Summary
Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.
Abstract
Het genoom is georganiseerd in topologisch koppelende domeinen (TAD's) gescheiden door grenzen die interacties tussen domeinen isoleren. In Drosophila worden de mechanismen die ten grondslag liggen aan TAD-formatie en grenzen nog onderzocht. De toepassing van de hier beschreven hi-C-methode in de kern hielp bij het ontleden van de functie van architecturale eiwitbindende locaties bij TAD-grenzen die het Notch-gen isoleren. Genetische modificatie van domeingrenzen die verlies van AP's veroorzaken, resulteert in TAD-fusie, transcriptiedefecten en topologische veranderingen op lange afstand. Deze resultaten leverden bewijs dat genetische elementen bijdragen aan de vorming van domeingrens en genexpressiecontrole in Drosophila. Hier is de hi-C-methode in de kern in detail beschreven, die belangrijke controlepunten biedt om de kwaliteit van het experiment samen met het protocol te beoordelen. Ook worden de vereiste aantallen sequencing-leesingen en geldige Hi-C-paren weergegeven om genomische interacties op verschillende genomische schalen te analyseren. CRISPR/Cas9-gemedieerde genetische bewerking van regulerende elementen en profilering met hoge resolutie van genomische interacties met behulp van dit hi-C-protocol in de kern zou een krachtige combinatie kunnen zijn voor het onderzoek naar de structurele functie van genetische elementen.
Introduction
Bij eukaryoten wordt het genoom verdeeld in chromosomen die specifieke gebieden in de nucleaire ruimte bezetten tijdens interfase1. De chromatine die de chromosomen vormt, kan worden onderverdeeld in twee hoofdtoestanden: een van toegankelijke chromatine die transcriptie-permissief is, en de andere van compacte chromatine die transcriptie-repressief is. Deze chromatinetoestanden scheiden en mengen zich zelden in de nucleaire ruimte en vormen twee afzonderlijke compartimenten in de kern2. Op de sub-megabase schaal, grenzen afzonderlijke domeinen van hoogfrequente chromatine interacties, genaamd TADs, die chromosomale organisatiemarkeren 3,4,5. Bij zoogdieren worden tad-grenzen ingenomen door cohesine en CCCTC-bindingsfactor (CTCF)6,7,8. Het cohesinecomplex extrudeert chromatine en stopt op CTCF-bindingsplaatsen die in een convergente oriëntatie in de genomische sequentie worden afgevoerd om stabiele chromatinelussen9,10 , 13,14te vormen . Genetische verstoring van de CTCF DNA-bindende plaats aan de grenzen of vermindering van de overvloed aan CTCF - en cohesine-eiwit resulteert in abnormale interacties tussen regulerende elementen, verlies van TAD-vorming en genexpressiederegulering9,10,11,13,14.
In Drosophila worden de grenzen tussen TAD's bezet door verschillende AP's, waaronder grenselement-geassocieerde factor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 binding eiwit (M1BP), centrosomaal eiwit 190 (CP190), suppressor van hairy-wing (SuHW) en CTCF, en zijn verrijkt met actieve histonmodificaties en Polymerase II16,17,18. Er is gesuggereerd dat in Drosophila TAD's verschijnen als gevolg van transcriptie13,17,19, en de exacte rol van onafhankelijke AP's in grensvorming en isolatie-eigenschappen wordt nog onderzocht. Dus of domeinen in Drosophila een enig gevolg zijn van de aggregatie van regio's van vergelijkbare transcriptietoestanden of dat AP's, waaronder CTCF, bijdragen aan grensvorming, moet dus nog volledig worden gekarakteriseerd. Exploratie van genomische contacten met hoge resolutie is mogelijk geweest door de ontwikkeling van chromosoomconformatie-opnametechnologieën in combinatie met sequencing van de volgende generatie. Het Hi-C protocol werd voor het eerst beschreven met de ligatiestap uitgevoerd "in oplossing"2 in een poging om valse ligatieproducten tussen chromatinefragmenten te voorkomen. Verschillende studies wezen echter op het besef dat het nuttige signaal in de gegevens afkomstig was van ligatieproducten die werden gevormd bij gedeeltelijk gelyseerde kernen die niet in oplossing20,21waren .
Het protocol werd vervolgens aangepast om de ligatie in de kern uit te voeren als onderdeel van het eencellige Hi-C-experiment22. Het hi-c-protocol in de kern werd vervolgens opgenomen in de celpopulatie Hi-C om een consistentere dekking over het volledige bereik van genomische afstanden te produceren en gegevens te produceren met minder technische ruis23,24. Het protocol, hier in detail beschreven, is gebaseerd op het populatie-in-nucleus Hi-C protocol23,24 en werd gebruikt om de gevolgen te onderzoeken van het genetisch verwijderen van DNA-bindende motieven voor CTCF en M1BP van een domeingrens bij de Notch-gen locus in Drosophila25. De resultaten tonen aan dat het veranderen van de DNA-bindende motieven voor AP's aan de grens drastische gevolgen heeft voor de vorming van notch-domein, grotere topologische defecten in de regio's rond de Notch-locus en genexpressiederegulering. Dit geeft aan dat genetische elementen op domeingrenzen belangrijk zijn voor het behoud van genoomtopologie en genexpressie in Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fixatie
- Begin met 10 miljoen Schneider's lijn 2 plus (S2R+) cellen om 17,5 ml van een celsuspensie in Schneider medium te bereiden met 10% foetale runderserum (FBS) bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg methanolvrije formaldehyde toe om een eindconcentratie van 2% te verkrijgen. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij RT en zorg ervoor dat je elke minuut mengt.
OPMERKING: Formaldehyde is een gevaarlijke chemische stof. Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften en werk in de zuurkast. - Doof de reactie door glycine toe te voegen om een eindconcentratie van 0,125 M te bereiken en meng. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT, gevolgd door 15 minuten op ijs.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten gedurende 400 × g bij RT en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C; gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet zorgvuldig in 25 ml koude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing.
- Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Als u doorgaat met het protocol, gaat u naar stap 2.1 voor lysis; anders, flash-freeze de pellet in vloeistof N2 en bewaar de pellet op -80 °C.
2. Lysis
- Resuspendeer de cellen in 1 ml ijs-koude-lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% van niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de tabel met materialen);10 mM NaCl; 1x proteaseremmers) en stel het volume in op 10 ml met ijskoude lysisbuffer. Pas het volume aan om een concentratie van 1 × 106 cellen/ml te verkrijgen. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en meng elke 2 minuten door de buizen om te keren.
- Centrifugeer de kernen op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg. Was de pellet 1x met 1 ml koude lysisbuffer en breng deze over naar een microcentrifugebuis. Was de pellet 1x met 1 ml koude 1,25x restrictiebuffer en resuspendeer elke celpellet in 360 μL 1,25x restrictiebuffer.
- Voeg 11 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) per buis (0,3% eindconcentratie) toe, meng voorzichtig door pipetten en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten, schuddend bij 700-950 tpm. Pipet op en neer om klonten een paar keer te verstoren tijdens de incubatie.
- Blus de SDS door 75 μL niet-ionische oppervlakteactieve stof (10% oplossing, zie de tabel met materialen)per buis (1,6% eindconcentratie) toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten, schuddend bij 950 tpm. Pipet een paar keer op en neer om klonten tijdens de incubatie te verstoren.
OPMERKING: Als klonten groot zijn en moeilijk te verstoren, verlaagt u de draaisnelheid tot 400 tpm tijdens SDS- en oppervlakteactieve behandelingen. Als de klonten moeilijk te verdelen zijn door pipetten, splits het monster dan in tweeën; de volumes van de beperkingsbuffer, SDS en oppervlakteactieve stof aan te passen; en ga verder met de permeabilisatie. Draai vervolgens de kernen op minimale snelheid (200 × g),gooi het supernatant voorzichtig weg, bundel de monsters samen in een 1X-beperkingsbuffer en ga verder met de spijsvertering. Neem een aliquot van 10 μL als onverteerd monster (UD).
3. Enzymatische spijsvertering
- Verteer het chromatine door 200 eenheden (U) Mbo I per buis toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende een periode variërend van 4 uur tot 's nachts tijdens het draaien (950 tpm).
- Voeg de volgende dag nog eens 50 U Mbo I per buis toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur tijdens het draaien (950 tpm).
- Inactiveer het enzym door de buizen gedurende 20 minuten op 60 °C te incuberen. Leg de buizen op ijs.
OPMERKING: Neem een aliquot van 10 μL als verteerd monster (D).
4. Biotinylering van DNA-uiteinden
- Om het beperkingsfragment overhangen op te vullen en het DNA-uiteinden te labelen met biotine, voeg 1,5 μL elk van 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL van 0,4 mM biotine dATP, 17,5 μL Tris low-EDTA (TLE) buffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] en 10 μL van 5 Meng voorzichtig en incubeer gedurende 75 minuten bij 37 °C. Schud bij 700 tpm elke 10 s gedurende 30 s. Leg alle buizen op ijs tijdens het bereiden van de ligatiemix.
5. Ligatie
- Breng elk verteerd chromatinemengsel over in een afzonderlijke buis van 1 ml met ligatiemengsel (100 μL 10x ligatiebuffer, 10 μL 10 mg/ml runderserumalbumine, 15 U T4 DNA-ligase en 425 μL dubbel gedestilleerd water [ddH2O]). Meng grondig door zachte pipetten en incubeer 's nachts bij 16 °C.
6. Crosslink omkering en DNA zuivering
- Degradeer eiwitten door 50 μL van 10 mg/ml Proteinase K per buis toe te voegen en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Keer crosslinks om door de temperatuur te verhogen tot 65 °C en 's nachts te incuberen.
- Degradeer RNA door 20 μL RNase A van 10 mg/ml toe te voegen en gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen.
- Voer fenol uit: chloroformextractie gevolgd door ethanolprecipitatie.
- Voeg 1 volume fenol-chloroform toe en meng grondig door inversie om een homogene witte fase te verkrijgen.
OPMERKING: Fenol is een gevaarlijke chemische stof. Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. Werk in de zuurkast. - Centrifugeer gedurende 15 min. op 15.000 × g. Breng de waterfase over in een verse microcentrifugebuis van 2 ml. Voer een terugwinning van de onderste laag uit met 100 μL TLE-buffer en breng de waterfase over in dezelfde buis van 2 ml.
- Precipitaat DNA door toevoeging van 2 volumes 100% ethylalcohol (EtOH), 0,1 volumes van 3 M natriumacetaat en 2 μL 20 mg/ml glycogeen. Incubeer bij -20 °C gedurende een periode variërend van 2 uur tot 's nachts.
- Draai op 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en was de pellets 2x met ijskoude 70% EtOH. Droog de pellets bij RT en resuspend in 100 μL TLE buffer. Kwantificeer het DNA met behulp van een fluorogene kleurstof die selectief aan DNA en een fluorometer bindt volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar ligatieproducten bij 4 °C voor de korte termijn of bij -20 °C voor de lange termijn. Gebruik een aliquot (100 ng) van het materiaal als ligated monster (L) voor kwaliteitscontrole.
- Voeg 1 volume fenol-chloroform toe en meng grondig door inversie om een homogene witte fase te verkrijgen.
7. Beoordeel de kwaliteit van hi-c-sjablonen
- Kwalitatieve controles op de spijsvertering en ligatie
- Zuiver DNA van de UD en D aliquots door de crosslinks om te draaien en voer fenol:chloroform extractie en ethanol neerslag uit zoals hierboven beschreven.
