Summary
Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.
Abstract
Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.
Introduction
Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase1bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern2. Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomenorganisation3,4,5markieren. Bei Säugetieren werden TAD-Grenzen durch Cohesin und CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)6,7,8besetzt. Der Cohesin-Komplex extrudiert Chromatin und stoppt an CTCF-Bindungsstellen, die in konvergenter Orientierung in der genomischen Sequenz angeordnet sind, um stabile Chromatinschleifen9,10,13,14zu bilden. Genetische Störung der CTCF-DNA-Bindungsstelle an den Grenzen oder Verringerung der CTCF- und Cohesinproteinhäufigkeit führt zu abnormalen Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen, Verlust der TAD-Bildung und Deregulierung der Genexpression9,10,11,13,14.
Bei Drosophila werden die Grenzen zwischen TADs von mehreren APs besetzt, darunter der Grenzelement-assoziierte Faktor 32 kDa (BEAF-32), das Motif 1-Bindungsprotein (M1BP), das zentromale Protein 190 (CP190), der Suppressor des Haarflügels (SuHW) und CTCF, und sind mit aktiven Histonmodifikationen und Polymerase II16,17,18angereichert. Es wurde vermutet, dass bei Drosophila TADs als Folge der Transkription13 , 17,19auftreten, und die genaue Rolle unabhängiger APs bei der Grenzbildung und den Isolationseigenschaften wird noch untersucht. Ob Domänen in Drosophila eine alleinige Folge der Aggregation von Regionen ähnlicher Transkriptionszustände sind oder ob APs, einschließlich CTCF, zur Grenzbildung beitragen, muss daher noch vollständig charakterisiert werden. Die Erforschung genomischer Kontakte mit hoher Auflösung wurde durch die Entwicklung von Chromosomenkonformationserfassungstechnologien in Verbindung mit sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht. Das Hi-C-Protokoll wurde erstmals mit dem Ligationsschritt "in Lösung"2 beschrieben, um falsche Ligationsprodukte zwischen Chromatinfragmenten zu vermeiden. Mehrere Studien wiesen jedoch auf die Erkenntnis hin, dass das nützliche Signal in den Daten von Ligationsprodukten stammte, die an teilweise lysierten Kernen gebildet wurden, die nicht in Lösung20,21waren .
Das Protokoll wurde dann modifiziert, um die Ligatur im Kern als Teil des Einzelzell-Hi-C-Experiments22durchzuführen. Das In-Nucleus-Hi-C-Protokoll wurde anschließend in die Zellpopulation Hi-C integriert, um eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen zu erzielen und Daten mit weniger technischem Rauschen zu erzeugen23,24. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll basiert auf dem Population in-nucleus Hi-C Protokoll23,24 und wurde verwendet, um die Folgen der genetischen Entfernung von DNA-bindenden Motiven für CTCF und M1BP von einer Domänengrenze am Notch-Genlocus in Drosophila25zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung der DNA-bindungsnden Motive für APs an der Grenze drastische Folgen für die Bildung der Notch-Domäne, größere topologische Defekte in den Regionen rund um den Notch-Locus und die Deregulierung der Genexpression hat. Dies deutet darauf hin, dass genetische Elemente an Domänengrenzen für die Aufrechterhaltung der Genomtopologie und Genexpression in Drosophila25wichtig sind.
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Protocol
1. Fixierung
- Beginnen Sie mit 10 Millionen Schneider's Line 2 plus (S2R+) Zellen, um 17,5 ml einer Zellsuspension in Schneider-Medium herzustellen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) bei Raumtemperatur (RT) enthält.
- Fügen Sie methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei RT, wobei Sie darauf achten, jede Minute zu mischen.
HINWEIS: Formaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften und arbeiten Sie im Abzug. - Löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von Glycin, um eine Endkonzentration von 0,125 M zu erreichen, und mischen Sie. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT, gefolgt von 15 Minuten auf Eis.
- Zentrifuge für 400 × g bei RT für 5 min und dann für 10 min bei 4 °C; Verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet vorsichtig in 25 ml kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung wieder auffüllen.
- Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 °C, dann den Überstand entsorgen.
HINWEIS: Wenn Sie mit dem Protokoll fortfahren, fahren Sie mit Schritt 2.1 für die Lyse fort. Andernfalls wird das Pellet in flüssigkeitsN2 eingefroren und bei -80 °C gelagert.
2. Lyse
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% nichtionisches Tensid (siehe Materialtabelle);10 mM NaCl; 1x Proteaseinhibitoren) und stellen Sie das Volumen mit eiskaltem Lysepuffer auf 10 ml ein. Stellen Sie das Volumen ein, um eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml zu erhalten. 30 Minuten auf Eis inkubieren und alle 2 Minuten durch Umkehren der Röhrchen mischen.
- Zentrifugieren Sie die Kerne bei 300 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml Kaltlysepuffer und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml kaltem 1,25-fachem Restriktionspuffer und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 360 μL 1,25x Restriktionspuffer.
- Fügen Sie 11 μL 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) pro Röhrchen (0,3% Endkonzentration) hinzu, mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie bei 700-950 U / min. Pipetieren Sie auf und ab, um Klumpen während der Inkubation einige Male zu stören.
- Löschen Sie das SDS durch Zugabe von 75 μL nichtionischem Tensid (10% ige Lösung, siehe Materialtabelle)pro Röhrchen (1,6% Endkonzentration) und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie es bei 950 U / min. Pipeten Sie ein paar Mal auf und ab, um Klumpen während der Inkubation zu stören.
HINWEIS: Wenn Klumpen groß und schwer zu stören sind, verringern Sie die Drehzahl während SDS- und Tensidbehandlungen auf 400 U / min. Wenn die Klumpen durch Pipettieren schwer zu disaggregieren sind, teilen Sie die Probe in zwei Teile; Passen Sie die Volumina von Restriktionspuffer, SDS und Tensid an; und fahren Sie mit der Permeabilisierung fort. Als nächstes drehen Sie die Kerne mit minimaler Geschwindigkeit (200 × g),entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, bündeln Sie die Proben in einem 1X-Restriktionspuffer und fahren Sie mit dem Aufschluss fort. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als unverdaute Probe (UD).
