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Genetics

ड्रोसोफिला कोशिकाओं में इन-न्यूक्लियस हाय-सी

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/62106
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

जीनोम को परमाणु अंतरिक्ष में विभिन्न संरचनाओं में व्यवस्थित किया जाता है जिसे गुणसूत्र संरचना कैप्चर प्रौद्योगिकियों के माध्यम से प्रकट किया जा सकता है। इन-न्यूक्लियस हाई-सी विधि ड्रोसोफिला सेल लाइनों में क्रोमेटिन इंटरैक्शन का जीनोम-वाइड संग्रह प्रदान करती है, जो संपर्क मानचित्र उत्पन्न करती है जिसे प्रतिबंध खंड स्तर पर मेगाबेस रिज़ॉल्यूशन पर खोजा जा सकता है।

Abstract

जीनोम को डोमेन के बीच बातचीत को अलग करने वाली सीमाओं द्वारा सीमित डोमेन (TADs) को टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध करने में आयोजित किया जाता है। ड्रोसोफिला में, टीएडी गठन और सीमाओं में अंतर्निहित तंत्र अभी भी जांच के घेरे में हैं । यहां वर्णित इन-न्यूक्लियस हाई-सी विधि के आवेदन ने पायदान जीन को अलग करने वाली टीएडी सीमाओं पर वास्तुशिल्प प्रोटीन (एपी) के बाध्यकारी स्थलों के कार्य को विच्छेदन करने में मदद की । डोमेन सीमाओं का आनुवंशिक संशोधन जो एपीएस के नुकसान का कारण बनता है, टीएडी संलयन, प्रतिलेखन दोषों और लंबी दूरी के स्थलाकृतिक परिवर्तनों में परिणाम देता है। इन परिणामों ने ड्रोसोफिला में डोमेन सीमा निर्माण और जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण में आनुवंशिक तत्वों के योगदान का प्रदर्शन करने वाले साक्ष्य प्रदान किए । यहां इन-न्यूक्लियस हाई-सी विधि का विस्तार से वर्णन किया गया है, जो प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण चौकियां प्रदान करता है । यह भी दिखाया अनुक्रमण पढ़ता है और वैध हाय-सी जोड़े की आवश्यक संख्या के लिए विभिंन जीनोमिक तराजू पर जीनोमिक बातचीत का विश्लेषण कर रहे हैं । CRISPR/Cas9-मध्यस्थता आनुवंशिक तत्वों के आनुवंशिक संपादन और इस में नाभिक हाय-सी प्रोटोकॉल का उपयोग कर जीनोमिक बातचीत के उच्च संकल्प प्रोफाइलिंग आनुवंशिक तत्वों के संरचनात्मक समारोह की जांच के लिए एक शक्तिशाली संयोजन हो सकता है ।

Introduction

यूकेरियोट्स में, जीनोम को गुणसूत्रों में विभाजित किया जाता है जो इंटरफेज1के दौरान परमाणु अंतरिक्ष में विशिष्ट क्षेत्रों पर कब्जा करते हैं। गुणसूत्रों का गठन करने वाले गुणसूत्रों को दो मुख्य राज्यों में विभाजित किया जा सकता है: सुलभ गुणकों में से एक जो प्रतिलेखन रूप से स्वतंत्र है, और कॉम्पैक्ट क्रोमेटिन का दूसरा जो ट्रांसक्रिप्शनल दमनकारी है। ये क्रोमेटिन राज्य परमाणु अंतरिक्ष में अलग और शायद ही कभी मिश्रण करते हैं, जो नाभिक2में दो अलग-अलग डिब्बे बनाते हैं। उप-मेगाबेस पैमाने पर, सीमाएं उच्च आवृत्ति क्रोमेटिन इंटरैक्शन के डोमेन को अलग करती हैं, जिन्हें TADs कहा जाता है, जो क्रोमोसोमल संगठन3,4,5को चिह्नित करते हैं। स्तनधारियों में, टीएडी सीमाओं पर कोहेसिन और सीसीटीसी-बाध्यकारीकारक (सीटीसीएफ)6,7,8 द्वारा कब्जा कर लियाजाताहै। कोहेसिन परिसर क्रोमेटिन को बाहर निकालता है और सीटीसीएफ-बाध्यकारी स्थलों पर रुकता है जिन्हें जीनोमिक अनुक्रम में एक अभिसरण अभिविन्यास में निपटाया जाता है ताकि स्थिर क्रोमेटिन लूप9,10,13,14बनसके। सीमाओं पर सीटीसीएफ डीएनए-बाइंडिंग साइट के आनुवंशिक व्यवधान या सीटीसीएफ और कोहेसिन प्रोटीन प्रचुरता में कमी के परिणामस्वरूप नियामक तत्वों के बीच असामान्य बातचीत, टीएडी गठन की हानि, और जीन अभिव्यक्ति विनियमन9,10, 11,13,14।

ड्रोसोफिला में, TADs के बीच सीमाओं सीमा तत्व से जुड़े कारक ३२ केडीए (BEAF-३२), आकृति 1 बाध्यकारी प्रोटीन (M1BP), सेंट्रोसोमल प्रोटीन १९० (CP190), बालों के दमन विंग (SuHW), और CTCF सहित कई एपीएस द्वारा कब्जा कर रहे हैं, और सक्रिय हिस्टोन संशोधनों और बहुलकों द्वितीय16,17,18में समृद्ध हैं । यह सुझाव दिया गया है कि ड्रोसोफिला में, TADsप्रतिलेखन13,17, 19के परिणामस्वरूप दिखाई देता है, और सीमागठनऔर इन्सुलेशन गुणों में स्वतंत्र एपीएस की सही भूमिका की अभी जांच की जा रही है। इस प्रकार, चाहे ड्रोसोफिला में डोमेन समान प्रतिलेखन राज्यों के क्षेत्रों के एकत्रीकरण का एकमात्र परिणाम है या क्या सीटीसीएफ सहित एपीएस, सीमा निर्माण में योगदान करते हैं, पूरी तरह से विशेषता बनी हुई है । उच्च संकल्प पर जीनोमिक संपर्कों की खोज अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ-साथ गुणसूत्र संरचना कैप्चर प्रौद्योगिकियों के विकास के माध्यम से संभव हुई है । हाय-सी प्रोटोकॉल को सबसे पहले क्रोमेटिन टुकड़ों के बीच नकली लिगेशन उत्पादों से बचने के प्रयास में "समाधान में"2 प्रदर्शन किए गए लिगेशन चरण के साथ वर्णित किया गया था। हालांकि, कई अध्ययनों ने इस अहसास की ओर इशारा किया कि आंकड़ों में उपयोगी संकेत आंशिक रूप से lysed नाभिक पर बने लिगेशन उत्पादों से आया है जो समाधान20,21में नहीं थे ।

इसके बाद प्रोटोकॉल को एकल-कोशिका हाय-सी प्रयोग22के हिस्से के रूप में नाभिक के अंदर लिगेशन करने के लिए संशोधित किया गया था । इन-न्यूक्लियस हाई-सी प्रोटोकॉल को बाद में कोशिका जनसंख्या हाई-सी में शामिल किया गया ताकि जीनोमिक दूरी की पूरी श्रृंखला पर अधिक सुसंगत कवरेज प्राप्त किया जा सके और कम तकनीकी शोर23,24के साथ डेटा का उत्पादन कियाजासके। प्रोटोकॉल, यहां विस्तार से वर्णित है, जनसंख्या में नाभिक हाय-सी प्रोटोकॉल23, 24पर आधारित है और ड्रोसोफिला25 में पायदान जीन लोकस में एकडोमेन सीमा से सीटीसीएफ और M1BP के लिए डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों को आनुवंशिक रूप से हटाने के परिणामों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणाम बताते है कि सीमा पर एपीएस के लिए डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों में फेरबदल पायदान डोमेन गठन के लिए कठोर परिणाम है, पायदान लोकस आसपास के क्षेत्रों में बड़ा स्थलाकृतिक दोष, और जीन अभिव्यक्ति विनियमन । यह इंगित करता है कि डोमेन सीमाओं पर आनुवंशिक तत्व ड्रोसोफिला25में जीनोम टोपोलॉजी और जीन अभिव्यक्ति के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

