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Genetics

Hi-C dans le noyau dans les cellules de la drosophile

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/62106
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

Le génome est organisé dans l’espace nucléaire en différentes structures qui peuvent être révélées par les technologies de capture de conformation chromosomique. La méthode Hi-C dans le noyau fournit une collection à l’échelle du génome d’interactions de la chromatine dans les lignées cellulaires de la drosophile, qui génère des cartes de contact qui peuvent être explorées à la résolution de la mégabase au niveau du fragment de restriction.

Abstract

Le génome est organisé en domaines topologiquement associants (TAD) délimités par des limites qui isolent les interactions entre les domaines. Chez la drosophile, les mécanismes sous-jacents à la formation et aux limites du TAD sont encore à l’étude. L’application de la méthode Hi-C dans le noyau décrite ici a permis de disséquer la fonction des sites architecturaux de liaison aux protéines (AP) aux limites TAD isolant le gène Notch. La modification génétique des limites de domaine qui cause la perte de points d’accès entraîne la fusion tad, des défauts transcriptionnels et des altérations topologiques à longue portée. Ces résultats ont fourni des preuves démontrant la contribution des éléments génétiques à la formation des limites du domaine et au contrôle de l’expression génique chez la drosophile. Ici, la méthode Hi-C dans le noyau a été décrite en détail, ce qui fournit des points de contrôle importants pour évaluer la qualité de l’expérience avec le protocole. Sont également indiqués le nombre requis de lectures de séquençage et de paires Hi-C valides pour analyser les interactions génomiques à différentes échelles génomiques. L’édition génétique des éléments régulateurs médiée par CRISPR/Cas9 et le profilage à haute résolution des interactions génomiques à l’aide de ce protocole Hi-C dans le noyau pourraient être une combinaison puissante pour l’étude de la fonction structurelle des éléments génétiques.

Introduction

Chez les eucaryotes, le génome est divisé en chromosomes qui occupent des territoires spécifiques dans l’espace nucléaire pendant l’interphase1. La chromatine formant les chromosomes peut être divisée en deux états principaux: l’un de chromatine accessible qui est transcriptionnellement permissive, et l’autre de chromatine compacte qui est transcriptionnellement répressive. Ces états de chromatine se séparent et se mélangent rarement dans l’espace nucléaire, formant deux compartiments distincts dans le noyau2. À l’échelle des sous-mégabases, les limites séparent les domaines des interactions de la chromatine à haute fréquence, appelés TAM, qui marquent l’organisation chromosomique3,4,5. Chez les mammifères, les limites TAD sont occupées par la cohésine et le facteur de liaison CCCTC (CTCF)6,7,8. Le complexe de cohésine extrude la chromatine et s’arrête aux sites de liaison CTCF qui sont disposés dans une orientation convergente dans la séquence génomique pour former des boucles de chromatine stables9,10,13,14. La perturbation génétique du site de liaison à l’ADN CTCF aux limites ou la réduction de l’abondance des protéines CTCF et cohésine entraîne des interactions anormales entre les éléments régulateurs, une perte de formation de TAD et une dérégulation de l’expressiongénique 9,10,11,13,14.

Chez la drosophile, les limites entre les TAD sont occupées par plusieurs AP, y compris le facteur 32 kDa associé aux éléments limites (BEAF-32), la protéine de liaison motif 1 (M1BP), la protéine centrosomale 190 (CP190), le suppresseur d’aile velue (SuHW) et le CTCF, et sont enrichis en modifications actives des histones et en polymérase II16,17,18. Il a été suggéré que chez la drosophile, les TAD apparaissent à la suite de la transcription13 , 17,19, et le rôle exact des PO indépendants dans la formation des limites et les propriétés d’isolation est encore à l’étude. Ainsi, il reste à déterminer si les domaines de la drosophile sont la seule conséquence de l’agrégation de régions d’états transcriptionnels similaires ou si les AP, y compris le CTCF, contribuent à la formation des limites. L’exploration des contacts génomiques à haute résolution a été possible grâce au développement de technologies de capture de conformation chromosomique couplées à un séquençage de nouvelle génération. Le protocole Hi-C a été décrit pour la première fois avec l’étape de ligature effectuée « en solution »2 dans le but d’éviter les produits de ligature fallacieux entre les fragments de chromatine. Cependant, plusieurs études ont montré que le signal utile dans les données provenait de produits de ligature formés à des noyaux partiellement lysés qui n’étaient pas en solution20,21.

Le protocole a ensuite été modifié pour effectuer la ligature à l’intérieur du noyau dans le cadre de l’expérience Hi-C unicellulaire22. Le protocole Hi-C dans le noyau a ensuite été incorporé dans la population cellulaire Hi-C pour produire une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances génomiques et produire des données avec moins de bruit technique23,24. Le protocole, décrit en détail ici, est basé sur le protocole Hi-C de population dans le noyau23,24 et a été utilisé pour étudier les conséquences de l’élimination génétique des motifs de liaison à l’ADN pour CTCF et M1BP d’une limite de domaine au locus du gène Notch chez Drosophila25. Les résultats montrent que la modification des motifs de liaison à l’ADN pour les AP à la limite a des conséquences drastiques sur la formation du domaine Notch, des défauts topologiques plus importants dans les régions entourant le locus Notch et une dérégulation de l’expression génique. Cela indique que les éléments génétiques aux limites du domaine sont importants pour le maintien de la topologie du génome et de l’expression des gènes chez Drosophila25.