- Laad 100 ng UD-, D- en L-monsters in een 1,5% agarosegel. Zoek naar een uitstrijkje gecentreerd rond 500 bp in het D-monster versus een hoge moleculaire gewichtsband voor het L-monster (zie representatieve resultaten).
- Kwantitatieve controle van de spijsverteringsefficiëntie
OPMERKING: Om de spijsverteringsefficiëntie nauwkeuriger te beoordelen, gebruikt u de UD- en D-monsters als sjablonen om kwantitatieve polymerasekettingreacties (qPCR) uit te voeren met behulp van primers die als volgt zijn ontworpen.- Ontwerp een primerpaar dat een DNA-fragment versterkt dat de DNA-beperkingsplaats bevat voor het enzym dat wordt gebruikt voor de spijsvertering (Mbo I in het huidige protocol), R genoemd in de formule in stap 7.2.3.
- Ontwerp een primerpaar dat een controle-DNA-fragment versterkt dat niet de beperkingsplaats bevat voor het enzym dat voor de spijsvertering wordt gebruikt (Mbo I voor het huidige protocol), C genoemd in de formule in stap 7.2.3.
- Gebruik de cyclusdrempelwaarden (Ct-waarden) van de versterking om de beperkingsefficiëntie te berekenen volgens de onderstaande formule:
% restrictie = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Waarbij CtR verwijst naar de Ct-waarde van fragment R, en CtC verwijst naar de Ct-waarde van het fragment C voor monster D en monster UD.
OPMERKING: Het beperkingspercentage weerspiegelt de efficiëntie van het restrictie-enzym dat het beperkte (R) DNA-fragment splijt in vergelijking met een controle(C) DNA-fragment dat de beperkings-DNA-locatie niet bevat. Een beperkingsefficiëntie van ≥ 80% wordt aanbevolen.
- Detectie van bekende interacties
- Voer PCR uit om een interne ligatiecontrole te versterken om interacties op korte en/of middellange of lange afstand te onderzoeken (zie representatieve resultaten).
- U kunt ook primers ontwerpen om een ligatieproduct te versterken waarbij de primers in voorwaartse of omgekeerde richting in aangrenzende beperkingsfragmenten staan.
- Invul- en biotinelabeling
- Controleer de hi-C markering en ligatie-efficiëntie door versterking en vertering van een bekende interactie of een ligatieproduct tussen aangrenzende beperkingsfragmenten in het genoom, zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Succesvolle invulling en ligatie van de Mbo I-site (GATC) genereert een nieuwe site voor het restrictie-enzym Cla I (ATCGAT) op het ligatieknooppunt en regenereert de Mbo I-site. - Verteer het PCR-product met Mbo I, Cla I of beide. Na het uitvoeren van de monsters op een gel van 1,5-2%, schat u het relatieve aantal 3C- en Hi-C-ligatieverbindingen door de intensiteit van de snede- en ongesneden banden te kwantificeren26.
OPMERKING: Een efficiëntie van > 70% is gewenst (zie representatieve resultaten).
- Controleer de hi-C markering en ligatie-efficiëntie door versterking en vertering van een bekende interactie of een ligatieproduct tussen aangrenzende beperkingsfragmenten in het genoom, zoals hierboven beschreven.
8. Sonicatie
- Soniceer de monsters om 200-500 bp DNA fragmenten te verkrijgen. Verdun voor het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt (zie de tabel met materialen)het monster (van 5 tot 10 μg) in 130 μL ddH2O per buis en stel het instrument in op sonicaat tot 400 bp: vulniveau: 10; heffingsfactor: 10%; piekincidentvermogen (w): 140; cycli per uitbarsting: 200; tijd(en): 80.
9. Biotine verwijdering / eindreparatie
OPMERKING: De onderstaande stappen zijn aangepast voor 5 μg Hi-C DNA.
- Breng het monster (130 μL) over in een verse microcentrifugebuis om de verwijdering van biotine uit te voeren. Voeg 16 μL 10x ligatiebuffer, 2 μL van 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) en 7 μL ddH2O (160 μL totaal volume) toe. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min.
- Voeg 5 μL 10 mM dNTPs, 4 μL 10x ligatiebuffer, 5 μL T4 polynucleotidekinase (10 U/μL), 1 μL Klenow en 25 μL ddH2O (200 μL totaal volume) toe. Incubeer bij 20 °C gedurende 30 min.
10. Grootte selectie
- Om fragmenten te selecteren, meestal in het bereik van 250-550 bp, voert u eerst sequentiële SPRI-grootteselectie (Solid Phase Reversible Immobilization) uit met 0,6x, gevolgd door 0,90x volgens de instructies van de fabrikant, en elute het DNA met behulp van 100 μL TLE.
11. Biotine pulldown/A-tailing/adapter ligatie
OPMERKING: Voer de wasbeurten uit door de magnetische kralen opnieuw te gebruiken door te vortexen, draai de monsters gedurende 3 minuten op een draaiend wiel en draai het monster vervolgens kort naar beneden en plaats het op de magnetische standaard. Laat de kralen aan de magneet plakken, gooi het supernatant weg en ga verder met de volgende wasstap. Voer de wasbeurten uit bij 55 °C op een thermoblok met rotatie in plaats van het roterende wiel.
- Maak het uiteindelijke volume op tot 300 μL per monster met TLE voor pull-down. Bereid de kraalwasbuffers voor: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM
- Gebruik 150 μL streptavidine-gebonden magnetische kralen (zie de tabel met materialen)per bibliotheek. Was de kralen 2x met 400 μL 1x TB. Resuspend kralen in 300 μL 2x NTB.
- Meng de kralen met het 300 μL Hi-C materiaal en incubeer bij RT gedurende 30 minuten op een draaiend wiel om biotinebinding aan streptavidin kralen mogelijk te maken.
- Was de kralen met 400 μL van 0,5x TB en incubeer gedurende 3 minuten op 55 °C, draaiend bij 750 tpm. Was de kralen in 200 μL 1x restrictiebuffer.
