Summary
O genoma é organizado no espaço nuclear em diferentes estruturas que podem ser reveladas através de tecnologias de captura de conformação cromossomos. O método Hi-C no núcleo fornece uma coleção de interações de cromatina em linhas celulares Drosophila, que gera mapas de contato que podem ser explorados em resolução de megabases em nível de fragmento de restrição.
Abstract
O genoma é organizado em domínios topologicamente associando (TADs) delimitados por fronteiras que isolam interações entre domínios. Em Drosophila, os mecanismos subjacentes à formação e aos limites do TAD ainda estão sob investigação. A aplicação do método Hi-C em núcleo descrito aqui ajudou a dissecar a função de sítios de ligação de proteína arquitetônica (AP) nas fronteiras do TAD isolando o gene Notch. A modificação genética dos limites de domínio que causam a perda de APs resulta em fusão TAD, defeitos transcricionais e alterações topológicas de longo alcance. Esses resultados forneceram evidências demonstrando a contribuição de elementos genéticos para a formação de limites de domínio e controle da expressão genética em Drosophila. Aqui, o método Hi-C no núcleo foi descrito em detalhes, o que fornece importantes pontos de verificação para avaliar a qualidade do experimento juntamente com o protocolo. Também são mostrados os números necessários de leituras de sequenciamento e pares Hi-C válidos para analisar interações genômicas em diferentes escalas genômicas. A edição genética mediada pelo CRISPR/Cas9 de elementos regulatórios e o perfil de alta resolução das interações genômicas usando este protocolo Hi-C no núcleo pode ser uma combinação poderosa para a investigação da função estrutural dos elementos genéticos.
Introduction
Nos eucariotes, o genoma é dividido em cromossomos que ocupam territórios específicos no espaço nuclear durante a interfase1. A cromatina formando os cromossomos pode ser dividida em dois estados principais: um de cromatina acessível que é transcritivamente permissivo, e o outro de cromatina compacta que é transcritivamente repressiva. Esses estados de cromatina segregam e raramente se misturam no espaço nuclear, formando dois compartimentos distintos no núcleo2. Na escala sub-megabase, os limites separam domínios de interações de cromatina de alta frequência, chamados TADs, que marcam a organização cromossômica3,4,5. Nos mamíferos, os limites do TAD são ocupados por cohesin e fator de ligação CCCTC (CTCF)6,7,8. O complexo de cohesina extruda a cromatina e para em locais de ligação CTCF que são dispostos em uma orientação convergente na sequência genômica para formar laços de cromatina estável9,10,13,14. A interrupção genética do local de ligação de DNA ctcf nos limites ou redução da densidade de proteínas de CTCF e cohesina resulta em interações anormais entre elementos regulatórios, perda da formação de TAD e desregulação da expressão genética9,10,11,13,14.
Em Drosophila, os limites entre os TADs são ocupados por vários APs, incluindo fator associado a elementos de fronteira 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 proteína de ligação (M1BP), proteína centrosômica 190 (CP190), supressor de asa peluda (SuHW) e CTCF, e são enriquecidos em modificações de histona ativa e Polymerase II16,17,18. Tem sido sugerido que em Drosophila, os TADs aparecem como consequência da transcrição13,17,19, e o papel exato dos APs independentes na formação de limites e propriedades de isolamento ainda está sob investigação. Assim, se os domínios em Drosophila são uma consequência única da agregação de regiões de estados transcricionais semelhantes ou se as APs, incluindo a CTCF, contribuem para a formação de limites permanece totalmente caracterizada. A exploração de contatos genômicos em alta resolução tem sido possível através do desenvolvimento de tecnologias de captura de conformação de cromossomos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração. O protocolo Hi-C foi descrito pela primeira vez com a etapa de ligadura realizada "em solução"2 na tentativa de evitar produtos de ligadura espúria entre fragmentos de cromatina. No entanto, vários estudos apontaram para a constatação de que o sinal útil nos dados veio de produtos de ligadura formados em núcleos parcialmente lysed que não estavam na solução20,21.
O protocolo foi então modificado para realizar a ligadura dentro do núcleo como parte do experimento Hi-C de célula única22. O protocolo Hi-C no núcleo foi posteriormente incorporado à população celular Hi-C para produzir uma cobertura mais consistente ao longo de toda a gama de distâncias genômicas e produzir dados com menos ruído técnico23,24. O protocolo, descrito em detalhes aqui, baseia-se no protocolo Hi-C da população no núcleo23,24 e foi usado para investigar as consequências da remoção genética de motivos de vinculação de DNA para CTCF e M1BP de um limite de domínio no lócus genético notch em Drosophila25. Os resultados mostram que alterar os motivos de vinculação de DNA para APs na fronteira tem consequências drásticas para a formação do domínio de Notch, defeitos topológicos maiores nas regiões ao redor do lócus notch e desregulamentação da expressão genética. Isso indica que elementos genéticos nos limites do domínio são importantes para a manutenção da topologia do genoma e expressão genética em Drosophila25.
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Protocol
1. Fixação
- Comece com 10 milhões de células da linha 2 plus (S2R+) da Schneider para preparar 17,5 mL de suspensão celular no meio Schneider contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) à temperatura ambiente (RT).
- Adicione formaldeído sem metanol para obter uma concentração final de 2%. Misture e incubar por 10 minutos no RT, tomando o cuidado de misturar a cada minuto.