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Protocol

1. Fixation

  1. Commencez avec 10 millions de cellules de la ligne 2 plus (S2R+) de Schneider pour préparer 17,5 mL d’une suspension cellulaire en milieu Schneider contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à température ambiante (RT).
  2. Ajouter le formaldéhyde sans méthanol pour obtenir une concentration finale de 2 %. Mélanger et incuber pendant 10 min à TA, en prenant soin de mélanger chaque minute.
    REMARQUE: Le formaldéhyde est un produit chimique dangereux. Respectez les règles de santé et de sécurité appropriées et travaillez dans la hotte.
  3. Éteindre la réaction en ajoutant de la glycine pour obtenir une concentration finale de 0,125 M et mélanger. Incuber pendant 5 min à TA, suivi de 15 min sur glace.
  4. Centrifuger pendant 400 × g à RT pendant 5 min puis pendant 10 min à 4 °C ; jeter le surnageant. Resuspendez soigneusement la pastille dans 25 mL de solution saline froide 1x tamponnée au phosphate.
  5. Centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C, puis jeter le surnageant.
    REMARQUE: Si vous continuez avec le protocole, passez à l’étape 2.1 pour la lyse; sinon, congeler la pastille dans un liquideN2 et la conserver à -80 °C.

2. Lyse

  1. Resuspendez les cellules dans 1 mL de tampon de lyse glacé (10 mM de Tris-HCl, pH 8 ; 0,2 % de tensioactif non ionique (voir la Table des matériaux); 10 mM de NaCl ; 1x inhibiteurs de protéase), et ajustez le volume à 10 mL avec un tampon de lyse glacé. Régler le volume pour obtenir une concentration de 1 × 106 cellules/mL. Incuber sur de la glace pendant 30 min, en mélangeant toutes les 2 min en inversant les tubes.
  2. Centrifuger les noyaux à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, puis jeter soigneusement le surnageant. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de tampon de lyse à froid et transférez-la dans un tube de microcentrifugation. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de tampon de restriction froid de 1,25x et ressuspendez chaque pastille de cellule dans 360 μL de tampon de restriction 1,25x.
  3. Ajouter 11 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % par tube (concentration finale de 0,3 %), mélanger soigneusement par pipetage et incuber à 37 °C pendant 45 min, en agitant à 700-950 tr/min. Pipet de haut en bas pour perturber les touffes plusieurs fois pendant l’incubation.
  4. Trempez la FDS en ajoutant 75 μL de tensioactif non ionique (solution à 10 %, voir le tableau des matériaux)par tube (concentration finale de 1,6 %), puis incubez à 37 °C pendant 45 min, en agitant à 950 tr/min. Pipet de haut en bas plusieurs fois pour perturber les touffes pendant l’incubation.
    REMARQUE: Si les amas sont gros et difficiles à perturber, diminuez la vitesse de rotation à 400 tr / min pendant les traitements SDS et tensioactifs. Si les amas sont difficiles à désagréger par pipetage, divisez l’échantillon en deux; ajuster les volumes du tampon de restriction, de la FDS et du tensioactif; et procéder à la perméabilisation. Ensuite, faites tourner les noyaux à une vitesse minimale (200 × g),jetez soigneusement le surnageant, mettez les échantillons ensemble dans un tampon de restriction 1X et procédez à la digestion. Prendre une aliquote de 10 μL comme échantillon non digéré (UD).

3. Digestion enzymatique

  1. Digérer la chromatine en ajoutant 200 unités (U) de Mbo I par tube, et incuber à 37 °C pendant une période allant de 4 h à la nuit en rotation (950 tr/min).
  2. Le lendemain, ajoutez 50 U de Mbo I supplémentaires par tube et incubez à 37 °C pendant 2 h en tournant (950 tr/min).
  3. Inactiver l’enzyme en incubant les tubes à 60 °C pendant 20 min. Placez les tubes sur de la glace.
    REMARQUE : Prendre une aliquote de 10 μL comme échantillon digéré (D).

4. Biotinylation des extrémités de l’ADN

  1. Pour remplir les surplombs de fragments de restriction et étiqueter les extrémités de l’ADN avec de la biotine, ajoutez 1,5 μL chacun de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0,4 mM de biotine dATP, 17,5 μL de tampon Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0], et 10 μL de 5 U/μL de Klenow (gros fragment d’ADN polymérase I) à tous les tubes. Mélanger soigneusement et incuber pendant 75 min à 37 °C. Agiter à 700 tr/min toutes les 10 s pendant 30 s. Placez tous les tubes sur de la glace pendant la préparation du mélange de ligature.

5. Ligature

  1. Transférer chaque mélange de chromatine digéré dans un tube séparé de 1 mL avec mélange de ligature (100 μL de tampon de ligature 10x, 10 μL d’albumine sérique bovine de 10 mg/mL, 15 U d’ADN ligase T4 et 425 μL d’eau double distillée [ddH2O]). Bien mélanger par pipetage doux et incuber toute la nuit à 16 °C.

6. Inversion de la réticulation et purification de l’ADN

  1. Dégrader les protéines en ajoutant 50 μL de 10 mg/mL de protéinase K par tube, et incuber à 37 °C pendant 2 h. Inverser les réticulations en augmentant la température à 65 °C et incuber pendant la nuit.
  2. Dégrader l’ARN en ajoutant 20 μL de 10 mg/mL de RNase A, et incuber à 37 °C pendant 1 h.
  3. Effectuer une extraction phénol:chloroforme suivie d’une précipitation d’éthanol.
    1. Ajouter 1 volume de phénol-chloroforme, et bien mélanger par inversion pour obtenir une phase blanche homogène.
      REMARQUE: Le phénol est un produit chimique dangereux. Respectez les règles de santé et de sécurité appropriées. Travailler dans la hotte.
    2. Centrifuger à 15 000 × g pendant 15 min. Transférer la phase aqueuse dans un tube de microcentrifugation frais de 2 mL. Effectuer une rétro-extraction de la couche inférieure avec 100 μL de tampon TLE et transférer la phase aqueuse dans le même tube de 2 mL.
    3. Précipiter l’ADN en ajoutant 2 volumes d’alcool éthylique à 100 % (EtOH), 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M et 2 μL de glycogène 20 mg/mL. Incuber à -20 °C pendant une période allant de 2 h à toute la nuit.
    4. Tourner à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C, et laver les granulés 2x avec de l’EtOH glacé à 70 %. Sécher les granulés à RT et les mettre en service dans 100 μL de tampon TLE. Quantifier l’ADN à l’aide d’un colorant fluorogénique qui se lie sélectivement à l’ADN et d’un fluoromètre selon les instructions du fabricant (Table des matériaux).
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les produits de ligature à 4 °C à court terme ou à -20 °C à long terme. Utilisez une aliquote (100 ng) du matériau comme échantillon ligaturé (L) pour le contrôle de la qualité.

