Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

في النواة مرحبا C في خلايا دروسوفيلا

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/62106

Summary

يتم تنظيم الجينوم في الفضاء النووي في هياكل مختلفة يمكن الكشف عنها من خلال تقنيات التقاط تكوين الكروموسومات. توفر طريقة Hi-C في النواة مجموعة على مستوى الجينوم من تفاعلات الكروماتين في خطوط خلايا Drosophila ، والتي تولد خرائط اتصال يمكن استكشافها بدقة megabase على مستوى جزء التقييد.

Abstract

يتم تنظيم الجينوم في مجالات ربط طوبولوجية (TADs) محددة بحدود تعزل التفاعلات بين المجالات. وفي دروسوفيلا، لا تزال الآليات الكامنة وراء تكوين هذا المرض وحدوده قيد التحقيق. ساعد تطبيق طريقة Hi-C في النواة الموصوفة هنا على تشريح وظيفة مواقع الربط للبروتين المعماري (AP) عند حدود TAD التي تعزل جين Notch. يؤدي التعديل الوراثي لحدود النطاقات التي تسبب فقدان APs إلى دمج TAD ، والعيوب النسخية ، والتعديلات الطوبولوجية طويلة المدى. وقدمت هذه النتائج أدلة تثبت مساهمة العناصر الوراثية في تكوين حدود النطاق والتحكم في التعبير الجيني في دروسوفيلا. هنا، تم وصف طريقة Hi-C في النواة بالتفصيل، والتي توفر نقاط تفتيش مهمة لتقييم جودة التجربة جنبا إلى جنب مع البروتوكول. كما تظهر الأعداد المطلوبة من قراءات التسلسل وأزواج Hi-C الصالحة لتحليل التفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة. ويمكن أن يكون التحرير الجيني بوساطة CRISPR/Cas9 للعناصر التنظيمية والتنميط عالي الاستبانة للتفاعلات الجينية باستخدام هذا البروتوكول Hi-C في النواة مزيجا قويا للتحقيق في الوظيفة الهيكلية للعناصر الوراثية.

Introduction

في eukaryotes ، يتم تقسيم الجينوم إلى كروموسومات تحتل مناطق محددة في الفضاء النووي خلال مرحلة ما بين المراحل1. يمكن تقسيم الكروماتين الذي يشكل الكروموسومات إلى ولايتين رئيسيتين: واحدة من الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه والمتساهل نسخيا ، والآخر من الكروماتين المضغوط القمعي النسخي. هذه الدول الكروماتين فصل ونادرا ما تختلط في الفضاء النووي، وتشكيل اثنين من مقصورات متميزة في النواة2. على مقياس قاعدة تحت megabase، حدود مجالات منفصلة من التفاعلات الكروماتين عالية التردد، ودعا TADs، التي علامة المنظمة الكروموسومية3،4،5. في الثدييات، وتحتل حدود TAD من قبل عامل التماسك وCCTC ملزمة (CTCF)6،7،8. المجمع التماسك ينقذ الكروماتين وتوقف في مواقع الربط CTCF التي يتم التخلص منها في اتجاه متقارب في تسلسل الجينوم لتشكيل حلقات الكروماتين مستقرة9،10،13،14. اضطراب وراثي من موقع ربط الحمض النووي CTCF عند الحدود أو الحد من CTCF ووفرة البروتين التماسك النتائج في تفاعلات غير طبيعية بين العناصر التنظيمية، وفقدان تشكيل TAD، والتعبير الجيني إلغاء الضوابطالتنظيمية 9،10،11،13،14.

في Drosophila ، تحتل الحدود بين TADs العديد من APs ، بما في ذلك عامل عنصر الحدود المرتبط 32 kDa (BEAF-32) ، Motif 1 بروتين ملزم (M1BP) ، بروتين سنتروسومي 190 (CP190) ، مثبط للأجنحة المشعرة (SuHW) ، و CTCF ، ويتم إثراء في تعديلات الهستون النشطة وبوليميراز الثاني16،17،18. وقد اقترح أن في Drosophila، TADs تظهر نتيجة للنسخ13،17،19، والدور الدقيق لAPs مستقلة في تشكيل الحدود وخصائص العزل لا يزال قيد التحقيق. وبالتالي، ما إذا كانت المجالات في دروسوفيلا هي نتيجة وحيدة لتجميع مناطق من الدول النسخية المماثلة أو ما إذا كانت الجهات الراعية، بما في ذلك لجنة مكافحة الإرهاب، تساهم في تشكيل الحدود، لا تزال غير مميزة تماما. وقد أمكن استكشاف الاتصالات الجينومية بدقة عالية من خلال تطوير تكنولوجيات التقاط تكوين الكروموسومات إلى جانب تسلسل الجيل التالي. وصف بروتوكول Hi-C لأول مرة مع خطوة الربط التي أجريت "في الحل" 2 فيمحاولة لتجنب منتجات الربط الزائفة بين شظايا الكروماتين. ومع ذلك، أشارت العديد من الدراسات إلى إدراك أن الإشارة المفيدة في البيانات جاءت من منتجات الربط التي تشكلت في نواة مشقوقة جزئيا لم تكن في الحل20،21.

ثم تم تعديل البروتوكول لتنفيذ الربط داخل النواة كجزء من تجربة Hi-C أحادية الخلية22. تم دمج بروتوكول Hi-C في النواة لاحقا في مجموعة الخلايا Hi-C لتحقيق تغطية أكثر اتساقا على النطاق الكامل للمسافات الجينومية وإنتاج بيانات ذات ضوضاء تقنية أقل23و24. ويستند البروتوكول، الموصوف بالتفصيل هنا، على السكان في النواة مرحبا-C بروتوكول23،24، وكان يستخدم للتحقيق في عواقب إزالة وراثيا زخارف الحمض النووي ملزمة لC CTCF و M1BP من حدود المجال في مكان الجين نوتش في Drosophila25. تظهر النتائج أن تغيير الزخارف الملزمة للحمض النووي ل APs عند الحدود له عواقب وخيمة على تكوين نطاق Notch ، وعيوب طوبولوجية أكبر في المناطق المحيطة بموضع Notch ، وإلغاء تحرير التعبير الجيني. وهذا يشير إلى أن العناصر الوراثية عند حدود المجال مهمة للحفاظ على طبولوجيا الجينوم والتعبير الجيني في Drosophila25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التثبيت

  1. ابدأ بخلايا 10 ملايين شنايدر +S2R+) لإعداد 17.5 مل من تعليق الخلية في شنايدر المتوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. إضافة الفورمالديهايد خالية من الميثانول للحصول على تركيز النهائي من 2٪. مزيج واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT، مع الحرص على خلط كل دقيقة.
    ملاحظة: الفورمالديهايد مادة كيميائية خطرة. اتبع اللوائح المناسبة للصحة والسلامة، والعمل في غطاء الدخان.
  3. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة الجليسين لتحقيق تركيز النهائي من 0.125 M ومزيج. احتضان لمدة 5 دقائق في RT، تليها 15 دقيقة على الجليد.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 400 × غرام في RT لمدة 5 دقائق ثم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ تجاهل العملاق. Resuspend بيليه بعناية في 25 مل من الباردة 1x الفوسفات العازلة المالحة.
  5. جهاز الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية، ثم تجاهل supernatant.
    ملاحظة: إذا استمر مع البروتوكول، انتقل إلى الخطوة 2.1 للتحلل; خلاف ذلك، فلاش تجميد بيليه في السائل N2 وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية.