- Resuspendeer de kralen in 100 μL dATP tailing mix (5 μL van 10 mM dATP, 10 μL van 10x restrictiebuffer, 5 μL Klenow exo-, en 80 μL ddH2O). Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Verwijder het supernatant, was de kralen 2x met 400 μL van 0,5x TB door gedurende 3 minuten op 55 °C te broeden en bij 750 tpm te draaien.
- Was de kralen met 400 μL van 1x NTB en vervolgens met 100 μL 1x ligatiebuffer.
- Resuspend de kralen in 50 μL van 1x ligatiebuffer en breng de suspensie over naar een nieuwe buis. Voeg 4 μL voorgegloeide PE-adapters (15 μM-voorraad) en 2 μL T4-ligase (400 U/μL, d.w.z. 800 U/tube) toe; incubeer bij RT gedurende 2 uur.
OPMERKING: Voorgloei de adapters door gelijke volumes van zowel PE 1.0- als PE 2.0-adapters (voorraad van 30 μM) toe te voegen en gedurende 10 minuten bij RT te broeden (zie de tabel met materialen). - Herover de kralen door het supernatant te verwijderen en de kralen 2x te wassen met 400 μL TB. Was de kralen met 200 μL van 1x NTB, vervolgens met 100 μL 1x restrictiebuffer en resuspend de kralen in 40 μL 1x restrictiebuffer.
12. PCR-versterking
- Stel PCR's van 25 μL volume in met 5, 6, 7 en 8 cycli. Gebruik voor elke PCR:
Reactie Recept Hi-C kralen 2,5 μL 10 μM PE PCR primer 1 (Tabel van Materialen) 0,75 μL 10 μM PE PCR primer 2 (Tabel van Materialen) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL 5x reactiebuffer 5 μL DNA-polymerase 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Totaal 25 μL Cycli Temperatuur Tijd 1 98 °C 30 s n cycli 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 min
13. Definitieve PCR-versterking
- Voer de uiteindelijke PCR-versterking uit onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven en het aantal geselecteerde cycli. Splits het monster met 5 μL Hi-C kralen als sjabloon in 50 μL reacties.
- Verzamel alle PCR-reacties en breng ze over naar een verse buis. Gebruik de magneet om de streptavidin kralen te verwijderen en het supernatant (PCR producten) terug te winnen. Breng de kralen over in een verse buis, was de kralen zoals aangegeven in stap 11.2.9 en bewaar in 1x beperkingsbuffer bij 4 °C als back-up.
- Zuiver de PCR-producten met 0,85x het volume van de SPRI-kralen volgens de instructies van de fabrikant. Elute met 30 μL TLE buffer.
- Kwantificeer de Hi-C-bibliotheek met behulp van een fluormetrisch instrument en bevestig de kwaliteit van de bibliotheek door capillaire elektroforese op basis van chips.
- Gebruik als laatste kwaliteitscontrolepunt 1 μL van de Hi-C-bibliotheek als sjabloon om een PCR-reactie uit te voeren met behulp van 10 cycli met dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 12.1. Verdeel het PCR-product in twee microcentrifugebuizen: verteer de ene met Cla I en laat de andere onverteerd als controlemiddel. Voer de producten uit in een agarosegel van 1,5-2% (zie representatieve resultaten).
- Ga verder met 50 bp of 75 bp paired-end sequencing op een geschikt sequencing platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hieronder worden de resultaten van een succesvol Hi-C-protocol beschreven (zie een samenvatting van de hi-c-protocolworkflow in figuur 1A). Er zijn verschillende kwaliteitscontrolecontrolepunten tijdens het hi-C-experiment in de kern. Monster aliquots werden verzameld vóór (UD) en na (D) de chromatine restrictie stap en na ligatie (L). Crosslinks werden omgekeerd, en DNA werd gezuiverd en op een agarose gel gelopen. Een uitstrijkje van 200-1000 bp werd waargenomen bij een beperking met Mbo I (Figuur 1B). De verwachte grootte van het molecuul hangt af van het beperkingsenzym van keuze. Als de ligatie succesvol was, werd een band met een hoog molecuulgewicht gezien aan de bovenkant van de gel (Figuur 1B). De efficiëntie van de spijsvertering kan ook worden bevestigd door qPCR zoals in detail beschreven in het protocol. Een aanvaardbaar spijsverteringsrendement is 80% of hoger (figuur 1C).
Om de hi-C ligatie-efficiëntie in detail te beoordelen, kunnen primers worden ontworpen om een interne ligatieproductcontrole te versterken waarbij de primers in voorwaartse of omgekeerde omgekeerde oriëntatie in aangrenzende beperkingsfragmenten staan. Als alternatief kunnen primers worden ontworpen om bekende interacties te versterken. Figuur 2A toont de versterking van een bekende medium-range (300 kb) interactie in Drosophila25. Hi-C ligatieproducten (waarbij de biotinemarkering, -invulling en ligatie met succes hebben plaatsgevonden) kunnen worden geschat door de vertering van het PCR-product dat in de versterking is teruggewonnen. Na invulling en ligatie bevatten Hi-C amplicons een nieuwe Cla I-beperkingssite op de oorspronkelijke Mbo I-site, die bewaard blijft bij botte ligatie. Als de beperking met Cla I niet volledig is, zullen de invulreactie en biotinemarkering inefficiënt zijn. Een spijsverteringsefficiëntie van meer dan 70% wordt aanbevolen om te voorkomen dat een groot deel van de niet-nuttige leesingen voor de bibliotheken na sequencing(figuur 2A, vergelijk de Cla I-spijsvertering van de 3C versus de Hi-C-sjabloon).