7. Évaluez la qualité du modèle Hi-C

  1. Contrôles qualitatifs de la digestion et de la ligature
    1. Purifier l’ADN des aliquotes UD et D en inversant les réticulations et effectuer l’extraction phénol:chloroforme et la précipitation de l’éthanol comme décrit ci-dessus.
    2. Chargez 100 ng d’échantillons UD, D et L dans un gel d’agarose à 1,5%. Recherchez un frottis centré autour de 500 pb dans l’échantillon D par rapport à une bande de poids moléculaire élevé pour l’échantillon L (voir les résultats représentatifs).
  2. Contrôle quantitatif de l’efficacité de la digestion
    REMARQUE: Pour évaluer l’efficacité de la digestion avec plus de précision, utilisez les échantillons UD et D comme modèles pour effectuer des réactions en chaîne quantitatives par polymérase (qPCR) à l’aide d’amorces conçues comme suit.
    1. Concevoir une paire d’amorces qui amplifie un fragment d’ADN contenant le site de restriction de l’ADN pour l’enzyme utilisée pour la digestion (Mbo I dans le présent protocole), appelée R dans la formule de l’étape 7.2.3.
    2. Concevoir une paire d’amorces qui amplifie un fragment d’ADN témoin qui ne contient pas le site de restriction de l’enzyme utilisée pour la digestion (Mbo I pour le présent protocole), appelé C dans la formule de l’étape 7.2.3.
    3. Utilisez les valeurs seuils de cycle (valeurs Ct) de l’amplification pour calculer l’efficacité de restriction selon la formule ci-dessous :
      % Restriction = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Où CtR fait référence à la valeur Ct du fragment R, et CtC se réfère à la valeur Ct du fragment C pour l’échantillon D et l’échantillon UD.
      REMARQUE: Le pourcentage de restriction reflète l’efficacité de l’enzyme de restriction clivant le fragment d’ADN restreint (R) par rapport à un fragment d’ADN témoin (C) qui ne contient pas le site d’ADN de restriction. Une efficacité de restriction de ≥ 80% est recommandée.
  3. Détection des interactions connues
    1. Effectuer une PCR pour amplifier un contrôle de ligature interne afin d’examiner les interactions à courte portée et/ou à moyenne ou longue portée (voir les résultats représentatifs).
    2. Alternativement, concevez des amorces pour amplifier un produit de ligature dans lequel les amorces sont en orientation avant-avant ou arrière-arrière dans des fragments de restriction adjacents.
  4. Contrôle du remplissage et de l’étiquetage de la biotine
    1. Vérifier le marquage Hi-C et l’efficacité de la ligature par amplification et digestion d’une interaction connue ou d’un produit de ligature entre des fragments de restriction adjacents dans le génome, comme décrit ci-dessus.
      REMARQUE: Le remplissage et la ligature réussis du site Mbo I (GATC) génèrent un nouveau site pour l’enzyme de restriction Cla I (ATCGAT) à la jonction de ligature et régénèrent le site Mbo I.
    2. Digérez le produit PCR avec Mbo I, Cla I ou les deux. Après avoir exécuté les échantillons sur un gel de 1,5 à 2%, estimer le nombre relatif de jonctions de ligature 3C et Hi-C en quantifiant l’intensité des bandes coupées et non coupées26.
      NOTE: Une efficacité de > 70% est souhaitée (voir les résultats représentatifs).

8. Sonication

  1. Soniquer les échantillons pour obtenir des fragments d’ADN de 200 à 500 bp. Pour l’instrument utilisé dans ce protocole (voir le Tableau des matériaux),diluer l’échantillon (de 5 à 10 μg) dans 130 μL de ddH2O par tube, et régler l’instrument sur soniquer à 400 pb : niveau de remplissage : 10 ; facteur de droit: 10%; puissance incidente de crête (w) : 140; cycles par rafale: 200; temps(s): 80.

9. Élimination de la biotine / réparation finale

REMARQUE: Les étapes ci-dessous sont ajustées pour 5 μg d’ADN Hi-C.

  1. Pour éliminer la biotine, transférer l’échantillon (130 μL) dans un tube de microcentrifugation frais. Ajouter 16 μL de tampon de ligature 10x, 2 μL de 10 mM dATP, 5 μL d’ADN polymérase T4 (15U) et 7 μL de ddH2O (160 μL de volume total). Incuber à 20 °C pendant 30 min.
  2. Ajouter 5 μL de dNTP de 10 mM, 4 μL de tampon de ligature 10x, 5 μL de polynucléotide kinase T4 (10 U/μL), 1 μL de Klenow et 25 μL de ddH2O (200 μL de volume total). Incuber à 20 °C pendant 30 min.

10. Sélection de la taille

  1. Pour sélectionner des fragments principalement dans la plage de taille 250-550 bp, effectuez d’abord la sélection séquentielle de la taille d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) avec 0,6x, suivie de 0,90x selon les instructions du fabricant, et éluez l’ADN en utilisant 100 μL de TLE.