2. ليسيس

  1. Resuspend الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة (10 mM تريس-HCl, درجة الحموضة 8; 0.2٪ من السطحي غير الأيونية (انظر جدول المواد); 10 M M NaCl; مثبطات البروتيز 1x), وضبط حجم إلى 10 مل مع الجليد الباردة تحلل العازلة. ضبط مستوى الصوت للحصول على تركيز 1 × 106 خلايا / مل. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وخلط كل 2 دقيقة عن طريق عكس الأنابيب.
  2. الطرد المركزي النوى في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، ومن ثم تجاهل بعناية supernatant. غسل بيليه 1x مع 1 مل من العازلة تحلل الباردة، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. غسل بيليه 1x مع 1 مل من الباردة 1.25x تقييد العازلة، وإعادة إنفاق كل بيليه الخلية في 360 ميكرولتر من 1.25x تقييد العازلة.
  3. إضافة 11 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) لكل أنبوب (0.3٪ تركيز نهائي)، مزيج بعناية عن طريق pipetting، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، تهتز في 700-950 دورة في الدقيقة. Pipet صعودا وهبوطا لتعطيل كتل عدة مرات خلال الحضانة.
  4. إخماد SDS بإضافة 75 ميكرولتر من السطحي غير الأيونية (حل 10٪، انظر جدول المواد)لكل أنبوب (1.6٪ التركيز النهائي)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، تهتز في 950 دورة في الدقيقة. Pipet صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل أثناء الحضانة.
    ملاحظة: إذا كانت الكتل كبيرة ويصعب تعطيلها، فقلل سرعة الدوران إلى 400 دورة في الدقيقة أثناء علاجات SDS والعلاجات السطحية. إذا كان من الصعب تقسيم الكتل عن طريق الأنابيب ، وتقسيم العينة إلى قسمين ؛ ضبط وحدات التخزين المؤقت تقييد SDS و السطحي; والمضي قدما في permeabilization. بعد ذلك ، تدور النوى في الحد الأدنى للسرعة (200 × غرام)، وتجاهل بعناية supernatant ، تجمع العينات معا في 1X تقييد العازلة ، والمضي قدما في الهضم. خذ 10 ميكرولتر aliquot كعينة غير مهضومة (UD).

3. الهضم الأنزيمي

  1. هضم الكروماتين بإضافة 200 وحدة (U) من Mbo I لكل أنبوب ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 4 ساعات إلى بين عشية وضحاها أثناء الدوران (950 دورة في الدقيقة).
  2. في اليوم التالي، إضافة إضافية 50 U من مبو الأول لكل أنبوب، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أثناء الدوران (950 دورة في الدقيقة).
  3. تعطيل الانزيم عن طريق احتضان الأنابيب في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ضع الأنابيب على الثلج.
    ملاحظة: خذ a aliquot 10 ميكرولتر كعينة هضم (D).

4. نهايات البيوتينيل من الحمض النووي

  1. لملء جزء التقييد الذي يتدلى وتسمية ينتهي الحمض النووي مع البيوتين، إضافة 1.5 ميكرولتر لكل من 10 mM dCTP، dGTP، dTTP، 20 ميكرولتر من 0.4 m البيوتين dATP، 17.5 ميكرولتر من تريس منخفضة EDTA (TLE) العازلة [10 mM تريس-HCl، 0.1 mM EDTA، درجة الحموضة 8.0]، و 10 ميكرولتر من 5 U/μL من كلينو (DNA polymerase I جزء كبير) لجميع الأنابيب. تخلط بعناية واحتضان لمدة 75 دقيقة في 37 درجة مئوية. يهز في 700 دورة في الدقيقة كل 10 ق لمدة 30 ق. ضع جميع الأنابيب على الجليد أثناء إعداد مزيج الربط.

5. الربط

  1. نقل كل خليط الكروماتين المهضوم إلى أنبوب منفصل 1 مل مع مزيج الربط (100 ميكرولتر من العازلة ربط 10x، 10 ميكرولتر من 10 ملغم / مل ألبوم مصل البقري، 15 U من T4 الحمض النووي ليغانيس، و 425 ميكروغرام من الماء المقطر المزدوج [ddH2O]). تخلط جيدا عن طريق pipetting لطيف، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 °C.

6. انعكاس الربط العرضي وتنقية الحمض النووي

  1. تتحلل البروتينات بإضافة 50 ميكرولتر من 10 ملغم/مل بروتيناز K لكل أنبوب، وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. عكس الروابط المتقاطعة عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. تتحلل الحمض النووي الريبي بإضافة 20 ميكرولتر من 10 ملغم / مل RNase A، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أداء الفينول: استخراج الكلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول.
    1. إضافة 1 حجم الفينول-الكلوروفورم، وتخلط جيدا عن طريق عكس للحصول على مرحلة بيضاء متجانسة.
      ملاحظة: الفينول مادة كيميائية خطرة. اتبع اللوائح المناسبة للصحة والسلامة. العمل في غطاء الدخان.
    2. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × غرام لمدة 15 دقيقة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد 2 مل. إجراء الاستخراج الخلفي للطبقة السفلى مع 100 ميكرولتر من TLE العازلة، ونقل المرحلة المائية في نفس أنبوب 2 مل.
    3. تسريع الحمض النووي بإضافة 2 مجلدات من الكحول الإيثيلي 100٪ (EtOH)، 0.1 مجلد من خلات الصوديوم 3 M، و 2 ميكرولتر من 20 ملغم / مل الجليكوجين. حضانة في -20 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 2 ساعة إلى بين عشية وضحاها.
    4. تدور في 15،000 × غرام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، وغسل الكريات 2x مع الجليد الباردة 70٪ EtOH. جفف الكريات في RT، وأعيد إنفاقها في 100 ميكرولتر من حاجز TLE. قياس الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية التي تربط بشكل انتقائي إلى الحمض النووي ومقياس الفلور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين منتجات الربط عند 4 درجة مئوية على المدى القصير أو عند -20 درجة مئوية على المدى الطويل. استخدام aliquot (100 نانوغرام) من المواد كعينة ربط (L) لمراقبة الجودة.