NOTA: Formaldeído é um produto químico perigoso. Siga as normas de saúde e segurança apropriadas e trabalhe no capô da fumaça. - Sacie a reação adicionando glicina para alcançar uma concentração final de 0,125 M e misture. Incubar por 5 min na RT, seguido por 15 min no gelo.
- Centrífuga por 400 × g no RT por 5 min e depois por 10 min a 4 °C; descartar o supernante. Resuspenda a pelota cuidadosamente em 25 mL de salina fria 1x tamponada com fosfato.
- Centrifugar a 400 × g por 10 min a 4 °C, depois descarte o supernaspe.
NOTA: Se continuar com o protocolo, vá para a etapa 2.1 para a lise; caso contrário, congele a pelota em líquido N2 e armazene a pelota a -80 °C.
2. Lysis
- Resuspenncie as células em 1 mL de tampão de lise gelada (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% de surfactante não iônico (ver a Tabela de Materiais); 10 mM NaCl; 1x inibidores de protease), e ajuste o volume para 10 mL com tampão de lise gelada. Ajuste o volume para obter uma concentração de 1 × 106 células/mL. Incubar no gelo por 30 minutos, misturando a cada 2 minutos invertendo os tubos.
- Centrifugar os núcleos a 300 × g por 5 min a 4 °C e, em seguida, descartar cuidadosamente o sobrenante. Lave a pelota 1x com 1 mL de tampão de lise fria e transfira-a para um tubo de microcentrifutura. Lave a pelota 1x com 1 mL de tampão de restrição de 1,25x frio e resuspenda cada pelota de célula em 360 μL de tampão de restrição de 1,25x.
- Adicione 11 μL de sulfato de dodecyl de sódio de 10% de sódio (SDS) por tubo (concentração final de 0,3), misture cuidadosamente por pipetação e incubar a 37 °C por 45 min, tremendo a 700-950 rpm. Pipet para cima e para baixo para interromper aglomerados algumas vezes durante a incubação.
- Sacie o SDS adicionando 75 μL de surfactante não iônico (solução de 10%, ver a Tabela de Materiais) por tubo (concentração final de 1,6%) e incubar a 37 °C por 45 min, tremendo a 950 rpm. Encolé-lo algumas vezes para interromper aglomerados durante a incubação.
NOTA: Se os aglomerados forem grandes e difíceis de interromper, diminua a velocidade rotativa para 400 rpm durante os tratamentos SDS e surfactantes. Se os aglomerados são difíceis de desagregar por pipetação, divida a amostra em duas; ajustar os volumes de buffer de restrição, SDS e surfactante; e proceder com a permeabilização. Em seguida, gire os núcleos em velocidade mínima (200 × g),descarte cuidadosamente o supernante, acumule as amostras em tampão de restrição de 1X e proceda com a digestão. Tome uma alíquota de 10 μL como a amostra não digerida (UD).
3. Digestão enzimática
- Digerir a cromatina adicionando 200 unidades (U) de Mbo I por tubo, e incubar a 37 °C por um período que varia de 4h a durante a noite durante a rotação (950 rpm).
- No dia seguinte, adicione mais 50 U de Mbo I por tubo e incubar a 37 °C por 2h enquanto gira (950 rpm).
- Inativar a enzima incubando os tubos a 60 °C por 20 min. Coloque os tubos no gelo.
NOTA: Tome uma alíquota de 10 μL como a amostra digerida (D).
4. Biotinylation de extremidades de DNA
- Para preencher as saliências do fragmento de restrição e rotular as extremidades do DNA com biotina, adicione 1,5 μL cada um de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0,4 mM biotina dATP, 17,5 μL de tampão Tris low-EDTA (TLE) tampão [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8.0], e 10 μL de 5 U/μL de Klenow (DNA polymerase I grande fragmento) para todos os tubos. Misture cuidadosamente e incubar por 75 min a 37 °C. Agite a 700 rpm a cada 10 s por 30 s. Coloque todos os tubos no gelo enquanto prepara a mistura de ligadura.
5. Ligadura
- Transfira cada mistura de cromatina digerida para um tubo separado de 1 mL com mistura de ligadura (100 μL de tampão de ligadura de 10x, 10 μL de 10 mg/mL de colmeia bovina, 15 U de ligadura de DNA T4 e 425 μL de água dupla destilada [ddH2O]). Misture bem por pipetação suave e incubar durante a noite a 16 °C.
6. Reversão de crosslink e purificação de DNA
- Degrade as proteínas adicionando 50 μL de 10 mg/mL Proteinase K por tubo, e incubar a 37 °C por 2 h. Crosslinks reversos aumentando a temperatura para 65 °C e incubar durante a noite.
- Degrade o RNA adicionando 20 μL de 10 mg/mL RNase A, e incubar a 37 °C por 1 h.
- Realizar extração de fenol:clorofórmio seguido de precipitação de etanol.
- Adicione 1 volume de fenol-clorofórmio e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea.
NOTA: O fenol é um produto químico perigoso. Siga as normas de saúde e segurança adequadas. Trabalhe no capô da fumaça. - Centrífuga a 15.000 × g por 15 min. Transfira a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga de 2 mL fresco. Realize uma extração traseira da camada inferior com 100 μL de tampão TLE e transfira a fase aquosa para o mesmo tubo de 2 mL.
- DNA precipitado adicionando 2 volumes de 100% de álcool etílico (EtOH), 0,1 volumes de acetato de sódio de 3 M e 2 μL de 20 mg/mL de glicogênio. Incubar a -20 °C por um período que varia de 2h a noite.