11. Biotine pulldown / A-tailing / ligature de l’adaptateur

REMARQUE: Effectuez les lavages en resusmettant les billes magnétiques par vortex, faites pivoter les échantillons pendant 3 minutes sur une roue rotative, puis faites tourner brièvement l’échantillon et placez-le sur le support magnétique. Laissez les perles coller à l’aimant, jetez le surnageant et passez à l’étape de lavage suivante. Effectuez les lavages à 55 °C sur un thermob bloc avec rotation au lieu de la roue rotative.

  1. Augmentez le volume final à 300 μL par échantillon avec TLE pour le pull-down. Préparez les tampons de lavage des billes : 1x tampon d’interpolation (TB) (TB : 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05 % Tween), 0,5x TB, 1x tampon No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Utilisez 150 μL de billes magnétiques liées à la streptavidine (voir la Table des matériaux)par bibliothèque. Lavez les perles 2x avec 400 μL de 1x TB. Ensuite, resuspendez les billes dans 300 μL 2x NTB.
  3. Mélanger les billes avec le matériau Hi-C de 300 μL et incuber à RT pendant 30 minutes sur une roue rotative pour permettre à la biotine de se lier aux billes de streptavidine.
  4. Lavez les billes avec 400 μL de 0,5 t.c. et coubez à 55 °C pendant 3 min, en tournant à 750 tr/min. Lavez les billes dans 200 μL de tampon de restriction 1x.
  5. Resuspendez les billes dans 100 μL de mélange de résidus dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampon de restriction 10x, 5 μL d’exo- Klenow et 80 μL de ddH2O). Incuber à 37 °C pendant 30 min.
  6. Retirez le surnageant, lavez les billes 2x avec 400 μL de 0,5x To en incubant à 55 °C pendant 3 min et en tournant à 750 tr/min.
  7. Lavez les billes avec 400 μL de 1x NTB puis avec 100 μL de 1x tampon de ligature.
  8. Resuspendez les billes dans 50 μL de tampon de ligature 1x et transférez la suspension dans un nouveau tube. Ajouter 4 μL d’adaptateurs PE pré-recuits (15 μM de stock) et 2 μL de ligase T4 (400 U/μL, soit 800 U/tube); incuber à RT pendant 2 h.
    REMARQUE: Pré-recuit les adaptateurs en ajoutant des volumes égaux d’adaptateurs PE 1.0 et PE 2.0 (stock de 30 μM) et en incubant pendant 10 minutes à RT (voir le tableau des matériaux).
  9. Recapturez les perles en retirant le surnageant et en lavant les perles 2x avec 400 μL de TB. Lavez les billes avec 200 μL de 1x NTB, puis avec 100 μL de tampon de restriction 1x, et resuspendez les billes dans 40 μL de 1x tampon de restriction.

12. Amplification PCR

  1. Configurez des PCR de 25 μL de volume avec 5, 6, 7 et 8 cycles. Pour chaque PCR, utilisez :
    Recette de réaction
    Perles Hi-C 2,5 μL
    Amorce PCR PE 10 μM (Table des matériaux) 0,75 μL
    Amorce PCR PE 10 μM 2 (Table des matériaux) 0,75 μL
    10 mM dNTP 0,6 μL
    5x tampon de réaction 5 μL
    ADN polymérase 0,3 μL
    ddH2O 14,65 μL
    Total 25 μL
    Cycles Température Heure
    1 98 °C 30 s
    n cycles 98 °C 10 s
    65 °C 30 s
    72 °C 30 s
    1 72 °C 7 min

13. Amplification PCR finale

  1. Effectuez l’amplification PCR finale en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus et le nombre de cycles sélectionnés. Divisez l’échantillon en utilisant 5 μL de billes Hi-C comme modèle dans des réactions de 50 μL.
  2. Recueillir toutes les réactions de PCR et les transférer dans un tube frais. Utilisez l’aimant pour retirer les billes de streptavidine et récupérer le surnageant (produits PCR). Transférer les billes dans un tube frais, laver les perles comme indiqué à l’étape 11.2.9 et les stocker dans un tampon de restriction 1x à 4 °C en guise de sauvegarde.
  3. Purifier les produits PCR en utilisant 0,85x le volume des billes SPRI selon les instructions du fabricant. Éluez avec 30 μL de tampon TLE.
  4. Quantifier la bibliothèque Hi-C à l’aide d’un instrument fluorométrique et confirmer la qualité de la bibliothèque par électrophorèse capillaire sur puce.
  5. Comme dernier point de contrôle de qualité, utilisez 1 μL de la bibliothèque Hi-C comme modèle pour effectuer une réaction PCR en utilisant 10 cycles en utilisant les mêmes conditions décrites à l’étape 12.1. Divisez le produit PCR en deux tubes de microcentrifugation : digérez l’un avec Cla I et laissez l’autre non digéré comme témoin. Exécutez les produits dans un gel d’agarose à 1,5-2% (voir les résultats représentatifs).
  6. Passez au séquençage par paires de 50 pb ou 75 pb sur une plate-forme de séquençage appropriée.

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Representative Results

Vous trouverez ci-dessous les résultats d’un protocole Hi-C réussi (voir un résumé du flux de travail du protocole Hi-C à la Figure 1A). Il existe plusieurs points de contrôle de la qualité pendant l’expérience Hi-C dans le noyau. Les aliquotes de l’échantillon ont été prélevées avant (UD) et après (D) l’étape de restriction de la chromatine ainsi qu’après la ligature (L). Les réticulations ont été inversées et l’ADN a été purifié et exécuté sur un gel d’agarose. Un frottis de 200-1000 bp a été observé lorsque la restriction avec Mbo I a réussi (Figure 1B). La taille attendue de la molécule dépend de l’enzyme de restriction de choix. Si la ligature a réussi, une bande de poids moléculaire élevé a été observée au sommet du gel(Figure 1B). L’efficacité de la digestion peut également être confirmée par qPCR comme décrit en détail dans le protocole. Une efficacité de digestion acceptable est de 80 % ou plus(Figure 1C).