7. تقييم جودة قالب Hi-C

  1. الهضم وربط الضوابط النوعية
    1. تنقية الحمض النووي من UD وD aliquots عن طريق عكس الوصلات المتقاطعة، وأداء phenol:استخراج الكلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول كما هو موضح أعلاه.
    2. تحميل 100 نانوغرام من UD، D، وعينات L في هلام agarose 1.5٪. ابحث عن مسحة تركزت حول 500 نقطة أساس في العينة D مقابل نطاق عالي الوزن الجزيئي لعينة L (انظر النتائج التمثيلية).
  2. التحكم الكمي لكفاءة الهضم
    ملاحظة: لتقييم كفاءة الهضم بشكل أكثر دقة، استخدم عينات UD وD كنماذج لتنفيذ التفاعلات المتسلسلة البوليميراز الكمية (qPCR) باستخدام التهيئة المصممة على النحو التالي.
    1. تصميم زوج التمهيدي الذي يضخم جزء الحمض النووي التي تحتوي على موقع تقييد الحمض النووي للإنزيم المستخدم للهضم (Mbo الأول في البروتوكول الحالي)، ودعا R في الصيغة في الخطوة 7.2.3.
    2. تصميم زوج التمهيدي الذي يضخم جزء الحمض النووي التحكم الذي لا يحتوي على موقع تقييد للإنزيم المستخدم للهضم (Mbo I للبروتوكول الحالي)، ودعا C في الصيغة في الخطوة 7.2.3.
    3. استخدم قيم عتبة الدورة (قيم Ct) للتضخيم لحساب كفاءة التقييد وفقا للصيغة الموضحة أدناه:
      ٪ تقييد = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      حيث تشير CtR إلى قيمة Ct للقسم R، ويشير CtC إلى القيمة Ct للقطعة C للعينة D وعينة UD.
      ملاحظة: تعكس نسبة التقييد كفاءة إنزيم التقييد الذي يلتصق بشظايا الحمض النووي المقيدة (R) مقارنة بجزأ الحمض النووي (C) عنصر التحكم الذي لا يحتوي على موقع الحمض النووي التقييدي. ينصح بكفاءة تقييد ≥ 80٪.
  3. الكشف عن التفاعلات المعروفة
    1. إجراء PCR لتضخيم عنصر تحكم ربط داخلي لفحص التفاعلات قصيرة المدى و/أو متوسطة أو طويلة المدى (انظر النتائج التمثيلية).
    2. بدلا من ذلك، تصميم التمهيديات لتضخيم منتج الربط الذي التمهيديات هي في اتجاه إلى الأمام أو عكس عكس في شظايا تقييد المجاورة.
  4. التحكم في التعبئة ووضع العلامات على البيوتين
    1. تحقق من كفاءة وضع العلامات وربط Hi-C عن طريق تضخيم وهضم تفاعل معروف أو منتج ربط بين شظايا التقييد المجاورة في الجينوم ، كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: نجاح التعبئة في وربط موقع Mbo I (GATC) بإنشاء موقع جديد للإنزيم تقييد Cla I (ATCGAT) عند تقاطع الربط وتجديد موقع Mbo I.
    2. هضم المنتج PCR مع مبو I، Cla I، أو كليهما. بعد تشغيل العينات على هلام 1.5-2٪، وتقدير العدد النسبي للتقاطعات ربط 3C ومرحبا C عن طريق تحديد كثافة قطع والعصابات غير المصقول26.
      ملاحظة: مطلوب كفاءة > 70٪ (راجع النتائج التمثيلية).

8. سونيكيشن

  1. Sonicate العينات للحصول على شظايا الحمض النووي 200-500 نقطة أساس. للآلة المستخدمة في هذا البروتوكول (انظر جدول المواد)،تمييع العينة (من 5 إلى 10 ميكروغرام) في 130 ميكرولتر من ddH2O لكل أنبوب، وتعيين الصك إلى سونيكاتي إلى 400 نقطة أساس: مستوى التعبئة: 10؛ عامل الواجب: 10٪؛ ذروة قوة الحادث (ث): 140؛ دورات لكل انفجار: 200; الوقت (ق): 80.

9. إزالة البيوتين / إصلاح نهاية

ملاحظة: يتم تعديل الخطوات الموضحة أدناه ل 5 ميكروغرام من الحمض النووي Hi-C.

  1. لإجراء إزالة البيوتين، نقل العينة (130 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد دقيق جديد. إضافة 16 ميكرولتر من 10x ربط العازلة، 2 ميكرولتر من 10 mM dATP، 5 ميكرولتر من T4 DNA بوليمراسي (15U)، و 7 ميكرولتر من ddH2O (160 ميكرولتر من الحجم الإجمالي). حضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 4 ميكرولتر من 10x الربط العازلة، 5 ميكرولتر من T4 كيناز البولي نوكليوتيد (10 U/μL)، 1 ميكرولتر من كلينو، و 25 ميكروغرام من DDH2O (200 ميكروغرام من الحجم الإجمالي). حضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

10. اختيار الحجم

  1. لتحديد شظايا معظمها في نطاق حجم 250-550 نقطة أساس، وتنفيذ مرحلة الصلبة تسلسلي عكسها تعطيل (SPRI) اختيار حجم أولا مع 0.6x، تليها 0.90x وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وelute الحمض النووي باستخدام 100 ميكروغرام من TLE.

11. البيوتين المنسدلة / A - الذيل / ربط محول

ملاحظة: قم بإجراء الغسيل عن طريق إعادة تعليق الخرز المغناطيسي عن طريق الدوامة، وتناوب العينات لمدة 3 دقائق على عجلة دوارة، ثم قم بتدوير العينة لفترة وجيزة ووضعها على الحامل المغناطيسي. السماح للخرزات التمسك المغناطيس، والتخلص من supernatant، والمضي قدما في خطوة غسل التالية. قم بإجراء الغسيل عند درجة حرارة 55 درجة مئوية على كتلة حرارية مع دوران بدلا من العجلة الدوارة.