Om een adequaat aantal PCR-versterkingscycli te bepalen om de uiteindelijke Hi-C-bibliotheek te versterken, werden PCR-reacties ingesteld met 2,5 μL van een bepaalde bibliotheek op kralen, zoals beschreven in het protocol. Het aantal PCR-cycli voor de uiteindelijke versterking is één cyclus kleiner dan het aantal cycli waarvoor het uitstrijkje zichtbaar is (figuur 2B). In dit geval werden 4 cycli van PCR-versterking gekozen. Als laatste kwaliteitscontrolepunt werd een aliquot van de Hi-C-bibliotheek opnieuw versterkt en verteerd met Cla I. Het niveau van vertering van de bibliotheek (een afname van de uitstrijkjes) geeft de overvloed aan geldige Hi-C-paren aan en weerspiegelt het aandeel nuttige leesvoer dat uit de bibliotheek zal worden verkregen (Figuur 2C). Een verhouding van het bovenste groottebereik (bepaald door de grootte in het UD-monster) en het onderste groottebereik in zowel UD- als D-monsters moet een verhouding > 1 voor de UD en een verhouding ≤ 1 voor het verteerd monster opleveren als de Cla I-vergisting efficiënt is.
Na paired-end sequencing werden de FASTQ-bestanden (Tabel 1) verwerkt met HiCPro28 en de gegenereerde statistieken uitgezet met MultiQC28. Een alternatief hulpmiddel voor HiCPro is de HiCUP30-pijplijn die vergelijkbare resultaten oplevert (niet weergegeven). Figuur 3 en tabel 2 tonen de gedetailleerde statistische informatie van de gesequentieerde leesvoeren. Volledige leesuitlijning en uitlijning na het trimmen worden gerapporteerd. Deze twee categorieën komen overeen met met succes uitgelijnde lees lezen die in de daaropvolgende analyse worden gebruikt om geldige hi-c-paren te vinden. De categorie uitlijning na trimmen verwijst naar aflezingen die de ligatieverbinding overspannen, die in de eerste stap niet waren uitgelijnd en op de ligatieplaats zijn bijgesneden om vervolgens hun 5'-extremiteit opnieuw uit te lijnen op het genoom28 (figuur 3B, C en tabel 2). De contactstatistieken tonen aan dat de Hi-C-bibliotheek van hoge kwaliteit was met 82,2% geldige paren en 7,6% niet-nuttige leesbare leescategorieën die in dezelfde-fragment zelfcirkel, hetzelfde-fragment bungelende uiteinden, re-ligatie, gefilterde paren en gedumpte parencategorieën vielen (figuur 3A, figuur 3Den tabel 2). Bovendien is het aantal PCR-duplicaten zeer laag, wat aangeeft dat de complexiteit van de bibliotheek hoog is en dat de PCR-cycli minimale artefacten introduceerden (figuur 3E en tabel 2).
Met behulp van de unieke geldige Hi-C-paren werd de basisanalyse van de paarverdeling uitgevoerd met HiCPro27. Dit experiment leverde 46,5% unieke cis-contacten op ≤ 20 kbp, 47,1% unieke cis-contacten > 20 kbp en 5,8% unieke transcontacten (figuur 3D). De verdeling van cis naar trans geldige paren beantwoordde met de verwachte resultaten voor een succesvol Hi-C experiment met de meeste interacties gedetecteerd binnen hetzelfde chromosoom. Een groot deel van de transcontacten duidt op inefficiënte fixatie. Met behulp van de Hi-C geldige paren van HiCPro27werden matrices genormaliseerd door iteratieve correctie en eigenvector decompositie (ICE)30, en 1 kb en 5 kb resolutie matrices werden gegenereerd met behulp van HiCPlotter30,31,32. Genormaliseerde contactmatrices met een resolutie van 1 kb en 5 kb worden gepresenteerd voor de Notch-gen locus in Drosophila (figuur 4A, figuur 4Cen figuur 4D). In figuur 4Ais de Notch-gen locus te zien, samen met de AP's, domein l en II, evenals histonmodificaties langs de locus (figuur 4A en tabel 1). Het ontwerp van de CRISPR-Cas9-deletie betrof het motief van CTCF en M1BP (figuur 4B).
Bij verwijdering van het gebied dat zowel CTCF- als M1BP DNA-bindingsplaatsen bevat op de 5'-grens van de Notch-locus (5pN-delta343, tabel 1), kan een dramatische verandering in chromatinecontacten worden waargenomen met verlies van interacties in de Notch-locus en toename van contacten met de upstream TAD in vergelijking met het wilde type (WT) (Figuur 4C, D). Ten slotte toont figuur 4E een gedetailleerd panorama van WT- en mutante interactieprofielen op het beperkingsfragmentniveau van het Notch-gen 5' UTR, met een afname van het aandeel contacten met de Notch-gen locus en een toename van contacten met het upstream-domein. De virtuele 4C-weergaven van het Notch-gen 5' UTR werden verkregen met Behulp van HiC-Pro27. Een alternatieve tool is de Hi-C other-ends quantification beschikbaar in SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Alle resultaten in figuur 4 werden verkregen door toepassing van het hi-C-protocol in de kern in WT- en mutante S2R+ Drosophila-cellen, zoals beschreven door Arzate-Mejía et al.25.