Pour évaluer en détail l’efficacité de la ligature Hi-C, les amorces peuvent être conçues pour amplifier un contrôle interne du produit de ligature dans lequel les amorces sont en orientation avant-avant ou arrière-arrière dans des fragments de restriction adjacents. Alternativement, les amorces peuvent être conçues pour amplifier les interactions connues. La figure 2A montre l’amplification d’une interaction connue à moyenne distance (300 kb) chez Drosophila25. Les produits de ligature Hi-C (dans lesquels le marquage, le remplissage et la ligature de la biotine se sont produits avec succès) peuvent être estimés par digestion du produit PCR récupéré dans l’amplification. Après remplissage et ligature, les amplicons Hi-C contiendront un nouveau site de restriction Cla I sur le site Mbo I d’origine, qui est préservé lors de la ligature émoussée. Si la restriction avec Cla I n’est pas complète, la réaction de remplissage et le marquage de la biotine seront inefficaces. Une efficacité de digestion de plus de 70% est recommandée pour éviter d’avoir une grande proportion de lectures inutiles pour les bibliothèques après le séquençage(Figure 2A,comparez la digestion Cla I du 3C par rapport au modèle Hi-C).

Pour déterminer un nombre adéquat de cycles d’amplification PAR PCR pour amplifier la bibliothèque Hi-C finale, des réactions pcR ont été mises en place en utilisant 2,5 μL d’une bibliothèque donnée sur des billes, comme décrit dans le protocole. Le nombre de cycles de PCR pour l’amplification finale est inférieur d’un cycle au nombre de cycles pour lesquels le frottis est visible (Figure 2B). Dans ce cas, 4 cycles d’amplification PCR ont été choisis. Comme point de contrôle de qualité final, une aliquote de la bibliothèque Hi-C a été ré-amplifiée et digérée avec Cla I. Le niveau de digestion de la bibliothèque (diminution de la taille du frottis) indique l’abondance de paires Hi-C valides et reflète la proportion de lectures utiles qui seront obtenues à partir de la bibliothèque (Figure 2C). Un rapport entre la plage de taille supérieure (déterminée par la taille présente dans l’échantillon UD) et la plage de taille inférieure dans les échantillons UD et D devrait produire un rapport > 1 pour l’UD et un rapport ≤ 1 pour l’échantillon digéré si la digestion Cla I est efficace.

Après le séquençage par appariement, les fichiers FASTQ (Tableau 1) ont été traités à l’aide de HiCPro28 et les statistiques générées ont été tracées à l’aide de MultiQC28. Un outil alternatif à HiCPro est le pipeline HiCUP30 qui donne des résultats similaires (non montré). La figure 3 et le tableau 2 montrent les informations statistiques détaillées des lectures séquencées. L’alignement en lecture complète et l’alignement après le rognage sont signalés. Ces deux catégories correspondent à des lectures alignées avec succès qui seront utilisées dans une analyse ultérieure pour trouver des paires Hi-C valides. La catégorie alignement-après rognage fait référence aux lectures couvrant la jonction de ligature, qui n’ont pas été alignées dans la première étape et sont coupées au site de ligature pour ensuite réaligner leur extrémité 5' sur le génome28 (Figure 3B,C et Tableau 2). Les statistiques de contact montrent que la bibliothèque Hi-C était de haute qualité avec 82,2% de paires valides et 7,6% de lectures non utiles tombant dans les catégories auto-cercle de même fragment, même fragment d’extrémités pendantes, re-ligature, paires filtrées et paires dumped (Figure 3A, Figure 3Det Tableau 2). De plus, le nombre de doublons de PCR est très faible, ce qui indique que la complexité de la bibliothèque est élevée et que les cycles de PCR ont introduit un minimum d’artefacts(Figure 3E et Tableau 2).

En utilisant les paires Hi-C valides uniques, l’analyse de base de la distribution des paires a été effectuée à l’aide de HiCPro27. Cette expérience a permis de produire 46,5 % de contacts cis uniques ≤ 20 kbp, 47,1 % de contacts cis uniques > 20 kbp et 5,8 % de contacts trans uniques(Figure 3D). La distribution des paires valides cis à trans correspondait aux résultats attendus pour une expérience Hi-C réussie avec la plupart des interactions détectées au sein du même chromosome. Une forte proportion de contacts trans indique une fixation inefficace. En utilisant les paires valides Hi-C de HiCPro27,les matrices ont été normalisées par correction itérative et décomposition du vecteur propre (ICE)30, et des matrices de résolution de 1 kb et 5 kb ont été générées à l’aide de HiCPlotter30,31,32. Des matrices de contact normalisées à une résolution de 1 kb et 5 kb sont présentées pour le locus du gène Notch chez la drosophile (Figure 4A, Figure 4Cet Figure 4D). Dans la figure 4A,le locus du gène Notch peut être vu avec les points d’accès, domaine l et II, ainsi que les modifications des histones le long du locus(figure 4A et tableau 1). La conception de la délétion CRISPR-Cas9 impliquait le motif de CTCF et M1BP(Figure 4B).

Lors de la suppression de la région contenant à la fois des sites de liaison à l’ADN CTCF et M1BP à la limite 5' du locus Notch (5pN-delta343, Tableau 1),un changement spectaculaire dans les contacts de chromatine peut être observé avec une perte d’interactions à l’intérieur du locus Notch et un gain de contacts avec le TAD en amont par rapport au type sauvage (WT)(Figure 4C,D). Enfin, la figure 4E montre un panorama détaillé des profils d’interaction WT et mutant au niveau du fragment de restriction du gène Notch 5' UTR, montrant une diminution de la proportion de contacts établis avec le locus du gène Notch et une augmentation des contacts avec le domaine amont. Les vues virtuelles 4C du gène Notch 5' UTR ont été obtenues à l’aide de HiC-Pro27. Un outil alternatif est la quantification Hi-C à d’autres extrémités disponible dans SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Tous les résultats présentés à la figure 4 ont été obtenus en appliquant le protocole Hi-C dans le noyau dans les cellules WT et mutantes S2R+ Drosophila, tel que décrit par Arzate-Mejía et al.25.

