Summary
Il genoma è organizzato nello spazio nucleare in diverse strutture che possono essere rivelate attraverso tecnologie di cattura della conformazione cromosomica. Il metodo Hi-C in-nucleus fornisce una raccolta a livello di genoma di interazioni cromatiniche nelle linee cellulari di Drosophila, che genera mappe di contatto che possono essere esplorate a risoluzione megabase a livello di frammento di restrizione.
Abstract
Il genoma è organizzato in domini topologicamente associanti (TAD) delimitati da confini che isolano le interazioni tra domini. In Drosophila, i meccanismi alla base della formazione e dei confini di TAD sono ancora in fase di studio. L'applicazione del metodo Hi-C nel nucleo qui descritto ha contribuito a sezionare la funzione dei siti di legame delle proteine architetturali (AP) ai confini TAD isolando il gene Notch. La modificazione genetica dei confini di dominio che causano la perdita di AP provoca la fusione TAD, difetti trascrizionali e alterazioni topologiche a lungo raggio. Questi risultati hanno fornito prove che dimostrano il contributo degli elementi genetici alla formazione dei confini del dominio e al controllo dell'espressione genica in Drosophila. Qui, il metodo Hi-C in-nucleus è stato descritto in dettaglio, che fornisce importanti punti di controllo per valutare la qualità dell'esperimento insieme al protocollo. Vengono inoltre mostrati i numeri richiesti di letture di sequenziamento e coppie Hi-C valide per analizzare le interazioni genomiche a diverse scale genomiche. L'editing genetico mediato da CRISPR/Cas9 di elementi regolatori e la profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche utilizzando questo protocollo Hi-C in-nucleus potrebbero essere una potente combinazione per lo studio della funzione strutturale degli elementi genetici.
Introduction
Negli eucarioti, il genoma è diviso in cromosomi che occupano territori specifici nello spazio nucleare durante l'interfase1. La cromatina che forma i cromosomi può essere divisa in due stati principali: uno di cromatina accessibile che è trascrizionalmente permissiva e l'altro di cromatina compatta che è trascrizionalmente repressiva. Questi stati di cromatina si segregano e raramente si mescolano nello spazio nucleare, formando due compartimenti distinti nel nucleo2. Alla scala sub-megabase, i confini separano i domini delle interazioni cromatiniche ad alta frequenza, chiamati TAD, che segnano l'organizzazione cromosomica3,4,5. Nei mammiferi, i confini TAD sono occupati dalla coesina e dal fattore di legame CCCTC (CTCF)6,7,8. Il complesso della coesina estrude la cromatina e si ferma nei siti di legame CTCF che vengono disposti in un orientamento convergente nella sequenza genomica per formare anelli di cromatina stabili9,10,13,14. L'interruzione genetica del sito di legame del DNA CTCF ai confini o la riduzione dell'abbondanza di CTCF e della proteina coesina provoca interazioni anormali tra elementi regolatori, perdita di formazione di TAD e derregolazione dell'espressionegenica 9,10,11,13,14.
In Drosophila, i confini tra i TAD sono occupati da diversi AP, tra cui il fattore 32 kDa associato all'elemento limite (BEAF-32), la proteina legante Motif 1 (M1BP), la proteina centrosomiale 190 (CP190), soppressore dell'ala pelosa (SuHW) e CTCF, e sono arricchiti in modificazioni isoniche attive e polimerasi II16,17,18. È stato suggerito che in Drosophila, i TAD appaiono come conseguenza della trascrizione13,17, 19e l'esattoruolodegli AP indipendenti nella formazione dei confini e nelle proprietà di isolamento è ancora in fase di studio. Pertanto, se i domini in Drosophila sono l'unica conseguenza dell'aggregazione di regioni di stati trascrizionali simili o se gli AP, incluso il CTCF, contribuiscono alla formazione dei confini rimane da caratterizzare completamente. L'esplorazione dei contatti genomici ad alta risoluzione è stata possibile attraverso lo sviluppo di tecnologie di cattura della conformazione cromosomica abbinate al sequenziamento di nuova generazione. Il protocollo Hi-C è stato descritto per la prima volta con la fase di legatura eseguita "insoluzione" 2 nel tentativo di evitare prodotti di legatura spuri tra frammenti di cromatina. Tuttavia, diversi studi hanno indicato la realizzazione che il segnale utile nei dati proveniva da prodotti di legatura formati in nuclei parzialmente llysed che non erano insoluzione 20,21.
Il protocollo è stato quindi modificato per eseguire la legatura all'interno del nucleo come parte dell'esperimento Hi-C a cellula singola22. Il protocollo Hi-C in-nucleus è stato successivamente incorporato nella popolazione cellulare Hi-C per produrre una copertura più coerente su tutta la gamma di distanze genomiche e produrre dati con meno rumore tecnico23,24. Il protocollo, qui descritto in dettaglio, si basa sul protocollo Hi-C23, 24 in-nucleus di popolazione ed è stato utilizzato per studiare le conseguenze della rimozione genetica di motivi leganti il DNA per CTCF e M1BP da un confine di dominio al locus del gene Notch in Drosophila25. I risultati mostrano che l'alterazione dei motivi di legame del DNA per gli AP al confine ha conseguenze drastiche per la formazione del dominio di Notch, difetti topologici più grandi nelle regioni che circondano il locus di Notch e la derregolazione dell'espressione genica. Ciò indica che gli elementi genetici ai confini del dominio sono importanti per il mantenimento della topologia del genoma e dell'espressione genica in Drosophila25.