Figuur 1: Hi-C-vergistings- en ligatieregelaars in de kern. (A) Hi-C protocoloverzicht. Cellen zijn gekruist met formaldehyde, wat resulteert in covalente verbindingen tussen chromatinesegmenten (DNA-fragmenten: roze, paars) en eiwitten. Chromatine wordt verteerd met een restrictie-enzym (vertegenwoordigd door een schaar), in dit voorbeeld Mbo I. De resulterende kleverige uiteinden worden gevuld met nucleotiden, waaronder een biotinylated dATP (Donkerblauwe cirkels). DNA wordt gezuiverd en de biotinylated verbindingen worden verrijkt met streptavidin-gecoate magnetische kralen (grijze cirkels). Interacterende fragmenten worden geïdentificeerd door next-generation, paired-end sequencing. (B) Hi-C digestie- en ligatiekwaliteitscontroles voor twee biologische duplo's (Hi-C 1 en Hi-C 2). Hi-C bibliotheken werden opgelost op een 1,5% agarose gel. Beide verteerd, D, bibliotheken lopen als een uitstrijkje rond 600 bp. Ligated monsters, Lig, lopen als een vrij strakke band groter dan 10 kb vergelijkbaar met de onverteerd UD monsters. De verschillen in signaalsterkte zijn te wijten aan ongelijke hoeveelheden geladen DNA op de gel. (C) Kwantitatieve controle van de hi-C-vergisting door kwantitatieve polymerasekettingreactie voor dezelfde twee biologische duplo's als in (B) (Hi-C 1 en Hi-C 2) met behulp van de cyclusdrempelwaarden zoals beschreven in het protocol. Een succesvolle spijsvertering heeft ≥ beperking van 80%. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: In-nucleus Hi-C fill-in en blunt-end ligatie controles. (A) Fill-in en biotine labeling assessment. Een bekende interactie tussen fragmenten die zich 300 kb uit elkaar in chromosoom X bevonden, werd gebruikt als een controle en versterkt met behulp van de primers aangegeven met zwarte pijlen (zie bovenaan het schema in (B), primer 1 (links), primer 2 (rechts), tabel 1), waardoor een amplicon van 347 bp werd gegenereerd. Hi-C ligatieproducten kunnen worden onderscheiden van die geproduceerd in een 3C-experiment door de spijsvertering van de ligatieplaats. Hi-C-verbindingen werden verteerd door Cla I op de oorspronkelijke Mbo I-site, omdat dit zich vormde bij botte ligatie. Hi-C en 3C-verbindingen werden verteerd met Mbo I omdat de beperkingsplaats regenereert bij ligatie (links van de gel). 3C-verbindingen daarentegen werden niet verteerd door Cla I op de Mbo I-site, maar alleen door Mbo I. Vergelijk het spijsverteringsprofiel van de Hi-C- en 3C-producten met Cla I. Een fragment van 53 bp werd verkregen door het verteren van het Hi-C-product (vanwege beperking van de Cla I-site gevormd op de Mbo I-site en beperking van een Cla I-site die al in de regio aanwezig was). Dit fragment werd niet waargenomen in de 3C-productvertering, omdat de enige Cla I-site die beschikbaar was, degene was die al in de regio aanwezig was. (B) Na PCR versterking van de Hi-C bibliotheek met behulp van verschillende PCR cycli, de producten werden uitgevoerd op een 1,5% agarose gel. Een uitstrijkje van 400-1000 bp werd verwacht en waargenomen. De juiste getalcycli voor de uiteindelijke versterking PCR moeten worden beschouwd als het getal dat onmiddellijk lager is dan het getal waarbij een uitstrijkje net zichtbaar is. (C) Laatste bibliotheek Cla I spijsvertering. Een aliquot van de definitieve bibliotheek werd opnieuw versterkt en verteerd met Cla I. De groottevermindering van het uitstrijkje bevestigde dat een groot deel van de moleculen in de bibliotheek geldige Hi-C-paren waren. Densitometrische analyse van deze gel kan worden uitgevoerd om een verhouding tussen de VN- en D-monsters te verkrijgen, zoals beschreven in de sectie representatieve resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: HiC-Pro statistieken van de Hi-C bibliotheek. (A) Schematische weergave van geldige Hi-C paren en de verschillende soorten niet-geldige paren die tijdens het experiment geproduceerd en gefilterd kunnen worden door HiCPro27 (Tabel 2). Deze omvatten leessels die in aaneengesloten sequenties vallen, bungelende uiteinden, zelfde-fragment, zelfcirkel, re-ligations en PCR duplicaten. (B) Het in kaart brengen van statistieken. Lees gelezen die niet kunnen worden uitgelijnd, worden weergegeven (grijs) en zowel volledig uitgelijnde lees- als lees leeslijnen die na het bijsnijden zijn uitgelijnd, worden respectievelijk blauw en lichtblauw weergegeven. Deze twee categorieën vertegenwoordigen de nuttige leesvoeren die in latere analyses in aanmerking worden genomen. (C) Koppelingsstatistieken. Multi-uitgelijnde lees bewerkingen (donker oranje) vertegenwoordigen lees bewerkingen die zijn uitgelijnd in meerdere gebieden in het genoom. Uniek uitgelijnde (donkerblauwe) leesparen vertegenwoordigen de leesparen die eenmaal in het genoom zijn uitgelijnd, en singletons (lichtoranje) vertegenwoordigen leesparen waarin slechts één genomisch gebied in beide leesparen is gesequentieerd. (D) Filterstatistieken. Geldige leesparen (blauw) vertegenwoordigen succesvolle Hi-C ligatieproducten zoals beschreven in (A). Zelffragment zelfcirkels (lichtroze) zijn niet-nuttige leesvoeren omdat ze hetzelfde genomische fragment vertegenwoordigen dat wordt weergegeven in (A). Zelfde-fragment bungelende uiteinden (oranje) vertegenwoordigen leest waarin één enkel beperkingsfragment werd gesequenced. Gefilterde en gedumpte paren (bruin) zijn ook