3. Enzymatische Verdauung
- Verdauen Sie das Chromatin durch Zugabe von 200 Einheiten (U) Mbo I pro Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 °C für einen Zeitraum von 4 h bis über Nacht während des Drehens (950 U / min).
- Fügen Sie am nächsten Tag zusätzliche 50 U Mbo I pro Rohr hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 2 h, während Sie drehen (950 U / min).
- Inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie die Röhrchen bei 60 °C für 20 min inkubieren. Legen Sie die Schläuche auf Eis.
HINWEIS: Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als verdaute Probe (D).
4. Biotinylierung von DNA-Enden
- Um die Restriktionsfragmentüberhänge zu füllen und die DNA-Enden mit Biotin zu kennzeichnen, fügen Sie jeweils 1,5 μL von 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL von 0,4 mM Biotin dATP, 17,5 μL Tris Low-EDTA (TLE) Puffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] und 10 μL von 5 U / μL Klenow (DNA Polymerase I großes Fragment) zu allen Röhrchen hinzu. Vorsichtig mischen und 75 min bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie bei 700 U / min alle 10 s für 30 s. Legen Sie alle Schläuche auf Eis, während Sie die Ligationsmischung vorbereiten.
5. Ligatur
- Jede verdaute Chromatinmischung wird in ein separates 1-ml-Röhrchen mit Ligationsmischung (100 μL 10x Ligationspuffer, 10 μL 10 mg/ml Rinderserumalbumin, 15 HE T4-DNA-Ligase und 425 μL doppelt destilliertes Wasser [ddH2O]) übertragen. Durch sanftes Pipettieren gründlich mischen und über Nacht bei 16 °C inkubieren.
6. Vernetzungsumkehr und DNA-Reinigung
- Bauen Sie Proteine durch Zugabe von 50 μL 10 mg/ml Proteinase K pro Röhrchen ab und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 2 h. Umgekehrte Vernetzung durch Erhöhung der Temperatur auf 65 °C und Inkubation über Nacht.
- RNA durch Zugabe von 20 μL 10 mg/ml RNase A abbauen und 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
- Führen Sie eine Phenol:Chloroform-Extraktion durch, gefolgt von einer Ethanolfällung.
- Fügen Sie 1 Volumen Phenol-Chloroform hinzu und mischen Sie gründlich durch Inversion, um eine homogene Weißphase zu erhalten.
HINWEIS: Phenol ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften. Arbeiten Sie im Abzug. - Zentrifuge bei 15.000 × g für 15 min. Die wässrige Phase in ein frisches 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Führen Sie eine Rückextraktion der unteren Schicht mit 100 μL TLE-Puffer durch und übertragen Sie die wässrige Phase in dasselbe 2-ml-Röhrchen.
- Ausfällung der DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100% Ethylalkohol (EtOH), 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 μL 20 mg/ml Glykogen. Bei -20 °C für einen Zeitraum von 2 h bis über Nacht inkubieren.
- Bei 15.000 × g 30 min bei 4 °C schleudern und die Pellets 2x mit eiskaltem 70% EtOH waschen. Trocknen Sie die Pellets bei RT und bürsten Sie sie in 100 μL TLE-Puffer wieder auf. Quantifizieren Sie die DNA mit einem fluorogenen Farbstoff, der selektiv an DNA bindet, und einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle).
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie Ligationsprodukte kurzfristig bei 4 °C oder langfristig bei -20 °C. Verwenden Sie ein Aliquot (100 ng) des Materials als ligierte Probe (L) zur Qualitätskontrolle.
- Fügen Sie 1 Volumen Phenol-Chloroform hinzu und mischen Sie gründlich durch Inversion, um eine homogene Weißphase zu erhalten.
7. Bewerten Sie die Qualität der Hi-C-Vorlage
- Qualitative Kontrollen von Verdauung und Ligation
- Reinigen Sie DNA von den UD- und D-Aliquoten, indem Sie die Vernetzungen umkehren, und führen Sie die Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wie oben beschrieben durch.
- Laden Sie 100 ng UD-, D- und L-Proben in ein 1,5% iges Agarosegel. Suchen Sie nach einem Abstrich um 500 bp in der D-Probe im Vergleich zu einem hochmolekularen Band für die L-Probe (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Aufschlusseffizienz quantitative Kontrolle
HINWEIS: Um die Aufschlusseffizienz genauer zu beurteilen, verwenden Sie die UD- und D-Proben als Vorlagen, um quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (qPCR) mit Primern durchzuführen, die wie folgt entwickelt wurden.- Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein DNA-Fragment amplifiziert, das die DNA-Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I im vorliegenden Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 R genannt wird.
- Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein Kontroll-DNA-Fragment amplifiziert, das nicht die Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I für das vorliegende Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 als C bezeichnet wird.
- Verwenden Sie die Zyklusschwellenwerte (Ct-Werte) der Verstärkung, um die Restriktionseffizienz gemäß der unten gezeigten Formel zu berechnen:
% Restriktion = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Dabei bezieht sich CtR auf den Ct-Wert von Fragment R und CtC auf den Ct-Wert des Fragments C für Probe D und Probe UD.
HINWEIS: Der Restriktionsprozentsatz spiegelt die Effizienz des Restriktionsenzyms wider, das das eingeschränkte (R) DNA-Fragment spaltet, verglichen mit einem Kontroll-DNA-Fragment (C), das die Restriktions-DNA-Stelle nicht enthält. Ein Restriktionswirkungsgrad von ≥ 80% wird empfohlen.
- Erkennung bekannter Wechselwirkungen
- Führen Sie eine PCR durch, um eine interne Ligationskontrolle zu verstärken, um Wechselwirkungen mit kurzer und/oder mittlerer oder langer Reichweite zu untersuchen (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Alternativ können Primer zur Verstärkung eines Ligationsprodukts, bei dem sich die Primer in Vorwärts-Vorwärts- oder Rückwärts-Rückwärts-Ausrichtung in benachbarten Restriktionsfragmenten befinden, entwerfen.