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Protocol
1. Fissazione
- Inizia con 10 milioni di cellule Schneider line 2 plus (S2R+) per preparare 17,5 mL di sospensione cellulare in mezzo Schneider contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere formaldeide priva di metanolo per ottenere una concentrazione finale del 2%. Mescolare e incubare per 10 minuti a RT, avendo cura di mescolare ogni minuto.
NOTA: La formaldeide è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate e lavorare nella cappa aspirante. - Spegnere la reazione aggiungendo glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 M e mescolare. Incubare per 5 minuti a RT, seguiti da 15 minuti sul ghiaccio.
- Centrifugare per 400 × g a RT per 5 min e poi per 10 min a 4 °C; scartare il surnatante. Rispenare accuratamente il pellet in 25 ml di soluzione salina fredda tamponata con 1x fosfato.
- Centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.
NOTA: se si continua con il protocollo, andare al passaggio 2.1 per la lisi; in caso contrario, congelare il pellet nel liquido N2 e conservare il pellet a -80 °C.
2. Lisi
- Spesesere le cellule in 1 mL di tampone di lisi ghiacciato (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% di tensioattivo non ionico (vedere la Tabella dei materiali);10 mM NaCl; 1x inibitori della proteasi) e regolare il volume a 10 mL con tampone di lisi ghiacciato. Regolare il volume per ottenere una concentrazione di 1 × 106 celle/ml. Incubare su ghiaccio per 30 min, mescolando ogni 2 min invertendo i tubi.
- Centrifugare i nuclei a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare con cura il surnatante. Lavare il pellet 1x con 1 mL di tampone di lisi fredda e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga. Lavare il pellet 1x con 1 mL di buffer di restrizione freddo 1,25x e risusciere ogni pellet di cella in 360 μL di tampone di restrizione 1,25x.
- Aggiungere 11 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% per tubo (concentrazione finale dello 0,3%), mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 37 °C per 45 minuti, agitando a 700-950 giri/min. Pipettare su e giù per interrompere i grumi un paio di volte durante l'incubazione.
- Spegnere la SDS aggiungendo 75 μL di tensioattivo non ionico (soluzione al 10%, vedere la Tabella dei materiali)per tubo (concentrazione finale dell'1,6%) e incubare a 37 °C per 45 min, agitando a 950 giri/min. Pipettare su e giù un paio di volte per interrompere i grumi durante l'incubazione.
NOTA: se i grumi sono grandi e difficili da interrompere, ridurre la velocità di rotazione a 400 giri / min durante i trattamenti SDS e tensioattivi. Se i grumi sono difficili da disaggregare mediante pipettaggio, dividere il campione in due; regolare i volumi di buffer di restrizione, SDS e tensioattivo; e procedere con la permeabilizzazione. Quindi, ruotare i nuclei alla velocità minima (200 × g),scartare con cura il surnatante, raggruppare i campioni insieme in un buffer di restrizione 1X e procedere con la digestione. Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione non digerito (UD).
3. Digestione enzimatica
- Digerire la cromatina aggiungendo 200 unità (U) di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per un periodo che va da 4 ore a una notte durante la rotazione (950 giri/min).
- Il giorno successivo, aggiungere altri 50 U di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore durante la rotazione (950 giri/min).
- Inattivare l'enzima incubando i tubi a 60 °C per 20 min. Posizionare i tubi sul ghiaccio.
NOTA: Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione digerito (D).
4. La biotinilazione delle estremità del DNA
- Per riempire le sporgenze del frammento di restrizione ed etichettare le estremità del DNA con biotina, aggiungere 1,5 μL ciascuno di 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL di 0,4 mM di biotina dATP, 17,5 μL di tampone Tris a basso EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] e 10 μL di 5 U / μL di Klenow (DNA polimerasi I grande frammento) a tutti i tubi. Mescolare con cura e incubare per 75 minuti a 37 °C. Agitare a 700 giri / min ogni 10 s per 30 s. Posizionare tutti i tubi sul ghiaccio mentre si prepara la miscela di legatura.
5. Legatura
- Trasferire ogni miscela di cromatina digerita in un tubo separato da 1 mL con miscela di legatura (100 μL di tampone di legatura 10x, 10 μL di albumina sierica bovina da 10 mg/mL, 15 U di DNA ligasi T4 e 425 μL di acqua a doppia distillazione [ddH2O]). Mescolare accuratamente con un leggero pipettaggio e incubare durante la notte a 16 °C.
6. Inversione del reticolare e purificazione del DNA
- Degradare le proteine aggiungendo 50 μL di 10 mg/mL di proteinasi K per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore. Invertire i collegamenti incrociati aumentando la temperatura a 65 °C e incubare durante la notte.
- Degradare l'RNA aggiungendo 20 μL di 10 mg/mL di RNasi A e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Eseguire l'estrazione del fenolo:cloroformio seguita dalla precipitazione dell'etanolo.
- Aggiungere 1 volume di fenolo-cloroformio e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea.
NOTA: Il fenolo è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate. Lavora nella cappa aspirante. - Centrifuga a 15.000 × g per 15 min. Trasferire la fase acquosa in un tubo microcentrifuga fresco da 2 ml. Eseguire una retro-estrazione dello strato inferiore con 100 μL di tampone TLE e trasferire la fase acquosa nello stesso tubo da 2 mL.
- Precipitare il DNA aggiungendo 2 volumi di alcol etilico al 100% (EtOH), 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M e 2 μL di glicogeno da 20 mg/mL. Incubare a -20 °C per un periodo che va dalle 2 ore alla notte.
- Girare a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C e lavare il pellet 2 volte con etOH al 70% ghiacciato. Asciugare i pellet a RT e ricaspenare in 100 μL di tampone TLE. Quantificare il DNA utilizzando un colorante fluorogenico che si lega selettivamente al DNA e un fluorometro secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i prodotti di legatura a 4 °C per il breve periodo o a -20 °C a lungo termine. Utilizzare un'aliquota (100 ng) del materiale come campione legato (L) per il controllo di qualità.