- Gire a 15.000 × g por 30 min a 4 °C, e lave as pelotas 2x com gelo frio de 70% EtOH. Seque as pelotas em RT e resuspenque em 100 μL de tampão TLE. Quantifique o DNA usando um corante fluorogênico que se liga seletivamente ao DNA e um fluorômetro de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazenar produtos de ligadura a 4 °C a curto prazo ou a -20 °C a longo prazo. Use uma alíquota (100 ng) do material como a amostra ligada (L) para controle de qualidade.
- Adicione 1 volume de fenol-clorofórmio e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea.
7. Avalie a qualidade do modelo Hi-C
- Controles qualitativos de digestão e ligadura
- Purifique o DNA das alíquotas UD e D invertendo os crosslinks, e realize a extração de fenol:clorofórmio e precipitação de etanol conforme descrito acima.
- Carregar 100 ng de amostras de UD, D e L em um gel de 1,5% de agarose. Procure por uma mancha centrada em torno de 500 bp na amostra D versus uma faixa de alto peso molecular para a amostra de L (ver resultados representativos).
- Controle quantitativo de eficiência de digestão
NOTA: Para avaliar a eficiência de digestão com mais precisão, use as amostras de UD e D como modelos para realizar reações quantitativas da cadeia de polimerase (qPCR) usando primers projetados da seguinte forma.- Projete um par de primer que amplifica um fragmento de DNA contendo o local de restrição de DNA para a enzima usada para digestão (Mbo I no protocolo atual), chamado R na fórmula na etapa 7.2.3.
- Projete um par de primer que amplifica um fragmento de DNA de controle que não contenha o local de restrição para a enzima usada para digestão (Mbo I para o protocolo atual), chamado C na fórmula na etapa 7.2.3.
- Use os valores do limiar de ciclo (valores ct) da amplificação para calcular a eficiência da restrição de acordo com a fórmula mostrada abaixo:
% Restrição = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Quando a CtR refere-se ao valor ct do fragmento R, e CtC refere-se ao valor ct do fragmento C para amostra D e UD amostra.
NOTA: A porcentagem de restrição reflete a eficiência da enzima de restrição que corta o fragmento de DNA restrito (R) em comparação com um fragmento de DNA de controle (C) que não contém o local de DNA de restrição. Recomenda-se uma eficiência de restrição de ≥ 80%.
- Detecção de interações conhecidas
- Execute o PCR para amplificar um controle de ligadura interna para examinar interações de curto e/ou médio ou longo alcance (ver resultados representativos).
- Alternativamente, projete primers para amplificar um produto de ligadura no qual os primers estão em orientação para frente ou reverso em fragmentos de restrição adjacentes.
- Controle de preenchimento e rotulagem de biotina
- Verifique a eficiência de marcação e ligadura hi-C por amplificação e digestão de uma interação conhecida ou um produto de ligadura entre fragmentos de restrição adjacentes no genoma, conforme descrito acima.
NOTA: O preenchimento bem-sucedido e a ligadura do site Mbo I (GATC) geram um novo local para a enzima de restrição Cla I (ATCGAT) na junção de ligadura e regenera o site Mbo I. - Digerir o produto PCR com Mbo I, Cla I ou ambos. Depois de executar as amostras em um gel de 1,5-2%, estimar o número relativo de junções de ligaduras 3C e Hi-C quantificando a intensidade das bandas de corte e sem cortes26.
NOTA: É desejada uma eficiência de > 70% (veja resultados representativos).
- Verifique a eficiência de marcação e ligadura hi-C por amplificação e digestão de uma interação conhecida ou um produto de ligadura entre fragmentos de restrição adjacentes no genoma, conforme descrito acima.
8. Sonicação
- Sonicar as amostras para obter fragmentos de DNA de 200-500 bp. Para o instrumento utilizado neste protocolo (ver a Tabela de Materiais),dilua a amostra (de 5 a 10 μg) em 130 μL de ddH2O por tubo, e defina o instrumento para sonicar até 400 bp: nível de preenchimento: 10; fator de dever: 10%; pico de tráfego incidente (w): 140; ciclos por explosão: 200; tempo (s): 80.
9. Remoção/reparo final da biotina
NOTA: As etapas abaixo são ajustadas para 5 μg de DNA Hi-C.
- Para realizar a remoção da biotina, transfira a amostra (130 μL) para um tubo de microcentrifuge fresco. Adicione 16 μL de tampão de ligadura de 10x, 2 μL de 10 mM dATP, 5 μL de T4 DNA Polymerase (15U) e 7 μL de ddH2O (160 μL de volume total). Incubar a 20 °C por 30 min.
- Adicione 5 μL de 10 mM dNTPs, 4 μL de tampão de ligadura de 10x, 5 μL de T4 polynucleotide quinase (10 U/μL), 1 μL de Klenow e 25 μL de ddH2O (200 μL de volume total). Incubar a 20 °C por 30 min.
10. Seleção de tamanho
- Para selecionar fragmentos principalmente na faixa de tamanho de 250-550 bp, realize a seleção de tamanho de imobilização reversível de fase sólida sequencial (SPRI) primeiro com 0,6x, seguido por 0,90x de acordo com as instruções do fabricante, e elute o DNA usando 100 μL de TLE.
11. Retração de biotina/ligadura/adaptador/adaptação
NOTA: Realize as lavagens reutilizando as contas magnéticas por vórtice, gire as amostras por 3 minutos em uma roda giratória e, em seguida, gire brevemente a amostra e coloque-a no suporte magnético. Deixe as contas grudarem no ímã, descarte o supernasce e proceda com a seguinte etapa de lavagem. Execute as lavagens a 55 °C em um bloco termo com rotação em vez da roda giratória.
