet af 0,3% SDS permeabilization og overfladeaktive behandlinger. Hvis klumperne er store og vanskelige at forstyrre, skal den roterende hastighed reduceres til 400 omdrejninger i minuttet under SDS og overfladeaktive behandlinger. Hvis klumperne fortsat er vanskelige at opdele ved pipettering, skal prøven opdeles i to ved at justere mængderne med begrænsningsbuffer, SDS og det nonioniske overfladeaktive middel, før du fortsætter med gennemtrængning. Dernæst skal kernerne centrifugeres ved minimal hastighed (200 × g), supernatanten kasseres omhyggeligt, og prøverne samles i 450 μL 1x begrænsningsbuffer, før de fortsætter med fordøjelsen. For det andet er det vigtigt at anslå fordøjelseseffektiviteten for at give nok DNA-fragmenter til udfyldning og ligation. Hvis fordøjelsen ved kvalitativ vurdering viser sig at være ineffektiv, skal der udføres en anden fordøjelsesrunde med restriktionsenzymet i en periode fra 4 timer til natten over.
For det tredje er det vigtigt at anslå ligationens effektivitet. Hvis ligationen ved kvalitativ vurdering viser sig at være ineffektiv (dvs. at der i stedet for det høje molekylvægtbånd observeres en smøre svarende til den, der er observeret for den fordøjede prøve), bør ligationen gentages ved at centrifugere kernerne ved 200 × g og genbruge dem i ligationblanding ved hjælp af frisk 10x ligation buffer og ligase. For det fjerde bør procentdelen af Hi-C gyldige produkter anslås ved at fordøje en PCR-amplicon af en forventet interaktion med Cla I (for Mbo I original fordøjelse). Den effektive forstærkning og fordøjelse af ampliconen af den forventede interaktion bekræfter vellykket ligation og dannelse af Hi-C-kryds. Hvis amplicon fordøjelsen ikke er effektiv, vil størstedelen af molekylerne være 3C i stedet for Hi-C produkter, og dette bør tages i betragtning, hvis biblioteket vil blive sekventeret. Dette kan også bekræftes ved at udføre det endelige bibliotek Cla I fordøjelseskontrol, som beskrevet i det repræsentative resultatafsnit. Endelig er det vigtigt at vælge det lavere antal PCR-cyklusser for at undgå PCR-dubletter. Hvis det ved sekventering viser sig, at procentdelen af læsepar dubletter er høj, bør antallet af PCR-cyklusser reduceres yderligere.
Denne in-kerne Hi-C teknik har nogle begrænsninger. For det første repræsenterer den protokol, der er beskrevet her, Hi-C-eksperimentet, der udføres for en cellepopulation. Derfor repræsenterer signalet om hyppigheden af genomiske kontakter millioner af genomer med variable individuelle konformationer. For at opnå det sæt genomiske kontakter fra et enkelt genom anbefales et enkeltcellet Hi-C-eksperiment22. For det andet er Hi-C baseret på ligationen af proksimale DNA-fragmenter. Hvis genomiske regioner er en del af et stort proteinkromatinkompleks, kan afstanden mellem fragmenter således hæmme ligationen. For eksempel har det vist sig, at transkontakter er dårligt repræsenteret i Hi-C38. Desuden slutter Hi-C med parret rækkefølge og henter dermed par af genomiske kontakter. Flere DNA-fragmenter kan dog samtidig interagere i det samme kromatinkompleks. For at opnå identiteten af flere DNA-fragmenter i et kromatinkompleks kan der anvendes alternative sekventeringsmetoder på Hi-C39, eller der kan anvendes forskellige eksperimentelle strategier, hvor ligation ikke udføres38,40,41. Endelig, selv om Hi-C måler genomiske kontakter, afslører det ikke identiteten af de proteiner, der formidler interaktionerne. Der skal anvendes alternative metoder til at identificere de genomiske interaktioner , der formidles af et bestemt protein af interesse42 , eller identiteten af proteinensemble ved specifikke genomiske elementer43.
Afslutningsvis vil jeg sige, at med et Hi-C-eksperiment af høj kvalitet som det her beskrevne for Drosophila-genomet (tabel 2) kan matricer bygges med en lang række opløsninger (fra 1, 5 kb, 50 kb eller lavere; se figur 4). Hvis en bestemt region af genomet skal evalueres på begrænsningsfragmentniveau, kan dataene desuden bruges til at opbygge et virtuelt 4C-landskab af det ønskede synspunkt (f.eks. Notch-genet 5' UTR i figur 4E). Hi-C-værktøjet i Andre ender i SeqMonk er en meget brugervenlig mulighed, der muliggør visualisering af dette landskab. Anvendelse af 4C kvantificeringsværktøjet, også en del af SeqMonk, på dette landskab kan give statistisk signifikante kontakter.
Anvendelsen af in-nucleus Hi-C eksperimentet beskrevet her til en samling af mutant cellelinjer med ændrede AP DNA-bindingssteder ved TAD-grænserne (Figur 4) afslørede, at genetiske elementer er nødvendige ved grænserne for at strukturere Drosophila-genomet i domæner og opretholde genudtryksregulering som fuldt diskuteret af Arzate-Mejía et al.25. Genetisk redigering af regulatoriske elementer med CRISPR/Cas9-systemet kombineret med profilering i høj opløsning af genomiske interaktioner ved hjælp af den in-nukleus Hi-C-protokol, der er beskrevet her, kan således være en stærk strategi for at teste den strukturelle funktion af genetiske elementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskud nummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskud nummer 303068. A.E.-L. er en kandidatstuderende støttet af Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