- Aggiungere 1 volume di fenolo-cloroformio e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea.
7. Valuta la qualità del modello Hi-C
- Controlli qualitativi di digestione e legatura
- Purificare il DNA dalle aliquote UD e D invertendo i collegamenti incrociati ed eseguire l'estrazione fenolo:cloroformio e la precipitazione dell'etanolo come descritto sopra.
- Caricare 100 ng di campioni UD, D e L in un gel di acarosio all'1,5%. Cerca uno striscio centrato intorno a 500 bp nel campione D rispetto a una banda ad alto peso molecolare per il campione L (vedi risultati rappresentativi).
- Controllo quantitativo dell'efficienza digestiva
NOTA: per valutare l'efficienza della digestione in modo più accurato, utilizzare i campioni UD e D come modelli per eseguire reazioni quantitative a catena della polimerasi (qPCR) utilizzando primer progettati come segue.- Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA contenente il sito di restrizione del DNA per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I nel presente protocollo), chiamato R nella formula nel passaggio 7.2.3.
- Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA di controllo che non contiene il sito di restrizione per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I per il presente protocollo), chiamato C nella formula nel passaggio 7.2.3.
- Utilizzare i valori di soglia del ciclo (valori Ct) dell'amplificazione per calcolare l'efficienza di restrizione secondo la formula mostrata di seguito:
% Restrizione = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Dove CtR si riferisce al valore Ct del frammento R e CtC si riferisce al valore Ct del frammento C per il campione D e il campione UD.
NOTA: la percentuale di restrizione riflette l'efficienza dell'enzima di restrizione che scinde il frammento di DNA (R) ristretto rispetto a un frammento di DNA di controllo (C) che non contiene il sito del DNA di restrizione. Si raccomanda un'efficienza di restrizione dell'≥ dell'80%.
- Rilevamento di interazioni note
- Eseguire la PCR per amplificare un controllo di legatura interno per esaminare le interazioni a corto raggio e/ o medio o lungo raggio (vedere risultati rappresentativi).
- In alternativa, progettare primer per amplificare un prodotto di legatura in cui i primer sono in orientamento avanti-avanti o indietro-indietro in frammenti di restrizione adiacenti.
- Controllo del riempimento e dell'etichettatura della biotina
- Verificare la marcatura Hi-C e l'efficienza di legatura mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota o di un prodotto di legatura tra frammenti di restrizione adiacenti nel genoma, come descritto sopra.
NOTA: Il riempimento e la legatura riusciti del sito Mbo I (GATC) generano un nuovo sito per l'enzima di restrizione Cla I (ATCGAT) alla giunzione di legatura e rigenerano il sito Mbo I. - Digerire il prodotto PCR con Mbo I, Cla I o entrambi. Dopo aver eseguito i campioni su un gel all'1,5-2%, stimare il numero relativo di giunzioni di legatura 3C e Hi-C quantificando l'intensità delle bande tagliate e nontagliate 26.
NOTA: si desidera un'efficienza del > il 70% (vedere risultati rappresentativi).
- Verificare la marcatura Hi-C e l'efficienza di legatura mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota o di un prodotto di legatura tra frammenti di restrizione adiacenti nel genoma, come descritto sopra.
8. Sonicazione
- Sonicare i campioni per ottenere frammenti di DNA da 200-500 bp. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo (vedi tabella dei materiali),diluire il campione (da 5 a 10 μg) in 130 μL di ddH2O per tubo e impostare lo strumento su sonicare a 400 bp: livello di riempimento: 10; fattore di dazio: 10%; potenza incidente di picco (w): 140; cicli per scoppio: 200; tempo (i): 80.
9. Rimozione della biotina / riparazione finale
NOTA: I passaggi mostrati di seguito sono regolati per 5 μg di DNA Hi-C.
- Per eseguire la rimozione della biotina, trasferire il campione (130 μL) in un tubo microcentrifuga fresco. Aggiungere 16 μL di tampone di legatura 10x, 2 μL di dATP 10 mM, 5 μL di T4 DNA polimerasi (15U) e 7 μL di ddH2O (160 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.
- Aggiungere 5 μL di 10 mM dNTPs, 4 μL di tampone di legatura 10x, 5 μL di polinucleotide chinasi T4 (10 U/μL), 1 μL di Klenow e 25 μL di ddH2O (200 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.
10. Selezione delle dimensioni
- Per selezionare frammenti per lo più nell'intervallo di dimensioni 250-550 bp, eseguire la selezione sequenziale delle dimensioni dell'immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) prima con 0,6x, seguita da 0,90x secondo le istruzioni del produttore, ed eluire il DNA utilizzando 100 μL di TLE.
11. Pulldown di biotina / A-tailing / legatura dell'adattatore
NOTA: Eseguire i lavaggi risussoscendendo le perle magnetiche vorticosamente, ruotare i campioni per 3 minuti su una ruota rotante, quindi ruotare brevemente il campione e posizionarlo sul supporto magnetico. Lasciare che le pere si attacchino al magnete, scartare il surnatante e procedere con la successiva fase di lavaggio. Eseguire i lavaggi a 55 °C su un termoblotto con rotazione al posto della ruota rotante.
- Portare il volume finale a 300 μL per campione con TLE per il pull-down. Preparare i tamponi per il lavaggio delle perle: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x Tampone No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Utilizzare 150 μL di perle magnetiche legate alla streptavitina (vedere la Tabella dei materiali)per biblioteca. Lavare le perle 2x con 400 μL di 1x TB. Quindi sospendare le perle in 300 μL 2x NTB.