Figure 1
Figure 1: Contrôles de la digestion et de la ligature Hi-C dans le noyau. (A) Vue d’ensemble du protocole Hi-C. Les cellules sont réticulées avec le formaldéhyde, ce qui entraîne des liens covalents entre les segments de chromatine (fragments d’ADN: rose, violet) et les protéines. La chromatine est digérée avec une enzyme de restriction (représentée par des ciseaux), dans cet exemple, Mbo I. Les extrémités collantes résultantes sont remplies de nucléotides, y compris un dATP biotinylé (cernes bleu foncé). L’ADN est purifié et les jonctions biotinylées sont enrichies à l’aide de billes magnétiques recouvertes de streptavidine (cercles gris). Les fragments en interaction sont identifiés par séquençage d’extrémité appariée de nouvelle génération. (B) Contrôles de la qualité de la digestion et de la ligature Hi-C pour deux répliqués biologiques (Hi-C 1 et Hi-C 2). Les bibliothèques Hi-C ont été résolues sur un gel d’agarose à 1,5%. Les deux bibliothèques digérées, D, fonctionnent comme un frottis autour de 600 bp. Les échantillons ligaturés, Lig, fonctionnent comme une bande plutôt serrée de plus de 10 kb similaire aux échantillons UD non digérés. Les différences dans la force du signal sont dues à des quantités inégales d’ADN chargé sur le gel. (C) Contrôle quantitatif de la digestion Hi-C par réaction en chaîne quantitative par polymérase pour les deux mêmes répliqués biologiques que dans (B) (Hi-C 1 et Hi-C 2) en utilisant les valeurs seuils du cycle détaillées dans le protocole. Une digestion réussie a ≥ restriction de 80%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Contrôles de remplissage hi-C dans le noyau et de ligature émoussée. (A) Évaluation du remplissage et du label de la biotine. Une interaction connue entre des fragments situés à 300 kb de distance dans le chromosome X a été utilisée comme témoin et amplifiée à l’aide des amorces indiquées par des flèches noires (voir en haut du schéma dans (B), amorce 1 (à gauche), amorce 2 (à droite), tableau 1), générant un amplicon de 347 pb. Les produits de ligature Hi-C peuvent être distingués de ceux produits dans une expérience 3C par la digestion du site de ligature. Les jonctions Hi-C ont été digérées par Cla I sur le site original de Mbo I, car cela s’est formé lors d’une ligature émoussée. Les jonctions Hi-C et 3C ont été digérées avec Mbo I à mesure que le site de restriction se régénère lors de la ligature (à gauche du gel). En revanche, les jonctions 3C n’ont pas été digérées par Cla I sur le site de Mbo I, mais seulement par Mbo I. Comparez le profil de digestion des produits Hi-C et 3C en utilisant Cla I. Un fragment de 53 bp a été obtenu par digestion du produit Hi-C (en raison de la restriction du site Cla I formé sur le site Mbo I et de la restriction d’un site Cla I déjà présent dans la région). Ce fragment n’a pas été observé dans la digestion du produit 3C car le seul site Cla I disponible était celui qui était déjà présent dans la région. (B) Après amplification PCR de la bibliothèque Hi-C à l’aide de différents cycles de PCR, les produits ont été exécutés sur un gel d’agarose à 1,5%. Un frottis de 400-1000 pb était attendu et observé. Le nombre de cycles appropriés pour la PCR d’amplification finale doit être considéré comme le nombre immédiatement inférieur à celui auquel un frottis est juste visible. (C) Bibliothèque finale Cla I digestion. Une aliquote de la bibliothèque finale a été ré-amplifiée et digérée avec Cla I. La réduction de la taille du frottis a confirmé qu’une grande partie des molécules de la bibliothèque étaient des paires Hi-C valides. L’analyse densitométrique de ce gel peut être effectuée pour obtenir un rapport entre les échantillons ONU et D, comme détaillé dans la section des résultats représentatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Statistiques HiC-Pro de la bibliothèque Hi-C. (A) Représentation schématique des paires Hi-C valides et des différents types de paires non valides qui peuvent être produites au cours de l’expérience et filtrées par HiCPro27 (Tableau 2). Il s’agit notamment des lectures tombant dans des séquences contiguës, des extrémités pendantes, du même fragment, de l’auto-cercle, des re-ligatures et des doublons PCR. (B) Statistiques cartographiques. Les lectures qui n’ont pas réussi à s’aligner sont affichées (gris), et les lectures entièrement alignées et les lectures alignées après le rognage sont affichées en bleu et en bleu clair, respectivement. Ces deux catégories représentent les lectures utiles qui sont prises en compte dans les analyses ultérieures. ( C )Statistiquesd’appariement. Les lectures multi-alignées (orange foncé) représentent les lectures alignées dans plusieurs régions du génome. Les lectures alignées de manière unique (bleu foncé) représentent les paires de lecture qui sont alignées une fois dans le génome, et les singletons (orange clair) représentent les paires de lecture dans lesquelles une seule région génomique a été séquencée dans les deux lectures. (D) Statistiques de filtrage. Les paires de lecture valides (bleu) représentent des produits de ligature Hi-C réussis comme décrit dans (A). Les auto-cercles auto-fragmentés (rose clair) sont des lectures inutiles car ils représentent le même fragment génomique que celui illustré dans (A). Les extrémités pendantes du même fragment (orange) représentent les lectures dans lesquelles un seul fragment de restriction a été séquencé. Les paires filtrées et déversées (brunes) sont également des lectures inutiles qui ont la mauvaise taille ou pour lesquelles le produit de ligature n’a pas pu être reconstruit. Enfin, les lectures de re ligature (rouge) représentent les lectures dans lesquelles deux fragments adjacents ont été re-ligaturés, produisant ainsi des informations inutiles. (E) Paires de lecture valides distribution de contact dans le génome. Les contacts cis uniques (bleu) sont plus fréquents que les contacts trans uniques (vert). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Matrices de contact Hi-C et analyse virtuelle 4C des cellules WT et mutantes S2R+. (A) Carte thermique normalisée Hi-C d’une région de 50 kb à une résolution de 1 kb centrée dans le locus du gène Notch. Le score de séparation TAD32 pour le locus est montré, ainsi que le partitionnement du locus Notch en deux domaines topologiques (domaine 1 et domaine 2). Les données ChIP-seq pour les points d’accès, l’ARN Pol II et les marques d’histones pour les cellules S2/S2R+34,35,36,37 sont présentées sous la carte thermique ( Tableau1). Les positions des limites du domaine Notch 1 sont surlignées en vert clair. (B) Représentation schématique de la frontière B1 du mutant CRISPR. Le rectangle vert indique la région 343 bp supprimée. Les ciseaux indiquent les sgRNA utilisés pour l’édition du génome médiée par CRISPR. Les sites de liaison de motifs pour les points d’accès sont affichés sous forme de cases pour CTCF et M1BP. Les sommets de crête pour les PO de liaison à l’ADN indiqués en (A) sont également indiqués35. (C) Cartes thermiques normalisées Hi-C à une résolution de 1 kb couvrant une région de 50 kb centrée dans Notch pour le WT et les cellules mutantes. À gauche, cartes thermiques Hi-C des différences log2 dans la fréquence d’interaction entre WT et les cellules mutantes. (D) Cartes thermiques normalisées Hi-C couvrant une région de 250 kb centrée en Notch à une résolution de 5 kb pour WT et les cellules mutantes. À gauche, cartes thermiques Hi-C des différences log2 dans la fréquence d’interaction entre WT et les cellules mutantes. (E) Virtual-4C pour WT et les cellules mutantes en utilisant l’UTR 5' de Notch comme point de vue. Les pourcentages d’interactions entre le point de vue et les régions au sein du kirredomain-2en amont, du domaine Notch 1, du domaine Notch 2 et du domaine dnc en aval pour les cellules WT et mutantes sont indiqués25. Abréviations: WT = type sauvage; TAD = domaine topologiquement associé; ChIP = immunoprécipitation de la chromatine; AP = protéine architecturale; ARN Pol = ARN polymérase; S2R+ = récepteur S2 plus; sg ARN = ARN guide unique; UTR = région non traduite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Expérience Échantillon Numéro d’acquisition GEO
Puce CP190 GSM1015404
Puce SuHW GSM1015406
Puce Mod(mdg4) GSM1015408
Puce Le GSM1015410
Puce Ibf1 GSM1133264
Puce Ibf2 GSM1133265
Puce BEAF32 GSM1278639
Puce Pita GSM1313420
Puce ZIPIC GSM1313421
Puce ARN PolII GSM2259975
Puce H3K4me1 GSM2259983
Puce H3K4me3 GSM2259985
Puce H3K27ac GSM2259987
Puce MSL2 GSM2469507
Puce H4K16ac GSM2469508
Puce M1BP GSM2706055
Puce Le GSM2860390
Puce Entrée GSM1015412
Salut-C Cellules S2R+ WT GSE136137
Salut-C Cellules S2R+ 5pN-delta343 GSE136137