- Coma o volume final para 300 μL por amostra com TLE para puxar para baixo. Prepare os buffers de lavagem de contas: 1x Tampão de Interpolação (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x Tampão No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Use 150 μL de contas magnéticas ligadas a streptavidina (ver a Tabela de Materiais) por biblioteca. Lave as contas 2x com 400 μL de 1x TB. Em seguida, resuspend contas em 300 μL 2x NTB.
- Misture as contas com o material Hi-C de 300 μL e incubar na RT por 30 minutos em uma roda giratória para permitir a ligação de biotina às contas streptavidin.
- Lave as contas com 400 μL de 0,5x TB e incubar a 55 °C por 3 min, girando a 750 rpm. Lave as contas em 200 μL de 1x de buffer de restrição.
- Resuspenque as contas em 100 μL de mistura de rejeito dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampão de restrição de 10x, 5 μL de Klenow exo-, e 80 μL de ddH2O). Incubar a 37 °C por 30 min.
- Retire o supernascimento, lave as contas 2x com 400 μL de 0,5x TB incubando a 55 °C por 3 min e girando a 750 rpm.
- Lave as contas com 400 μL de 1x NTB e, em seguida, com 100 μL de tampão de ligadura 1x.
- Resuspenque as contas em 50 μL de tampão de ligadura 1x e transfira a suspensão para um novo tubo. Adicione 4 μL de adaptadores pe pré-enalados (15 μM de estoque) e 2 μL de ligase T4 (400 U/μL, ou seja, 800 U/tube); incubar na RT por 2 h.
NOTA: Pré-anneal os adaptadores adicionando volumes iguais de ambos os adaptadores PE 1.0 e PE 2.0 (estoque de 30 μM) e incubação por 10 minutos na RT (ver a Tabela de Materiais). - Recapture as contas removendo o supernascimento e lavando as contas 2x com 400 μL de TB. Lave as contas com 200 μL de 1x NTB, depois com 100 μL de tampão de restrição de 1x e resuspenja as contas em 40 μL de tampão de restrição de 1x.
12. Amplificação do PCR
- Configure PCRs de volume de 25 μL com ciclos de 5, 6, 7 e 8. Para cada PCR, use:
Receita de Reação Contas hi-C 2,5 μL 10 μM PE PCR primer 1 (Tabela de Materiais) 0,75 μL 10 μM PE PCR primer 2 (Tabela de Materiais) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL Tampão de reação 5x 5 μL Polimerase de DNA 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Total 25 μL Ciclos Temperatura Hora 1 98 °C 30 s n ciclos 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 min.
13. Amplificação final do PCR
- Realize a amplificação final do PCR usando as mesmas condições descritas acima e o número de ciclos selecionados. Divida a amostra usando 5 μL de contas Hi-C como modelo em reações de 50 μL.
- Colete todas as reações do PCR e transfira-as para um tubo fresco. Use o ímã para remover as contas de streptavidina e recuperar os produtos supernascentes (PCR). Transfira as contas para um tubo fresco, lave as contas conforme indicado na etapa 11.2.9 e armazene em 1x tampão de restrição a 4 °C como backup.
- Purifique os produtos PCR utilizando 0,85x o volume das contas SPRI de acordo com as instruções do fabricante. Elute com 30 μL de tampão TLE.
- Quantifique a biblioteca Hi-C usando um instrumento fluorométrico, e confirme a qualidade da biblioteca por eletroforese capilar baseada em chip.
- Como ponto de verificação de última qualidade, use 1 μL da biblioteca Hi-C como modelo para executar uma reação pcr usando 10 ciclos usando as mesmas condições descritas na etapa 12.1. Divida o produto PCR em dois tubos de microcentrifuuge: digerir um com Cla I e deixar o outro indigesto como controle. Executar os produtos em um gel de 1,5-2% de agarose (ver resultados representativos).
- Prossiga para 50 bp ou 75 bp de sequência de extremidade emparelhada em uma plataforma de sequenciamento adequada.
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Representative Results
Descritos abaixo estão os resultados de um protocolo Hi-C bem sucedido (veja um resumo do fluxo de trabalho do protocolo Hi-C na Figura 1A). Existem vários pontos de controle de qualidade durante o experimento Hi-C no núcleo. As alíquotas amostrais foram coletadas antes (UD) e depois (D) da etapa de restrição da cromatina, bem como após a ligadura (L). Os crosslinks foram invertidos, e o DNA foi purificado e executado em um gel de agarose. Uma mancha de 200-1000 bp foi observada quando a restrição com Mbo I foi bem sucedida(Figura 1B). O tamanho esperado da molécula depende da enzima de restrição de escolha. Se a ligadura foi bem sucedida, uma faixa de alto peso molecular foi vista no topo do gel (Figura 1B). A eficiência de digestão também pode ser confirmada pelo qPCR, conforme descrito em detalhes no protocolo. Uma eficiência de digestão aceitável é de 80% ou mais(Figura 1C).