- Mescolare le perle con il materiale Hi-C da 300 μL e incubare a RT per 30 minuti su una ruota rotante per consentire il legame della biotina alle perle di streptavicina.
- Lavare le perle con 400 μL di 0,5x TB e incubare a 55 °C per 3 min, ruotando a 750 giri/min. Lavare le perle in 200 μL di 1x buffer di restrizione.
- Riespendare le perle in 100 μL di miscela di coda dATP (5 μL di 10 mM dATP, 10 μL di tampone di restrizione 10x, 5 μL di Klenow exo- e 80 μL di ddH2O). Incubare a 37 °C per 30 min.
- Rimuovere il surnatante, lavare le perle 2x con 400 μL di 0,5x TB incubando a 55 °C per 3 min e ruotando a 750 rpm.
- Lavare le perle con 400 μL di 1x NTB e poi con 100 μL di 1x tampone di legatura.
- Risuscimere le perle in 50 μL di tampone di legatura 1x e trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Aggiungere 4 μL di adattatori in PE preittidati (15 μM di stock) e 2 μL di T4 ligasi (400 U/μL, cioè 800 U/tubo); incubare a RT per 2 ore.
NOTA: Pre-ricottura degli adattatori aggiungendo volumi uguali di entrambi gli adattatori PE 1.0 e PE 2.0 (stock da 30 μM) e incubando per 10 minuti a RT (vedi la Tabella dei materiali). - Ricatturisci le perle rimuovendo il surnatante e lavando le perle 2x con 400 μL di TB. Lavare le perle con 200 μL di 1x NTB, quindi con 100 μL di 1x buffer di restrizione, e risospendare le perle in 40 μL di 1x buffer di restrizione.
12. Amplificazione PCR
- Impostare PCR di 25 μL di volume con 5, 6, 7 e 8 cicli. Per ogni PCR, utilizzare:
Ricetta di reazione Pere Hi-C 2,5 μL 10 μM PE PCR primer 1 (Tabella dei materiali) 0,75 μL 10 μM PE PCR primer 2 (Tabella dei materiali) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL 5x tampone di reazione 5 μL DNA polimerasi 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Totale 25 μL Cicli Temperatura Ore 1 98 °C 30 anni n cicli 98 °C 10 s 65 °C 30 anni 72 °C 30 anni 1 72 °C 7 minuti
13. Amplificazione PCR finale
- Eseguire l'amplificazione PCR finale utilizzando le stesse condizioni sopra descritte e il numero di cicli selezionati. Dividere il campione utilizzando 5 μL di perle Hi-C come modello in reazioni da 50 μL.
- Raccogliere tutte le reazioni PCR e trasferirle in un tubo fresco. Utilizzare il magnete per rimuovere le pere di streptavitina e recuperare il surnatante (prodotti PCR). Trasferire le perle in un tubo fresco, lavare le perle come indicato al punto 11.2.9 e conservare in 1x buffer di restrizione a 4 °C come backup.
- Purificare i prodotti PCR utilizzando 0,85 volte il volume delle perle SPRI secondo le istruzioni del produttore. Elute con 30 μL di tampone TLE.
- Quantificare la libreria Hi-C utilizzando uno strumento fluorometrico e confermare la qualità della libreria mediante elettroforesi capillare basata su chip.
- Come ultimo punto di controllo di qualità, utilizzare 1 μL della libreria Hi-C come modello per eseguire una reazione PCR utilizzando 10 cicli utilizzando le stesse condizioni descritte nel passaggio 12.1. Dividere il prodotto PCR in due tubi microcentrifuga: digerire uno con Cla I e lasciare l'altro non digerito come controllo. Eseguire i prodotti in un gel di acarosio all'1,5-2% (vedere risultati rappresentativi).
- Procedere al sequenziamento accoppiato a 50 bp o 75 bp su una piattaforma di sequenziamento adeguata.
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Representative Results
Di seguito sono descritti i risultati di un protocollo Hi-C di successo (vedere un riepilogo del flusso di lavoro del protocollo Hi-C nella Figura 1A). Ci sono diversi punti di controllo della qualità durante l'esperimento Hi-C in-nucleus. Le aliquote del campione sono state raccolte prima (UD) e dopo (D) la fase di restrizione della cromatina e dopo la legatura (L). I collegamenti incrociati sono stati invertiti e il DNA è stato purificato eseguito su un gel di agarosio. Uno striscio di 200-1000 bp è stato osservato quando la restrizione con Mbo I ha avuto successo (Figura 1B). La dimensione prevista della molecola dipende dall'enzima di restrizione scelto. Se la legatura ha avuto successo, è stata osservata una fascia ad alto peso molecolare nella parte superiore del gel (Figura 1B). L'efficienza della digestione può anche essere confermata dalla qPCR come descritto in dettaglio nel protocollo. Un'efficienza digestiva accettabile è pari o superiore all'80% (Figura 1C).
Per valutare in dettaglio l'efficienza della legatura Hi-C, i primer possono essere progettati per amplificare un controllo interno del prodotto di legatura in cui i primer sono in orientamento avanti-avanti o indietro-indietro in frammenti di restrizione adiacenti. In alternativa, i primer possono essere progettati per amplificare le interazioni note. La Figura 2A mostra l'amplificazione di un'interazione nota a medio raggio (300 kb) in Drosophila25. I prodotti di legatura Hi-C (in cui la marcatura, il riempimento e la legatura della biotina si sono verificati con successo) possono essere stimati dalla digestione del prodotto PCR recuperato nell'amplificazione. Dopo il riempimento e la legatura, gli ampliconi Hi-C conterranno un nuovo sito di restrizione Cla I nel sito originale di Mbo I, che viene conservato dopo la legatura smussata. Se la restrizione con Cla I non è completa, la reazione di riempimento e la marcatura della biotina saranno inefficienti. Si raccomanda un'efficienza di digestione superiore al 70% per evitare di avere una grande percentuale di letture non utili per le librerie dopo il sequenziamento (Figura 2A, confrontare la digestione Cla I del modello 3C rispetto al modello Hi-C).