- Fill-in- und Biotin-Markierungskontrolle
- Überprüfung der Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Verdauung einer bekannten Wechselwirkung oder eines Ligationsprodukts zwischen benachbarten Restriktionsfragmenten im Genom, wie oben beschrieben.
HINWEIS: Erfolgreiches Fill-in und Ligation der Mbo I-Stelle (GATC) erzeugt eine neue Stelle für das Restriktionsenzym Cla I (ATCGAT) an der Ligationsstelle und regeneriert die Mbo-I-Stelle. - Verdauen Sie das PCR-Produkt mit Mbo I, Cla I oder beidem. Nachdem Sie die Proben mit einem 1,5-2% igen Gel ausgeführt haben, schätzen Sie die relative Anzahl der 3C- und Hi-C-Ligationsverbindungen, indem Sie die Intensität der geschnittenen und ungeschnittenen Bänder quantifizieren26.
HINWEIS: Ein Wirkungsgrad von > 70% ist erwünscht (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Überprüfung der Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Verdauung einer bekannten Wechselwirkung oder eines Ligationsprodukts zwischen benachbarten Restriktionsfragmenten im Genom, wie oben beschrieben.
8. Beschallung
- Beschallen Sie die Proben, um 200-500 bp DNA-Fragmente zu erhalten. Für das in diesem Protokoll verwendete Instrument (siehe Materialtabelle) verdünnenSie die Probe (von 5 bis 10 μg) in 130 μL ddH2O pro Röhrchen und stellen Sie das Instrument auf 400 bp ein: Füllstand: 10; Zollfaktor: 10%; Spitzenleistung (w): 140; Zyklen pro Burst: 200; Zeit(en): 80.
9. Biotinentfernung/Endreparatur
HINWEIS: Die unten gezeigten Schritte sind für 5 μg Hi-C-DNA angepasst.
- Um die Biotinentfernung durchzuführen, wird die Probe (130 μL) in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Fügen Sie 16 μL 10x Ligationspuffer, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) und 7 μL ddH2O (160 μL Gesamtvolumen) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.
- Fügen Sie 5 μL von 10 mM dNTPs, 4 μL 10x Ligationspuffer, 5 μL T4-Polynukleotidkinase (10 U/μL), 1 μL Klenow und 25 μL ddH2O (200 μL Des Gesamtvolumens) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.
10. Größenauswahl
- Um Fragmente auszuwählen, die hauptsächlich im Größenbereich von 250-550 bp liegen, führen Sie zuerst eine sequenzielle SPRI-Größenauswahl (Solid Phase Reversible Immobilization) mit 0,6x durch, gefolgt von 0,90x gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie die DNA mit 100 μL TLE.
11. Biotin Pulldown / A-Tailing / Adapter-Ligation
HINWEIS: Führen Sie die Waschungen durch, indem Sie die magnetischen Perlen durch Wirbeln wieder aufwenden, drehen Sie die Proben für 3 Minuten auf einem rotierenden Rad und drehen Sie dann die Probe kurz herunter und legen Sie sie auf den magnetischen Ständer. Lassen Sie die Perlen am Magneten haften, verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie mit dem folgenden Waschschritt fort. Führen Sie die Waschungen bei 55 °C auf einem Thermoblock mit Rotation anstelle des rotierenden Rades durch.
- Machen Sie das Endvolumen auf 300 μL pro Probe mit TLE für Pull-Down. Bereiten Sie die Perlenwaschpuffer vor: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x No-Tween Puffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Verwenden Sie 150 μL Streptavidin-gebundene magnetische Perlen (siehe Materialtabelle)pro Bibliothek. Waschen Sie die Perlen 2x mit 400 μL 1x TB. Dann Perlen in 300 μL 2x NTB resuspendieren.
- Mischen Sie die Perlen mit dem 300 μL Hi-C-Material und inkubieren Sie bei RT für 30 Minuten auf einem rotierenden Rad, damit Biotin an Streptavidin-Perlen gebunden werden kann.
- Die Perlen mit 400 μL 0,5x TB waschen und bei 55 °C für 3 min inkubieren und mit 750 U/min drehen. Waschen Sie die Perlen in 200 μL 1x Restriktionspuffer.
- Die Perlen werden in 100 μL dATP-Tailing-Mischung (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x Restriktionspuffer, 5 μL Klenow exo- und 80 μL ddH2 O)resuspendiert. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Den Überstand entfernen, die Perlen 2x mit 400 μL 0,5x TB waschen, bei 55 °C für 3 min inkubieren und bei 750 U/min drehen.
- Waschen Sie die Perlen mit 400 μL 1x NTB und dann mit 100 μL 1x Ligationspuffer.
- Die Perlen in 50 μL 1x Ligationspuffer resuspendieren und die Suspension in ein neues Röhrchen überführen. Fügen Sie 4 μL vorgeglühte PE-Adapter (15 μM Vorrat) und 2 μL T4-Ligase (400 U / μL, dh 800 U / Röhrchen) hinzu; inkubieren Sie bei RT für 2 h.
HINWEIS: Glühen Sie die Adapter vor, indem Sie gleiche Mengen von PE 1.0- und PE 2.0-Adaptern (30 μM-Bestand) hinzufügen und 10 Minuten bei RT inkubieren (siehe Materialtabelle). - Fangen Sie die Perlen wieder ein, indem Sie den Überstand entfernen und die Perlen 2x mit 400 μL TB waschen. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 1x NTB, dann mit 100 μL 1x Restriktionspuffer und resuspendieren Sie die Perlen in 40 μL 1x Restriktionspuffer.
12. PCR-Amplifikation
- Richten Sie PCRs mit 25 μL Volumen mit 5, 6, 7 und 8 Zyklen ein. Verwenden Sie für jede PCR:
Reaktionsrezept Hi-C Perlen 2,5 μL 10 μM PE PCR Primer 1 (Materialtabelle) 0,75 μL 10 μM PE PCR Primer 2 (Materialtabelle) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL 5x Reaktionspuffer 5 μL DNA-Polymerase 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Gesamt 25 μL Zyklen Temperatur Zeit 1 98 °C 30 s n Zyklen 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 Min.
