Summary

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

Abstract

Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.

Introduction

Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase1bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern2. Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomenorganisation3,4,5markieren. Bei Säugetieren werden TAD-Grenzen durch Cohesin und CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)6,7,8besetzt. Der Cohesin-Komplex extrudiert Chromatin und stoppt an CTCF-Bindungsstellen, die in konvergenter Orientierung in der genomischen Sequenz angeordnet sind, um stabile Chromatinschleifen9,10,13,14zu bilden. Genetische Störung der CTCF-DNA-Bindungsstelle an den Grenzen oder Verringerung der CTCF- und Cohesinproteinhäufigkeit führt zu abnormalen Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen, Verlust der TAD-Bildung und Deregulierung der Genexpression9,10,11,13,14.

Bei Drosophila werden die Grenzen zwischen TADs von mehreren APs besetzt, darunter der Grenzelement-assoziierte Faktor 32 kDa (BEAF-32), das Motif 1-Bindungsprotein (M1BP), das zentromale Protein 190 (CP190), der Suppressor des Haarflügels (SuHW) und CTCF, und sind mit aktiven Histonmodifikationen und Polymerase II16,17,18angereichert. Es wurde vermutet, dass bei Drosophila TADs als Folge der Transkription13 , 17,19auftreten, und die genaue Rolle unabhängiger APs bei der Grenzbildung und den Isolationseigenschaften wird noch untersucht. Ob Domänen in Drosophila eine alleinige Folge der Aggregation von Regionen ähnlicher Transkriptionszustände sind oder ob APs, einschließlich CTCF, zur Grenzbildung beitragen, muss daher noch vollständig charakterisiert werden. Die Erforschung genomischer Kontakte mit hoher Auflösung wurde durch die Entwicklung von Chromosomenkonformationserfassungstechnologien in Verbindung mit sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht. Das Hi-C-Protokoll wurde erstmals mit dem Ligationsschritt “in Lösung”2 beschrieben, um falsche Ligationsprodukte zwischen Chromatinfragmenten zu vermeiden. Mehrere Studien wiesen jedoch auf die Erkenntnis hin, dass das nützliche Signal in den Daten von Ligationsprodukten stammte, die an teilweise lysierten Kernen gebildet wurden, die nicht in Lösung20,21waren .

Das Protokoll wurde dann modifiziert, um die Ligatur im Kern als Teil des Einzelzell-Hi-C-Experiments22durchzuführen. Das In-Nucleus-Hi-C-Protokoll wurde anschließend in die Zellpopulation Hi-C integriert, um eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen zu erzielen und Daten mit weniger technischem Rauschen zu erzeugen23,24. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll basiert auf dem Population in-nucleus Hi-C Protokoll23,24 und wurde verwendet, um die Folgen der genetischen Entfernung von DNA-bindenden Motiven für CTCF und M1BP von einer Domänengrenze am Notch-Genlocus in Drosophila25zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung der DNA-bindungsnden Motive für APs an der Grenze drastische Folgen für die Bildung der Notch-Domäne, größere topologische Defekte in den Regionen rund um den Notch-Locus und die Deregulierung der Genexpression hat. Dies deutet darauf hin, dass genetische Elemente an Domänengrenzen für die Aufrechterhaltung der Genomtopologie und Genexpression in Drosophila25wichtig sind.

Protocol

1. Fixierung Beginnen Sie mit 10 Millionen Schneider’s Line 2 plus (S2R+) Zellen, um 17,5 ml einer Zellsuspension in Schneider-Medium herzustellen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) bei Raumtemperatur (RT) enthält. Fügen Sie methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei RT, wobei Sie darauf achten, jede Minute zu mischen.HINWEIS: Formaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheit…

Representative Results

Im Folgenden werden die Ergebnisse eines erfolgreichen Hi-C-Protokolls beschrieben (siehe eine Zusammenfassung des Hi-C-Protokollworkflows in Abbildung 1A). Während des Hi-C-Experiments im Kern gibt es mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle. Probenal aliquots wurden vor (UD) und nach (D) dem Chromatinrestriktionsschritt sowie nach der Ligatur (L) gesammelt. Die Vernetzung wurde umgekehrt und die DNA wurde gereinigt und auf einem Agarosegel ausgeführt. Ein Abstrich von 200-1000…

Discussion

Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente25. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die ZUSCHUSSNUMMER IN207319 des UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) und die Fördernummer 303068 des Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) unterstützt. == ist ein Masterstudent, der vom Science and Technology National Council (CONACyT) CVU Nummer 968128 unterstützt wird.

Materials

16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

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Cite This Article
Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

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