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Protocol

1. निर्धारण

  1. 10 मिलियन श्नाइडर की लाइन 2 प्लस (S2R +) कोशिकाओं के साथ शुरू करें श्नाइडर माध्यम में एक सेल निलंबन के 17.5 एमएल तैयार करने के लिए जिसमें कमरे के तापमान (आरटी) पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होता है।
  2. 2% की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मेथनॉल-मुक्त फॉर्मेल्डिहाइड जोड़ें। मिश्रण और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट, हर मिनट मिश्रण करने के लिए ध्यान रखते हुए ।
    नोट: फॉर्मलडिहाइड एक खतरनाक रसायन है। उचित स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों का पालन करें, और धूम हुड में काम करते हैं।
  3. 0.125 मीटर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने और मिश्रण करने के लिए ग्लाइसिन जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट, बर्फ पर 15 मिनट के बाद ।
  4. 400 × जी के लिए सेंट्रलाइज 5 मिनट के लिए आरटी में और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए; सुपरनेट को त्याग दें। गोली को ठंड 1x फॉस्फेट-बफर खारा के 25 एमएल में सावधानी से रिस्पेंड करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 × जी पर सेंट्रलाइज, फिर सुपरनेट को त्यागें।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल जारी रखते हैं, तो लाइसिस के लिए चरण 2.1 पर जाएं; अन्यथा, तरल एन2 में गोली को फ्लैश-फ्रीज करें और गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. लाइसिस

  1. बर्फ-कोल्ड लाइसिस बफर (10 एमएम ट्रिसिस-एचसीएल, पीएच 8; 0.2% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (सामग्री की तालिकादेखें); 10 एमएन एनएसीएल; 1x प्रोटीज अवरोधकों के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और वॉल्यूम को बर्फ-ठंडे लाइसिस बफर के साथ 10 मिलीएल तक समायोजित करें। 1 × 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मात्रा को समायोजित करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, ट्यूबों को उलटा करके हर 2 मिनट मिश्रण ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर नाभिक को अपकेंद्रित्र करें, और फिर ध्यान से सुपरनैंट को त्यागें। गोली को 1x ठंडे लाइसिस बफर के 1 मिलील के साथ धोएं, और इसे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। गोली 1x को ठंडे 1.25x प्रतिबंध बफर के 1 एमएल के साथ धोएं, और प्रत्येक सेल पेलेट को 1.25x प्रतिबंध बफर के 360 माइक्रोन में फिर से रखें।
  3. प्रति ट्यूब (0.3% अंतिम एकाग्रता) 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 11 माइक्रोन जोड़ें, पाइपिंग द्वारा ध्यान से मिलाएं, और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 700-950 आरपीएम पर मिलाते हुए। इनक्यूबेशन के दौरान कई बार झुरमुटों को बाधित करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट।
  4. गैर आयनिक सर्फेक्टेंट के 75 माइक्रोन जोड़कर एसडीएस को बुझाएं (10% समाधान, सामग्री की तालिकादेखें) प्रति ट्यूब (1.6% अंतिम एकाग्रता), और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 950 आरपीएम पर मिलाते हुए। इनक्यूबेशन के दौरान झुरमुटों को बाधित करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    नोट: यदि झुरमुट बड़े हैं और बाधित करना मुश्किल है, तो एसडीएस और सर्फेक्टेंट उपचार के दौरान घूर्णन गति को 400 आरपीएम तक कम करें। यदि झुरमुटों को पिपटिंग द्वारा अलग करना मुश्किल है, तो नमूना को दो में विभाजित करें; प्रतिबंध बफर, एसडीएस और सर्फेक्टेंट की मात्रा को समायोजित करें; और पारियना के साथ आगे बढ़ें। इसके बाद, नाभिक को न्यूनतम गति (200 × जी)पर स्पिन करें, सावधानी से सुपरनैंट को त्यागें, 1X प्रतिबंध बफर में नमूनों को एक साथ पूल करें, और पाचन के साथ आगे बढ़ें। अपाच्य नमूना (यूडी) के रूप में एक 10 μL aliquot ले लो।

3. एंजाइमेटिक पाचन

  1. 200 यूनिट्स (यू) प्रति ट्यूब जोड़कर क्रोमेटिन को पचाएं, और घूर्णन (950 आरपीएम) करते समय 4 घंटे से लेकर रात भर की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन, प्रति ट्यूब एमबीओआई का अतिरिक्त 50 यू जोड़ें, और घूर्णन (950 आरपीएम) करते समय 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेटिंग करके एंजाइम को निष्क्रिय करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    नोट: पचा नमूना (डी) के रूप में एक 10 μL aliquot ले लो ।

4. डीएनए का बायोटिनाइलेशन समाप्त होता है

  1. प्रतिबंध के टुकड़े को भरने और बायोटिन के साथ डीएनए समाप्त होता है लेबल करने के लिए, 10 m dCTP, dGTP, dTTP, 0.4 m m biotin dATP के 20 माइक्रोन, के 1.5 μL जोड़ें, ट्रिस कम-EDTA (TLE) बफर [10 mM Tris-HCl, 0.1 m EDTA, पीएच 8.0] के 17.5 μL, और सभी ट्यूबों के लिए Klenow के 5 यू/μL के 10 μL (डीएनए बहुलक मैं बड़ा टुकड़ा) सभी ट्यूबों के लिए । 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए ध्यान से और इनक्यूबेट मिलाएं। 30 एस के लिए हर 10 एस 700 आरपीएम पर हिलाएं। लिगेशन मिक्स तैयार करते समय सभी ट्यूबों को बर्फ पर रखें।

5. लिगेशन

  1. प्रत्येक पचा क्रोमेटिन मिश्रण को लिगेशन मिश्रण के साथ एक अलग 1 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें (10x लिगेशन बफर के 100 माइक्रोन, 10 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 10 माइक्रोन, T4 DNA ligase के 15 यू, और डबल-आसुत पानी के 425 μL [ddH2O])। कोमल पिपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. क्रॉसलिंक उलट और डीएनए शुद्धि

  1. प्रति ट्यूब 10 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन के 50 माइक्रोन डालकर प्रोटीन को नीचा दिखाना और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना। तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाकर और रात भर इनक्यूबेट करके रिवर्स क्रॉसलिंक।
  2. 10 मिलीग्राम/एमएल आरएनएएस ए के 20 माइक्रोन जोड़कर आरएनए को नीचा दिखाना, और 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना ।
  3. फिनॉल: इथेनॉल वर्षा के बाद क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण करें।
    1. फिनॉल-क्लोरोफॉर्म की 1 मात्रा जोड़ें, और एक सजातीय सफेद चरण प्राप्त करने के लिए उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: फिनॉल एक खतरनाक रसायन है। उचित स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों का पालन करें । धूम हुड में काम करते हैं।
    2. 15 मिनट के लिए 15,000 × जी पर सेंट्रलाइज। जलीय चरण को एक ताजा 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। टीएएल बफर के 100 माइक्रोन के साथ निचली परत का बैक-एक्सट्रैक्ट करें, और जलीय चरण को उसी 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. 100% एथिल अल्कोहल (एटोह) की 2 मात्रा, 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 वॉल्यूम और 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन के 2 वॉल्यूम जोड़कर डीएनए को कम करें। 2 घंटे से लेकर रात तक की अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 × जी पर स्पिन करें, और बर्फ-ठंड 70% एटोह के साथ छर्रों 2x धोएं। आरटी में छर्रों को सुखाएं, और टीएएल बफर के 100 माइक्रोन में पुनर्व्यवस्रित करें। एक फ्लोरोजेनिक डाई का उपयोग करके डीएनए को मात्रा दें जो निर्माता के निर्देशों(सामग्रियों की तालिका)के अनुसार डीएनए और फ्लोरोमीटर के लिए चुनिंदा रूप से बांधता है।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । लंबी अवधि के लिए शॉर्ट टर्म के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर लिगेशन उत्पादों को स्टोर करें। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए लिगाटेड नमूना (एल) के रूप में सामग्री के एक एलिकोट (100 एनजी) का उपयोग करें।