Para avaliar detalhadamente a eficiência da ligadura Hi-C, os primers podem ser projetados para amplificar um controle interno do produto de ligadura no qual os primers estão em orientação de avanço ou reverso em fragmentos de restrição adjacentes. Alternativamente, os primers podem ser projetados para amplificar interações conhecidas. Figura 2A mostra a amplificação de uma interação conhecida de médio alcance (300 kb) em Drosophila25. Os produtos de ligadura hi-C (nos quais a marcação de biotina, preenchimento e ligadura ocorreram com sucesso) podem ser estimados pela digestão do produto PCR recuperado na amplificação. Após o preenchimento e a ligadura, os amplificadores Hi-C conterão um novo local de restrição Cla I no local original Mbo I, que é preservado após a ligadura de extremidade bruta. Se a restrição com Cla I não estiver completa, a reação de preenchimento e marcação de biotina será ineficiente. Recomenda-se uma eficiência de digestão de mais de 70% para evitar ter uma grande proporção de leituras não úteis para as bibliotecas após o sequenciamento(Figura 2A, compare a digestão Cla I do modelo 3C versus o modelo Hi-C).
Para determinar um número adequado de ciclos de amplificação do PCR para amplificar a biblioteca Hi-C final, foram configurais reações pcr usando 2,5 μL de uma determinada biblioteca em contas, conforme descrito no protocolo. O número de ciclos de PCR para a amplificação final é um ciclo menor do que o número de ciclos para os quais a mancha é visível(Figura 2B). Neste caso, foram escolhidos 4 ciclos de amplificação pcr. Como um ponto de verificação de qualidade final, uma alíquota da biblioteca Hi-C foi re-amplificada e digerida com Cla I. O nível de digestão da biblioteca (uma diminuição no tamanho da mancha) indica a abundância de pares Hi-C válidos e reflete a proporção de leituras úteis que serão obtidas da biblioteca (Figura 2C). Uma razão da faixa de tamanho superior (determinada pelo tamanho presente na amostra de UD) e a faixa de tamanho inferior em ambas as amostras de UD e D devem produzir uma razão > 1 para o UD e uma razão ≤ 1 para a amostra digerida se a digestão Cla I for eficiente.
Após sequenciamento de extremidade emparelhada, os arquivos FASTQ (Tabela 1) foram processados usando HiCPro28 e as estatísticas geradas plotadas usando MultiQC28. Uma ferramenta alternativa ao HiCPro é o pipeline HiCUP30 que produz resultados semelhantes (não mostrados). A Figura 3 e a Tabela 2 mostram as informações estatísticas detalhadas das leituras sequenciadas. Alinhamento e alinhamento completos da leitura após o corte são relatados. Essas duas categorias correspondem a leituras alinhadas com sucesso que serão usadas em análises subsequentes para encontrar pares Hi-C válidos. A categoria alinhamento após corte refere-se a leituras que abrangem a junção de ligadura, que não estavam alinhadas na primeira etapa e são aparadas no local de ligadura para, em seguida, realinhar sua extremidade de 5' para o genoma28 (Figura 3B,C e Tabela 2). As estatísticas de contato mostram que a biblioteca Hi-C era de alta qualidade, com pares válidos de 82,2% e 7,6% leituras não úteis caindo no auto-círculo do mesmo fragmento, extremidades do mesmo fragmento, religação, pares filtrados e pares despejados(Figura 3A, Figura 3De Tabela 2). Além disso, o número de duplicatas pcr é muito baixo, indicando que a complexidade da biblioteca é alta, e que os ciclos pcr introduziram artefatos mínimos(Figura 3E e Tabela 2).
Utilizando os pares Hi-C válidos exclusivos, a análise básica da distribuição do par foi realizada utilizando HiCPro27. Este experimento rendeu 46,5% de contatos cis únicos ≤ 20 kbp, 47,1% de contatos cis únicos > 20 kbp e 5,8% contatos trans únicos(Figura 3D). A distribuição de cis para pares trans válidos correspondeu aos resultados esperados para um experimento Hi-C bem sucedido com a maioria das interações detectadas dentro do mesmo cromossomo. Uma alta proporção de contatos trans indica fixação ineficiente. Utilizando os pares válidos hi-C da HiCPro27,as matrizes foram normalizadas por correção iterativa e decomposição eigenvector (ICE)30, e foram geradas matrizes de resolução de 1 kb e 5 kb utilizando HiCPlotter30,31,32. Matrizes de contato normalizadas a 1 kb e resolução de 5 kb são apresentadas para o lócus genético notch em Drosophila (Figura 4A, Figura 4Ce Figura 4D). Na Figura 4A, o lócus do gene Notch pode ser visto juntamente com os APs, domínio l e II, bem como modificações de histona ao longo do lócus(Figura 4A e Tabela 1). O desenho da exclusão CRISPR-Cas9 envolveu o motivo de CTCF e M1BP (Figura 4B).
Após a exclusão da região contendo ambos os locais de vinculação de DNA CTCF e M1BP no limite de 5' do entalhe de Notch locus (5pN-delta343, Tabela 1), uma mudança dramática nos contatos de cromatina pode ser observada com a perda de interações dentro do lócus notch e ganho de contatos com o TAD upstream em comparação com o tipo selvagem (WT) (Figura 4C,D). Finalmente, a Figura 4E mostra um panorama detalhado dos perfis de interação de WT e mutantes no nível de fragmento de restrição do gene Notch 5' UTR, mostrando uma diminuição na proporção de contatos feitos com o lócus do gene Notch e um aumento nos contatos com o domínio upstream. As visualizações virtuais 4C do gene Notch 5' UTR foram obtidas usando HiC-Pro27. Uma ferramenta alternativa é a quantificação hi-c de outros fins disponível em SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Todos os resultados apresentados na Figura 4 foram obtidos aplicando o protocolo Hi-C em núcleo em células Drosophila S2R+ mutantes, conforme descrito por Arzate-Mejía et al.25.