Per determinare un numero adeguato di cicli di amplificazione PCR per amplificare la libreria Hi-C finale, le reazioni PCR sono state impostate utilizzando 2,5 μL di una data libreria su perle, come descritto nel protocollo. Il numero di cicli PCR per l'amplificazione finale è un ciclo in meno rispetto al numero di cicli per i quali lo striscio è visibile (Figura 2B). In questo caso sono stati scelti 4 cicli di amplificazione PCR. Come checkpoint di qualità finale, un'aliquota della libreria Hi-C è stata ri-amplificata e digerita con Cla I. Il livello di digestione della libreria (una diminuzione della dimensione dello striscio) indica l'abbondanza di coppie Hi-C valide e riflette la proporzione di letture utili che si otterranno dalla libreria (Figura 2C). Un rapporto tra l'intervallo di dimensioni superiori (determinato dalla dimensione presente nel campione UD) e l'intervallo di dimensioni inferiori in entrambi i campioni UD e D dovrebbe produrre un rapporto > 1 per l'UD e un rapporto ≤ 1 per il campione digerito se la digestione Cla I è efficiente.
Dopo la sequenziazione di fine accoppiata, i file FASTQ (Tabella 1) sono stati elaborati utilizzando HiCPro28 e le statistiche generate tracciate utilizzando MultiQC28. Uno strumento alternativo a HiCPro è la pipeline HiCUP30 che produce risultati simili (non mostrati). La Figura 3 e la Tabella 2 mostrano le informazioni statistiche dettagliate delle letture sequenziate. Vengono riportati l'allineamento completo della lettura e l'allineamento dopo il taglio. Queste due categorie corrispondono a letture allineate con successo che verranno utilizzate nell'analisi successiva per trovare coppie Hi-C valide. La categoria alignment-after-trimming si riferisce alle letture che attraversano la giunzione di legatura, che non sono state allineate nel primo passaggio e vengono tagliate nel sito di legatura per poi riallineare la loro estremità di 5' al genoma28 (Figura 3B,C e Tabella 2). Le statistiche di contatto mostrano che la libreria Hi-C era di alta qualità con l'82,2% di coppie valide e il 7,6% di letture non utili che cadevano nello stesso autocerchio di frammenti, nelle estremità penzolanti dello stesso frammento, nella ri-legatura, nelle coppie filtrate e nelle categorie di coppie scaricate (Figura 3A, Figura 3De Tabella 2). Inoltre, il numero di duplicati PCR è molto basso, indicando che la complessità della libreria è elevata e che i cicli PCR hanno introdotto artefatti minimi (Figura 3E e Tabella 2).
Utilizzando le coppie Hi-C valide univoche, l'analisi di base della distribuzione delle coppie è stata eseguita utilizzando HiCPro27. Questo esperimento ha prodotto il 46,5% di contatti cis unici ≤ 20 kbp, il 47,1% di contatti cis unici > 20 kbp e il 5,8% di contatti trans unici (Figura 3D). La distribuzione di cis a coppie trans valide corrispondeva ai risultati attesi per un esperimento Hi-C di successo con la maggior parte delle interazioni rilevate all'interno dello stesso cromosoma. Un'alta percentuale di contatti trans indica una fissazione inefficiente. Utilizzando le coppie valide Hi-C di HiCPro27,le matrici sono state normalizzate mediante correzione iterativa e decomposizione dell'autovettore (ICE)30e sono state generate matrici di risoluzione da 1 kb e 5 kb utilizzando HiCPlotter30,31,32. Matrici di contatto normalizzate a risoluzione di 1 kb e 5 kb sono presentate per il locus del gene Notch in Drosophila (Figura 4A, Figura 4Ce Figura 4D). Nella Figura 4A, il locus del gene Notch può essere visto insieme agli AP, dominio l e II, così come le modifiche istoniche lungo il locus (Figura 4A e Tabella 1). Il design della delezione CRISPR-Cas9 ha coinvolto il motivo di CTCF e M1BP (Figura 4B).
Al momento della delezione della regione contenente sia i siti di legame del DNA CTCF che M1BP al confine 5' del locus Notch (5pN-delta343, Tabella 1), si può osservare un drammatico cambiamento nei contatti cromatici con perdita di interazioni all'interno del locus Notch e guadagno di contatti con il TAD a monte rispetto al tipo selvatico (WT) (Figura 4C,D). Infine, la Figura 4E mostra un panorama dettagliato dei profili di interazione WT e mutanti a livello di frammento di restrizione dal gene Notch 5' UTR, mostrando una diminuzione della proporzione di contatti effettuati con il locus del gene Notch e un aumento dei contatti con il dominio upstream. Le viste virtuali 4C del gene Notch 5' UTR sono state ottenute utilizzando HiC-Pro27. Uno strumento alternativo è la quantificazione Hi-C other-ends disponibile in SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Tutti i risultati presentati in Figura 4 sono stati ottenuti applicando il protocollo Hi-C in-nucleus in wt e cellule mutanti S2R+ Drosophila, come descritto da Arzate-Mejía et al.25.