  1. تشكل وحدة التخزين النهائية إلى 300 ميكرولتر لكل عينة مع TLE لسحب لأسفل. إعداد مخازن الغسيل الخرز: 1x توين العازلة (السل: 5 م م تريس-HCl pH 8.0، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، 0.05٪ توين)، 0.5x السل، 1x لا توين العازلة (NTB) (5 متر تريس-HCl pH 8.0، 0.5 m M EDTA، 1 M NaCl)، 2x NTB.
  2. استخدم 150 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرتبط بالستريبتافيدين (انظر جدول المواد)لكل مكتبة. غسل الخرز 2x مع 400 ميكرولتر من السل 1x. ثم حبات resuspend في 300 ميكرولتر 2x NTB.
  3. مزيج الخرز مع 300 ميكرولتر مرحبا-C المواد واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة للسماح ربط البيوتين إلى حبات streptavidin.
  4. اغسل الخرز ب 400 ميكرولتر من 0.5 تيرابايت، واحتضنه عند 55 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، بالتناوب عند 750 دورة في الدقيقة. غسل الخرز في 200 ميكرولتر من 1x تقييد المخزن المؤقت.
  5. Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر من مزيج المخلفات dATP (5 ميكرولتر من 10 mM dATP، 10 ميكرولتر من العازلة تقييد 10x، 5 ميكرولتر من كلينو exo-، و 80 ميكرولتر من DDH2O). حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. إزالة supernatant، وغسل الخرز 2x مع 400 ميكرولتر من 0.5x السل عن طريق احتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وتناوب في 750 دورة في الدقيقة.
  7. غسل الخرز مع 400 ميكرولتر من NTB 1x ثم مع 100 μL من العازلة ربط 1x.
  8. Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر من العازلة ربط 1x، ونقل التعليق إلى أنبوب جديد. إضافة 4 ميكرولتر من محولات PE قبل المماليد (15 ميكرومتر من المخزون) و 2 ميكرولتر من T4 ligase (400 U/μL، أي 800 U/tube)؛ احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: قبل أنال المحولات بإضافة كميات متساوية من كل من PE 1.0 و PE 2.0 محولات (30 ميكرومتر مخزون) واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT (انظر جدول المواد).
  9. استعادة الخرز عن طريق إزالة supernatant وغسل الخرز 2x مع 400 ميكروغرام من السل. غسل الخرز مع 200 ميكرولتر من NTB 1x، ثم مع 100 ميكرولتر من 1x تقييد العازلة، وإعادة إنفاق الخرز في 40 ميكرولتر من 1x تقييد المخزن المؤقت.

12. تضخيم PCR

  1. إعداد وحدات PCRs بحجم 25 ميكرولتر مع 5 و6 و7 و8 دورات. لكل PCR، استخدم:
    رد فعل وصفة
    مرحبا C الخرز 2.5 ميكرولتر
    10 ميكرومتر PE PCR التمهيدي 1 (جدول المواد) 0.75 ميكرولتر
    10 ميكرومتر PE PCR التمهيدي 2 (جدول المواد) 0.75 ميكرولتر
    10 mM dNTP 0.6 ميكرولتر
    5x رد فعل العازلة 5 ميكرولتر
    بوليمرات الحمض النووي 0.3 ميكرولتر
    ddH2O 14.65 ميكرولتر
    مجموع 25 ميكرولتر
    دورات درجة الحرارة الوقت
    1 98 درجة مئوية 30 ق
    ن دورات 98 درجة مئوية 10 ق
    65 درجة مئوية 30 ق
    72 درجة مئوية 30 ق
    1 72 درجة مئوية 7 دقائق

13. تضخيم PCR النهائي

  1. إجراء تضخيم PCR النهائي باستخدام نفس الشروط كما هو موضح أعلاه وعدد الدورات المحددة. تقسيم العينة باستخدام 5 ميكرولتر من الخرز مرحبا C كقالب في ردود الفعل 50 ميكرولتر.
  2. جمع جميع ردود الفعل PCR ونقلها إلى أنبوب جديد. استخدام المغناطيس لإزالة الخرز streptavidin واستعادة supernatant (PCR المنتجات). نقل الخرز إلى أنبوب جديد، وغسل الخرز كما هو مبين في الخطوة 11.2.9، وتخزينها في 1x تقييد العازلة في 4 درجة مئوية كنس احتياطي.
  3. تنقية منتجات PCR باستخدام 0.85x حجم الخرز SPRI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute مع 30 ميكرولتر من مخزن TLE المؤقت.
  4. قياس كميا مكتبة Hi-C باستخدام أداة قياس الفلورومترية، وتأكيد جودة المكتبة عن طريق الكهروفلوريس الشعري القائم على رقاقة.
  5. كنقطة تفتيش جودة الأخيرة، استخدم 1 ميكرولتر من مكتبة Hi-C كقالب لإجراء تفاعل PCR باستخدام 10 دورات باستخدام نفس الشروط الموضحة في الخطوة 12.1. تقسيم المنتج PCR إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي: هضم واحد مع Cla I وترك الآخر غير مهضوم كعنصر تحكم. تشغيل المنتجات في هلام agarose 1.5-2٪ (انظر النتائج التمثيلية).
  6. انتقل إلى تسلسل 50 نقطة أساس أو 75 نقطة أساس على منصة تسلسل مناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فيما يلي نتائج بروتوكول Hi-C ناجح (راجع ملخص سير عمل بروتوكول Hi-C في الشكل 1A). هناك العديد من نقاط مراقبة الجودة خلال تجربة Hi-C في النواة. تم جمع عينة aliquots قبل (UD) وبعد (D) خطوة تقييد الكروماتين وكذلك بعد الربط (L). تم عكس الوصلات المتقاطعة، وتم تنقية الحمض النووي وتشغيله على هلام الآغاروز. وقد لوحظ مسحة من 200-1000 نقطة أساس عند تقييد مع مبو أنا كان ناجحا(الشكل 1B). الحجم المتوقع للجزيء يعتمد على إنزيم تقييد الاختيار. إذا كان الربط ناجحا، شوهد شريط الوزن الجزيئي عالية في الجزء العلوي من هلام (الشكل 1B). ويمكن أيضا تأكيد كفاءة الهضم من قبل qPCR كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول. كفاءة الهضم المقبولة هي 80٪ أو أعلى(الشكل 1C).

لتقييم كفاءة ربط Hi-C بالتفصيل ، يمكن تصميم التهيئة لتضخيم التحكم الداخلي في منتج الربط حيث تكون المبرمجين في اتجاه أمامي أو عكسي في أجزاء تقييد مجاورة. بدلا من ذلك ، يمكن تصميم اللتمهيد لتضخيم التفاعلات المعروفة. الشكل 2A يظهر تضخيم تفاعل معروف متوسط المدى (300 kb) في Drosophila25. يمكن تقدير منتجات ربط Hi-C (التي حدثت فيها علامة البيوتين وملء الربط بنجاح) عن طريق هضم منتج PCR المسترد في التضخيم. بعد التعبئة والربط ، ستحتوي amplicons Hi-C على موقع تقييد Cla I جديد في موقع Mbo I الأصلي ، والذي يتم الحفاظ عليه عند الربط الحاد. إذا لم يكتمل التقييد مع Cla I ، فإن رد فعل التعبئة ووضع علامات البيوتين سيكون غير فعال. ويوصى كفاءة الهضم من أكثر من 70٪ لتجنب وجود نسبة كبيرة من قراءات غير مفيدة للمكتبات بعد التسلسل(الشكل 2A،قارن الهضم Cla I من 3C مقابل قالب مرحبا-C).