13. Endgültige PCR-Amplifikation
- Führen Sie die endgültige PCR-Amplifikation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben und der Anzahl der ausgewählten Zyklen durch. Teilen Sie die Probe mit 5 μL Hi-C-Perlen als Vorlage in 50 μL-Reaktionen.
- Sammeln Sie alle PCR-Reaktionen und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen. Verwenden Sie den Magneten, um die Streptavidin-Perlen zu entfernen und den Überstand (PCR-Produkte) wiederherzustellen. Die Perlen in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen wie in Schritt 11.2.9 angegeben waschen und als Backup in 1x Restriktionspuffer bei 4 °C lagern.
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit dem 0,85-fachen Volumen der SPRI-Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Elute mit 30 μL TLE-Puffer.
- Quantifizieren Sie die Hi-C-Bibliothek mit einem fluorometrischen Instrument und bestätigen Sie die Qualität der Bibliothek durch chipbasierte Kapillarelektrophorese.
- Verwenden Sie als letzten Qualitätskontrollpunkt 1 μL der Hi-C-Bibliothek als Vorlage, um eine PCR-Reaktion mit 10 Zyklen unter den gleichen Bedingungen durchzuführen, die in Schritt 12.1 beschrieben wurden. Teilen Sie das PCR-Produkt in zwei Mikrozentrifugenröhrchen auf: Verdauen Sie eine mit Cla I und lassen Sie die andere unverdaut als Kontrolle. Führen Sie die Produkte in einem 1,5-2% igen Agarosegel aus (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Fahren Sie mit der 50 bp oder 75 bp Paired-End-Sequenzierung auf einer geeigneten Sequenzierungsplattform fort.
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Representative Results
Im Folgenden werden die Ergebnisse eines erfolgreichen Hi-C-Protokolls beschrieben (siehe eine Zusammenfassung des Hi-C-Protokollworkflows in Abbildung 1A). Während des Hi-C-Experiments im Kern gibt es mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle. Probenal aliquots wurden vor (UD) und nach (D) dem Chromatinrestriktionsschritt sowie nach der Ligatur (L) gesammelt. Die Vernetzung wurde umgekehrt und die DNA wurde gereinigt und auf einem Agarosegel ausgeführt. Ein Abstrich von 200-1000 bp wurde beobachtet, als die Restriktion mit Mbo I erfolgreich war (Abbildung 1B). Die erwartete Größe des Moleküls hängt vom Restriktionsenzym der Wahl ab. Wenn die Ligatur erfolgreich war, wurde ein hochmolekulares Band an der Oberseite des Gels gesehen (Abbildung 1B). Die Aufschlusseffizienz kann auch durch qPCR bestätigt werden, wie im Protokoll ausführlich beschrieben. Eine akzeptable Aufschlusseffizienz beträgt 80% oder höher (Abbildung 1C).
Um die Hi-C-Ligationseffizienz im Detail zu bewerten, können Primer so konzipiert werden, dass sie eine interne Ligationsproduktkontrolle verstärken, bei der sich die Primer in Vorwärts-Vorwärts- oder Rückwärts-Rückwärts-Ausrichtung in benachbarten Restriktionsfragmenten befinden. Alternativ können Primer so konzipiert werden, dass sie bekannte Wechselwirkungen verstärken. Abbildung 2A zeigt die Verstärkung einer bekannten Wechselwirkung mittlerer Reichweite (300 kb) in Drosophila25. Hi-C-Ligationsprodukte (bei denen die Biotinmarkierung, das Fill-In und die Ligatur erfolgreich erfolgt sind) können durch Aufschluss des bei der Amplifikation gewonnenen PCR-Produkts geschätzt werden. Nach dem Ausfüllen und der Ligatur enthalten Hi-C-Amplicons eine neue Cla I-Restriktionsstelle an der ursprünglichen Mbo I-Stelle, die bei stumpfer Ligatur erhalten bleibt. Wenn die Beschränkung mit Cla I nicht vollständig ist, ist die Fill-in-Reaktion und die Biotinmarkierung ineffizient. Eine Aufschlusseffizienz von mehr als 70% wird empfohlen, um einen großen Anteil an nicht nützlichen Lesevorgängen für die Bibliotheken nach der Sequenzierung zu vermeiden(Abbildung 2A,vergleichen Sie die Cla I-Verdauung des 3C mit der Hi-C-Vorlage).
Um eine ausreichende Anzahl von PCR-Amplifikationszyklen zur Amplifikation der endgültigen Hi-C-Bibliothek zu bestimmen, wurden PCR-Reaktionen unter Verwendung von 2,5 μL einer bestimmten Bibliothek auf Perlen eingerichtet, wie im Protokoll beschrieben. Die Anzahl der PCR-Zyklen für die endgültige Amplifikation ist einen Zyklus kleiner als die Anzahl der Zyklen, für die der Abstrich sichtbar ist (Abbildung 2B). In diesem Fall wurden 4 Zyklen der PCR-Amplifikation gewählt. Als letzter Qualitätskontrollpunkt wurde ein Aliquot der Hi-C-Bibliothek erneut verstärkt und mit Cla I verdaut. Der Verdauungsgrad der Bibliothek (eine Abnahme der Abstrichgröße) gibt die Häufigkeit gültiger Hi-C-Paare an und spiegelt den Anteil nützlicher Lesevorgänge wider, die aus der Bibliothek abgerufen werden(Abbildung 2C). Ein Verhältnis des oberen Größenbereichs (bestimmt durch die in der UD-Probe vorhandene Größe) und des unteren Größenbereichs in UD- und D-Proben sollte ein Verhältnis > 1 für die UD und ein Verhältnis ≤ 1 für die verdaute Probe ergeben, wenn der Cla I-Aufschluss effizient ist.
Nach der Paired-End-Sequenzierung wurden die FASTQ-Dateien (Tabelle 1) mit HiCPro28 verarbeitet und die generierten Statistiken mit MultiQC28aufbereitet. Ein alternatives Tool zu HiCPro ist die HiCUP30-Pipeline, die ähnliche Ergebnisse liefert (nicht gezeigt). Abbildung 3 und Tabelle 2 zeigen die detaillierten statistischen Informationen der sequenzierten Lesevorgänge. Vollständige Leseausrichtung und Ausrichtung nach dem Trimmen werden gemeldet. Diese beiden Kategorien entsprechen erfolgreich ausgerichteten Lesevorgängen, die in der nachfolgenden Analyse verwendet werden, um gültige Hi-C-Paare zu finden. Die Alignment-after-Trimming-Kategorie bezieht sich auf Lesevorgänge, die den Ligationsübergang überspannen, die im ersten Schritt nicht ausgerichtet wurden und an der Ligationsstelle getrimmt werden, um dann ihre 5'-Extremität wieder auf das Genomauszurichten 28 (Abbildung 3B,C und Tabelle 2). Die Kontaktstatistiken zeigen, dass die Hi-C-Bibliothek von hoher Qualität war, mit 82,2% gültigen Paaren und 7,6% nicht nützlichen Lesevorgängen, die in die Kategorien same-fragment self-circle, same-fragment dangling-ends, re-ligation, filtered pairs und dumped pairs fielen (Abbildung 3A, Abbildung 3Dund Tabelle 2). Darüber hinaus ist die Anzahl der PCR-Duplikate sehr gering, was darauf hindeutet, dass die Bibliothekskomplexität hoch ist und dass die PCR-Zyklen minimale Artefakte eingeführt haben (Abbildung 3E und Tabelle 2).
Unter Verwendung der eindeutigen gültigen Hi-C-Paare wurde eine grundlegende Analyse der Paarverteilung mit HiCPro27durchgeführt. Dieses Experiment ergab 46,5 % eindeutige cis-Kontakte ≤ 20 kbp, 47,1% eindeutige cis-Kontakte > 20 kbp und 5,8% eindeutige Trans-Kontakte (Abbildung 3D). Die Verteilung von cis auf transvalidierte Paare entsprach den Ergebnissen, die für ein erfolgreiches Hi-C-Experiment erwartet wurden, wobei die meisten Interaktionen innerhalb desselben Chromosoms nachgewiesen wurden. Ein hoher Anteil an Transkontakten deutet auf eine ineffiziente Fixierung hin. Unter Verwendung der hi-C gültigen Paare aus HiCPro27wurden Matrizen durch iterative Korrektur und Eigenvektorzerlegung (ICE)30normalisiert, und 1 kb und 5 kb Auflösungsmatrizen wurden mit HiCPlotter30,31,32generiert . Für den Notch-Genlocus in Drosophila werden normalisierte Kontaktmatrizen mit einer Auflösung von 1 kb und 5 kb dargestellt (Abbildung 4A, Abbildung 4Cund Abbildung 4D). In Abbildung 4Aist der Notch-Genlocus zusammen mit den APs, Domäne l und II sowie Histonmodifikationen entlang des Locus zu sehen ( Abbildung4A und Tabelle 1). Das Design der CRISPR-Cas9 Deletion beinhaltete das Motiv von CTCF und M1BP (Abbildung 4B).
Nach Der Deletion der Region, die sowohl CTCF- als auch M1BP-DNA-Bindungsstellen an der 5'-Grenze des Notch-Locus enthält (5pN-delta343, Tabelle 1),kann eine dramatische Veränderung der Chromatinkontakte mit Verlust von Wechselwirkungen innerhalb des Notch-Locus und Gewinn von Kontakten mit dem vorgelagerten TAD im Vergleich zum Wildtyp (WT) beobachtet werden (Abbildung 4C, D). Schließlich zeigt Abbildung 4E ein detailliertes Panorama von WT- und mutanten Interaktionsprofilen auf der Ebene des Restriktionsfragments aus dem Notch-Gen 5' UTR, das eine Abnahme des Anteils der Kontakte mit dem Notch-Genlocus und eine Zunahme der Kontakte mit der vorgelagerten Domäne zeigt. Die virtuellen 4C-Ansichten des Notch-Gens 5' UTR wurden mit HiC-Pro27erhalten. Ein alternatives Werkzeug ist die Hi-C-Other-Ends-Quantifizierung, die in SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/ verfügbar ist. Alle in Abbildung 4 vorgestellten Ergebnisse wurden durch Anwendung des In-Nucleus-Hi-C-Protokolls in WT- und mutierten S2R+ Drosophila-Zellen erhalten, wie von Arzate-Mejía et al.25beschrieben.
Abbildung 1: In-Nucleus Hi-C Verdauung und Ligation Kontrollen. (A) Hi-C ProtokollÜbersicht. Zellen sind mit Formaldehyd vernetzt, was zu kovalenten Verbindungen zwischen Chromatinsegmenten (DNA-Fragmente: rosa, violett) und Proteinen führt. Chromatin wird mit einem Restriktionsenzym (dargestellt durch schere) verdaut, in diesem Beispiel Mbo I. Die resultierenden klebrigen Enden werden mit Nukleotiden einschließlich eines biotinylierten dATP (Dark Blue Circles) gefüllt. Die DNA wird gereinigt und die biotinylierten Verbindungen werden mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (graue Kreise) angereichert. Interagierende Fragmente werden durch Paired-End-Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert. (B) Hi-C-Verdauungs- und Ligationsqualitätskontrollen für zwei biologische Replikate (Hi-C 1 und Hi-C 2). Hi-C-Bibliotheken wurden auf einem 1,5% igen Agarosegel aufgelöst. Beide verdauten, D, Bibliotheken laufen als Abstrich um 600 bp. Ligated Samples, Lig, laufen als ein ziemlich enges Band größer als 10 kb ähnlich wie die unverdauten UD-Samples. Die Unterschiede in der Signalstärke sind auf ungleichmäßige Mengen an geladener DNA auf dem Gel zurückzuführen. (C) Quantitative Kontrolle des Hi-C-Aufschlusses durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion für dieselben beiden biologischen Replikate wie in (B) (Hi-C 1 und Hi-C 2) unter Verwendung der im Protokoll beschriebenen Zyklusschwellenwerte. Eine erfolgreiche Verdauung hat ≥ 80% Einschränkung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: In-Nucleus Hi-C Fill-in und Blunt-End Ligation Kontrollen. (A) Fill-in und Biotin Labeling Bewertung. Eine bekannte Wechselwirkung zwischen Fragmenten, die sich 300 kb voneinander entfernt im Chromosom X befinden, wurde als Kontrolle verwendet und mit den mit schwarzen Pfeilen gekennzeichneten Primern verstärkt (siehe oben im Schema in (B), Primer 1 (links), Primer 2 (rechts), Tabelle 1), wodurch ein Amplicon von 347 bp erzeugt wurde. Hi-C-Ligationsprodukte können von denen unterschieden werden, die in einem 3C-Experiment durch Verdauung der Ligationsstelle hergestellt werden. Hi-C-Verbindungen wurden von Cla I an der ursprünglichen Mbo I-Stelle verdaut, da sich diese bei stumpfer Ligatur bildeten. Hi-C- und 3C-Verbindungen wurden mit Mbo I verdaut, da sich die Restriktionsstelle bei der Ligatur regeneriert (links vom Gel). Im Gegensatz dazu wurden 3C-Verbindungen nicht von Cla I am Mbo I-Standort verdaut, sondern nur von Mbo I. Vergleichen Sie das Aufschlussprofil der Hi-C- und 3C-Produkte mit Cla I. Ein 53-bp-Fragment wurde durch Verdauung des Hi-C-Produkts erhalten (aufgrund der Einschränkung des cla I-Standorts, der am Standort Mbo I gebildet wurde, und der Beschränkung eines bereits in der Region vorhandenen Cla I-Standorts). Dieses Fragment wurde bei der Aufschluss des 3C-Produkts nicht beobachtet, da der einzige verfügbare Cla I-Standort derjenige war, der bereits in der Region vorhanden war. (B) Nach PCR-Amplifikation der Hi-C-Bibliothek unter Verwendung verschiedener PCR-Zyklen wurden die Produkte mit einem 1,5%igen Agarosegel betrieben. Ein Abstrich von 400-1000 bp wurde erwartet und beobachtet. Die entsprechenden Zahlenzyklen für die endgültige Amplifikations-PCR sollten als die Zahl angesehen werden, die unmittelbar niedriger ist als die Zahl, bei der ein Abstrich gerade sichtbar ist. (C) Endbibliothek Cla I Verdauung. Ein Aliquot der endgültigen Bibliothek wurde erneut verstärkt und mit Cla I verdaut. Die Verkleinerung des Abstrichs bestätigte, dass ein großer Teil der Moleküle in der Bibliothek gültige Hi-C-Paare waren. Die densitometrische Analyse dieses Gels kann durchgeführt werden, um ein Verhältnis zwischen den UN- und D-Proben zu erhalten, wie im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: HiC-Pro-Statistik der Hi-C-Bibliothek. (A) Schematische Darstellung gültiger Hi-C-Paare und der verschiedenen Typen ungültiger Paare, die während des Experiments erzeugt und von HiCPro27 herausgefiltert werden können (Tabelle 2). Dazu gehören Lesevorgänge, die in zusammenhängende Sequenzen fallen, baumelnde Enden, gleiche Fragmente, Selbstkreise, Neuligaturen und PCR-Duplikate. (B) Kartenstatistik. Lesevorgänge, die nicht ausgerichtet werden konnten, werden angezeigt (grau), und sowohl vollständig ausgerichtete Lesevorgänge als auch lesevorgänge, die nach dem Trimmen ausgerichtet sind, werden blau bzw. hellblau angezeigt. Diese beiden Kategorien stellen die nützlichen Lesevorgänge dar, die in nachfolgenden Analysen berücksichtigt werden. (C) Paarungsstatistiken. Multi Aligned Reads (dunkelorange) stellen Lesevorgänge dar, die in mehreren Regionen des Genoms ausgerichtet sind. Unique Aligned (dunkelblaue) Lesevorgänge stellen die Lesepaare dar, die einmal im Genom ausgerichtet sind, und Singletons (hellorange) stellen Lesepaare dar, in denen nur eine genomische Region in beiden Lesevorgängen sequenziert wurde. (D) Filterstatistiken. Gültige Lesepaare (blau) stellen erfolgreiche Hi-C-Ligationsprodukte dar, wie unter (A) beschrieben. Selbstfragment-Selbstkreise (hellrosa) sind nicht brauchbare Lesevorgänge, da sie das gleiche genomische Fragment darstellen, das in (A) gezeigt wird. Baumelnde Enden mit demselben Fragment (orange) stellen Lesevorgänge dar, bei denen ein einzelnes Einschränkungsfragment sequenziert wurde. Gefilterte und gedumpte Paare (braun) sind ebenfalls nicht brauchbare Lesevorgänge, die die falsche Größe haben oder für die das Ligationsprodukt nicht rekonstruiert werden konnte. Schließlich stellen Re-Ligation-Lesevorgänge (rot) Lesevorgänge dar, bei denen zwei benachbarte Fragmente neu ligiert wurden, wodurch nicht nützliche Informationen erzeugt wurden. (E) Gültige Lesepaare Kontaktverteilung im Genom. Eindeutige cis-Kontakte (blau) sind häufiger als eindeutige trans-Kontakte (grün). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Hi-C-Kontaktmatrizen und virtuelle 4C-Analyse von WT- und mutierten S2R+-Zellen. (A) Hi-C normalisierte Heatmap einer 50 kb Region mit 1-kb Auflösung zentriert im Notch Gen locus. Die TAD-Trennungspunktzahl32 für den Locus wird zusammen mit der Partitionierung des Notch-Locus in zwei topologische Domänen (Domäne 1 und Domäne 2) angezeigt. ChIP-seq-Daten für APs, RNA Pol II und Histonmarkierungen für S2/S2R+ Zellen34,35,36,37 sind unterhalb der Heatmap dargestellt ( Tabelle1). Die Positionen der Grenzen der Notch-Domäne 1 sind hellgrün hervorgehoben. (B) Schematische Darstellung der CRISPR-Mutante der B1-Grenze. Das grüne Rechteck zeigt den gelöschten Bereich mit 343 bp an. Scheren zeigen sgRNAs an, die für crispR-vermittelte Genom-Editing verwendet werden. Motivbindungsstellen für APs werden als Boxen für CTCF und M1BP angezeigt. Peak-Gipfel für DNA-bindende APs, die in (A) gezeigt werden, sind ebenfalls mit35angegeben. (C) Hi-C normalisierte Heatmaps mit einer Auflösung von 1 kb, die einen 50 kb-Bereich abdecken, der in Notch für die WT- und die mutierten Zellen zentriert ist. Links, Hi-C Heatmaps der log2 Unterschiede in der Interaktionshäufigkeit zwischen WT und mutierten Zellen. (D) Hi-C normalisierte Heatmaps, die einen 250 kb-Bereich abdecken, der in Notch mit einer Auflösung von 5 kb für WT- und mutanten Zellen zentriert ist. Links, Hi-C Heatmaps der log2 Unterschiede in der Interaktionshäufigkeit zwischen WT und mutierten Zellen. (E) Virtual-4C für WT- und mutierte Zellen unter Verwendung der 5' UTR von Notch als Standpunkt. Die Prozentsätze der Wechselwirkungen zwischen dem Standpunkt und den Regionen innerhalb der vorgelagerten Kirredomain-2, Notch-Domäne 1, Notch-Domäne 2 und der nachgelagerten dnc-Domäne für WT- und mutanten Zellen sind25 dargestellt. Abkürzungen: WT = Wildtyp; TAD = topologisch assoziierte Domäne; ChIP = Chromatin-Immunpräzipitation; AP = architektonisches Protein; RNA Pol = RNA-Polymerase; S2R+ = S2-Rezeptor plus; sg RNA = Single Guide RNA; UTR = unübersetzter Bereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Experiment | Probe | GEO Beitrittsnummer |
| Chip | CP190 | GSM1015404 |
| Chip | SuHW | GSM1015406 |
| Chip | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Chip | CTCF | GSM1015410 |
| Chip | Ibf1 | GSM1133264 |
| Chip | Ibf2 | GSM1133265 |
| Chip | BEAF32 | GSM1278639 |
| Chip | Pita | GSM1313420 |
| Chip | ZIPIC | GSM1313421 |
| Chip | RNA PolII | GSM2259975 |
| Chip | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Chip | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Chip | H3K27ac | GSM2259987 |
| Chip | MSL2 | GSM2469507 |
| Chip | H4K16ac | GSM2469508 |
| Chip | M1BP | GSM2706055 |
| Chip | GAF | GSM2860390 |
| Chip | Eingabe | GSM1015412 |
| Hi-C | S2R+ WT Zellen | GSE136137 |
| Hi-C | S2R+ 5pN-delta343 Zellen | GSE136137 |
Tabelle 1: GEO-Beitrittsnummern.
| HiC-Pro Statistiken | Liest | Prozentsatz |
| Mapping-Statistiken | ||
| Vollständige Leseausrichtungen | 131515921 | 82.20% |
| Zugeschnittene Leseausrichtungen | 16408309 | 10.30% |
| Fehler beim Ausrichten | 12110964 | 7.60% |
| Pairing-Statistiken | ||
| Einzigartig ausgerichtet | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Mehrfach ausgerichtet | 57700021 | 36.90% |
| Filtern von Statistiken | ||
| Gültige Paare | 71373989 | 90.12% |
| Same-Fragment: Selbstkreis | 2340697 | 2.90% |
| Same-Fragment: Baumelnde Enden | 2578783 | 3.20% |
| Gefilterte Paare | 2773043 | 3.50% |
| Dumped Paare | 196565 | 0.20% |
| Kontaktstatistik | ||
| Einzigartig: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Einzigartig: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Einzigartig: trans | 4133602 | 5.80% |
| Doppelte Lesepaare | 398400 | 0.60% |
Tabelle 2: HiC-Pro-Statistiken.
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Discussion
Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente25. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet33. Wenn beispielsweise ein Gewebe anstelle einer Einzelzellsuspension verarbeitet wird, wird das Gewebe durch einen 70 μm-Filter gesiebt und der Lyseschritt wird durchgeführt, während das Material mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert wird. Da das Säugetiergenom 25x größer ist als das Drosophila-Genom, ist die Anzahl der gültigen Lesepaare, die zum Erstellen von Matrizen mit einer Auflösung von 1-5 kb benötigt werden, größer. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode unterscheidet sich von der ursprünglichen Hi-C-Methode2 in der Vermeidung der Kernlyse mit 1% SDS bei 65 °C vor der Ligatur, wodurch die nukleare Integrität erhalten bleibt, und durch Ligieren in 1 ml statt 7 ml23,24.
Das Protokoll enthält einige wichtige Schritte, um eine hohe Effizienz zu gewährleisten. Der erste Schritt, der Verdauungs- und Fill-in-Ineffizienzen einführen kann, ist die Bildung von Klumpen während 0,3% SDS-Permeabilisierung und Tensidbehandlungen. Wenn die Klumpen groß und schwer zu stören sind, sollte die Drehzahl während der SDS- und Tensidbehandlungen auf 400 U / min gesenkt werden. Wenn die Klumpen durch Pipettieren schwer zu disaggregieren sind, sollte die Probe in zwei Teile geteilt werden, indem die Volumina mit Restriktionspuffer, SDS und dem nichtionischen Tensid angepasst werden, bevor mit der Permeabilisierung fortgefahren wird. Als nächstes sollten die Kerne mit minimaler Geschwindigkeit (200 × g)zentrifugiert, der Überstand sorgfältig verworfen und die Proben in 450 μL 1x Restriktionspuffer zusammengefasst werden, bevor mit dem Aufschluss fortgefahren wird. Zweitens ist die Abschätzung der Verdauungseffizienz wichtig, um genügend DNA-Fragmente für das Ausfüllen und die Ligatur bereitzustellen. Wenn sich bei qualitativer Beurteilung die Verdauung als ineffizient erweist, sollte eine zweite Verdauungsrunde mit dem Restriktionsenzym für einen Zeitraum von 4 h bis über Nacht durchgeführt werden.
Drittens ist die Abschätzung der Ligationseffizienz wichtig. Wenn sich bei qualitativer Bewertung die Ligatur als ineffizient erweist (d. h. anstelle des hochmolekularen Bandes wird ein Abstrich ähnlich dem für die verdaute Probe beobachteten beobachtet), sollte die Ligatur wiederholt werden, indem die Kerne bei 200 × g zentrifugiert und in Ligationsmischung mit frischem 10-fach-Ligationspuffer und Ligase neu ausgerichtet werden. Viertens sollte der Prozentsatz der Hi-C-gültigen Produkte geschätzt werden, indem ein PCR-Amplicon einer erwarteten Wechselwirkung mit Cla I (für Mbo I originale Verdauung) verdaut wird. Die effiziente Verstärkung und Verdauung des Amplikons der erwarteten Wechselwirkung bestätigt eine erfolgreiche Ligatur und Bildung von Hi-C-Verbindungen. Wenn die Amplicon-Verdauung nicht effizient ist, wird die Mehrheit der Moleküle 3C anstelle von Hi-C-Produkten sein, und dies sollte berücksichtigt werden, wenn die Bibliothek sequenziert wird. Dies kann auch durch die Durchführung der abschließenden Cla I-Aufschlusskontrolle der Bibliothek bestätigt werden, wie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschrieben. Schließlich ist die Auswahl der geringeren Anzahl von PCR-Zyklen wichtig, um PCR-Duplikate zu vermeiden. Wenn bei der Sequenzierung festgestellt wird, dass der Prozentsatz der Lesepaarduplikate hoch ist, sollte die Anzahl der PCR-Zyklen weiter verringert werden.
Diese In-Nucleus Hi-C-Technik hat einige Einschränkungen. Erstens stellt das hier beschriebene Protokoll das Hi-C-Experiment dar, das für eine Zellpopulation durchgeführt wurde. Daher repräsentiert das Signal der Häufigkeit genomischer Kontakte Millionen von Genomen mit variablen individuellen Konformationen. Um den Satz genomischer Kontakte aus einem einzigen Genom zu erhalten, wird ein einzelliges Hi-C-Experiment22 empfohlen. Zweitens basiert Hi-C auf der Ligatur proximaler DNA-Fragmente. Wenn also genomische Regionen Teil eines großen Protein-Chromatin-Komplexes sind, könnte der Abstand zwischen den Fragmenten die Ligatur behindern. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Transkontakte in Hi-C38schlecht dargestellt sind. Darüber hinaus endet Hi-C mit Paired-End-Sequenzierung, wodurch Paare genomischer Kontakte abgerufen werden. Im selben Chromatinkomplex können jedoch mehrere DNA-Fragmente gleichzeitig interagieren. Um die Identität mehrerer DNA-Fragmente in einem Chromatinkomplex zu erhalten, können alternative Sequenzierungsmethoden auf Hi-C39 angewendet werden, oder es können verschiedene experimentelle Strategien eingesetzt werden, bei denen keine Ligatur durchgeführt wird38,40,41. Schließlich, obwohl Hi-C genomische Kontakte misst, enthüllt es nicht die Identität der Proteine, die die Interaktionen vermitteln. Es müssen alternative Methoden angewendet werden, um die genomischen Interaktionen zu identifizieren, die durch ein bestimmtes Protein von Interesse vermittelt werden42 oder die Identität des Proteinssembles an bestimmten genomischen Elementen43.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit einem hochwertigen Hi-C-Experiment, wie es hier für das Drosophila-Genom beschrieben wird (Tabelle 2), Matrizen mit einer Vielzahl von Auflösungen (von 1, 5 kb, 50 kb oder niedriger; siehe Abbildung 4) aufgebaut werden können. Wenn eine bestimmte Region des Genoms auf der Ebene des Restriktionsfragments ausgewertet werden muss, können die Daten verwendet werden, um eine virtuelle 4C-Landschaft des gewünschten Standpunkts zu erstellen (z. B. das Notch-Gen 5' UTR in Abbildung 4E). Das Hi-C-Other-Ends-Tool in SeqMonk ist eine sehr benutzerfreundliche Option, die die Visualisierung dieser Landschaft ermöglicht. Die Anwendung des 4C-Quantifizierungstools, das ebenfalls Teil von SeqMonk ist, auf diese Landschaft kann statistisch signifikante Kontakte ergeben.
Die Anwendung des hier beschriebenen Hi-C-Experiments im Zellkern auf eine Sammlung mutierter Zelllinien mit veränderten AP-DNA-Bindungsstellen an den TAD-Grenzen (Abbildung 4) zeigte, dass genetische Elemente an den Grenzen benötigt werden, um das Drosophila-Genom in Domänen zu strukturieren und die Genexpressionsregulation aufrechtzuerhalten, wie von Arzate-Mejía et al.25ausführlich diskutiert. So kann die genetische Editierung regulatorischer Elemente mit dem CRISPR/Cas9-System, kombiniert mit der hochauflösenden Profilierung genomischer Interaktionen unter Verwendung des hier beschriebenen In-Nucleus-Hi-C-Protokolls, eine leistungsfähige Strategie sein, um die strukturelle Funktion genetischer Elemente zu testen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die ZUSCHUSSNUMMER IN207319 des UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) und die Fördernummer 303068 des Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) unterstützt. == ist ein Masterstudent, der vom Science and Technology National Council (CONACyT) CVU Nummer 968128 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
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