Figura 1: Controlli della digestione e della legatura Hi-C nel nucleo. ( A )Panoramicadel protocollo Hi-C. Le cellule sono reticolate con la formaldeide, con conseguenti legami covalenti tra segmenti di cromatina (frammenti di DNA: rosa, viola) e proteine. La cromatina viene digerita con un enzima di restrizione (rappresentato da forbici), in questo esempio, Mbo I. Le estremità appiccicose risultanti sono riempite con nucleotidi tra cui un dATP biotinilato (cerchi blu scuro). Il DNA viene purificato e le giunzioni biotinilate sono arricchite utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavitina (cerchi grigi). I frammenti interagenti sono identificati dal sequenziamento accoppiato di nuova generazione. (B) Controlli di qualità della digestione e della legatura Hi-C per due repliche biologiche (Hi-C 1 e Hi-C 2). Le librerie Hi-C sono state risolte su un gel di agarose all'1,5%. Entrambe le librerie digerite, D, funzionano come uno striscio intorno ai 600 bp. I campioni legati, Lig, vengono eseguiti come una banda piuttosto stretta più grande di 10 kb simile ai campioni UD non digeriti. Le differenze nella potenza del segnale sono dovute a quantità irregolari di DNA caricato sul gel. (C) Controllo quantitativo della digestione Hi-C mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi per le stesse due repliche biologiche dicuial punto B (Hi-C 1 e Hi-C 2) utilizzando i valori di soglia del ciclo come dettagliato nel protocollo. Una digestione di successo ha ≥ restrizione dell'80%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Controlli di riempimento e legatura smussata Hi-C nel nucleo. (A) Valutazione del riempimento e dell'etichettatura della biotina. Un'interazione nota tra frammenti situati a 300 kb di distanza nel cromosoma X è stata utilizzata come controllo e amplificata utilizzando i primer indicati con frecce nere (vedi parte superiore dello schema in (B), primer 1 (a sinistra), primer 2 (a destra), Tabella 1), generando un amplicon di 347 bp. I prodotti di legatura Hi-C possono essere distinti da quelli prodotti in un esperimento 3C dalla digestione del sito di legatura. Le giunzioni Hi-C sono state digerite da Cla I nel sito originale di Mbo I, poiché questo si è formato dopo la legatura smussata. Le giunzioni Hi-C e 3C sono state digerite con Mbo I mentre il sito di restrizione si rigenera dopo la legatura (a sinistra del gel). Al contrario, le giunzioni 3C non sono state digerite da Cla I nel sito Mbo I, ma solo da Mbo I. Confrontare il profilo di digestione dei prodotti Hi-C e 3C utilizzando Cla I. Un frammento di 53 bp è stato ottenuto digerendo il prodotto Hi-C (a causa della restrizione del sito Cla I formato nel sito Mbo I e della restrizione di un sito Cla I già presente nella regione). Questo frammento non è stato osservato nella digestione del prodotto 3C in quanto l'unico sito Cla I disponibile era quello che era già presente nella regione. (B) Dopo l'amplificazione PCR della libreria Hi-C utilizzando diversi cicli PCR, i prodotti sono stati eseguiti su un gel di agarose all'1,5%. Uno striscio di 400-1000 bp era previsto e osservato. I cicli numerici appropriati per la PCR di amplificazione finale devono essere presi come il numero immediatamente inferiore a quello in cui uno striscio è appena visibile. (C) Biblioteca finale Cla I digestione. Un'aliquota della biblioteca finale è stata ri-amplificata e digerita con Cla I. La riduzione delle dimensioni dello striscio ha confermato che gran parte delle molecole nella libreria erano coppie Hi-C valide. L'analisi densitometrica di questo gel può essere eseguita per ottenere un rapporto tra i campioni UN e D, come dettagliato nella sezione dei risultati rappresentativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Statistiche HiC-Pro della libreria Hi-C. (A) Rappresentazione schematica di coppie Hi-C valide e dei diversi tipi di coppie non valide che possono essere prodotte durante l'esperimento e filtrate da HiCPro27 (Tabella 2). Questi includono letture che cadono in sequenze contigue, estremità penzolanti, stesso frammento, autocerchio, rileggiature e duplicati PCR. (B) Statistiche cartotoste. Le letture che non sono riuscite ad allinearsi vengono visualizzate (grigio) e sia le letture completamente allineate che le letture allineate dopo il taglio vengono visualizzate rispettivamente in blu e azzurro. Queste due categorie rappresentano le letture utili che vengono considerate nelle analisi successive. (C) Statistiche di accoppiamento. Le letture multi allineate (arancione scuro) rappresentano letture allineate in più regioni del genoma. Le letture univocamente allineate (blu scuro) rappresentano le coppie di lettura che sono allineate una volta nel genoma e i singleton (arancione chiaro) rappresentano le coppie di lettura in cui è stata sequenziata una sola regione genomica in entrambe le letture. (D) Statistiche di filtraggio. Le coppie di lettura valide (blu) rappresentano i prodotti di legatura Hi-C di successo come descritto in (A). Gli autocerchi di auto-frammenti (rosa chiaro) sono letture non utili in quanto rappresentano lo stesso frammento genomico mostrato in (A). Le estremità penzolanti dello stesso frammento (arancione) rappresentano letture in cui è stato sequenziato un singolo frammento di restrizione. Le coppie filtrate e scaricate (marrone) sono anche letture non utili che hanno la dimensione sbagliata o per le quali non è stato possibile ricostruire il prodotto di legatura. Infine, le letture di ri-legatura (rosse) rappresentano letture in cui due frammenti adiacenti sono stati ri-ligati, producendo così informazioni non utili. (E) Distribuzione dei contatti delle coppie di lettura valide nel genoma. I contatti cis unici (blu) sono più frequenti dei contatti trans univoci (verde). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Matrici di contatto Hi-C e analisi virtuale 4C di cellule WT e mutanti S2R+. (A) Mappa di calore normalizzata Hi-C di una regione di 50 kb con risoluzione di 1 kb centrata nel locus del gene Notch. Viene mostrato il punteggio di separazione TAD32 per il locus, insieme al partizionamento del locus Notch in due domini topologici (Dominio 1 e Dominio 2). I dati ChIP-seq per AP, RNA Pol II e segni istonici per le cellule S2/S2R+34,35,36,37 sono mostrati sotto la mappa di calore(Tabella 1). Le posizioni dei limiti del dominio Notch 1 sono evidenziate in verde chiaro. (B) Rappresentazione schematica del mutante CRISPR al limite B1. Il rettangolo verde indica l'area di 343 bp eliminata. Le forbici indicano sgRNA utilizzati per l'editing del genoma mediato da CRISPR. I siti di legame dei motivi per gli AP sono mostrati come caselle per CTCF e M1BP. I picchi di picco per gli AP leganti il DNA mostrati in (A) sono anche indicati35. (C) Mappe di calore normalizzate Hi-C a risoluzione 1 kb che coprono una regione di 50 kb centrata in Notch per il WT e le cellule mutanti. A sinistra, mappe di calore Hi-C delle differenze log2 nella frequenza di interazione tra WT e cellule mutanti. (D) Mappe di calore normalizzate Hi-C che coprono una regione di 250 kb centrata in Notch a una risoluzione di 5 kb per WT e cellule mutanti. A sinistra, mappe di calore Hi-C delle differenze log2 nella frequenza di interazione tra WT e cellule mutanti. (E) Virtual-4C per WT e cellule mutanti che utilizzano l'UTR 5' di Notch come punto di vista. Le percentuali di interazioni tra il punto di vista e le regioni all'interno del kirredomain-2upstream, del dominio Notch 1, del dominio Notch 2 e del dominio dnc downstream sia per WT che per le cellule mutanti sono mostrate25. Abbreviazioni: WT = wild type; TAD = dominio topologicamente associato; ChIP = immunoprecipitazione della cromatina; AP = proteina architettonica; RNA Pol = RNA polimerasi; S2R+ = recettore S2 plus; sg RNA = RNA a guida singola; UTR = regione non tradotta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Rsperimento | Campione | GEO Numero di adesione |
| Scheggia | CP190 | GSM1015404 |
| Scheggia | SuHW · | GSM1015406 |
| Scheggia | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Scheggia | CTCF · | GSM1015410 |
| Scheggia | Ibf1 · | GSM1133264 |
| Scheggia | Ibf2 · | GSM1133265 |
| Scheggia | BEAF32 · | GSM1278639 |
| Scheggia | Pita | GSM1313420 |
| Scheggia | ZIPIC | GSM1313421 |
| Scheggia | RNA PolII | GSM2259975 |
| Scheggia | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Scheggia | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Scheggia | H3K27ac | GSM2259987 |
| Scheggia | MSL2 · | GSM2469507 |
| Scheggia | H4K16ac | GSM2469508 |
| Scheggia | M1BP · | GSM2706055 |
| Scheggia | GAF · | GSM2860390 |
| Scheggia | Immissione | GSM1015412 |
| Hi-C | Celle WT S2R+ | GSE136137 |
| Hi-C | Celle S2R+ 5pN-delta343 | GSE136137 |
Tabella 1: Numeri di adesione GEO.
| Statistiche HiC-Pro | Legge | Percentuale |
| Statistiche di mappatura | ||
| Allineamenti a lettura completa | 131515921 | 82.20% |
| Allineamenti di lettura tagliati | 16408309 | 10.30% |
| Impossibile allineare | 12110964 | 7.60% |
| Statistiche di accoppiamento | ||
| Allineato in modo univoco | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Multi allineato | 57700021 | 36.90% |
| Statistiche di filtraggio | ||
| Coppie valide | 71373989 | 90.12% |
| Stesso frammento: autocerchio | 2340697 | 2.90% |
| Stesso frammento: estremità pendenti | 2578783 | 3.20% |
| Coppie filtrate | 2773043 | 3.50% |
| Coppie scaricate | 196565 | 0.20% |
| Statistiche di contatto | ||
| Unico: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Unico: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Unico: trans | 4133602 | 5.80% |
| Coppie di lettura duplicate | 398400 | 0.60% |
Tabella 2: Statistiche HiC-Pro.
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Discussion
Il metodo Hi-C in-nucleus qui presentato ha permesso l'esplorazione dettagliata della topologia del genoma di Drosophila ad alta risoluzione, fornendo una visione delle interazioni genomiche a diverse scale genomiche, dai loop di cromatina tra elementi regolatori come promotori e potenziatori a TAD e identificazione di grandi compartimenti25. La stessa tecnologia è stata applicata in modo efficiente anche ai tessuti dei mammiferi con alcune modifiche33. Ad esempio, quando si elabora un tessuto anziché una sospensione a singola cellula, il tessuto viene setacciato attraverso un filtro da 70 μm e la fase di lisi viene eseguita durante l'omogeneizzazione del materiale utilizzando un omogeneizzatore Dounce. Inoltre, poiché il genoma dei mammiferi è 25 volte più grande del genoma di Drosophila, il numero di coppie di lettura valide necessarie per costruire matrici di risoluzione 1-5 kb è maggiore. Il metodo Hi-C in-nucleus differisce dal metodo Hi-C originale2 per evitare la lisi nucleare con 1% di SDS a 65 °C prima della legatura, preservando così l'integrità nucleare, e legando in 1 mL invece di 7 mL23,24.