لتحديد عدد كاف من دورات تضخيم PCR لتضخيم مكتبة Hi-C النهائية ، تم إعداد تفاعلات PCR باستخدام 2.5 ميكرولتر من مكتبة معينة على الخرز ، كما هو موضح في البروتوكول. عدد دورات PCR للتضخيم النهائي هو دورة واحدة أقل من عدد الدورات التي تكون اللطاخة مرئية(الشكل 2B). في هذه الحالة، تم اختيار 4 دورات من تضخيم PCR. كنقطة تفتيش الجودة النهائية، تم إعادة تضخيم وهضم aliquot من مكتبة مرحبا C مع Cla I. مستوى الهضم للمكتبة (انخفاض في حجم اللطاخة) يشير إلى وفرة أزواج Hi-C صالحة ويعكس نسبة القراءات المفيدة التي سيتم الحصول عليها من المكتبة(الشكل 2C). نسبة من نطاق الحجم العلوي (يحددها حجم موجود في عينة UD) ونطاق حجم القاع في كل من عينات UD و D يجب أن تنتج نسبة > 1 لUD ونسبة ≤ 1 للعينة المهضومة إذا كان الهضم Cla I فعالا.

بعد تسلسل نهاية المقترنة، تم معالجة ملفات FASTQ (الجدول 1) باستخدام HiCPro28 والإحصاءات التي تم إنشاؤها المرسومة باستخدام MultiQC28. أداة بديلة ل HiCPro هي خط أنابيب HiCUP30 الذي ينتج نتائج مماثلة (غير مبين). ويبين الشكل 3 والجدول 2 المعلومات الإحصائية التفصيلية للاطلاعات المتسلسلة. يتم الإبلاغ عن محاذاة القراءة الكاملة والمحاذاة بعد التشذيب. تتوافق هاتان الفئتان مع القراءات المتوائمة بنجاح التي سيتم استخدامها في التحليل اللاحق للعثور على أزواج Hi-C صالحة. فئة المحاذاة بعد التشذيب يشير إلى قراءات تمتد على تقاطع الربط، والتي لم تكن محاذاة في الخطوة الأولى وقلصت في موقع الربط ثم إعادة تنظيم أقصى 5 إلى الجينوم28 (الشكل 3B،C والجدول 2). تظهر إحصائيات جهة الاتصال أن مكتبة Hi-C كانت ذات جودة عالية مع أزواج صالحة بنسبة 82.2٪ و7.6٪ قراءات غير مفيدة تقع في نفس الدائرة الذاتية ، ونفس الجزء المتدلي ، وإعادة الربط ، والأزواج المصفاة ، وفئات الأزواج الملقاة (الشكل 3A، الشكل 3D، والجدول 2). وعلاوة على ذلك، فإن عدد تكرارات PCR منخفض جدا، مما يشير إلى أن تعقيد المكتبة مرتفع، وأن دورات PCR أدخلت الحد الأدنى من القطع الأثرية(الشكل 3E والجدول 2).

باستخدام أزواج Hi-C صالحة فريدة من نوعها، تم إجراء التحليل الأساسي لتوزيع الزوج باستخدام HiCPro27. أسفرت هذه التجربة عن اتصالات فريدة من نوعها 46.5٪ من رابطة الدول المستقلة ≤ 20 كيلوبت في الثانية، و 47.1٪ اتصالات فريدة من نوعها كومنولث الدول المستقلة > 20 كيلوبت في الثانية، و 5.8٪ اتصالات عبر فريدة من نوعها(الشكل 3D). توزيع رابطة الدول المستقلة على أزواج صالحة عبر يتوافق مع النتائج المتوقعة لتجربة ناجحة مرحبا جيم مع معظم التفاعلات التي تم الكشف عنها داخل الكروموسوم نفسه. وتشير نسبة عالية من جهات الاتصال العابرة إلى عدم كفاءة التثبيت. باستخدام أزواج Hi-C صالحة من HiCPro27، تم تطبيع المصفوفات عن طريق تصحيح متكرر وتحلل المهيج (ICE)30، وتم إنشاء مصفوفات دقة 1 كيلوبايت و 5 كيلوبايت باستخدام HiCPlotter30،31،32. يتم تقديم مصفوفات الاتصال العادية بدقة 1 كيلوبايت و 5 كيلوبايت لمجراد الجين Notch في Drosophila (الشكل 4A، الشكل 4C، والشكل 4D). في الشكل 4A، يمكن رؤية الموضع الجيني Notch جنبا إلى جنب مع APs ، والمجال L و II ، بالإضافة إلى تعديلات الهستون على طول الموضع(الشكل 4A والجدول 1). وقد انطوى تصميم حذف CRISPR-Cas9 على فكرة CTCF و M1BP(الشكل 4B).

عند حذف المنطقة التي تحتوي على كل من CTCF و M1BP مواقع الحمض النووي ملزمة عند الحدود 5 'من الموضع نوتش (5pN-delta343، الجدول 1)،يمكن ملاحظة تغيير كبير في الاتصالات الكروماتين مع فقدان التفاعلات داخل مكان نوتش وكسب الاتصالات مع TAD المنبع مقارنة مع النوع البري (WT)(الشكل 4C،D). وأخيرا، يظهر الشكل 4E بانوراما مفصلة ل WT وملفات تعريف التفاعل المتحولة على مستوى جزء التقييد من الجين Notch 5'UTR، مما يظهر انخفاضا في نسبة الاتصالات التي أجريت مع موضع الجين Notch وزيادة في الاتصالات مع مجال المنبع. تم الحصول على وجهات النظر 4C الظاهري من الجين نوتش 5 'UTR باستخدام HiC-Pro27. وهناك أداة بديلة هي التحديد الكمي للأطراف الأخرى مرحبا جيم المتاحة في SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. تم الحصول على جميع النتائج المعروضة في الشكل 4 من خلال تطبيق بروتوكول Hi-C في النواة في WT وخلايا S2R + Drosophila المتحولة ، كما وصفها Arzate-Mejía وآخرون.