Figura 1: Controles de digestão e ligadura hi-C em núcleo. (A) Visão geral do protocolo Hi-C. As células estão cruzadas com formaldeído, resultando em ligações covalentes entre segmentos de cromatina (fragmentos de DNA: rosa, roxo) e proteínas. A cromatina é digerida com uma enzima de restrição (representada por tesoura), neste exemplo, Mbo I. As extremidades pegajosas resultantes são preenchidas com nucleotídeos, incluindo um dATP biotinína (círculos azuis escuros). O DNA é purificado, e as junções biotiniladas são enriquecidas usando contas magnéticas revestidas de streptavidin (círculos cinzentos). Fragmentos de interação são identificados por sequenciamento de extremidade emparelhada da próxima geração. (B) Controles de qualidade de digestão e ligadura hi-C para duas réplicas biológicas (Hi-C 1 e Hi-C 2). As bibliotecas hi-C foram resolvidas em um gel de 1,5% de agarose. Ambas digeridas, D, bibliotecas funcionam como uma mancha em torno de 600 bp. Amostras ligadas, Lig, funcionam como uma banda bastante apertada maior que 10 kb semelhante às amostras de UD não digeridas. As diferenças na força do sinal são devido a quantidades irregulares de DNA carregado no gel. (C) Controle quantitativo de digestão hi-C por reação quantitativa da cadeia de polimerase para as mesmas duas réplicas biológicas como em (B) (Hi-C 1 e Hi-C 2) utilizando os valores do limiar de ciclo conforme detalhado no protocolo. Uma digestão bem sucedida ≥ restrição de 80%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Controles de ligamento hi-c em núcleo e de extremidade bruta. (A) Avaliação de rotulagem de preenchimento e biotina. Uma interação conhecida entre fragmentos localizados a 300 kb de distância no cromossomo X foi usada como controle e amplificada utilizando-se os primers indicados com setas pretas (ver parte superior do esquema em (B),primer 1 (esquerda), primer 2 (direita), Tabela 1), gerando um amplicon de 347 bp. Os produtos de ligadura hi-C podem ser distinguidos daqueles produzidos em um experimento 3C pela digestão do local de ligadura. As junções hi-C foram digeridas por Cla I no local original do Mbo I, como este se formou sobre a ligadura de ponta bruta. As junções hi-C e 3C foram digeridas com Mbo I à medida que o local de restrição se regenera sobre a ligadura (à esquerda do gel). Em contraste, as junções 3C não foram digeridas por Cla I no local mbo I, mas apenas por Mbo I. Compare o perfil de digestão dos produtos Hi-C e 3C usando Cla I. Um fragmento de 53 bp foi obtido pela digestão do produto Hi-C (devido à restrição do sítio Cla I formado no local Mbo I e restrição de um sítio Cla I já presente na região). Este fragmento não foi observado na digestão do produto 3C, pois o único local cla I disponível foi o que já estava presente na região. (B) Após a amplificação do PCR da biblioteca Hi-C utilizando diferentes ciclos de PCR, os produtos foram executados em um gel de 1,5% de agarose. Uma mancha de 400-1000 bp era esperada e observada. Os ciclos numéprios apropriados para o PCR de amplificação final devem ser tomados como o número imediatamente menor do que aquele em que uma mancha é apenas visível. (C) Biblioteca final Cla I digestão. Uma alíquota da biblioteca final foi re amplificada e digerida com Cla I. A redução de tamanho da mancha confirmou que grande parte das moléculas na biblioteca eram pares Hi-C válidos. A análise densitométrica deste gel pode ser realizada para obter uma razão entre as amostras da ONU e D, conforme detalhado na seção de resultados representativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estatísticas hic-pro da biblioteca Hi-C. (A) Representação esquemática de pares Hi-C válidos e os diferentes tipos de pares não válidos que podem ser produzidos durante o experimento e filtrados pela HiCPro27 (Tabela 2). Estes incluem leituras caindo em sequências contíguas, extremidades pendentes, mesmo fragmento, auto-círculo, re-ligaduras e duplicatas PCR. (B) Estatísticas de mapeamento. Lê-se que não se alinho é mostrado (cinza), e ambos lêem e lêem totalmente alinhados após o corte são mostrados em azul e azul claro, respectivamente. Essas duas categorias representam as leituras úteis que são consideradas em análises subsequentes. (C) Estatísticas de emparelhamento. Leituras multialinadas (laranja escura) representam leituras alinhadas em várias regiões do genoma. Leituras exclusivamente alinhadas (azul escuro) representam os pares de leitura que são alinhados uma vez no genoma, e singletons (laranja claro) representam pares de leitura em que apenas uma região genômica foi sequenciada em ambas as leituras. (D) Estatísticas de filtragem. Os pares de leitura válidos (azul) representam produtos de ligadura Hi-C bem sucedidos, conforme descrito em (A). Auto-fragmentos auto-círculos (rosa claro) são leituras não úteis, pois representam o mesmo fragmento genômico mostrado em(A). Extremidades penduradas do mesmo fragmento (laranja) representam leituras em que um único fragmento de restrição foi sequenciado. Pares filtrados e despejados (marrom) também são leituras não úteis que têm o tamanho errado ou para as quais o produto de ligadura não poderia ser reconstruído. Finalmente, as leituras de reconteção (vermelha) representam leituras nas quais dois fragmentos adjacentes foram re-ligados, produzindo assim informações não úteis. (E) A leitura válida combina a distribuição de contato no genoma. Contatos cis exclusivos (azul) são mais frequentes do que contatos trans únicos (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Matrizes de contato hi-C e análise virtual 4C de células WT e mutantes S2R+. (A) Mapa de calor normalizado hi-C de uma região de 50 kb em resolução de 1 kb centrada no lócus gene Notch. A pontuação de separação TAD32 para o lócus é mostrada, juntamente com a particionamento do lócus notch em dois domínios topológicos (Domínio 1 e Domínio 2). Os dados de ChIP-seq para APs, RNA Pol II e marcas de histona para células S2/S2R+34,35,36,37 são mostrados abaixo do mapa de calor(Tabela 1). As posições dos limites do domínio Notch 1 são destacadas em verde claro. (B) Representação esquemática do mutante CRISPR de fronteira B1. O retângulo verde indica a região de 343 bp suprimida. As tesouras indicam sgRNAs usados para edição de genoma mediada por CRISPR. Os locais de vinculação de motivos para APs são mostrados como caixas para CTCF e M1BP. As cúpulas de pico para APs de vinculação de DNA mostradas em (A) também são indicadas35. (C) Oi-C normalizou os heatmaps com resolução de 1 kb cobrindo uma região de 50 kb centrada em Notch para o WT e as células mutantes. À esquerda, o calor hi-C das diferenças de log2 na frequência de interação entre as células WT e mutantes. (D) Mapas de calor normalizados hi-C cobrindo uma região de 250 kb centrada em Notch com resolução de 5 kb para WT e células mutantes. À esquerda, o calor hi-C das diferenças de log2 na frequência de interação entre as células WT e mutantes. (E) Virtual-4C para células WT e mutantes usando o UTR de 5' de Notch como ponto de vista. As percentagens de interações entre o ponto de vista e as regiões dentro do kirredomain-2a montante , domínio notch 1, domínio notch 2 e domínio dnc a jusante para células WT e mutantes são mostradas25. Abreviaturas: WT = tipo selvagem; TAD = domínio topologicamente associado; ChIP = imunoprecipitação de cromatina; AP = proteína arquitetônica; RNA Pol = polimerase de RNA; Receptor S2R+ = S2 plus; sg RNA = RNA guia único; UTR = região não traduzida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experimentar | Amostra | Número de adesão GEO |
| Cavaco | CP190 | GSM1015404 |
| Cavaco | SuHW | GSM1015406 |
| Cavaco | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Cavaco | CTCF | GSM1015410 |
| Cavaco | Ibf1 | GSM1133264 |
| Cavaco | Ibf2 | GSM1133265 |
| Cavaco | BEAF32 | GSM1278639 |
| Cavaco | Pita | GSM1313420 |
| Cavaco | ZIPIC | GSM1313421 |
| Cavaco | RNA PolII | GSM2259975 |
| Cavaco | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Cavaco | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Cavaco | H3K27ac | GSM2259987 |
| Cavaco | MSL2 | GSM2469507 |
| Cavaco | H4K16ac | GSM2469508 |
| Cavaco | M1BP | GSM2706055 |
| Cavaco | GAF | GSM2860390 |
| Cavaco | Entrada | GSM1015412 |
| Hi-C | Células WT S2R+ | GSE136137 |
| Hi-C | Células S2R+ 5pN-delta343 | GSE136137 |
Tabela 1: Números de adesão GEO.
| Estatísticas do HiC-Pro | Lê | Porcentagem |
| Estatísticas de Mapeamento | ||
| Alinhamentos completos de leitura | 131515921 | 82.20% |
| Alinhamentos de leitura aparadas | 16408309 | 10.30% |
| Falha ao alinhar | 12110964 | 7.60% |
| Estatísticas de emparelhamento | ||
| Exclusivamente alinhado | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Multialintado | 57700021 | 36.90% |
| Estatísticas de filtragem | ||
| Pares Válidos | 71373989 | 90.12% |
| Mesmo Fragmento: Auto-círculo | 2340697 | 2.90% |
| Mesmo fragmento: Extremidades balançando | 2578783 | 3.20% |
| Pares filtrados | 2773043 | 3.50% |
| Pares despejados | 196565 | 0.20% |
| Estatísticas de contato | ||
| Exclusivo: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Exclusivo: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Único: trans | 4133602 | 5.80% |
| Pares de leitura duplicados | 398400 | 0.60% |
Tabela 2: Estatísticas do HiC-Pro.
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Discussion
O método Hi-C em núcleo apresentado aqui permitiu a exploração detalhada da topologia do genoma de Drosophila em alta resolução, proporcionando uma visão das interações genômicas em diferentes escalas genômicas, desde loops de cromatina entre elementos regulatórios, como promotores e melhoradores até TADs e identificação de compartimentos grandes25. A mesma tecnologia também foi aplicada eficientemente aos tecidos mamíferos com algumas modificações33. Por exemplo, ao processar um tecido em vez de uma suspensão unicelular, o tecido é peneirado através de um filtro de 70 μm, e a etapa de lise é realizada enquanto homogeneiza o material usando um homogeneizador Dounce. Além disso, como o genoma dos mamíferos é 25x maior que o genoma de Drosophila, o número de pares de leitura válidos necessários para construir matrizes de resolução de 1-5 kb é maior. O método Hi-C no núcleo difere do método Hi-C original2 em sua prevenção da lise nuclear com 1% de SDS a 65 °C antes da ligadura, preservando assim a integridade nuclear, e ligando em 1 mL em vez de 7 mL23,24.
O protocolo tem alguns passos fundamentais para garantir alta eficiência. O primeiro passo que pode introduzir a digestão e as ineficiências de preenchimento é a formação de aglomerados durante 0,3% de permeabilização de SDS e tratamentos surfactantes. Se os aglomerados forem grandes e difíceis de interromper, a velocidade rotativa deve ser reduzida para 400 rpm durante os tratamentos SDS e surfactantes. Se os aglomerados permanecerem difíceis de desagregar por pipetação, a amostra deve ser dividida em duas, ajustando os volumes com tampão de restrição, SDS e o surfactante não iônico antes de prosseguir com a permeabilização. Em seguida, os núcleos devem ser centrifugados em velocidade mínima (200 × g), o supernasce cuidadosamente descartado, e as amostras agrupadas em 450 μL de tampão de restrição de 1x antes de prosseguir com a digestão. Em segundo lugar, a estimativa da eficiência da digestão é importante para fornecer fragmentos de DNA suficientes para preenchimento e ligadura. Se após a avaliação qualitativa, a digestão for considerada ineficiente, uma segunda rodada de digestão deve ser realizada com a enzima de restrição por um período que varia de 4h a durante a noite.
Em terceiro lugar, a estimativa de eficiência de ligadura é importante. Se, após avaliação qualitativa, a ligadura for considerada ineficiente (ou seja, em vez da faixa de alto peso molecular, uma mancha semelhante à observada para a amostra digerida), a ligadura deve ser repetida por centrifugação dos núcleos a 200 × g e resususá-los na mistura de ligadura usando tampão de ligadura fresca de 10x e ligadura. Em quarto lugar, a porcentagem de produtos válidos hi-C deve ser estimada digerindo um amplicon PCR de uma interação esperada com Cla I (para digestão original Mbo I). A amplificação e digestão eficientes do amplicon da interação esperada confirma a ligadura e a formação bem sucedidas de junções Hi-C. Se a digestão de amplicon não for eficiente, a maioria das moléculas será 3C em vez de produtos Hi-C, e isso deve ser levado em consideração se a biblioteca será sequenciada. Isso também pode ser confirmado através da realização do controle final de digestão cla I da biblioteca, conforme descrito na seção de resultados representativos. Finalmente, a seleção do menor número de ciclos pcr é importante para evitar duplicatas pcr. Se, ao sequenciamento, a porcentagem de duplicatas de par de leitura for considerada alta, o número de ciclos pcr deve ser reduzido ainda mais.
Esta técnica hi-C no núcleo tem algumas limitações. Primeiro, o protocolo descrito aqui representa o experimento Hi-C realizado para uma população celular. Portanto, o sinal da frequência de contatos genômicos representa milhões de genomas com conformações individuais variáveis. Para obter o conjunto de contatos genômicos de um único genoma, recomenda-se um experimento Hi-C de uma única célula22. Segundo, Hi-C é baseado na ligadura de fragmentos de DNA proximal. Assim, se as regiões genômicas fazem parte de um grande complexo proteína-cromatina, a distância entre fragmentos poderia impedir a ligadura. Por exemplo, foi demonstrado que os contatos trans estão mal representados no Hi-C38. Além disso, o Hi-C termina com sequenciamento de extremidade pareada, recuperando assim pares de contatos genômicos. No entanto, vários fragmentos de DNA podem interagir simultaneamente no mesmo complexo de cromatina. Para obter a identidade de múltiplos fragmentos de DNA em um complexo de cromatina, métodos alternativos de sequenciamento podem ser aplicados ao Hi-C39, ou diferentes estratégias experimentais podem ser empregadas nas quais a ligadura não é realizada38,40,41. Finalmente, embora o Hi-C mede contatos genômicos, não revela a identidade das proteínas que mediam as interações. Métodos alternativos devem ser aplicados para identificar as interações genômicas mediadas por uma proteína particular de interesse42 ou a identidade do conjunto de proteínas em elementos genômicos específicos43.
Em conclusão, com um experimento Hi-C de alta qualidade como o descrito aqui para o genoma Drosophila(Tabela 2), as matrizes podem ser construídas em uma ampla gama de resoluções (a partir de 1, 5 kb, 50 kb ou inferior; ver Figura 4). Além disso, se uma determinada região do genoma tiver que ser avaliada no nível do fragmento de restrição, os dados podem ser usados para construir uma paisagem 4C virtual do ponto de vista desejado (por exemplo, o gene Notch 5' UTR na Figura 4E). A ferramenta Hi-C de outras extremidades em SeqMonk é uma opção muito fácil de usar que permite a visualização deste cenário. A aplicação da ferramenta de quantificação 4C, também parte do SeqMonk, a este cenário pode produzir contatos estatisticamente significativos.
A aplicação do experimento Hi-C no núcleo descrito aqui a uma coleção de linhas celulares mutantes com locais alterados de ligação de DNA AP nos limites do TAD(Figura 4) revelou que elementos genéticos são necessários nos limites para estruturar o genoma Drosophila em domínios e sustentar a regulação da expressão genética como totalmente discutido por Arzate-Mejía et al.25. Assim, a edição genética de elementos regulatórios com o sistema CRISPR/Cas9, combinada com o perfil de alta resolução das interações genômicas usando o protocolo Hi-C in-nucleus descrito aqui, pode ser uma estratégia poderosa para testar a função estrutural dos elementos genéticos.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo número de bolsas do PROGRAMA DE INOVAÇÃO E Amparo à Pesquisa (PAPIIT) da UNAM Technology Innovation and Research(PAPIIT) em 207319 e pelo número de bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. é um aluno de mestrado apoiado pelo número de CVU do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT) 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
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