niet-nuttige leesvoeren die de verkeerde grootte hebben of waarvoor het ligatieproduct niet kon worden gereconstrueerd. Ten slotte vertegenwoordigen re-ligation reads (rood) reads waarin twee aangrenzende fragmenten opnieuw werden geligeerd, waardoor niet-nuttige informatie werd verkregen. (E) Geldige leesparen contactverdeling in het genoom. Unieke cis-contacten (blauw) komen vaker voor dan unieke transcontacten (groen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Hi-C contactmatrices en virtuele 4C analyse van WT en mutante S2R+ cellen. (A) Hi-C genormaliseerde heatmap van een 50 kb regio bij 1-kb resolutie gecentreerd in de Notch gen locus. TAD-scheidingsscore32 voor de locus wordt weergegeven, samen met de verdeling van de Notch-locus in twee topologische domeinen (domein 1 en domein 2). ChIP-seq-gegevens voor AP's, RNA Pol II en histonen voor S2/S2R+ cellen34,35,36,37 worden onder de heatmap weergegeven ( Tabel1). De posities van de grenzen van notch domein 1 worden lichtgroen gemarkeerd. (B) Schematische weergave van B1 grens CRISPR mutant. De groene rechthoek geeft het verwijderde gebied van 343 bp aan. Schaar geeft sgRNAs aan die worden gebruikt voor CRISPR-gemedieerde genoombewerking. Motiefbindende sites voor AP's worden weergegeven als vakken voor CTCF en M1BP. Piektoppen voor DNA-bindende AP 's in (A) zijn eveneens aangegeven35. (C) Hi-C genormaliseerde heatmaps met een resolutie van 1 kb voor een gebied van 50 kb gecentreerd in Notch voor de WT en de mutante cellen. Links, Hi-C heatmaps van de log2 verschillen in interactiefrequentie tussen WT en mutante cellen. (D) Hi-C genormaliseerde heatmaps die een 250 kb regio beslaan gecentreerd in Notch met een resolutie van 5 kb voor WT en mutante cellen. Links, Hi-C heatmaps van de log2 verschillen in interactiefrequentie tussen WT en mutante cellen. (E) Virtual-4C voor WT- en mutantcellen met de 5' UTR van Notch als gezichtspunt. De percentages interacties tussen het gezichtspunt en de regio's binnen het upstream kirredomain-2, Notch domain 1, Notch domain 2 en het downstream dnc domein voor zowel WT als mutant cellen worden weergegeven25. Afkortingen: WT = wild type; TAD = topologisch geassocieerd domein; ChIP = chromatine immunoprecipitatie; AP = architectonisch eiwit; RNA Pol = RNA-polymerase; S2R+ = S2 receptor plus; sg RNA = RNA met één gids; UTR = onvertaald gebied. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Experiment | Monster | GEO-toetredingsnummer |
| Bikken | CP190 | GSM1015404 |
| Bikken | SuHW | GSM1015406 |
| Bikken | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Bikken | CTCF | GSM1015410 |
| Bikken | Ibf1 | GSM1133264 |
| Bikken | Ibf2 | GSM1133265 |
| Bikken | BEAF32 | GSM1278639 |
| Bikken | Pita | GSM1313420 |
| Bikken | ZIPIC | GSM1313421 |
| Bikken | RNA PolII | GSM2259975 |
| Bikken | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Bikken | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Bikken | H3K27ac | GSM2259987 |
| Bikken | MSL2 | GSM2469507 |
| Bikken | H4K16ac | GSM2469508 |
| Bikken | M1BP | GSM2706055 |
| Bikken | GAF | GSM2860390 |
| Bikken | Invoer | GSM1015412 |
| Hallo-C | S2R+ WT-cellen | GSE136137 |
| Hallo-C | S2R+ 5pN-delta343 cellen | GSE136137 |
Tabel 1: GEO-toetredingsnummers.
| HiC-Pro statistieken | Leest | Percentage |
| Statistieken in kaart brengen | ||
| Volledige leesuitlijningen | 131515921 | 82.20% |
| Bijgesneden leesuitlijningen | 16408309 | 10.30% |
| Kan niet worden uitgelijnd | 12110964 | 7.60% |
| Koppelingsstatistieken | ||
| Uniek uitgelijnd | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Multi uitgelijnd | 57700021 | 36.90% |
| Filterstatistieken | ||
| Geldige paren | 71373989 | 90.12% |
| Zelfde-Fragment: Zelfcirkel | 2340697 | 2.90% |
| Zelfde-Fragment: Bungelende Einden | 2578783 | 3.20% |
| Gefilterde paren | 2773043 | 3.50% |
| Gedumpte paren | 196565 | 0.20% |
| Contact statistieken | ||
| Uniek: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Uniek: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Uniek: trans | 4133602 | 5.80% |
| Dubbele leesparen | 398400 | 0.60% |
Tabel 2: HiC-Pro statistieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde hi-c-methode in de kern heeft een gedetailleerde verkenning van de drosophila-genoomtopologie met hoge resolutie mogelijk gemaakt, waardoor een beeld werd verkregen van genomische interacties op verschillende genomische schalen, van chromatinelussen tussen regulerende elementen zoals promotors en versterkers tot TAD's en identificatie van grotecompartimenten 25. Dezelfde technologie is ook efficiënt toegepast op weefsels van zoogdieren met enkele wijzigingen33. Bij het verwerken van een weefsel in plaats van een eencellige suspensie wordt het weefsel bijvoorbeeld gezeefd door een filter van 70 μm en wordt de lysisstap uitgevoerd terwijl het materiaal wordt gehomogeniseerd met behulp van een Dounce-homogenisator. Bovendien, aangezien het genoom van zoogdieren 25x groter is dan het Drosophila-genoom, is het aantal geldige leesparen dat nodig is om matrices met een resolutie van 1-5 kb te bouwen groter. De hi-c-methode in de kern verschilt van de oorspronkelijke Hi-C-methode2 in het vermijden van kernlyse met 1% SDS bij 65 °C vóór ligatie, waardoor de nucleaire integriteit behouden blijft, en door ligatie in 1 ml in plaats van 7 ml23,24.
Het protocol heeft een aantal belangrijke stappen om een hoog rendement te garanderen. De eerste stap die de spijsvertering en inefficiënties kan introduceren, is de vorming van klonten tijdens 0,3% SDS-permeabilisatie en oppervlakteactieve behandelingen. Als de klonten groot zijn en moeilijk te verstoren, moet de draaisnelheid worden verlaagd tot 400 tpm tijdens SDS- en oppervlakteactieve behandelingen. Als de klonten moeilijk te verdelen blijven door pipetten, moet het monster in tweeën worden gesplitst door de volumes met beperkingsbuffer, SDS en de niet-ionische oppervlakteactieve stof aan te passen voordat verder wordt gegaan met de permeabilisatie. Vervolgens moeten de kernen worden gecentrifugeerd met een minimumsnelheid (200 × g),het supernatant zorgvuldig worden weggegooid en de monsters worden samengevoegd in 450 μL 1x beperkingsbuffer voordat ze verder gaan met de spijsvertering. Ten tweede is de schatting van de spijsverteringsefficiëntie belangrijk om voldoende DNA-fragmenten te leveren voor invulling en ligatie. Als bij kwalitatieve beoordeling blijkt dat de spijsvertering inefficiënt is, moet een tweede ronde van de spijsvertering worden uitgevoerd met het restrictie-enzym gedurende een periode variërend van 4 uur tot 's nachts.
Ten derde is de schatting van de ligatie-efficiëntie belangrijk. Als bij kwalitatieve beoordeling wordt vastgesteld dat de ligatie inefficiënt is (d.w.z. in plaats van de band met een hoog molecuulgewicht wordt een uitstrijkje waargenomen dat vergelijkbaar is met dat van het verteerd monster), moet de ligatie worden herhaald door de kernen bij 200 × g te centrifugeren en ze in ligatiemix te resuspenderen met behulp van verse 10x ligatiebuffer en ligase. Ten vierde moet het percentage hi-c geldige producten worden geschat door een PCR-amplicon te verteren van een verwachte interactie met Cla I (voor de oorspronkelijke spijsvertering van Mbo I). De efficiënte versterking en vertering van het amplicon van de verwachte interactie bevestigt succesvolle ligatie en vorming van Hi-C-verbindingen. Als ampliconvertering niet efficiënt is, zal de meerderheid van de moleculen 3C zijn in plaats van Hi-C-producten, en hiermee moet rekening worden gehouden als de bibliotheek wordt gesequenced. Dit kan ook worden bevestigd door het uitvoeren van de definitieve bibliotheek Cla I spijsverteringscontrole, zoals beschreven in de sectie representatieve resultaten. Ten slotte is selectie van het lagere aantal PCR-cycli belangrijk om PCR-duplicaten te voorkomen. Als bij sequencing het percentage leespaarduplicaties hoog blijkt te zijn, moet het aantal PCR-cycli verder worden verminderd.
Deze hi-c-techniek in de kern heeft enkele beperkingen. Ten eerste vertegenwoordigt het hier beschreven protocol het Hi-C-experiment dat is uitgevoerd voor een celpopulatie. Daarom vertegenwoordigt het signaal van de frequentie van genomische contacten miljoenen genomen met variabele individuele conformaties. Om de set genomische contacten uit één genoom te verkrijgen, wordt een eencellig Hi-C-experiment22 aanbevolen. Ten tweede is Hi-C gebaseerd op de ligatie van proximale DNA-fragmenten. Dus als genomische gebieden deel uitmaken van een groot eiwit-chromatinecomplex, kan de afstand tussen fragmenten ligatie belemmeren. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat transcontacten slecht vertegenwoordigd zijn in Hi-C38. Bovendien eindigt Hi-C met gekoppelde sequencing, waardoor paren genomische contacten worden opgehaald. Verschillende DNA-fragmenten kunnen echter tegelijkertijd interageren in hetzelfde chromatinecomplex. Om de identiteit van meerdere DNA-fragmenten in een chromatinecomplex te verkrijgen, kunnen alternatieve sequencingmethoden worden toegepast op Hi-C39, of kunnen verschillende experimentele strategieën worden gebruikt waarbij ligatie niet wordt uitgevoerd38,40,41. Ten slotte, hoewel Hi-C genomische contacten meet, onthult het niet de identiteit van de eiwitten die de interacties bemiddelen. Er moeten alternatieve methoden worden toegepast om de genomische interacties te identificeren die worden gemedieerd door een bepaald eiwit van belang42 of de identiteit van het ensemble van eiwitten bij specifieke genomische elementen43.
Concluderend, met een hi-C-experiment van hoge kwaliteit zoals hier beschreven voor het Drosophila-genoom (tabel 2), kunnen matrices worden gebouwd met een breed scala aan resoluties (van 1, 5 kb, 50 kb of lager; zie figuur 4). Bovendien, als een bepaald gebied van het genoom moet worden geëvalueerd op het niveau van het beperkingsfragment, kunnen de gegevens worden gebruikt om een virtueel 4C-landschap van het gewenste gezichtspunt op te bouwen (bijvoorbeeld het Notch-gen 5' UTR in figuur 4E). De Hi-C other-ends tool in SeqMonk is een zeer gebruiksvriendelijke optie die de visualisatie van dit landschap mogelijk maakt. Het toepassen van de 4C kwantificeringstool, ook een onderdeel van SeqMonk, op dit landschap kan statistisch significante contacten opleveren.
Door het hier beschreven hi-C-experiment in de kern toe te passen op een verzameling mutante cellijnen met gewijzigde AP DNA-bindingsplaatsen aan de TAD-grenzen (figuur 4) bleek dat genetische elementen nodig zijn aan de grenzen om het Drosophila-genoom in domeinen te structureren en genexpressieregulatie te ondersteunen, zoals volledig besproken door Arzate-Mejía et al.25. Genetische bewerking van regulerende elementen met het CRISPR/Cas9-systeem, gecombineerd met een hoge resolutie profilering van genomische interacties met behulp van het hier beschreven hi-C-protocol in de kern, kan dus een krachtige strategie zijn om de structurele functie van genetische elementen te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) subsidienummer IN207319 en de Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) subsidienummer 303068. A.E.-L. is een masterstudent ondersteund door de CVA-nummer 968128 van de Science and Technology National Council (CONACyT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