Figure 1
الشكل 1: في النواة مرحبا جيم الهضم وربط الضوابط. (أ) مرحبا جيم بروتوكول نظرة عامة. ترتبط الخلايا بالفورمالديهايد، مما يؤدي إلى روابط تساهمية بين شرائح الكروماتين (شظايا الحمض النووي: الوردي والأرجواني) والبروتينات. يتم هضم الكروماتين مع إنزيم تقييد (يمثله مقص)، في هذا المثال، مبو I. تمتلئ النهايات اللزجة الناتجة بالنيوكليوتيدات بما في ذلك dATP البيوتينية (الدوائر الزرقاء الداكنة). يتم تنقية الحمض النووي ، ويتم إثراء التقاطعات البيوتينية باستخدام الخرز المغناطيسي المغلف بالستريبتافيدين (الدوائر الرمادية). يتم التعرف على الأجزاء المتفاعلة بواسطة الجيل التالي، تسلسل الانتهاء المقترن. (ب) ضوابط جودة الهضم وربط مرحبا-C لاثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية (مرحبا-C 1 و Hi-C 2). تم حل مكتبات Hi-C على هلام agarose بنسبة 1.5٪. كلاهما هضم، D، المكتبات تعمل كمسحة حول 600 نقطة أساس. عينات ligated، Lig، تشغيل كشريط ضيق بدلا أكبر من 10 كيلوبايت مماثلة لعينات UD غير مهضوم. الاختلافات في قوة الإشارة ترجع إلى كميات متفاوتة من الحمض النووي المحملة على الجل. (ج)التحكم الكمي في الهضم Hi-C بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لنفس النسختين البيولوجيتين كما هو الحال في (B) (Hi-C 1 و Hi-C 2) باستخدام قيم عتبة الدورة كما هو مفصل في البروتوكول. وقد ≥ عملية الهضم الناجحة تقييد 80٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: في النواة مرحبا جيم التعبئة في وضوابط الربط حادة نهاية. (أ) ملء في وتقييم وضع العلامات البيوتين. تم استخدام تفاعل معروف بين شظايا تقع 300 كيلوبايت بعيدا في الكروموسوم X كعنصر تحكم وتضخيمها باستخدام التمهيديات المشار إليها مع الأسهم السوداء (انظر أعلى المخطط في (B)، التمهيدي 1 (يسار)، التمهيدي 2 (يمين)، الجدول 1)،وتوليد أمبليكون 347 bp. يمكن تمييز منتجات ربط Hi-C عن تلك التي يتم إنتاجها في تجربة 3C عن طريق هضم موقع الربط. تم هضم تقاطعات Hi-C من قبل Cla I في موقع Mbo I الأصلي ، حيث تشكل هذا على ربط حاد. تم هضم تقاطعات Hi-C و 3C مع Mbo I حيث يجدد موقع التقييد عند الربط (يسار الجل). في المقابل ، لم يتم هضم تقاطعات 3C من قبل Cla I في موقع Mbo I ، ولكن فقط من قبل Mbo I. قارن ملف الهضم لمنتجات Hi-C و 3C باستخدام Cla I. تم الحصول على جزء 53 bp عن طريق هضم المنتج Hi-C (بسبب تقييد موقع Cla I الذي تم تشكيله في موقع Mbo I وتقييد موقع Cla I الموجود بالفعل في المنطقة). لم يلاحظ هذا الجزء في عملية هضم المنتج 3C حيث أن موقع Cla I الوحيد المتاح هو الموقع الموجود بالفعل في المنطقة. (ب)بعد تضخيم PCR من مكتبة مرحبا جيم باستخدام دورات PCR مختلفة، تم تشغيل المنتجات على هلام agarose 1.5٪. وكان من المتوقع أن تلطخ من 400-1000 نقطة أساس ولوحظ. وينبغي أن تؤخذ دورات العدد المناسب لتضخيم PCR النهائي كما عدد أقل فورا من تلك التي تشويه مرئيا فقط. (ج) المكتبة النهائية Cla I الهضم. تم إعادة تضخيم وهضم صورة من المكتبة النهائية مع Cla I. وأكد انخفاض حجم المسحة أن نسبة كبيرة من الجزيئات في المكتبة كانت صالحة مرحبا جيم أزواج. يمكن إجراء تحليل الكثافة لهذا الجل للحصول على نسبة بين عينات الأمم المتحدة وD ، كما هو مفصل في قسم النتائج التمثيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إحصاءات HiC-Pro لمكتبة Hi-C. (A) التمثيل التخطيطي لأزواج Hi-C الصالحة والأنواع المختلفة من الأزواج غير الصالحة التي يمكن إنتاجها أثناء التجربة وتصفيتها بواسطة HiCPro27 (الجدول 2). وتشمل هذه القراءات الوقوع في تسلسلات متجاورة، ونهايات متدلية، ونفس الجزء، والدائرة الذاتية، وإعادة الربط، وتكرارات PCR. (ب) إحصائيات رسم الخرائط. يتم عرض القراءات التي فشلت في المحاذاة (رمادي)، ويتم عرض كل من القراءات والمؤاونة المنحازة بالكامل بعد التشذيب باللونين الأزرق والأزرق الفاتح، على التوالي. وتمثل هاتان الفئتان القراءات المفيدة التي يتم النظر فيها في التحليلات اللاحقة. (ج) إحصائيات الاقتران. تمثل القراءات متعددة المحاذاة (البرتقالي الداكن) القراءات التي يتم محاذاتها في مناطق متعددة في الجينوم. تمثل قراءات المحاذاة الفريدة (الأزرق الداكن) أزواج القراءة التي يتم محاذاتها مرة واحدة في الجينوم ، وتمثل العزاب (البرتقالي الفاتح) أزواج القراءة التي تم فيها تسلسل منطقة جينومية واحدة فقط في كل من القراءات. (D) إحصائيات التصفية. أزواج القراءة الصالحة (الأزرق) تمثل منتجات ربط Hi-C الناجحة كما هو موضح في (A). الدوائر الذاتية الذاتي جزء (وردي فاتح) هي قراءات غير مفيدة لأنها تمثل نفس جزء الجينوم هو مبين في (A). تمثل النهايات المتدلية ذات الأجزاء نفسها (البرتقالية) القراءات التي تم فيها تسلسل جزء تقييد واحد. الأزواج المصفاة والمتخلص منها (البني) هي أيضا قراءات غير مفيدة لها حجم خاطئ أو التي لا يمكن إعادة بناء منتج الربط لها. وأخيرا، تمثل قراءات إعادة الربط (الحمراء) قراءات أعيد فيها ربط شظيتين متجاورتين، مما أسفر عن معلومات غير مفيدة. (E) صالح قراءة أزواج الاتصال التوزيع في الجينوم. اتصالات رابطة الدول المستقلة فريدة من نوعها (الأزرق) هي أكثر تواترا من الاتصالات عبر فريدة من نوعها (الأخضر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مرحبا جيم مصفوفات الاتصال والتحليل الظاهري 4C من WT وخلايا S2R + متحولة. (أ) مرحبا جيم تطبيع خريطة حرارية من منطقة 50 كيلوبايت في 1 كيلوبايت القرار تركزت في الموضع الجين نوتش. تظهر درجة الفصلTAD 32 للجراد ، إلى جانب تقسيم موضع الشق إلى مجالين طوبولوجيين (المجال 1 والمجال 2). تظهر بيانات ChIP-seq ل APs وRNA Pol II وعلامات الهستونلخلايا S2/S2R+34و35و36و37 أسفل خريطة الحرارة (الجدول 1). يتم تمييز مواقف نطاق Notch 1 بالأخضر الفاتح. (ب)تمثيل تخطيطي لحدود B1 CRISPR متحولة. يشير المستطيل الأخضر إلى منطقة 343 bp المحذوفة. يشير المقص إلى SgRNAs المستخدمة لتحرير الجينوم بوساطة CRISPR. تظهر المواقع الملزمة للزخارف ل APs كمربعات ل CTCF و M1BP. القمم الذروة ل APs الحمض النووي ملزمة هو مبين في (A) يشار أيضا35. (C) مرحبا جيم تطبيع heatmaps في 1 كيلوبايت القرار تغطي منطقة 50 كيلوبايت تركزت في نوتش لWT والخلايا متحولة. اليسار، مرحبا-C heatmaps من الاختلافات log2 في وتيرة التفاعل بين WT والخلايا متحولة. (د) مرحبا جيم تطبيع heatmaps تغطي منطقة 250 كيلوبايت تركزت في نوتش في 5 كيلوبايت القرار لWT والخلايا المتحولة. اليسار، مرحبا-C heatmaps من الاختلافات log2 في وتيرة التفاعل بين WT والخلايا متحولة. (ه) الظاهري -4C لWT والخلايا المتحولة باستخدام 5 'UTR من Notch وجهة نظر. تظهر النسب المئوية للتفاعلات بين وجهة النظر والمناطق داخل kirredomain-2المنبع ، نوتش المجال 1 ، نوتش المجال 2 ، والمجال dnc المصب لكل من WT والخلايا المتحولة25. الاختصارات: WT = نوع البرية; TAD = المجال المرتبط طوبولوجيا; ChIP = الاختناع المناعي الكروماتين; AP = البروتين المعماري. RNA بول = RNA بوليمراز; S2R + = مستقبلات S2 زائد; SG RNA = دليل واحد الجيش الملكي النيبالي؛ UTR = المنطقة غير المترجمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التجربه عينة رقم الانضمام إلى GEO
رقاقه CP190 جي إس إم1015404
رقاقه سوه وات جي إس إم 1015406
رقاقه وزارة الدفاع(mdg4) جي إس إم1015408
رقاقه لجنة مكافحة الإرهاب جي إس إم1015410
رقاقه Ibf1 جي إس إم1133264
رقاقه Ibf2 جي إس إم1133265
رقاقه بياف32 جي إس إم 1278639
رقاقه بيتا جي إس إم 1313420
رقاقه زيبيك جي إس إم 1313421
رقاقه RNA بولي جي إس إم2259975
رقاقه H3K4me1 جي إس إم2259983
رقاقه H3K4me3 جي إس إم2259985
رقاقه H3K27ac جي إس إم2259987
رقاقه MSL2 جي إس إم 2469507
رقاقه H4K16ac جي إس إم 2469508
رقاقه M1BP جي إس إم2706055
رقاقه GAF جي إس إم2860390
رقاقه الادخال جي إس إم 1015412
مرحبا-C خلايا S2R+ WT GSE136137
مرحبا-C S2R + 5pN-دلتا343 خلايا GSE136137