Tableau 1: Numéros d’accession GEO.

Statistiques HiC-Pro Lit Pourcentage
Cartographie des statistiques
Alignements en lecture complète 131515921 82.20%
Alignements de lecture découpés 16408309 10.30%
Échec de l’alignement 12110964 7.60%
Statistiques d’appariement
Aligné de manière unique 79428455 50.90%
Singleton 19063418 12.20%
Multi-aligné 57700021 36.90%
Filtrage des statistiques
Paires valides 71373989 90.12%
Same-Fragment: Cercle de soi 2340697 2.90%
Same-Fragment: Extrémités pendantes 2578783 3.20%
Paires filtrées 2773043 3.50%
Paires déversées 196565 0.20%
Statistiques de contact
Unique: cis ≤ 20 kbp 33108815 46.50%
Unique: cis > 20 kbp 33539888 47.10%
Unique : trans 4133602 5.80%
Dupliquer les paires de lecture 398400 0.60%

Tableau 2 : Statistiques HiC-Pro.

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Discussion

La méthode Hi-C dans le noyau présentée ici a permis une exploration détaillée de la topologie du génome de la drosophile à haute résolution, fournissant une vue des interactions génomiques à différentes échelles génomiques, des boucles de chromatine entre les éléments régulateurs tels que les promoteurs et les amplificateurs aux TAM et à l’identification des grands compartiments25. La même technologie a également été appliquée efficacement aux tissus de mammifères avec quelques modifications33. Par exemple, lors du traitement d’un tissu au lieu d’une suspension unicellulaire, le tissu est tamisé à travers un filtre de 70 μm et l’étape de lyse est effectuée tout en homogénéisant le matériau à l’aide d’un homogénéisateur Dounce. De plus, comme le génome des mammifères est 25 fois plus grand que le génome de la drosophile, le nombre de paires de lecture valides nécessaires pour construire des matrices de résolution de 1 à 5 kb est plus élevé. La méthode Hi-C dans le noyau diffère de la méthode Hi-Coriginale 2 en évitant la lyse nucléaire avec 1% de SDS à 65 °C avant la ligature, préservant ainsi l’intégrité nucléaire, et en ligaturant en 1 mL au lieu de 7 mL23,24.

Le protocole comporte quelques étapes clés pour assurer une efficacité élevée. La première étape qui peut introduire des inefficacités de digestion et de remplissage est la formation d’amas lors de la perméabilisation À 0,3% des FDS et des traitements tensioactifs. Si les amas sont gros et difficiles à perturber, la vitesse de rotation doit être réduite à 400 tr/min pendant les traitements SDS et tensioactifs. Si les amas restent difficiles à désagréger par pipetage, l’échantillon doit être divisé en deux en ajustant les volumes avec le tampon de restriction, la FDS et le tensioactif non ionique avant de procéder à la perméabilisation. Ensuite, les noyaux doivent être centrifugés à une vitesse minimale (200 × g),le surnageant soigneusement jeté et les échantillons regroupés dans 450 μL de tampon de restriction 1x avant de procéder à la digestion. Deuxièmement, l’estimation de l’efficacité de la digestion est importante pour fournir suffisamment de fragments d’ADN pour le remplissage et la ligature. Si, après évaluation qualitative, la digestion s’avère inefficace, une deuxième série de digestion doit être effectuée avec l’enzyme de restriction pendant une période allant de 4 h à la nuit.

Troisièmement, l’estimation de l’efficacité de la ligature est importante. Si, après évaluation qualitative, la ligature s’avère inefficace (c.-à-d. qu’au lieu de la bande de poids moléculaire élevé, un frottis similaire à celui observé pour l’échantillon digéré est observé), la ligature doit être répétée en centrifugant les noyaux à 200 × g et en les réutilisant dans un mélange de ligature à l’aide d’un tampon de ligature 10x frais et de la ligase. Quatrièmement, le pourcentage de produits valides Hi-C doit être estimé en digérant un amplicon PCR d’une interaction attendue avec Cla I (pour la digestion originale Mbo I). L’amplification et la digestion efficaces de l’amplicon de l’interaction attendue confirment la ligature et la formation réussies des jonctions Hi-C. Si la digestion des amplicons n’est pas efficace, la majorité des molécules seront 3C au lieu de produits Hi-C, et cela doit être pris en considération si la bibliothèque sera séquencée. Cela peut également être confirmé en effectuant le contrôle final de la digestion Cla I de la bibliothèque, comme décrit dans la section des résultats représentatifs. Enfin, la sélection du plus petit nombre de cycles de PCR est importante pour éviter les doublons de PCR. Si, lors du séquençage, le pourcentage de doublons de paires de lecture s’avère élevé, le nombre de cycles de PCR doit être encore réduit.

Cette technique Hi-C dans le noyau a quelques limites. Tout d’abord, le protocole décrit ici représente l’expérience Hi-C réalisée pour une population cellulaire. Par conséquent, le signal de la fréquence des contacts génomiques représente des millions de génomes avec des conformations individuelles variables. Pour obtenir l’ensemble des contacts génomiques à partir d’un seul génome, une expérience Hi-Cunicellulaire 22 est recommandée. Deuxièmement, Hi-C est basé sur la ligature de fragments d’ADN proximal. Ainsi, si les régions génomiques font partie d’un grand complexe protéine-chromatine, la distance entre les fragments pourrait entraver la ligature. Par exemple, il a été démontré que les contacts trans sont mal représentés dans Hi-C38. De plus, Hi-C se termine par un séquençage par paires, récupérant ainsi des paires de contacts génomiques. Cependant, plusieurs fragments d’ADN peuvent interagir simultanément dans le même complexe de chromatine. Pour obtenir l’identité de plusieurs fragments d’ADN dans un complexe de chromatine, des méthodes de séquençage alternatives peuvent être appliquées à Hi-C39, ou différentes stratégies expérimentales peuvent être utilisées dans lesquelles la ligature n’est pas effectuée38,40,41. Enfin, bien que Hi-C mesure les contacts génomiques, il ne révèle pas l’identité des protéines médiant les interactions. D’autres méthodes doivent être appliquées pour identifier les interactions génomiques médiées par une protéine particulière d’intérêt42 ou l’identité de l’ensemble des protéines à des éléments génomiques spécifiques43.

En conclusion, avec une expérience Hi-C de haute qualité comme celle décrite ici pour le génome de la drosophile (Tableau 2), les matrices peuvent être construites à une large gamme de résolutions (de 1, 5 kb, 50 kb ou moins; voir Figure 4). De plus, si une région particulière du génome doit être évaluée au niveau du fragment de restriction, les données peuvent être utilisées pour construire un paysage virtuel 4C du point de vue souhaité (par exemple, le gène Notch 5' UTR dans la figure 4E). L’outil Hi-C other-ends de SeqMonk est une option très conviviale qui permet la visualisation de ce paysage. L’application de l’outil de quantification 4C, qui fait également partie de SeqMonk, à ce paysage peut produire des contacts statistiquement significatifs.

L’application de l’expérience Hi-C dans le noyau décrite ici à une collection de lignées cellulaires mutantes avec des sites de liaison à l’ADN AP altérés aux limites TAD (Figure 4) a révélé que des éléments génétiques sont nécessaires aux limites pour structurer le génome de la drosophile dans les domaines et maintenir la régulation de l’expression génique comme discuté en détail par Arzate-Mejía et al.25. Ainsi, l’édition génétique des éléments régulateurs avec le système CRISPR/Cas9, combinée au profilage à haute résolution des interactions génomiques à l’aide du protocole Hi-C dans le noyau décrit ici, peut être une stratégie puissante pour tester la fonction structurelle des éléments génétiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme d’appui à l’innovation technologique et à la recherche de l’UNAM (PAPIIT) numéro de subvention IN207319 et le numéro de subvention du Conseil national de la science et de la technologie (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. est un étudiant à la maîtrise soutenu par le Conseil national des sciences et de la technologie (CONACyT) CVU numéro 968128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

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Génétique numéro 175 Chromatine Organisation 3D du génome compartiments domaines associant topologiquement
Hi-C dans le noyau dans les cellules de la drosophile
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Esquivel-López, A.,… More

Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

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