7. हाई-सी टेम्पलेट गुणवत्ता का आकलन करें

  1. पाचन और लिगेशन गुणात्मक नियंत्रण
    1. क्रॉसलिंक को पीछे करके यूडी और डी एलिकोट्स से डीएनए को शुद्ध करें, और ऊपर वर्णित फिनोल: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा करें।
    2. 1.5% एगर उठे जेल में यूडी, डी और एल नमूनों के 100 एनजी लोड करें। एल नमूना के लिए एक उच्च आणविक वजन बैंड बनाम डी नमूना में 500 बीपी के आसपास केंद्रित एक धब्बा के लिए देखो (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  2. पाचन दक्षता मात्रात्मक नियंत्रण
    नोट: पाचन दक्षता का अधिक सटीक आकलन करने के लिए, इस प्रकार डिजाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रियाओं (क्यूपीसीआर) का उपयोग करने के लिए टेम्पलेट्स के रूप में यूडी और डी नमूनों का उपयोग करें।
    1. एक प्राइमर जोड़ी डिजाइन करें जो पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइम (वर्तमान प्रोटोकॉल में एमबीओ आई) के लिए डीएनए प्रतिबंध साइट युक्त डीएनए खंड को बढ़ाती है, जिसे चरण 7.2.3 में सूत्र में आर कहा जाता है।
    2. एक प्राइमर जोड़ी डिजाइन करें जो एक नियंत्रण डीएनए टुकड़ा को बढ़ाता है जिसमें पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइम (वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए एमबीओ आई) के लिए प्रतिबंध साइट शामिल नहीं है, जिसे चरण 7.2.3 में सूत्र में सी कहा जाता है।
    3. नीचे दिखाए गए सूत्र के अनुसार प्रतिबंध दक्षता की गणना करने के लिए प्रवर्धन के चक्र सीमा मानों (सीटी मान) का उपयोग करें:
      % प्रतिबंध = 100 - 100/2{(सीटीआर - सीटीसी) डी - (सीटीआर - सीटीसी) यूडी}
      जहां सीटीआर टुकड़ा आर के सीटी मूल्य को संदर्भित करता है, और सीटीसी नमूना डी और नमूना यूडी के लिए टुकड़ा सी के सीटी मूल्य को संदर्भित करता है ।
      नोट: प्रतिबंध प्रतिशत प्रतिबंध एंजाइम की दक्षता को दर्शाता है प्रतिबंध (आर) डीएनए टुकड़ा एक नियंत्रण (सी) डीएनए टुकड़ा है कि प्रतिबंध डीएनए साइट शामिल नहीं है की तुलना में प्रतिबंध (आर) डीएनए टुकड़ा cleaving । 80% ≥ की प्रतिबंध दक्षता की सिफारिश की जाती है।
  3. ज्ञात बातचीत का पता लगाना
    1. कम दूरी और/या मध्यम या लंबी दूरी की बातचीत की जांच करने के लिए एक आंतरिक बंधन नियंत्रण बढ़ाना करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन (प्रतिनिधि परिणाम देखें) ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक लिगेशन उत्पाद को बढ़ाने के लिए प्राइमर डिजाइन करें जिसमें प्राइमर आसन्न प्रतिबंध टुकड़ों में आगे-आगे या रिवर्स-रिवर्स ओरिएंटेशन में हैं।
  4. फिल-इन और बायोटिन-लेबलिंग नियंत्रण
    1. ऊपर वर्णित जीनोम में आसन्न प्रतिबंध के टुकड़ों के बीच एक ज्ञात बातचीत या एक लिगेशन उत्पाद के प्रवर्धन और पाचन द्वारा हाय-सी अंकन और लिगेशन दक्षता को सत्यापित करें।
      नोट: एमओआई साइट (जीएटीसी) का सफल फिल-इन और लिगेशन लिगेशन जंक्शन पर प्रतिबंध एंजाइम क्लै I (एटीसीएटी) के लिए एक नई साइट उत्पन्न करता है और एमबीओ आई साइट को पुनर्जीवित करता है।
    2. Mbo I, सीएलए मैं, या दोनों के साथ पीसीआर उत्पाद को पचाें। 1.5-2% जेल पर नमूनों को चलाने के बाद, कट और अनकट बैंड26की तीव्रता को निर्धारित करके 3 सी और हाई-सी लिगेशन जंक्शनों की सापेक्ष संख्या का अनुमान लगाएं।
      नोट: > 70% की दक्षता वांछित है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।

8. सोनिकेशन

  1. 200-500 बीपी डीएनए के टुकड़े प्राप्त करने के लिए नमूनों को सोनिकेट करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले साधन के लिए (सामग्री की तालिकादेखें), नमूने को पतला करें (5 से 10 माइक्रोन) डीडीएच2ओ प्रति ट्यूब के 130 माइक्रोन में, और उपकरण को 400 बीपी तक सोनीकेट करने के लिए सेट करें: स्तर भरें: 10; शुल्क कारक: 10%; पीक घटना शक्ति (डब्ल्यू): 140; प्रति फट चक्र: 200; समय (एस): 80.

9. बायोटिन हटाने/अंत मरम्मत

नोट: नीचे दिखाए गए चरणों को हाई-सी डीएनए के 5 माइक्रोग्राम के लिए समायोजित किया जाता है।

  1. बायोटिन हटाने के लिए, नमूना (130 माइक्रोएल) को एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10x लिगेशन बफर के 16 माइक्रोन, 10 mm dATP के 2 माइक्रोन, T4 डीएनए पॉलीमरेज (15U) के 5 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ (कुल मात्रा के 160 माइक्रोन) के 7 माइक्रोन जोड़ें। 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. 10 m dNTPs के 5 माइक्रोन, 10x ligation बफर के 4 माइक्रोन, T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज (10 यू/माइक्रोन) के 5 माइक्रोन, Klenow के 1 μL, और ddH 2 O (कुल मात्रा के २०० μL) के25माइक्रोन जोड़ें । 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

10. आकार चयन

  1. ज्यादातर 250-550 बीपी आकार रेंज में टुकड़ों का चयन करने के लिए, अनुक्रमिक ठोस चरण रिवर्सिबल इम्मोबिलाइजेशन (एसपीआरआई) आकार चयन पहले 0.6x के साथ प्रदर्शन करते हैं, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0.90x के बाद, और TLE के 100 μL का उपयोग करके डीएनए को स्पष्ट करें।

11. बायोटिन पुलडाउन/ए-टेलिंग/एडाप्टर लिगेशन

नोट: भंवर द्वारा चुंबकीय मोतियों को फिर से खर्च करके धोता का प्रदर्शन करें, नमूनों को घूर्णन पहिया पर 3 मिनट के लिए घुमाएं, और फिर संक्षेप में नमूने को नीचे स्पिन करें और इसे चुंबकीय स्टैंड पर रखें। मोतियों को चुंबक से चिपके रहने दें, सुपरनेट को त्यागें, और निम्नलिखित धोने के कदम के साथ आगे बढ़ें। घूर्णन पहिया के बजाय रोटेशन के साथ एक थर्मो-ब्लॉक पर 55 डिग्री सेल्सियस पर वॉश करें।

  1. पुल-डाउन के लिए टीएएल के साथ प्रति नमूना 300 माइक्रोन तक अंतिम मात्रा बनाएं। मनका धोने बफ़र्स तैयार करें: 1x ट्वीन बफर (टीबी) (टीबी: 5 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 0.5 m EDTA, 1 M NaCl, 0.05% ट्वीन), 0.5x टीबी, 1x नहीं ट्वीन बफर (एनटीबी) (5 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 0.5 एमएम ईडीटीए, 1 एम एनएसीएल), 2x एनटीबी।
  2. स्ट्रेप्टाविडिन से जुड़े चुंबकीय मोतियों के 150 माइक्रोन का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति पुस्तकालय। मोतियों को 2x 1x टीबी के 400 माइक्रोन से धोएं। फिर 300 μL 2x NTB में मोती रीसस्लपेंड करें।
  3. मोतियों को 300 माइक्रोन हाय-सी सामग्री के साथ मिलाएं और एक घूर्णन पहिया पर 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें ताकि बायोटिन को स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के लिए बाध्यकारी किया जा सके।
  4. मोतियों को 0.5x टीबी के 400 माइक्रोन से धोएं, और 750 आरपीएम पर घुमाते हुए 3 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 1x प्रतिबंध बफर के 200 माइक्रोन में मोतियों को धोएं।
  5. डैटपी टेलिंग मिक्स के 100 माइक्रोन में मोतियों को फिर से ढंकें (10 एमएम डैटपी के 5 माइक्रोन, 10x प्रतिबंध बफर के 10 माइक्रोन, Klenow exo-के 5 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ के 80 माइक्रोन)। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. सुपरनेट निकालें, मोतियों को 2x को 0.5x टीबी के 400 माइक्रोन के साथ 3 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके धोएं और 750 आरपीएम पर घुमाएं।
  7. मोतियों को 1x एनटीबी के 400 माइक्रोन के साथ धोएं और फिर 1x लिगेशन बफर के 100 माइक्रोन के साथ धोएं।
  8. 1x लिगेशन बफर के 50 माइक्रोन में मोतियों को फिर से खर्च करें, और निलंबन को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। पूर्व-एनील्ड पीई एडाप्टर (15 माइक्रोन स्टॉक) और T4 ligase (400 यू/μL, यानी, 800 यू/ट्यूब) के 2 माइक्रोन जोड़ें; 2 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
    नोट: पीई 1.0 और पीई 2.0 एडाप्टर (30 माइक्रोन स्टॉक) दोनों की समान मात्रा जोड़कर एडाप्टर को प्री-एनील करें और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  9. सुपरनेट को हटाकर मोतियों को फिर से प्राप्त करें और 400 माइक्रोन टीबी के साथ मोतियों को 2x धोएं। 1x एनटीबी के 200 माइक्रोन के साथ मोतियों को धोएं, फिर 1x प्रतिबंध बफर के 100 माइक्रोन के साथ, और 1x प्रतिबंध बफर के 40 माइक्रोन में मोतियों को फिर से खर्च करें।

12. पीसीआर प्रवर्धन

  1. 5, 6, 7, और 8 चक्रों के साथ 25 μL मात्रा के पीसीआर सेट करें। प्रत्येक पीसीआर के लिए, उपयोग करें:
    रिएक्शन रेसिपी
    हाय-सी मोती 2.5 माइक्रोन
    10 μM पीई पीसीआर प्राइमर 1 (सामग्री की तालिका) 0.75 माइक्रोल
    10 माइक्रोन पीई पीसीआर प्राइमर 2 (सामग्री की तालिका) 0.75 माइक्रोल
    10 एमएमएम डीएनटीपी 0.6 माइक्रोन
    5x रिएक्शन बफर 5 माइक्रोन
    डीएनए पॉलीमरेज 0.3 माइक्रोन
    डीडीएच2ओ 14.65 माइक्रोल
    कुल 25 माइक्रोन
    चक्र तापमान समय
    1 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस
    द चक्र 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस
    65 डिग्री सेल्सियस 30 एस
    72 डिग्री सेल्सियस 30 एस
    1 72 डिग्री सेल्सियस 7 मिनट

13. अंतिम पीसीआर प्रवर्धन

  1. ऊपर वर्णित और चयनित चक्रों की संख्या के अनुसार उन्हीं शर्तों का उपयोग करके अंतिम पीसीआर प्रवर्धन करें। 50 माइक्रोन प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट के रूप में हाई-सी मोतियों के 5 माइक्रोन का उपयोग करके नमूना विभाजित करें।
  2. सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें और उन्हें एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को हटाने और सुपरनेट (पीसीआर उत्पादों) को ठीक करने के लिए चुंबक का उपयोग करें। मोतियों को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, मोतियों को धोएं जैसा कि चरण 11.2.9 में इंगित किया गया है, और बैकअप के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x प्रतिबंध बफर में स्टोर करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्प्री मोतियों की मात्रा 0.85x का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें। एलईएल बफर के 30 माइक्रोल के साथ एल्यूट।
  4. फ्लोरोमेट्रिक उपकरण का उपयोग करके हाई-सी लाइब्रेरी की मात्रा निर्धारित करें, और चिप-आधारित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पुस्तकालय की गुणवत्ता की पुष्टि करें।
  5. अंतिम गुणवत्ता चौकी के रूप में, चरण 12.1 में वर्णित समान शर्तों का उपयोग करके 10 चक्रों का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में हाई-सी लाइब्रेरी के 1 माइक्रोन का उपयोग करें। पीसीआर उत्पाद को दो माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें: एक को सीएलए I के साथ पचाएं और दूसरे को नियंत्रण के रूप में अपाच्य छोड़ दें। उत्पादों को 1.5-2% एगर उठे जेल में चलाएं (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  6. एक उपयुक्त अनुक्रमण मंच पर 50 बीपी या 75 बीपी पेय्ड-एंड अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ें।

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Representative Results

नीचे वर्णित एक सफल हाई-सी प्रोटोकॉल के परिणाम हैं (चित्रा 1 एमें हाई-सी प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का सारांश देखें)। इन-न्यूक्लियस हाई-सी प्रयोग के दौरान कई गुणवत्ता नियंत्रण चौकियां हैं। नमूना aliquots से पहले एकत्र किए गए (यूडी) और बाद (डी) क्रोमेटिन प्रतिबंध कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ligation (एल) के बाद । क्रॉसलिंक को उलट दिया गया, और डीएनए को शुद्ध किया गया और एक एगर उठे जेल पर चलाया गया। 200-1000 बीपी का एक धब्बा देखा गया था जब Mbo मैं सफल रहा था(चित्रा 1B)के साथ प्रतिबंध । अणु का अपेक्षित आकार पसंद के प्रतिबंध एंजाइम पर निर्भर करता है। यदि लिगेशन सफल रहा, तो जेल(चित्रा 1 बी)के शीर्ष पर एक उच्च आणविक वजन बैंड देखा गया था। प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित क्यूपीसीआर द्वारा पाचन दक्षता की पुष्टि भी की जा सकती है। एक स्वीकार्य पाचन दक्षता 80% या उससे अधिक है(चित्रा 1C)।

हाय-सी लिगेशन दक्षता का विस्तार से आकलन करने के लिए, प्राइमर को एक आंतरिक लिगेशन उत्पाद नियंत्रण को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है जिसमें प्राइमर आसन्न प्रतिबंध टुकड़ों में आगे-आगे या रिवर्स-रिवर्स ओरिएंटेशन में हैं। वैकल्पिक रूप से, प्राइमर ज्ञात बातचीत को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। चित्रा 2A ड्रोसोफिला25में एक ज्ञात मध्यम श्रेणी (300 केबी) इंटरैक्शन के प्रवर्धन को दर्शाता है। हाई-सी लिगेशन उत्पाद (जिसमें बायोटिन मार्किंग, फिल-इन और लिगेशन सफलतापूर्वक हुआ) का अनुमान प्रवर्धन में बरामद पीसीआर उत्पाद के पाचन द्वारा लगाया जा सकता है। भरने में और बंधन के बाद, हाय-सी एम्प्लिकोन्स में मूल एमबीओ आई साइट पर एक नया सी 1 प्रतिबंध साइट शामिल होगी, जो कुंद-अंत बंधन पर संरक्षित है। यदि क्लै के साथ प्रतिबंध मैं पूरा नहीं हुआ है, तो भरने की प्रतिक्रिया और बायोटिन अंकन अक्षम होगा। अनुक्रमण के बाद पुस्तकालयों के लिए गैर-उपयोगी पुस्तकों का एक बड़ा हिस्सा होने से बचने के लिए 70% से अधिक की पाचन दक्षता की सिफारिश की जाती है(चित्रा 2 ए,3 सी बनाम हाई-सी टेम्पलेट के क्लै I पाचन की तुलना करें)।

अंतिम हाई-सी लाइब्रेरी को बढ़ाने के लिए पर्याप्त संख्या में पीसीआर प्रवर्धन चक्र निर्धारित करने के लिए, प्रोटोकॉल में वर्णित मोतियों पर दिए गए पुस्तकालय के 2.5 माइक्रोन का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं की स्थापना की गई थी। अंतिम प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्रों की संख्या चक्रों की संख्या से एक चक्र कम है जिसके लिए धब्बा दिखाई देता है(चित्रा 2B)। इस मामले में, पीसीआर प्रवर्धन के 4 चक्रों को चुना गया था। एक अंतिम गुणवत्ता चौकी के रूप में, हाय-सी पुस्तकालय का एक aliquot फिर से परिलक्षित और क्लै मैं के साथ पचा रहा था । पुस्तकालय के पाचन का स्तर (धब्बा आकार में कमी) वैध हाय-सी जोड़े की बहुतायत को इंगित करता है और उपयोगी पुस्तकों के अनुपात को दर्शाता है जो पुस्तकालय(चित्रा 2 सी)से प्राप्त किया जाएगा। ऊपरी आकार सीमा का अनुपात (यूडी नमूने में मौजूद आकार द्वारा निर्धारित) और यूडी और डी दोनों नमूनों में निचले आकार की सीमा को यूडी के लिए 1 > अनुपात और पचाने वाले नमूने के लिए 1 ≤ अनुपात का उत्पादन करना चाहिए यदि सीएलए मैं पाचन कुशल है।

युग्मित-अंत अनुक्रमण के बाद, फास्टक्यू फाइलों(तालिका 1)को HiCPro28 का उपयोग करके संसाधित किया गया था और मल्टीक्यूसी28का उपयोग करके उत्पन्न आंकड़ों को प्लॉट किया गया था। HiCPro के लिए एक वैकल्पिक उपकरण HiCUP30 पाइपलाइन है जो समान परिणाम देता है (नहीं दिखाया गया है)। चित्रा 3 और तालिका 2 अनुक्रम की विस्तृत सांख्यिकीय जानकारी पढ़ता है दिखाओ । ट्रिमिंग के बाद पूर्ण पठन संरेखण और संरेखण की सूचना दी जाती है। ये दो श्रेणियां सफलतापूर्वक गठबंधन की गई रीड्स के अनुरूप हैं जिनका उपयोग बाद के विश्लेषण में वैध हाय-सी जोड़े खोजने के लिए किया जाएगा। संरेखण के बाद ट्रिमिंग श्रेणी लिगेशन जंक्शन में फैले हुए रीड को संदर्भित करती है, जो पहले चरण में गठबंधन नहीं थे और फिर जीनोम 28(चित्र 3बी,सी और टेबल2) के लिए अपने 5 ' चरम को फिर से संगठित करने के लिए लिगेशन साइट पर छंटनी की जाती है। संपर्क आंकड़े बताते हैं कि हाई-सी लाइब्रेरी 82.2% वैध जोड़े और 7.6% गैर-उपयोगी के साथ उच्च गुणवत्ता की थी, जो एक ही-टुकड़ा स्वयं-सर्कल में गिरने, समान-टुकड़ा झूलने-समाप्त होता है, पुनः बंधन, फ़िल्टर जोड़े, और फेंक दिया जोड़े श्रेणियां(चित्रा 3 ए, चित्रा 3डी, और तालिका 2)। इसके अलावा, पीसीआर डुप्लिकेट की संख्या बहुत कम है, जो यह दर्शाती है कि पुस्तकालय की जटिलता अधिक है, और पीसीआर चक्रों ने न्यूनतम कलाकृतियों(चित्र 3E और तालिका 2)को पेश किया।

अद्वितीय वैध हाय-सी जोड़े का उपयोग करके, जोड़ी वितरण का बुनियादी विश्लेषण HiCPro27का उपयोग करके किया गया था। इस प्रयोग में 20 केबीपी ≤ 46.5% यूनिक सीआईएस संपर्क, 20 केबीपी > 47.1% यूनिक सीआईएस संपर्क और 5.8% यूनिक ट्रांस कॉन्टैक्ट्स(चित्रा 3डी)मिले। सीआईएस से ट्रांस वैध जोड़े का वितरण एक ही गुणसूत्र के भीतर पता चला बातचीत के अधिकांश के साथ एक सफल हाय-सी प्रयोग के लिए अपेक्षित परिणामों से मेल खाती है । ट्रांस संपर्कों का एक उच्च अनुपात अक्षम निर्धारण को इंगित करता है। HiCPro27से हाई-सी वैध जोड़े का उपयोग करके, मैट्रिस को पुनरावर्तक सुधार और ईजेनवेक्टर अपघटन(आईसीई) 30द्वारा सामान्यीकृत किया गया था, और 1 केबी और 5 केबी संकल्प मैट्रिस को HiCPlotter30,31, 32का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। ड्रोसोफिला(चित्रा 4ए, चित्रा 4Cऔर चित्रा 4D)में नॉच जीन लोकस के लिए 1 केबी और 5 केबी रिज़ॉल्यूशन पर सामान्यीकृत संपर्क मैट्रिस प्रस्तुत किए जातेहैं। चित्रा 4Aमें, पायदान जीन लोकस एपीएस, डोमेन एल और II के साथ-साथ टिड्डी(चित्रा 4A और तालिका 1)के साथ हिस्टोन संशोधनों के साथ देखा जा सकता है। CRISPR-Cas9 हटाने के डिजाइन में सीटीसीएफ और एम 1बीपी(चित्रा 4B)का आदर्श शामिल था।

पायदान लोकस (5pN-delta343, तालिका1) की 5 सीमा पर सीटीसीएफ और एम 1बीपी डीएनए-बाइंडिंग साइटों दोनों वाले क्षेत्र को हटाने पर, क्रोमेटिन संपर्कों में नाटकीय परिवर्तन पायदान लोकस के अंदर बातचीत के नुकसान और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी4सी,डी)की तुलना में अपस्ट्रीम टीएडी के साथ संपर्कों के लाभ के साथ देखा जा सकता है। अंत में, चित्रा 4E पायदान जीन 5 ' यूटीआर से प्रतिबंध टुकड़ा स्तर पर WT और उत्परिवर्ती बातचीत प्रोफाइल का एक विस्तृत पैनोरमा दिखाता है, जो पायदान जीन लोकस के साथ किए गए संपर्कों के अनुपात में कमी और अपस्ट्रीम डोमेन के साथ संपर्कों में वृद्धि दिखाता है । पायदान जीन 5 ' यूटीआर के वर्चुअल 4सी विचारों को एचईसी-प्रो27का उपयोग करके प्राप्त किया गया था । एक वैकल्पिक उपकरण है Hi-C अन्य समाप्त होता है Quantification SeqMonk में उपलब्ध (SeqMonk (RRID: SCR_001913) http: www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/। चित्रा 4 में प्रस्तुत सभी परिणाम डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती S2R + ड्रोसोफिला कोशिकाओं में इन-न्यूक्लियस हाई-सी प्रोटोकॉल लागू करके प्राप्त किए गए थे, जैसा कि अर्जेट-मेजिया एट अल25द्वारा वर्णित है।

Figure 1
चित्रा 1:इन-न्यूक्लियस हाई-सी पाचन और लिगाशन नियंत्रण। (A)हाई-सी प्रोटोकॉल अवलोकन। कोशिकाएं फॉर्मलडिहाइड के साथ क्रॉस-लिंक होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्रोमेटिन सेगमेंट (डीएनए के टुकड़े: गुलाबी, बैंगनी) और प्रोटीन के बीच सहसंयोजक संबंध होते हैं। क्रोमेटिन को एक प्रतिबंध एंजाइम (कैंची द्वारा प्रतिनिधित्व) के साथ पचाया जाता है, इस उदाहरण में, एमबीओ आई। परिणामस्वरूप चिपचिपा सिरों को बायोटिनाइलेटेड डैटपी (गहरे नीले घेरे) सहित न्यूक्लियोटाइड से भरा जाता है। डीएनए शुद्ध किया जाता है, और बायोटिनेलेटेड जंक्शनों को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों (ग्रे सर्कल) का उपयोग करके समृद्ध किया जाता है। बातचीत के टुकड़ों को अगली पीढ़ी द्वारा पहचाना जाता है, युग्मित-अंत अनुक्रमण। (ख)दो जैविक प्रतिकृति (हाय-सी 1 और हाई-सी 2) के लिए हाय-सी पाचन और लिगेशन गुणवत्ता नियंत्रण। हाय-सी पुस्तकालयों को 1.5% एगर उठे जेल पर हल किया गया था। दोनों पचा, डी, पुस्तकालयों ६०० बीपी के आसपास एक धब्बा के रूप में चलाते हैं । लिगाटेड नमूने, एलआईजी, अपाच्य यूडी नमूनों के समान 10 केबी से बड़े एक तंग बैंड के रूप में चलते हैं। सिग्नल स्ट्रेंथ में अंतर जेल पर लोडेड डीएनए की असमान मात्रा के कारण होता है। (ग)प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप से चक्र सीमा मूल्यों का उपयोग करके(बी)(हाई-सी 1 और हाई-सी 2) के रूप में एक ही दो जैविक प्रतिकृति के लिए मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया द्वारा हाय-सी पाचन मात्रात्मक नियंत्रण । एक सफल पाचन में 80% प्रतिबंध ≥ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:इन-न्यूक्लियस हाई-सी फिल-इन और कुंद-अंत लिगेशन नियंत्रण। (A)फिल-इन और बायोटिन लेबलिंग असेसमेंट । गुणसूत्र एक्स में 300 केबी के अलावा स्थित टुकड़ों के बीच एक ज्ञात बातचीत का उपयोग एक नियंत्रण के रूप में किया गया था और काले तीरों के साथ इंगित प्राइमर का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था(बी),प्राइमर 1 (बाएं), प्राइमर 2 (दाएं), टेबल 1में योजना के शीर्ष देखें), 347 बीपी एम्प्लाइसन उत्पन्न करते हैं। हाई-सी लिगेशन उत्पादों को लिगेशन साइट के पाचन द्वारा 3 सी प्रयोग में उत्पादित लोगों से अलग किया जा सकता है। हाय-सी जंक्शनों को मूल एमबीओ आई साइट पर क्लै I द्वारा पचाया गया था, क्योंकि यह कुंद-अंत लिगेशन पर बना था। हाई-सी और 3 सी जंक्शनों को एमबीओ आई के साथ पचाया गया था क्योंकि प्रतिबंध साइट लिगेशन (जेल के बाएं) पर पुनर्जीवित होती है। इसके विपरीत, 3 सी जंक्शनों को सीई आई साइट पर सीली द्वारा पचाया नहीं गया था, लेकिन केवल एमबीओ आई द्वारा ही क्लै I का उपयोग करके हाई-सी और 3 सी उत्पादों के पाचन प्रोफ़ाइल की तुलना करें। एक 53 बीपी टुकड़ा हाय-सी उत्पाद को पचाने के द्वारा प्राप्त किया गया था (सीओ आई साइट पर गठित क्लै I साइट के प्रतिबंध और इस क्षेत्र में पहले से मौजूद एक सीएलए आई साइट के प्रतिबंध के कारण)। इस टुकड़े को 3 सी उत्पाद पाचन में नहीं देखा गया था क्योंकि केवल सी मैंने साइट उपलब्ध थी जो इस क्षेत्र में पहले से मौजूद थी। (ख)विभिन्न पीसीआर चक्रों का उपयोग करके हाई-सी लाइब्रेरी के पीसीआर प्रवर्धन के बाद, उत्पादों को 1.5% एगरेग्यारेड जेल पर चलाया गया था। 400-1000 बीपी का धब्बा लगने की उम्मीद थी और मनाया गया था। अंतिम प्रवर्धन पीसीआर के लिए उपयुक्त संख्या चक्र को उस संख्या से तुरंत कम के रूप में लिया जाना चाहिए जिस पर एक धब्बा सिर्फ दिखाई देता है। (ग)अंतिम पुस्तकालय सीएलए मैं पाचन। अंतिम पुस्तकालय का एक एलिकोट फिर से परिलक्षित और क्लै मैं के साथ पचा गया था । धब्बा के आकार में कमी की पुष्टि की है कि पुस्तकालय में अणुओं का एक बड़ा हिस्सा वैध हाय-सी जोड़े थे । प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत के रूप में, संयुक्त राष्ट्र और डी नमूनों के बीच अनुपात प्राप्त करने के लिए इस जेल का घनत्व विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:Hi-C पुस्तकालय के HiC-Pro आंकड़े। (A)वैध हाय-सी जोड़े का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और विभिन्न प्रकार के गैर-वैध जोड़े जो प्रयोग के दौरान उत्पादित किए जा सकते हैं और HiCPro27 (तालिका 2)द्वारा फ़िल्टर किए जा सकते हैं । इनमें समीपस्थ दृश्यों में पड़ने वाले पढ़ता है, झूलने समाप्त होता है, एक ही टुकड़ा, आत्म सर्कल, फिर से बंधन, और पीसीआर डुप्लिकेट । (ख)मानचित्रण आंकड़े । संरेखित करने में विफल रहे पढ़ता है (ग्रे), और दोनों पूरी तरह से गठबंधन पढ़ता है और ट्रिमिंग के बाद गठबंधन पढ़ता है क्रमशः नीले और हल्के नीले रंग में दिखाए जाते हैं । ये दोनों श्रेणियां उपयोगी पुस्तकों का प्रतिनिधित्व करती हैं जिन्हें बाद के विश्लेषणों में माना जाता है। (ग)बाँधना आंकड़े । मल्टी गठबंधन पढ़ता है (डार्क ऑरेंज) का प्रतिनिधित्व पढ़ता है कि जीनोम में कई क्षेत्रों में गठबंधन कर रहे हैं । विशिष्ट गठबंधन (गहरे नीले) पढ़ता है पढ़ा जोड़े कि जीनोम में एक बार गठबंधन कर रहे है प्रतिनिधित्व करते हैं, और सिंगलटन (प्रकाश नारंगी) जोड़े जिसमें सिर्फ एक जीनोमिक क्षेत्र दोनों पढ़ता में अनुक्रम था का प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ)आंकड़े छानने । वैध पढ़े गए जोड़े (नीला) सफल हाय-सी लिगेशन उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसा कि(ए)में वर्णित है। स्व-खंड आत्म-मंडल (हल्का गुलाबी) गैर-उपयोगी पढ़ता है क्योंकि वे उसी जीनोमिक टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं जो(ए)में दिखाया गया है। एक ही टुकड़ा झूलने समाप्त होता है (नारंगी) का प्रतिनिधित्व पढ़ता है जिसमें एक भी प्रतिबंध टुकड़ा अनुक्रम था । फ़िल्टर किए गए और फेंके गए जोड़े (भूरे) भी गैर-उपयोगी पढ़ते हैं जिनमें गलत आकार होता है या जिसके लिए लिगेशन उत्पाद को खंगाला नहीं जा सकता है। अंत में, पुनः बंधन पढ़ता है (लाल) का प्रतिनिधित्व पढ़ता है जिसमें दो आसन्न टुकड़े फिर से लिगाट थे, इस प्रकार गैर उपयोगी जानकारी का उत्पादन । (ई)जीनोम में वैध पढ़ा जोड़े संपर्क वितरण। अद्वितीय सीआईएस संपर्क (नीला) अद्वितीय ट्रांस संपर्कों (हरे रंग) की तुलना में अधिक बार होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:हाई-सी संपर्क मैट्रिस और डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती S2R + कोशिकाओं का वर्चुअल 4सी विश्लेषण। (क) नॉच जीन लोकस में केंद्रित 1-केबी संकल्प पर 50 केबी क्षेत्र का हाय-सी सामान्यीकृत हीटमैप। टिड्डी के लिए टीएडी सेपरेशन स्कोर32 दिखाया गया है, साथ ही पायदान लोकस को दो टोपोलॉजिकल डोमेन (डोमेन 1 और डोमेन 2) में विभाजित करने के साथ दिखाया गया है। एपीएस, आरएनए पोल द्वितीय के लिए छग-एसईक्यू डेटा, और S2/S2R + कोशिकाओं के लिए हिस्टोन के निशान34,35,36,37 हीटमैप(टेबल 1)के नीचे दिखाए गए हैं। पायदान डोमेन 1 सीमाओं की स्थिति हल्के हरे रंग में हाइलाइट की गई है। (B)बी 1 सीमा CRISPR उत्परिवर्ती का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । हरे आयत हटाए गए 343 बीपी क्षेत्र को इंगित करता है। कैंची CRISPR-मध्यस्थता जीनोम संपादन के लिए इस्तेमाल sgRNAs संकेत मिलता है । एपीएस के लिए आदर्श-बाध्यकारी साइटों को सीटीसीएफ और एम 1बीपी के लिए बक्से के रूप में दिखाया गया है। डीएनए-बाइंडिंग एपीएस(ए)के लिए पीक शिखर भी३५संकेत दिए गए हैं । (ग)डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए पायदान में केंद्रित 50 केबी क्षेत्र को कवर करने वाले 1 केबी संकल्प पर हाय-सी सामान्यीकृत हीटमैप। बाएं, डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच बातचीत आवृत्ति में लॉग2 मतभेदों के हाय-सी हीटमैप। (घ)डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए 5 केबी संकल्प पर पायदान में केंद्रित 250 केबी क्षेत्र को कवर करने वाले हाय-सी सामान्यीकृत हीटमैप। बाएं, डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच बातचीत आवृत्ति में लॉग2 मतभेदों के हाय-सी हीटमैप। (ई)डब्ल्यूटीई और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए वर्चुअल-4सी दृष्टिकोण के रूप में 5 'यूटीआर ऑफ नॉच का उपयोग करते हैं। अपस्ट्रीम किर्रेडॉमिन-2, नॉच डोमेन 1, नॉच डोमेन 2, और डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती कोशिकाओं दोनों के लिए डाउनस्ट्रीम डीएनसी डोमेन के भीतर दृष्टिकोण और क्षेत्रों के बीच बातचीत का प्रतिशत25दिखाया गया है। संक्षिप्त रूप: डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; बालक = स्थलाकृतिक रूप से जुड़े डोमेन; ChIP = क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन; एपी = वास्तु प्रोटीन; आरएनए पोल = आरएनए पॉलीमरेज; S2R + = S2 रिसेप्टर प्लस; एसजी आरएनए = एकल गाइड आरएनए; यूटीआर = अअनुवादित क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रयोग नमूना जियो परिग्रहण संख्या
टुकडा सीपी190 जीएसएम1015404
टुकडा सुहW जीएसएम1015406
टुकडा मॉड (mdg4) जीएसएम1015408
टुकडा सीटीसीएफ जीएसएम1015410
टुकडा आईबीएफ1 जीएसएम 1133264
टुकडा आईबीएफ2 जीएसएम 1133265
टुकडा बीईएफ32 जीएसएम 1278639
टुकडा पिटा जीएसएम1313420
टुकडा जिपिक जीएसएम1313421
टुकडा आरएनए पोली जीएसएम22259975
टुकडा H3K4me1 जीएसएम22259983
टुकडा H3K4me3 जीएसएम22259985
टुकडा H3K27ac जीएसएम22259987
टुकडा एमएसएल2 जीएसएम2469507
टुकडा H4K16ac जीएसएम2469508
टुकडा एम1बीपी जीएसएम2706055
टुकडा जीएएफ जीएसएम2860390
टुकडा निवेश जीएसएम1015412
हाय-सी S2R + WT कोशिकाएं जीएसई136137
हाय-सी S2R + 5pN-delta343 कोशिकाओं जीएसई136137

तालिका 1: जियो परिग्रहण संख्या।

एचईसी-प्रो आंकड़े पढ़ता प्रतिशतता
मैपिंग के आंकड़े
पूर्ण पढ़ें संरेखण 131515921 82.20%
छंटनी की गई पढ़ें संरेखण 16408309 10.30%
संरेखित करने में विफल 12110964 7.60%
बाँधना आंकड़े
विशिष्ट रूप से गठबंधन 79428455 50.90%
सिंगलटन 19063418 12.20%
मल्टी गठबंधन 57700021 36.90%
आंकड़े फ़िल्टर करना
वैध जोड़े 71373989 90.12%
एक ही-टुकड़ा: स्वयं सर्कल 2340697 2.90%
एक ही टुकड़ा: झूलने समाप्त होता है 2578783 3.20%
फ़िल्टर किए गए जोड़े 2773043 3.50%
फेंके गए जोड़े 196565 0.20%
संपर्क सांख्यिकी
अनोखा: सीआईएस ≤ 20 केबीपी 33108815 46.50%
अनोखा: सीआईएस > 20 केबीपी 33539888 47.10%
अद्वितीय: ट्रांस 4133602 5.80%
डुप्लीकेट पढ़ें जोड़े 398400 0.60%

तालिका 2: एचईसी-प्रो सांख्यिकी।

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Discussion

यहां प्रस्तुत इन-न्यूक्लियस हाय-सी विधि ने उच्च संकल्प पर ड्रोसोफिला जीनोम टोपोलॉजी की विस्तृत खोज की अनुमति दी है, जो विभिन्न जीनोमिक तराजू पर जीनोमिक इंटरैक्शन का एक दृश्य प्रदान करता है, जैसे प्रमोटरों और एन्ेवर्सर्स जैसे नियामक तत्वों के बीच क्रोमेटिन लूप से TADs और बड़े डिब्बे की पहचान25। इसी तकनीक को स्तनधारी ऊतकों पर भी कुशलतापूर्वक लागू किया गया है जिसमें कुछ संशोधनकिएगए हैं . उदाहरण के लिए, एकल-कोशिका निलंबन के बजाय ऊतक को संसाधित करते समय, ऊतक को 70 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, और डोनेस होमोजेनाइजर का उपयोग करके सामग्री को समरूप बनाते समय लाइसिस कदम किया जाता है। इसके अलावा, चूंकि स्तनधारी जीनोम ड्रोसोफिला जीनोम की तुलना में 25x बड़ा है, इसलिए 1-5 केबी संकल्प मैट्रिस बनाने के लिए आवश्यक वैध पढ़ने वाले जोड़े की संख्या अधिक है। इन-न्यूक्लियस हाई-सी विधि मूल हाई-सी विधि से भिन्न होती है2 परमाणु लाइसिस से बचने में 1% एसडीएस के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर लिगामेंट से पहले, इस प्रकार परमाणु अखंडता को संरक्षित करता है, और 7 एमएल23,24के बजाय 1 एमएल में लिटिंग करके।

प्रोटोकॉल में उच्च दक्षता को आश्वस्त करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला कदम जो पाचन और भरने की अक्षमताओं को लागू कर सकता है, वह 0.3% एसडीएस पारमेबिलाइजेशन और सर्फेक्टेंट उपचार के दौरान झुरमुटों का गठन है। यदि झुरमुट बड़े हैं और बाधित करना मुश्किल है, तो एसडीएस और सर्फेक्टेंट उपचार के दौरान घूर्णन गति को 400 आरपीएम तक कम किया जाना चाहिए। यदि झुरमुटों को पिपिंग द्वारा अलग करना मुश्किल रहता है, तो पारमेबिलाइजेशन के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रतिबंध बफर, एसडीएस और गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के साथ वॉल्यूम को समायोजित करके नमूना को दो में विभाजित किया जाना चाहिए। इसके बाद, नाभिक को न्यूनतम गति (200 × जी)पर अपकेंद्री किया जाना चाहिए, सुपरनैंट सावधानी से त्याग दिया गया है, और पाचन के साथ आगे बढ़ने से पहले 1x प्रतिबंध बफर के 450 माइक्रोन में नमूने एक साथ जमा किए गए हैं। दूसरा, पाचन दक्षता का अनुमान भरने और लिगेशन के लिए पर्याप्त डीएनए टुकड़े प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि गुणात्मक मूल्यांकन पर, पाचन अक्षम पाया जाता है, तो पाचन का दूसरा दौर 4 घंटे से लेकर रात तक की अवधि के लिए प्रतिबंध एंजाइम के साथ किया जाना चाहिए।

तीसरा, लिगेशन दक्षता का अनुमान महत्वपूर्ण है। यदि गुणात्मक मूल्यांकन पर, लिगेशन अक्षम पाया जाता है (यानी, उच्च आणविक वजन बैंड के बजाय, पचाने वाले नमूने के लिए मनाया जाने वाला एक धब्बा देखा जाता है), लिगेशन को 200 × जी पर नाभिक को अपकेंद्री करके दोहराया जाना चाहिए और ताजा 10xtion बफर और लिगाज़ का उपयोग करके उन्हें लिगेशन मिश्रण में फिर से खर्च करना चाहिए। चौथा, हाई-सी वैध उत्पादों के प्रतिशत का अनुमान सीएलए I (Mbo I मूल पाचन के लिए) के साथ अपेक्षित बातचीत की पीसीआर एम्प्लिकॉन को पचाने से किया जाना चाहिए। अपेक्षित बातचीत के एम्प्लिकॉन का कुशल प्रवर्धन और पाचन सफल लिगेशन और हाई-सी जंक्शनों के गठन की पुष्टि करता है। यदि एम्प्लिकॉन पाचन कुशल नहीं है, तो अधिकांश अणु हाई-सी उत्पादों के बजाय 3 सी होंगे, और यदि पुस्तकालय अनुक्रमित किया जाएगा तो इस पर विचार किया जाना चाहिए। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित अंतिम पुस्तकालय सीएलए आई पाचन नियंत्रण को निष्पादित करके भी इसकी पुष्टि की जा सकती है। अंत में पीसीआर डुप्लीकेट से बचने के लिए पीसीआर साइकिलों की कम संख्या का चयन महत्वपूर्ण है। यदि अनुक्रमण पर, पढ़ी जोड़ी डुप्लिकेट का प्रतिशत अधिक पाया जाता है, तो पीसीआर चक्रों की संख्या में और कमी की जानी चाहिए।

इस इन-न्यूक्लियस हाई-सी तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल आबादी के लिए किए गए हाई-सी प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, जीनोमिक संपर्कों की आवृत्ति का संकेत परिवर्तनीय व्यक्तिगत संरचनाओं के साथ लाखों जीनोम का प्रतिनिधित्व करता है। एक ही जीनोम से जीनोमिक संपर्कों के सेट को प्राप्त करने के लिए, एकल-कोशिका हाई-सी प्रयोग22 की सिफारिश की जाती है। दूसरा, हाय-सी समीपस्थ डीएनए के टुकड़ों के बंधन पर आधारित है । इस प्रकार, यदि जीनोमिक क्षेत्र एक बड़े प्रोटीन-क्रोमेटिन परिसर का हिस्सा हैं, तो टुकड़ों के बीच की दूरी लिगेशन में बाधा डाल सकती है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि हाई-सी38में ट्रांस संपर्कों का खराब प्रतिनिधित्व किया जाता है। इसके अलावा, हाय-सी युग्मित-अंत अनुक्रमण के साथ खत्म होता है, इस प्रकार जीनोमिक संपर्कों के जोड़े को पुनः प्राप्त करता है। हालांकि, कई डीएनए टुकड़े एक साथ एक ही क्रोमेटिन परिसर में बातचीत कर सकते हैं । क्रोमेटिन परिसर में कई डीएनए टुकड़ों की पहचान प्राप्त करने के लिए, हाय-सी39पर वैकल्पिक अनुक्रमण विधियों को लागू किया जा सकता है, या विभिन्न प्रयोगात्मक रणनीतियों को नियोजित किया जा सकता है जिसमें लिगेशन38,40, 41नहीं कियाजाताहै। अंत में, हालांकि हाय-सी जीनोमिक संपर्कों को मापता है, यह बातचीत मध्यस्थता प्रोटीन की पहचान प्रकट नहीं करता है । किसी विशेष प्रोटीन की रुचि42 या विशिष्ट जीनोमिकतत्वोंपर प्रोटीन के पहनावा की पहचान के द्वारा मध्यस्थता की गई जीनोमिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए वैकल्पिक तरीकों को लागू करना होगा ।

अंत में, ड्रोसोफिला जीनोम(तालिका 2)के लिए यहां वर्णित उच्च गुणवत्ता वाले हाई-सी प्रयोग के साथ, मैट्रिस को संकल्पों की एक विस्तृत श्रृंखला में बनाया जा सकता है (1, 5 केबी, 50 केबी या उससे कम; चित्रा 4देखें)। इसके अतिरिक्त, यदि जीनोम के किसी विशेष क्षेत्र का मूल्यांकन प्रतिबंध खंड स्तर पर किया जाना है, तो डेटा का उपयोग वांछित दृष्टिकोण के आभासी 4C परिदृश्य का निर्माण करने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 4Eमें नॉच जीन 5 ' यूटीआर)। SeqMonk में हाय-सी अन्य-समाप्त होता है उपकरण एक बहुत ही उपयोगकर्ता के अनुकूल विकल्प है जो इस परिदृश्य के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस परिदृश्य के लिए 4C क्वांटिफिकेशन टूल, SeqMonk का एक हिस्सा भी लागू करना सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण संपर्क प्राप्त कर सकता है।

टीएडी सीमाओं पर परिवर्तित एपी डीएनए-बाध्यकारी स्थलों के साथ उत्परिवर्ती कोशिका लाइनों के संग्रहके लिए यहां वर्णित इन-न्यूक्लियस हाय-सी प्रयोग को लागू करने से पता चला है कि डोमेन में ड्रोसोफिला जीनोम की संरचना और जीन अभिव्यक्ति विनियमन को बनाए रखने के लिए सीमाओं पर आनुवंशिक तत्वों की आवश्यकता होती है जैसा कि पूरी तरह से अर्जेट-मीजिया एट अल25द्वारा चर्चा की गई है । इस प्रकार, CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ नियामक तत्वों का आनुवंशिक संपादन, यहां वर्णित इन-न्यूक्लियस हाई-सी प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीनोमिक इंटरैक्शन की उच्च-संकल्प प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त, आनुवंशिक तत्वों के संरचनात्मक कार्य का परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति हो सकती है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को यूएनएएम टेक्नोलॉजी इनोवेशन एंड रिसर्च सपोर्ट प्रोग्राम (PAPIIT) अनुदान संख्या IN207319 और विज्ञान और प्रौद्योगिकी राष्ट्रीय परिषद (CONACyT-FORDECyT) अनुदान संख्या 303068 द्वारा समर्थित किया गया था। ई.एल. विज्ञान और प्रौद्योगिकी राष्ट्रीय परिषद (CONACyT) CVU नंबर 968128 द्वारा समर्थित एक मास्टर छात्र है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution Agar Scientific R1026
Biotin-14-dATP Invitrogen CA1524-016
ClaI enzyme NEB R0197S
COVARIS Ultrasonicator Covaris LE220-M220
Cut Smart NEB B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Life Technologies 41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1 Invitrogen 65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered Sigma F9665
Klenow Dna PolI large fragment NEB M0210L
Klenow exo(-) NEB M0210S
Ligation Buffer NEB B020S
MboI enzyme NEB R0147M
NP40-Igepal SIGMA CA-420 Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0 Illumina 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0 Illumina 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0 Illumina 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0 Illumina 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 SIGMA P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A) Sigma 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A) Sigma 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693132001
Proteinase K Roche 3115879001
Qubit ThermoFisher Q33327
RNAse Roche 10109142001
SPRI Beads Beckman B23318
T4 DNA ligase Invitrogen 15224-025
T4 DNA polymerase NEB M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)  NEB M0201L
TaqPhusion NEB M0530S DNA polymerase
Triton X-100 Non-ionic surfactant for quenching of SDS

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References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

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जेनेटिक्स अंक 175 क्रोमेटिन जीनोम 3 डी संगठन डिब्बे टोपोलॉजिकल रूप से डोमेन को जोड़ते हैं
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Esquivel-López, A., Arzate-Mejía, R., Pérez-Molina, R., Furlan-Magaril, M. In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells. J. Vis. Exp. (175), e62106, doi:10.3791/62106 (2021).

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