الجدول 1: أرقام الانضمام إلى توقعات البيئة العالمية.

إحصاءات HiC-Pro يقرا النسبه المئويه
إحصائيات التعيين
محاذاة القراءة الكاملة 131515921 82.20%
محاذاة القراءة المقصوصة 16408309 10.30%
فشل المحاذاة 12110964 7.60%
إحصائيات الاقتران
محاذاة فريدة 79428455 50.90%
المفرد 19063418 12.20%
متعدد المحاذاة 57700021 36.90%
إحصائيات التصفية
أزواج صالحة 71373989 90.12%
نفس الجزء: دائرة ذاتية 2340697 2.90%
نفس الجزء: نهايات متدلية 2578783 3.20%
أزواج تمت تصفيتها 2773043 3.50%
أزواج ملقاة 196565 0.20%
إحصائيات الاتصال
فريدة من نوعها: رابطة الدول المستقلة ≤ 20 كيلوبت في الثانية 33108815 46.50%
فريدة من نوعها: رابطة الدول المستقلة > 20 كيلوبت في الثانية 33539888 47.10%
فريدة من نوعها: عبر 4133602 5.80%
تكرار أزواج القراءة 398400 0.60%

الجدول 2: إحصاءات HiC-Pro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد سمحت طريقة Hi-C في النواة المعروضة هنا بالاستكشاف التفصيلي لطبولوجيا الجينوم Drosophila بدقة عالية ، مما يوفر رؤية للتفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة ، من حلقات الكروماتين بين العناصر التنظيمية مثل المروجين والمحسنات إلى TADs وتحديد المقصورة الكبيرة25. كما تم تطبيق نفس التكنولوجيا بكفاءة على أنسجة الثدييات مع بعض التعديلات33. على سبيل المثال، عند معالجة الأنسجة بدلا من تعليق خلية واحدة، يتم غربلة الأنسجة من خلال مرشح 70 ميكرومتر، ويتم تنفيذ خطوة التحلل مع تجانس المواد باستخدام متجانس Dounce. بالإضافة إلى ذلك ، بما أن جينوم الثدييات أكبر ب 25 مرة من جينوم Drosophila ، فإن عدد أزواج القراءة الصالحة اللازمة لبناء مصفوفات بدقة 1-5 كيلوبايت أكبر. تختلف طريقة Hi-C في النواة عن الطريقة Hi-C الأصلية2 في تجنبها للتحلل النووي بنسبة 1٪ SDS عند 65 درجة مئوية قبل الربط ، وبالتالي الحفاظ على السلامة النووية ، وربطها في 1 مل بدلا من 7 مل23،24.