Il protocollo ha alcuni passaggi chiave per garantire un'elevata efficienza. Il primo passo che può introdurre inefficienze di digestione e riempimento è la formazione di grumi durante la permeabilizzazione allo 0,3% della SDS e i trattamenti tensioattivi. Se i grumi sono grandi e difficili da interrompere, la velocità di rotazione deve essere ridotta a 400 giri / min durante i trattamenti SDS e tensioattivi. Se i grumi rimangono difficili da disaggregare mediante pipettaggio, il campione deve essere diviso in due regolando i volumi con buffer di restrizione, SDS e tensioattivo non ionico prima di procedere con la permeabilizzazione. Successivamente, i nuclei devono essere centrifugati alla velocità minima (200 × g),il surnatante accuratamente scartato e i campioni raggruppati insieme in 450 μL di tampone di restrizione 1x prima di procedere con la digestione. In secondo luogo, la stima dell'efficienza della digestione è importante per fornire abbastanza frammenti di DNA per il riempimento e la legatura. Se, dopo una valutazione qualitativa, la digestione risulta inefficiente, un secondo ciclo di digestione deve essere eseguito con l'enzima di restrizione per un periodo che va da 4 ore a durante la notte.
In terzo luogo, la stima dell'efficienza della legatura è importante. Se, dopo una valutazione qualitativa, la legatura risulta inefficiente (cioè, invece della banda ad alto peso molecolare, si osserva uno striscio simile a quello osservato per il campione digerito), la legatura deve essere ripetuta centrifugando i nuclei a 200 × g e riutilizzandoli in miscela di legatura utilizzando tampone di legatura 10x fresco e ligasi. In quarto luogo, la percentuale di prodotti hi-C validi dovrebbe essere stimata digerendo un amplicon PCR di un'interazione attesa con Cla I (per la digestione originale Mbo I). L'efficiente amplificazione e digestione dell'amplicon dell'interazione attesa conferma il successo della legatura e della formazione delle giunzioni Hi-C. Se la digestione amplicon non è efficiente, la maggior parte delle molecole sarà 3C invece di prodotti Hi-C, e questo dovrebbe essere preso in considerazione se la libreria sarà sequenziata. Ciò può essere confermato anche eseguendo il controllo finale della digestione Cla I della libreria, come descritto nella sezione dei risultati rappresentativi. Infine, la selezione del minor numero di cicli di PCR è importante per evitare duplicati di PCR. Se al momento del sequenziamento, la percentuale di duplicati della coppia di lettura risulta essere elevata, il numero di cicli di PCR dovrebbe essere ulteriormente ridotto.
Questa tecnica Hi-C in-nucleus presenta alcune limitazioni. In primo luogo, il protocollo qui descritto rappresenta l'esperimento Hi-C eseguito per una popolazione cellulare. Pertanto, il segnale della frequenza dei contatti genomici rappresenta milioni di genomi con conformazioni individuali variabili. Per ottenere l'insieme dei contatti genomici da un singolo genoma, si raccomanda un esperimento Hi-C a singola cellula22. In secondo luogo, Hi-C si basa sulla legatura di frammenti di DNA prossimale. Pertanto, se le regioni genomiche fanno parte di un grande complesso proteina-cromatina, la distanza tra i frammenti potrebbe impedire la legatura. Ad esempio, è stato dimostrato che i contatti trans sono scarsamente rappresentati in Hi-C38. Inoltre, Hi-C termina con il sequenziamento paired-end, recuperando così coppie di contatti genomici. Tuttavia, diversi frammenti di DNA possono interagire contemporaneamente nello stesso complesso di cromatina. Per ottenere l'identità di più frammenti di DNA in un complesso di cromatina, metodi di sequenziamento alternativi possono essere applicati a Hi-C39o possono essere impiegate diverse strategie sperimentali in cui la legatura non viene eseguita38,40,41. Infine, sebbene Hi-C mismi i contatti genomici, non rivela l'identità delle proteine che mediano le interazioni. Devono essere applicati metodi alternativi per identificare le interazioni genomiche mediate da una particolare proteina di interesse42 o l'identità dell'insieme di proteine a specifici elementi genomici43.
In conclusione, con un esperimento Hi-C di alta qualità come quello qui descritto per il genoma della Drosophila (Tabella 2), le matrici possono essere costruite ad una vasta gamma di risoluzioni (da 1, 5 kb, 50 kb o inferiore; vedi Figura 4). Inoltre, se una particolare regione del genoma deve essere valutata a livello di frammento di restrizione, i dati possono essere utilizzati per costruire un paesaggio virtuale di 4C del punto di vista desiderato (ad esempio, il gene Notch 5' UTR in Figura 4E). Lo strumento Hi-C other-ends in SeqMonk è un'opzione molto user-friendly che consente la visualizzazione di questo paesaggio. L'applicazione dello strumento di quantificazione 4C, anch'come parte di SeqMonk, a questo panorama può produrre contatti statisticamente significativi.
L'applicazione dell'esperimento Hi-C nel nucleo qui descritto a una raccolta di linee cellulari mutanti con siti di legame al DNA AP alterati ai confini TAD (Figura 4) ha rivelato che gli elementi genetici sono necessari ai confini per strutturare il genoma di Drosophila in domini e sostenere la regolazione dell'espressione genica come ampiamente discusso da Arzate-Mejía et al.25. Pertanto, l'editing genetico di elementi regolatori con il sistema CRISPR / Cas9, combinato con la profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche utilizzando il protocollo Hi-C in-nucleo qui descritto, può essere una potente strategia per testare la funzione strutturale degli elementi genetici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione DELL'UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) IN207319 e dal numero di sovvenzione del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. è uno studente di master supportato dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACyT) CVU numero 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
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