البروتوكول لديه بعض الخطوات الرئيسية لضمان كفاءة عالية. الخطوة الأولى التي يمكن أن تقدم الهضم وملء في أوجه القصور هو تشكيل كتل خلال 0.3٪ permeabilization SDS والعلاجات السطحية. إذا كانت الكتل كبيرة ويصعب تعطيلها ، فيجب تقليل السرعة الدوارة إلى 400 دورة في الدقيقة أثناء SDS والعلاجات السطحية. إذا كانت الكتل لا تزال صعبة التصنيف عن طريق الأنابيب ، يجب تقسيم العينة إلى قسمين عن طريق ضبط وحدات التخزين مع المخزن المؤقت التقييد ، SDS ، وخافض الأمواج غير الأيونية قبل الشروع في permeabilization. بعد ذلك ، يجب طرد النوى في الحد الأدنى للسرعة (200 × غرام)، والناحلة المهملة بعناية ، والعينات المجمعة معا في 450 ميكرولتر من حاجز التقييد 1x قبل الشروع في الهضم. ثانيا، تقدير كفاءة الهضم مهم لتوفير ما يكفي من شظايا الحمض النووي لملء وربط. إذا تبين عند التقييم النوعي أن عملية الهضم غير فعالة، يجب إجراء جولة ثانية من الهضم مع إنزيم التقييد لفترة تتراوح بين 4 ساعات وبين عشية وضحاها.

ثالثا، تقدير كفاءة الربط مهم. إذا تبين عند التقييم النوعي أن الربط غير فعال (أي بدلا من النطاق عالي الوزن الجزيئي ، لوحظ مسحة مماثلة لتلك التي لوحظت للعينة المهضومة) ، يجب تكرار الربط عن طريق الطرد المركزي للنوى عند 200 × ز وإعادة تعليقها في مزيج الربط باستخدام حاجز ربط 10x جديد وربط. رابعا، ينبغي تقدير النسبة المئوية للمنتجات صالح مرحبا-C عن طريق هضم amplicon PCR من التفاعل المتوقع مع Cla I (للضم الأصلي Mbo I). التضخيم الفعال والهضم من amplicon التفاعل المتوقع يؤكد نجاح الربط وتشكيل تقاطعات مرحبا جيم. إذا لم يكن هضم amplicon فعالا ، فإن غالبية الجزيئات ستكون 3C بدلا من منتجات Hi-C ، ويجب أخذ ذلك في الاعتبار إذا تم تسلسل المكتبة. ويمكن أيضا تأكيد ذلك عن طريق تنفيذ التحكم النهائي في عملية الهضم Cla I في المكتبة، كما هو موضح في قسم النتائج التمثيلية. وأخيرا، اختيار عدد أقل من دورات PCR من المهم تجنب تكرار PCR. إذا تبين عند التسلسل أن النسبة المئوية لتكرارات الزوج المقروء عالية، فينبغي زيادة انخفاض عدد دورات PCR.

هذه التقنية في النواة مرحبا جيم لديها بعض القيود. أولا، يمثل البروتوكول الموصوف هنا تجربة Hi-C التي أجريت لمحتوى الخلية. ولذلك، فإن إشارة تكرار الاتصالات الجينومية تمثل ملايين الجينومات ذات التركيبات الفردية المتغيرة. للحصول على مجموعة من الاتصالات الجينومية من جينوم واحد، ينصح بتجربة Hi-C أحادية الخلية22. ثانيا، يعتمد Hi-C على ربط شظايا الحمض النووي القريبة. وهكذا، إذا كانت المناطق الجينومية جزءا من مجمع كبير للبروتين والكروماتين، فإن المسافة بين الشظايا يمكن أن تعوق الربط. على سبيل المثال، فقد تبين أن الاتصالات عبر ممثلة تمثيلا ضعيفا في مرحبا-C38. وعلاوة على ذلك، ينتهي Hi-C مع تسلسل نهاية مقترنة، وبالتالي استرداد أزواج من الاتصالات الجينومية. ومع ذلك، يمكن أن تتفاعل عدة شظايا الحمض النووي في وقت واحد في نفس مجمع الكروماتين. للحصول على هوية شظايا الحمض النووي متعددة في مجمع الكروماتين، يمكن تطبيق أساليب تسلسل بديلة على Hi-C39،أو استراتيجيات تجريبية مختلفة يمكن استخدامها في ربط لا يتم فيها38،40،41. وأخيرا، على الرغم من أن Hi-C يقيس الاتصالات الجينومية، فإنه لا يكشف عن هوية البروتينات التي تتوسط في التفاعلات. يجب تطبيق طرق بديلة لتحديد التفاعلات الجينومية بوساطة بروتين معين مهم42 أو هوية مجموعة البروتينات في عناصر جينومية محددة43.

في الختام، مع تجربة عالية الجودة مرحبا جيم كما هو موضح هنا لجينوم Drosophila (الجدول 2)،يمكن بناء المصفوفات في مجموعة واسعة من القرارات (من 1، 5 كيلوبايت، 50 كيلوبايت أو أقل؛ انظر الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان لا بد من تقييم منطقة معينة من الجينوم على مستوى جزء التقييد، يمكن استخدام البيانات لبناء مشهد افتراضي 4C لوجهة النظر المطلوبة (على سبيل المثال، الجين Notch 5'UTR في الشكل 4E). أداة Hi-C ذات النهايات الأخرى في SeqMonk هي خيار سهل الاستخدام للغاية يمكن من تصور هذا المشهد. تطبيق أداة القياس الكمي 4C ، وهو أيضا جزء من SeqMonk ، على هذا المشهد يمكن أن تسفر عن اتصالات ذات دلالة إحصائية.

تطبيق تجربة Hi-C في النواة الموصوفة هنا على مجموعة من خطوط الخلايا المتحولة مع مواقع ربط الحمض النووي AP المعدلة عند حدود TAD (الشكل 4) كشفت أن هناك حاجة إلى عناصر جينية عند الحدودلهيكلة جينوم دروسوفيلا في المجالات والحفاظ على تنظيم التعبير الجيني كما ناقشه أرزات-ميخيا وآخرون. وهكذا، فإن التحرير الجيني للعناصر التنظيمية مع نظام CRISPR/Cas9، إلى جانب التنميط عالي الدقة للتفاعلات الجينومية باستخدام بروتوكول Hi-C في النواة الموصوف هنا، يمكن أن يكون استراتيجية قوية لاختبار الوظيفة الهيكلية للعناصر الوراثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل برنامج دعم التكنولوجيا والبحوث التابع للبعثة رقم المنحة IN207319 ورقم منحة المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-FORDECyT) 303068. أ.إ.ل. هو طالب ماجستير بدعم من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (كوناسي) رقم CVU 968128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Tags

علم الوراثة، العدد 175، الكروماتين، منظمة الجينوم ثلاثية الأبعاد، المقصورات، المجالات المرتبطة طوبولوجيا
في النواة مرحبا C في خلايا دروسوفيلا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Esquivel-López, A.,More

Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter