Summary
Геном организован в ядерном пространстве в различные структуры, которые могут быть выявлены с помощью технологий захвата конформации хромосом. Метод Hi-C в ядре обеспечивает общегеномную коллекцию взаимодействий хроматинов в клеточных линиях дрозофилы, которая генерирует контактные карты, которые могут быть исследованы с разрешением мегабазы на уровне рестстриктного фрагмента.
Abstract
Геном организован в топологически ассоциирующие домены (TAD), разграниченные границами, которые изолируют взаимодействия между доменами. У дрозофилы механизмы, лежащие в основе формирования и границ TAD, все еще исследуются. Применение описанного здесь метода Hi-C в ядре помогло препарировать функцию архитектурных белковых (AP)-связывающих сайтов на границах TAD, изолируя ген Notch. Генетическая модификация границ доменов, которая вызывает потерю ТОП, приводит к слиянию TAD, транскрипционным дефектам и дальнодейственным топологическим изменениям. Эти результаты предоставили доказательства, демонстрирующие вклад генетических элементов в формирование границ домена и контроль экспрессии генов у дрозофилы. Здесь подробно описан метод Hi-C в ядре, который обеспечивает важные контрольные точки для оценки качества эксперимента вместе с протоколом. Также показано необходимое количество показанных показаний секвенирования и действительных пар Hi-C для анализа геномных взаимодействий в различных геномных масштабах. CRISPR/Cas9-опосредованное генетическое редактирование регуляторных элементов и профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием этого протокола Hi-C в ядре может стать мощной комбинацией для исследования структурной функции генетических элементов.
Introduction
У эукариот геном разделен на хромосомы, которые занимают определенные территории в ядерном пространстве во время интерфазы1. Хроматин, образующий хромосомы, можно разделить на два основных состояния: одно из доступных хроматинов, которые являются транскрипционно разрешительными, и другое из компактного хроматина, который является транскрипционно репрессивным. Эти хроматиновые состояния отделяются и редко смешиваются в ядерном пространстве, образуя два отдельных отсека в ядре2. В масштабе субмегабазы границы разделяют области высокочастотных хроматиновых взаимодействий, называемые TADs, которые отмечают хромосомную организацию3,4,5. У млекопитающих границы TAD занимают когезионные и CCCTC-связывающий фактор (CTCF)6,7,8. Когезионный комплекс выдавливает хроматин и останавливается на CTCF-сайтах связывания, которые расположены в конвергентной ориентации в геномной последовательности с образованием стабильных хроматиновых петель9,10,13,14. Генетическое нарушение сайта связывания ДНК CTCF на границах или снижение CTCF и изобилия белка когезгена приводит к аномальным взаимодействиям между регуляторными элементами, потере образования TAD и дерегуляции экспрессии генов9,10,11,13,14.
У дрозофилы границы между TAD заняты несколькими ПП, включая граничный элемент-ассоциированный фактор 32 кДа (BEAF-32), связывающий белок Motif 1 (M1BP), центросомальный белок 190 (CP190), супрессор волосатого крыла (SuHW) и CTCF, и обогащены активными модификациями гистонов и полимеразой II16,17,18. Было высказано предположение, что у дрозофилы TAD появляются как следствие транскрипции13,17,19,и точная роль независимых ТОс в формировании границ и изоляционных свойствах все еще находится в стадии изучения. Таким образом, вопрос о том, являются ли домены у дрозофилы единственным следствием агрегации областей сходных транскрипционных состояний или же АП, включая CTCF, способствуют формированию границ, еще предстоит полностью охарактеризовать. Исследование геномных контактов с высоким разрешением стало возможным благодаря разработке технологий захвата конформации хромосом в сочетании с секвенированием следующего поколения. Протокол Hi-C был впервые описан с этапом лигирования, выполненным «в растворе»2 в попытке избежать ложных продуктов лигирования между фрагментами хроматина. Однако несколько исследований указали на осознание того, что полезный сигнал в данных исходил от продуктов лигирования, образуемых в частично лизированных ядрах, которые не находились в растворе20,21.
Затем протокол модифицировали для выполнения лигирования внутри ядра в рамках одноклеточного эксперимента Hi-C22. Протокол Hi-C в ядре был впоследствии включен в клеточную популяцию Hi-C, чтобы обеспечить более последовательное покрытие во всем диапазоне геномных расстояний и получить данные с меньшим техническим шумом23,24. Протокол, подробно описанный здесь, основан на популяционно-ядровом протоколеHi-C 23,24 и использовался для исследования последствий генетического удаления ДНК-связывающих мотивов для CTCF и M1BP с границы домена в локусе гена Notch в Drosophila25. Результаты показывают, что изменение ДНК-связывающих мотивов для ТОП на границе имеет радикальные последствия для формирования домена Notch, более крупных топологических дефектов в областях, окружающих локус Notch, и дерегуляции экспрессии генов. Это указывает на то, что генетические элементы на границах домена важны для поддержания топологии генома и экспрессии генов у Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Фиксация
- Начните с 10 миллионов клеток Schneider line 2 plus (S2R+) для приготовления 17,5 мл клеточной суспензии в среде Schneider, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) при комнатной температуре (RT).
- Добавьте формальдегид без метанола для получения конечной концентрации 2%. Перемешайте и инкубируете в течение 10 минут при RT, заботясь о том, чтобы смешивать каждую минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид является опасным химическим веществом. Соблюдайте соответствующие правила охраны труда и техники безопасности и работайте в вытяжном капюшоне. - Усыхните реакцию добавлением глицина для достижения конечной концентрации 0,125 М и перемешайте. Инкубировать в течение 5 мин на RT, затем 15 мин на льду.
- Центрифуга на 400 × г при РТ в течение 5 мин, а затем в течение 10 мин при 4 °С; отбросьте супернатант. Тщательно повторно суспендировать гранулы в 25 мл холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора.
- Центрифугу при 400 × г в течение 10 мин при 4 °С, затем выбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы продолжаете работу с протоколом, перейдите к шагу 2.1 для лизиса; в противном случае заморозьте гранулу во вспышке в жидкостиN2 и храните гранулу при -80 °C.
2. Лизис
- Повторно суспендировать клетки в 1 мл ледяно-холодного лизисного буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8; 0,2% неионного поверхностно-активного вещества (см. Таблицу материалов);10 мМ NaCl; 1x ингибиторы протеазы) и корректировать объем до 10 мл с помощью ледяно-холодного лизисного буфера. Отрегулируйте объем для получения концентрации 1 × 106 клеток/мл. Инкубировать на льду в течение 30 мин, перемешивая каждые 2 мин, переворачивая трубки.
- Центрифугируют ядра при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С, а затем осторожно отбрасывают супернатант. Вымойте гранулу 1x с 1 мл буфера холодного лизиса и переложите ее в микроцентрифужную трубку. Промыть гранулу 1x с 1 мл холодного 1,25x рестепензиционного буфера и повторно суспендовать каждую ячейку гранулы в 360 мкл 1,25x буфера ограничения.
- Добавьте 11 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) на пробирку (0,3% конечной концентрации), тщательно перемешайте путем пипетирования и инкубируют при 37 °C в течение 45 мин, встряхивая при 700-950 об/мин. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрушить сгустки несколько раз во время инкубации.
- Омолаживают SDS путем добавления 75 мкл неионного поверхностно-активного вещества (10% раствор, см. Таблицу материалов)на пробирку (конечная концентрация 1,6% и инкубируют при 37 °C в течение 45 мин, встряхивая при 950 об/мин. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки во время инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если скопления большие и их трудно разрушить, уменьшите скорость вращения до 400 об/мин во время обработки SDS и поверхностно-активным веществом. Если сгустки трудно дезагрегировать путем пипетирования, разделите выборку на две части; регулировать объемы буфера ограничения, SDS и поверхностно-активного вещества; и приступить к пермеабилизации. Затем раскрутите ядра с минимальной скоростью (200 × g),осторожно отбросьте супернатант, объедините образцы вместе в 1X рестракционный буфер и приступайте к пищеварению. Возьмите аликвоту 10 мкл в качестве непереваренный образец (UD).
3. Ферментативное пищеварение
- Переварить хроматин, добавив 200 единиц (U) Mbo I на пробирку, и инкубировать при 37 °C в течение периода от 4 ч до ночи при вращении (950 об/мин).
- На следующий день добавьте дополнительно 50 ЕД МБО I на пробирку и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч при вращении (950 об/мин).
- Инактивируют фермент путем инкубации пробирок при 60 °C в течение 20 мин. Поместите трубки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 мкл аликвоты в качестве переваренный образец (D).
4. Биотинилирование концов ДНК
- Чтобы заполнить свесы фрагмента рестрикции и пометить концы ДНК биотином, добавьте по 1,5 мкл по 10 мМ dCTP, dGTP, dTTP, 20 мкл 0,4 мМ биотина dATP, 17,5 мкл буфера Tris low-EDTA (TLE) [10 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0] и 10 мкл 5 U/мкл Кленова (днк-полимераза I большой фрагмент) во все трубки. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 75 мин при 37 °C. Встряхивать при 700 об/мин каждые 10 с в течение 30 с. Поместите все трубки на лед во время приготовления лигационной смеси.
5. Лигирование
- Переложите каждую переваренный хроматиновую смесь в отдельную пробирку объемом 1 мл с лигационной смесью (100 мкл 10-кратного лигационного буфера, 10 мкл 10 мг/мл бычий сывороточного альбумина, 15 ЕД Т4 ДНК-лигазы и 425 мкл двойной дистиллированной воды [ddH2O]). Тщательно перемешайте путем бережного пипетирования и высиживайте в течение ночи при 16 °C.
6. Реверсирование сшивок и очистка ДНК
- Разлагают белки, добавляя 50 мкл 10 мг/мл протеиназы К на пробирку, и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч. Обратные сшивки путем повышения температуры до 65 °C и инкубируют в течение ночи.
- Разлагают РНК путем добавления 20 мкл 10 мг/мл РНКазы А и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
- Выполните экстракцию фенола: хлороформа с последующим осаждением этанола.
- Добавьте 1 объем фенол-хлороформа и тщательно перемешайте путем инверсии, чтобы получить однородную белую фазу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол является опасным химическим веществом. Соблюдайте соответствующие правила охраны труда и техники безопасности. Работа в вытяжном капюшоне. - Центрифуга при 15 000 × г в течение 15 мин. Перенесите водную фазу в свежую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл. Выполните обратное извлечение нижнего слоя со 100 мкл буфера TLE и перенесите водную фазу в ту же трубку объемом 2 мл.
- Осаждение ДНК путем добавления 2 объемов 100% этилового спирта (EtOH), 0,1 объема 3 M ацетата натрия и 2 мкл 20 мг/мл гликогена. Инкубировать при -20 °C в течение периода от 2 ч до ночи.
- Открутите при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и промыть гранулы 2x ледяным 70% EtOH. Высушите гранулы на RT и повторно суспендируют в 100 мкл буфера TLE. Количественно определить ДНК с помощью фторогенного красителя, который избирательно связывается с ДНК и флуорометра в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить продукты лигирования при 4 °C в течение короткого срока или при -20 °C в течение длительного времени. Используйте аликвоту (100 нг) материала в качестве лигатированного образца (L) для контроля качества.
- Добавьте 1 объем фенол-хлороформа и тщательно перемешайте путем инверсии, чтобы получить однородную белую фазу.
7. Оцените качество шаблона Hi-C
- Качественный контроль пищеварения и перевязки
- Очистите ДНК от аликвот UD и D путем обращения вспять сшивок и выполните экстракцию фенола: хлороформа и осаждение этанола, как описано выше.
- Загрузите 100 нг образцов UD, D и L в 1,5% агарозном геле. Ищите мазок, сосредоточенный около 500 bp в образце D, по сравнению с высокомолекулярной полосой для образца L (см. репрезентативные результаты).
- Количественный контроль эффективности пищеварения
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более точной оценки эффективности пищеварения используйте образцы UD и D в качестве шаблонов для выполнения количественных полимеразных цепных реакций (qPCR) с использованием праймеров, разработанных следующим образом.- Спроектируйте пару праймеров, которая усиливает фрагмент ДНК, содержащий сайт рестрикции ДНК для фермента, используемого для пищеварения (Mbo I в настоящем протоколе), называемого R в формуле на этапе 7.2.3.
- Спроектируйте пару праймеров, которая усиливает контрольный фрагмент ДНК, который не содержит рестрикционный сайт для фермента, используемого для пищеварения (Mbo I для настоящего протокола), называемого C в формуле на этапе 7.2.3.
- Используйте пороговые значения цикла (значения Ct) усиления для расчета эффективности ограничения в соответствии с формулой, показанной ниже:
% ограничения = 100 - 100/2{(ctr - ctc)d - (ctr - ctc)UD}
Где CtR относится к значению Ct фрагмента R, а CtC относится к значению Ct фрагмента C для образца D и образца UD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент рестрикции отражает эффективность фермента рестрикции, расщепляющего ограниченный (R) фрагмент ДНК по сравнению с контрольным (C) фрагментом ДНК, который не содержит сайт рестригированной ДНК. Рекомендуется КПД ограничения ≥ 80%.
- Обнаружение известных взаимодействий
- Выполнение ПЦР для ампляции внутреннего контроля лигирования для изучения взаимодействий на коротких и/или средних или больших расстояниях (см. репрезентативные результаты).
- В качестве альтернативы, конструкция грунтовки для усиления продукта лигирования, в котором грунтовки находятся в прямо-прямой или обратной ориентации в соседних рестригационных фрагментах.
- Контроль заливки и маркировки биотином
- Проверить маркировку Hi-C и эффективность лигирования путем амплификации и переваривания известного взаимодействия или продукта лигирования между соседними рестригационными фрагментами в геноме, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная заправка и лигирование сайта Mbo I (GATC) генерирует новый сайт для фермента рестрикции Cla I (ATCGAT) в лигативном соединении и регенерирует сайт Mbo I. - Переварите продукт ПЦР с Mbo I, Cla I или обоими. После обведения образцов на 1,5-2% геля оценить относительное число лигационных соединений 3C и Hi-C путем количественной оценки интенсивности разрезанных и неразрезанных полос26.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность > 70% желательна (см. репрезентативные результаты).
- Проверить маркировку Hi-C и эффективность лигирования путем амплификации и переваривания известного взаимодействия или продукта лигирования между соседними рестригационными фрагментами в геноме, как описано выше.
8. Ультразвук
- Обработать образцы ультразвуком для получения 200-500 фрагментов ДНК. Для прибора, используемого в настоящем протоколе (см. Таблицу материалов),разбавляют образец (от 5 до 10 мкг) в 130 мкл ddH2O на пробирку и устанавливают прибор на обработку ультразвуком до 400 bp: уровень заполнения: 10; коэффициент пошлины: 10%; пиковая мощность (Вт): 140; циклов на всплеск: 200; время (ы): 80.
9. Удаление биотина/восстановление конца
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, показанные ниже, скорректированы на 5 мкг ДНК Hi-C.
- Для удаления биотина перенесите образец (130 мкл) в свежую микроцентрифужную трубку. Добавьте 16 мкл 10-кратного лигационного буфера, 2 мкл 10 мМ dATP, 5 мкл ДНК-полимеразы T4 (15U) и 7 мкл ddH2O (160 мкл общего объема). Инкубировать при 20 °C в течение 30 мин.
- Добавьте 5 мкл 10 мМ дНТП, 4 мкл 10-кратного лигационного буфера, 5 мкл полинуклеотидкиназы Т4 (10 ЕД/мкл), 1 мкл Кленова и 25 мкл ddH2O (200 мкл общего объема). Инкубировать при 20 °C в течение 30 мин.
10. Выбор размера
- Чтобы выбрать фрагменты в основном в диапазоне размеров 250-550 bp, выполните последовательный выбор размера обратимой иммобилизации (SPRI) сначала с 0,6x, а затем 0,90x в соответствии с инструкциями производителя и элюируйте ДНК с использованием 100 мкл TLE.
11. Биотин вытягивает / A-хвост / адаптер лигирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните промывку путем повторного сусщения магнитных шариков путем вихря, вращайте образцы в течение 3 минут на вращающемся колесе, а затем ненадолго раскрутите образец и поместите его на магнитную подставку. Дайте бусинам прилипнуть к магниту, отбросьте супернатант и перейдите к следующему этапу стирки. Выполняйте промывки при 55 °C на термоблоке с вращением вместо вращающегося колеса.
- Составьте конечный объем до 300 мкл на образец с помощью TLE для вытягивания. Подготовьте буферы для промывки шариков: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Используйте 150 мкл магнитных шариков, связанных со стрептавидином (см. Таблицу материалов)на библиотеку. Вымойте бусины 2x с 400 мкл 1x TB. Затем повторно суспендирует бусины в 300 мкл 2x NTB.
- Смешайте шарики с материалом Hi-C 300 мкл и инкубировать в RT в течение 30 минут на вращающемся колесе, чтобы биотин связывались с шариками стрептавидина.
- Вымойте шарики с 400 мкл 0,5 ТБ и высиживайте при 55 °C в течение 3 минут, вращаясь со скоростью 750 об/мин. Вымойте бусины в 200 мкл 1x рестистримного буфера.
- Повторно суспендировать шарики в 100 мкл хвостовой смеси dATP (5 мкл 10 мМ dATP, 10 мкл 10-кратного рестренирующего буфера, 5 мкл экзо- кленова и 80 мкл ddH2O). Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
- Удалите супернатант, промыть шарики 2x с 400 мкл 0,5x TB, насиживая при 55 °C в течение 3 мин и вращая при 750 об/мин.
- Вымойте шарики 400 мкл 1x NTB, а затем 100 мкл 1x лигационного буфера.
- Повторно суспендировать шарики в 50 мкл 1x лигационного буфера и перенести суспензию в новую трубку. Добавить 4 мкл предварительно отожженных ПЭ-адаптеров (запас 15 мкМ) и 2 мкл Т4-лигазы (400 ЕД/мкл, т.е. 800 Ед/пробирка); инкубируют на РТ в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно отжиг адаптеров путем добавления равных объемов адаптеров PE 1.0 и PE 2.0 (запас 30 мкМ) и инкубации в течение 10 мин на RT (см. Таблицу материалов). - Отбить бусины, удалив супернатант и промыв бусины в 2 раза 400 мкл туберкулеза. Вымойте бусины 200 мкл 1x NTB, затем 100 мкл 1x буфера ограничения и повторно суспендирует шарики в 40 мкл 1x буфера ограничения.
12. ПЦР-амплификация
- Установите ПЦР объемом 25 мкл с 5, 6, 7 и 8 циклами. Для каждой ПЦР используйте:
Рецепт реакции Бусины Hi-C 2.5 мкл 10 мкМ ПЭ ПЦР праймер 1 (Таблица материалов) 0.75 мкл 10 мкМ ПЭ ПЦР праймер 2 (Таблица материалов) 0.75 мкл 10 мМ дНТП 0.6 мкл 5-кратный реакционный буфер 5 мкл ДНК-полимераза 0.3 мкл ддН2О 14.65 мкл Итог 25 мкл Циклов Температура Время 1 98 °С 30 с n циклов 98 °С 10 с 65 °С 30 с 72 °С 30 с 1 72 °С 7 мин
13. Окончательная ПЦР-амплификация
- Выполните окончательную амплификацию ПЦР, используя те же условия, которые описаны выше, и количество выбранных циклов. Разделите образец, используя 5 мкл шариков Hi-C в качестве шаблона в реакциях по 50 мкл.
- Соберите все реакции ПЦР и перенесите их в свежую трубку. Используйте магнит для удаления шариков стрептавидина и восстановления супернатанта (продукты ПЦР). Переложите бусины в свежую трубку, вымойте бусины, как указано на этапе 11.2.9, и храните в 1x буфере ограничения при 4 °C в качестве резервной копии.
- Очищайте продукты ПЦР, используя в 0,85 раза больше объема шариков SPRI в соответствии с инструкциями производителя. Elute с 30 мкл буфера TLE.
- Количественно оцените библиотеку Hi-C с помощью флуорометрического прибора и подтвердите качество библиотеки с помощью капиллярного электрофореза на основе чипа.
- В качестве последней контрольной точки качества используйте 1 мкл библиотеки Hi-C в качестве шаблона для выполнения реакции ПЦР с использованием 10 циклов с использованием тех же условий, описанных на этапе 12.1. Разделите продукт ПЦР на две микроцентрифужные трубки: переварите одну с Cla I и оставьте другую непереваренным в качестве контрольной. Запускают препараты в 1,5-2% агарозном гелевом (см. репрезентативные результаты).
- Переходите к парной последовательности 50 bp или 75 bp на подходящей платформе секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ниже описаны результаты успешного протокола Hi-C (см. сводку рабочего процесса протокола Hi-C на рисунке 1A). Существует несколько контрольных точек контроля качества во время эксперимента Hi-C в ядре. Образцы аликвот собирали до (UD) и после (D) этапа ограничения хроматина, а также после лигирования (L). Сшивки были обращены вспять, а ДНК была очищена и запущена на агарозном геле. Мазок 200-1000 bp наблюдался при успешном ограничении Mbo I(рисунок 1B). Ожидаемый размер молекулы зависит от рестрикции фермента выбора. Если лигирование было успешным, в верхней части геля была замечена высокомолекулярная полоса(рисунок 1B). Эффективность пищеварения также может быть подтверждена qPCR, как подробно описано в протоколе. Приемлемая эффективность пищеварения составляет 80% или выше(рисунок 1С).
Для детальной оценки эффективности лигирования Hi-C грунтовки могут быть спроектированы для усиления внутреннего контроля продукта лигирования, в котором праймеры находятся в прямой или обратной ориентации в соседних фрагментах ограничения. Альтернативно, праймеры могут быть спроектированы для усиления известных взаимодействий. На рисунке 2A показано усиление известного взаимодействия среднего диапазона (300 кб) у Drosophila25. Продукты лигирования Hi-C (в которых маркировка биотина, заполнение и лигирование произошли успешно) могут быть оценены путем переваривания продукта ПЦР, восстановленного в амплификации. После заполнения и лигирования ампликоны Hi-C будут содержать новый участок ограничения Cla I на исходном участке Mbo I, который сохраняется при тупой лигации. Если ограничение с Cla I не будет полным, реакция заполнения и маркировка биотина будут неэффективными. Эффективность переваривания более 70% рекомендуется, чтобы избежать большой доли бесполезных считываний для библиотек после секвенирования(Рисунок 2A,сравните переваривание Cla I 3C с шаблоном Hi-C).
Для определения достаточного количества циклов амплификации ПЦР для усиления конечной библиотеки Hi-C были настроены реакции ПЦР с использованием 2,5 мкл данной библиотеки на шариках, как описано в протоколе. Количество циклов ПЦР для окончательной амплификации на один цикл меньше числа циклов, для которых виден мазок(рисунок 2B). В этом случае было выбрано 4 цикла амплификации ПЦР. В качестве конечной контрольной точки качества аликвота библиотеки Hi-C была повторно усилена и переварена с помощью Cla I. Уровень переваривания библиотеки (уменьшение размера мазка) указывает на обилие допустимых пар Hi-C и отражает долю полезных чтений, которые будут получены из библиотеки(рисунок 2С). Соотношение верхнего диапазона размеров (определяемого размером, присутствующим в образце UD) и нижнего диапазона размеров как в образцах UD, так и в D образцах должно давать соотношение > 1 для UD и отношение ≤ 1 для перевариваемого образца, если сбраживание Cla I является эффективным.
После парной последовательности файлы FASTQ(таблица 1)обрабатывались с помощью HiCPro28, а сгенерированная статистика строилась с помощью MultiQC28. Альтернативным инструментом HiCPro является конвейер HiCUP30, который дает аналогичные результаты (не показаны). На рисунке 3 и в таблице 2 показана подробная статистическая информация о секвенированных чтениях. Сообщается о полном выравнивании считывания и выравнивании после обрезки. Эти две категории соответствуют успешно выровненным чтениям, которые будут использоваться в последующем анализе для поиска допустимых пар Hi-C. Категория выравнивания после обрезки относится к показаниям, охватывающим лигативное соединение, которые не были выровнены на первом этапе и обрезаны в месте перевязки, чтобы затем перестроить их 5' конечность в геном28 (рисунок 3B,C и таблица 2). Статистика контактов показывает, что библиотека Hi-C была высокого качества с 82,2% допустимых пар и 7,6% бесполезных считывания, попадающих в однофрагментальные самокруглы, однофрагментальные свисающие концы, повторное лигирование, отфильтрованные пары и сброшенные пары категорий(рисунок 3A, рисунок 3Dи таблица 2). Кроме того, количество дубликатов ПЦР очень низкое, что указывает на то, что сложность библиотеки высока, и что циклы ПЦР ввели минимальные артефакты(рисунок 3E и таблица 2).
Используя уникальные допустимые пары Hi-C, базовый анализ распределения пар был выполнен с использованием HiCPro27. Этот эксперимент дал 46,5% уникальных контактов цис ≤ 20 кбит/с, 47,1% уникальных контактов цис > 20 кбит/с и 5,8% уникальных транс-контактов(рисунок 3D). Распределение цис-транс-действительных пар соответствовало результатам, ожидаемым для успешного эксперимента Hi-C с большинством взаимодействий, обнаруженных в одной хромосоме. Высокая доля транс-контактов свидетельствует о неэффективной фиксации. Используя допустимые пары Hi-C из HiCPro27,матрицы были нормализованы итеративной коррекцией и разложением собственных векторов (ICE)30, а матрицы разрешения 1 кб и 5 кб были сгенерированы с помощью HiCPlotter30,31,32. Нормализованные контактные матрицы с разрешением 1 кб и 5 кб представлены для локуса гена Notch у дрозофилы(рисунок 4A, рисунок 4Cи рисунок 4D). На рисунке 4Aлокус гена Notch можно увидеть вместе с APs, доменами l и II, а также модификациями гистонов вдоль локуса(рисунок 4A и таблица 1). Конструкция удаления CRISPR-Cas9 включала мотив CTCF и M1BP(рисунок 4B).
При удалении области, содержащей как CTCF, так и M1BP ДНК-связывающие участки на 5' границе локуса Notch (5pN-delta343, таблица 1),может наблюдаться резкое изменение контактов хроматина с потерей взаимодействий внутри локуса Notch и усилением контактов с восходящим TAD по сравнению с диким типом (WT)(рисунок 4C,D). Наконец, на рисунке 4E показана подробная панорама профилей WT и мутантного взаимодействия на уровне рестракционных фрагментов из гена Notch 5' UTR, показывающая снижение доли контактов, сделанных с локусом гена Notch, и увеличение контактов с доменом upstream. Виртуальные 4C-виды гена Notch 5' UTR были получены с использованием HiC-Pro27. Альтернативным инструментом является количественная оценка Hi-C с другими целями, доступная в SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Все результаты, представленные на рисунке 4, были получены путем применения протокола Hi-C в ядре в WT и мутантных клетках S2R+ Drosophila, как описано Arzate-Mejía et al.25.
Рисунок 1:Контроль пищеварения и лигирования Hi-C в ядре. (A) Обзор протокола Hi-C. Клетки сшиты формальдегидом, что приводит к ковалентным связям между сегментами хроматина (фрагменты ДНК: розовый, фиолетовый) и белками. Хроматин переваривается ферментом рестрикции (представленным ножницами), в данном примере Mbo I. Полученные липкие концы заполняются нуклеотидами, включая биотинилированный dATP (темно-синие круги). ДНК очищается, а биотинилированные соединения обогащаются с помощью магнитных шариков (серых кругов), покрытых стрептавидином. Взаимодействующие фрагменты идентифицируются с помощью парного секвенирования следующего поколения. (B)Контроль качества пищеварения и лигирования Hi-C для двух биологических реплик (Hi-C 1 и Hi-C 2). Библиотеки Hi-C были разрешены на 1,5% агарозном гелевом. Обе переваренные, D, библиотеки работают как мазок около 600 bp. Лигированные сэмплы, Lig, работают как довольно плотная полоса размером более 10 кб, похожая на непереваренные образцы UD. Различия в силе сигнала обусловлены неравномерным количеством загруженной ДНК на гель. (C)Количественный контроль сбраживания Hi-C с помощью количественной полимеразной цепной реакции для тех же двух биологических реплик, что и в(B)(Hi-C 1 и Hi-C 2), с использованием пороговых значений цикла, как подробно описано в протоколе. Успешное пищеварение имеет ≥ 80% ограничение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Контроль заполнения Hi-C в ядре и лигирования тупым концом. (A) Оценка заполнения и маркировки биотина. Известное взаимодействие между фрагментами, расположенными на расстоянии 300 кб друг от друга в хромосоме X, использовали в качестве контроля и усиливали с помощью праймеров, обозначенных черными стрелками (см. верхнюю часть схемы в(B),праймера 1 (слева), праймера 2 (справа), таблицы 1),генерирующих ампликон 347 bp. Продукты лигирования Hi-C можно отличить от продуктов, полученных в эксперименте 3C, путем сбраживания сайта лигирования. Соединения Hi-C были переварены Cla I на исходном участке Mbo I, так как они образовались при тупом лигировании. Соединения Hi-C и 3C переваривались с Mbo I, поскольку сайт рестрикции регенерирует при перевязке (слева от геля). Напротив, соединения 3C не переваривались Cla I на сайте Mbo I, а только Mbo I. Сравните профиль пищеварения продуктов Hi-C и 3C с использованием Cla I. Фрагмент 53 bp был получен путем переваривания продукта Hi-C (из-за ограничения сайта Cla I, образованного на сайте Mbo I, и ограничения сайта Cla I, уже присутствующего в регионе). Этот фрагмент не наблюдался при переваривании продукта 3C, поскольку единственным доступным участком Cla I был тот, который уже присутствовал в регионе. (B)После ПЦР-амплификации библиотеки Hi-C с использованием различных циклов ПЦР продукты запускали на 1,5% агарозном гелевом. Мазок 400-1000 бп ожидался и наблюдался. Соответствующие числовые циклы для окончательной амплификации ПЦР следует принимать за число, непосредственно меньшее, чем то, при котором мазок просто виден. (C) Заключительная библиотека Cla I пищеварение. Аликвота итоговой библиотеки была повторно усилена и переварена с помощью Cla I. Уменьшение размера мазка подтвердило, что большая часть молекул в библиотеке были действительными парами Hi-C. Денситометрический анализ этого геля может быть выполнен для получения соотношения между образцами ООН и D, как подробно описано в разделе репрезентативных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Статистика HiC-Pro библиотеки Hi-C. (A) Схематическое представление допустимых пар Hi-C и различных типов недопустимых пар, которые могут быть получены в ходе эксперимента и отфильтрованы HiCPro27 (Таблица 2). К ним относятся чтения, попадающие в смежные последовательности, свисающие концы, один и тот же фрагмент, самокруг, религации и дубликаты ПЦР. (B)Картографическая статистика. Показания, которые не удалось выровнять, отображаются (серым), а как полностью выровненные чтения, так и чтения, выровненные после обрезки, отображаются синим и светло-синим цветами соответственно. Эти две категории представляют собой полезные чтения, которые рассматриваются в последующих анализах. (C) Статистика сопряжения. Многоуровненные чтения (темно-оранжевый) представляют собой считывания, которые выровнены в нескольких областях генома. Однозначно выровненные (темно-синие) чтения представляют собой считываемые пары, которые выровнены один раз в геноме, а синглтоны (светло-оранжевые) представляют собой считываемые пары, в которых только одна геномная область была секвенирована в обоих чтениях. (D) Статистика фильтрации. Допустимые пары чтения (синий) представляют успешные продукты лигирования Hi-C, как описано в (A). Самофрагментные самокругменты (светло-розовые) являются бесполезными чтениями, поскольку они представляют собой тот же геномный фрагмент, показанный в (A). Свисающие концы с одним и тем же фрагментом (оранжевый) представляют собой чтения, в которых был секвенирован один фрагмент ограничения. Отфильтрованные и сброшенные пары (коричневые) также являются бесполезными показаниями, которые имеют неправильный размер или для которых продукт лигирования не может быть восстановлен. Наконец, религационные чтения (красный) представляют собой чтения, в которых два соседних фрагмента были повторно лигированы, что дает бесполезную информацию. (E) Допустимое распределение контактов считываемых пар в геноме. Уникальные цис-контакты (синий) встречаются чаще, чем уникальные транс-контакты (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Матрицы контактов Hi-C и виртуальный 4C анализ WT и мутантных клеток S2R+. (A) Нормализованная тепловая карта Hi-C области 50 кб с разрешением 1 кб, центрированной в локусе гена Notch. Показана оценка разделения TAD32 для локуса вместе с разделением локуса Notch на два топологических домена (Домен 1 и Домен 2). Данные ChIP-seq для APs, РНК Pol II и гистоновых меток для клеток S2/S2R+34,35,36,37 показаны ниже тепловой карты(таблица 1). Позиции границ домена Notch 1 выделены светло-зеленым цветом. (B) Схематическое изображение мутанта ГРАНИЦЫ B1 CRISPR. Зеленый прямоугольник указывает на удаленную область 343 bp. Ножницы указывают на sgRNAs, используемые для редактирования генома, опосредованного CRISPR. Сайты связывания мотивов для ТОП показаны в виде коробок для CTCF и M1BP. Пиковые вершины для ДНК-связывающих ТОП, показанные в (A), также обозначены35. (C)Нормализованные тепловые карты Hi-C с разрешением 1 кб, охватывающие область 50 кб, центрированную в Notch для WT и мутантных клеток. Слева, тепловые карты Hi-C log2 различий в частоте взаимодействия между WT и мутантными клетками. (D)Нормализованные тепловые карты Hi-C, охватывающие область 250 кб с центром в Notch с разрешением 5 кб для WT и мутантных клеток. Слева, тепловые карты Hi-C log2 различий в частоте взаимодействия между WT и мутантными клетками. (E) Virtual-4C для WT и мутантных клеток, использующих 5' UTR Notch в качестве точки зрения. Процент взаимодействий между точкой зрения и областями в верхнем потоке кирредомайн-2, домене Notch 1, домене Notch 2 и домене dnc ниже по течению как для WT, так и для мутантных клеток показаны25. Сокращения: WT = дикий тип; TAD = топологически связанная область; CHIP = иммунопреципитация хроматина; AP = архитектурный белок; РНК Pol = РНК-полимераза; S2R+ = S2 рецептор плюс; sg РНК = одиночная направляющая РНК; UTR = непереведенный регион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Эксперимент | Образец | Номер присоединения к GEO |
| Чип | СР190 | GSM1015404 |
| Чип | СуХВ | GSM1015406 |
| Чип | Мод(mdg4) | GSM1015408 |
| Чип | CTCF | GSM1015410 |
| Чип | Ибф1 | GSM1133264 |
| Чип | Ибф2 | GSM1133265 |
| Чип | БИФ32 | GSM1278639 |
| Чип | Пита | GSM1313420 |
| Чип | ЗИПИК | GSM1313421 |
| Чип | РНК PolII | GSM2259975 |
| Чип | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Чип | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Чип | H3K27ac | GSM2259987 |
| Чип | MSL2 | GSM2469507 |
| Чип | H4K16ac | GSM2469508 |
| Чип | М1БП | GSM2706055 |
| Чип | ГАФ | GSM2860390 |
| Чип | Ввод | GSM1015412 |
| Hi-C | Ячейки S2R+ WT | ГСЭ136137 |
| Hi-C | Ячейки S2R+ 5pN-delta343 | ГСЭ136137 |
Таблица 1: Номера присоединения к ГЭП.
| Статистика HiC-Pro | Читает | Процент |
| Картографическая статистика | ||
| Полностью прочитанные выравнивания | 131515921 | 82.20% |
| Обрезанные выравнивания чтения | 16408309 | 10.30% |
| Не удалось выровнять | 12110964 | 7.60% |
| Статистика сопряжений | ||
| Уникально выровненный | 79428455 | 50.90% |
| Одиночка | 19063418 | 12.20% |
| Многоуровненный | 57700021 | 36.90% |
| Статистика фильтрации | ||
| Допустимые пары | 71373989 | 90.12% |
| Тот же фрагмент: Самокруг | 2340697 | 2.90% |
| Один и тот же фрагмент: Свисающие концы | 2578783 | 3.20% |
| Отфильтрованные пары | 2773043 | 3.50% |
| Сброшенные пары | 196565 | 0.20% |
| Статистика контактов | ||
| Уникальный: цис ≤ 20 кбит/с | 33108815 | 46.50% |
| Уникальный: цис > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Уникальный: транс | 4133602 | 5.80% |
| Дублирование пар чтения | 398400 | 0.60% |
Таблица 2: Статистика HiC-Pro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь метод Hi-C в ядре позволил детально исследовать топологию генома дрозофилы с высоким разрешением, обеспечивая представление о геномных взаимодействиях в различных геномных масштабах, от хроматиновых петель между регуляторными элементами, такими как промоторы и энхансеры, до TAD и идентификации большого компартмента25. Эта же технология была также эффективно применена к тканям млекопитающих с некоторыми модификациями33. Например, при обработке ткани вместо одноклеточной суспензии ткань просеивается через фильтр 70 мкм, а этап лизиса выполняют при гомогенизации материала с использованием гомогенизатора Доунс. Кроме того, поскольку геном млекопитающего в 25 раз больше, чем геном дрозофилы, количество действительных пар чтения, необходимых для построения матриц с разрешением 1-5 кб, больше. Метод Hi-C в ядре отличается от оригинального методаHi-C 2 тем, что он избегает ядерного лизиса с 1% SDS при 65 °C до лигирования, тем самым сохраняя ядерную целостность, и путем лигирования в 1 мл вместо 7 мл23,24.
Протокол имеет несколько ключевых шагов для обеспечения высокой эффективности. Первым шагом, который может привести к перевариванию и неэффективности заполнения, является образование комков во время пермеабилизации SDS 0,3% и обработки поверхностно-активными веществами. Если скопления большие и их трудно разрушить, скорость вращения должна быть уменьшена до 400 об/мин во время обработки SDS и поверхностно-активным веществом. Если сгустки по-прежнему трудно дезагрегировать путем пипетирования, образец следует разделить на две части путем регулировки объемов с буфером ограничения, SDS и неионным поверхностно-активным веществом, прежде чем приступать к пермеабилизации. Затем ядра должны быть центрифугированы с минимальной скоростью (200 × g),супернатант тщательно отброшен, а образцы объединены в 450 мкл 1x рестракционный буфер, прежде чем приступить к пищеварению. Во-вторых, оценка эффективности пищеварения важна для обеспечения достаточного количества фрагментов ДНК для заполнения и перевязки. Если при качественной оценке пищеварение обнаруживается неэффективным, следует провести второй раунд пищеварения с ферментом рестрикции в течение периода от 4 ч до ночи.
В-третьих, важна оценка эффективности лигирования. Если при качественной оценке лигирование признано неэффективным (т.е. вместо высокомолекулярной полосы наблюдается мазок, аналогичный тому, который наблюдается для перевариваемого образца), лигирование следует повторить путем центрифугирования ядер на 200 × г и повторного использования их в лигационной смеси с использованием свежего 10-кратного лигационного буфера и лигазы. В-четвертых, процент действительных продуктов Hi-C следует оценивать путем переваривания ампликона ПЦР ожидаемого взаимодействия с Cla I (для оригинального пищеварения Mbo I). Эффективное усиление и переваривание ампликона ожидаемого взаимодействия подтверждает успешное лигирование и образование Hi-C переходов. Если пищеварение ампликона неэффективно, большинство молекул будет 3C вместо продуктов Hi-C, и это следует учитывать, если библиотека будет секвенирована. Это также может быть подтверждено путем выполнения окончательного контроля пищеварения Cla I, как описано в разделе репрезентативных результатов. Наконец, выбор меньшего числа циклов ПЦР важен для предотвращения дублирования ПЦР. Если при секвенировании процент дубликатов считываемой пары окажется высоким, количество циклов ПЦР следует еще больше уменьшить.
Эта техника Hi-C в ядре имеет некоторые ограничения. Во-первых, протокол, описанный здесь, представляет собой эксперимент Hi-C, выполненный для клеточной популяции. Поэтому сигнал частоты геномных контактов представляет собой миллионы геномов с переменными индивидуальными конформациями. Для получения набора геномных контактов из одного генома рекомендуется одноклеточный эксперимент Hi-C22. Во-вторых, Hi-C основан на лигирование проксимальных фрагментов ДНК. Таким образом, если геномные области являются частью большого белково-хроматинового комплекса, расстояние между фрагментами может препятствовать лигации. Например, было показано, что транс-контакты слабо представлены в Hi-C38. Кроме того, Hi-C завершается парным секвенированием, таким образом, извлекая пары геномных контактов. Однако несколько фрагментов ДНК могут одновременно взаимодействовать в одном и том же комплексе хроматина. Для получения идентичности множественных фрагментов ДНК в хроматиновом комплексе могут быть применены альтернативные методы секвенирования к Hi-C39,или могут быть использованы различные экспериментальные стратегии, в которых лигирование не выполняется38,40,41. Наконец, хотя Hi-C измеряет геномные контакты, он не раскрывает идентичность белков, опосредовывающих взаимодействия. Альтернативные методы должны быть применены для идентификации геномных взаимодействий, опосредованных конкретным интересуемым белком42 или тождества ансамбля белков у конкретных геномных элементов43.
В заключение, при высококачественном эксперименте Hi-C, как описано здесь для генома дрозофилы(таблица 2),матрицы могут быть построены в широком диапазоне разрешений (от 1, 5 кб, 50 кб или ниже; см. Рисунок 4). Кроме того, если конкретная область генома должна быть оценена на уровне фрагмента ограничения, данные могут быть использованы для построения виртуального ландшафта 4C желаемой точки зрения (например, ген Notch 5' UTR на рисунке 4E). Инструмент Hi-C с другими концами в SeqMonk является очень удобным вариантом, который позволяет визуализировать этот ландшафт. Применение инструмента количественной оценки 4C, также являющегося частью SeqMonk, к этому ландшафту может привести к статистически значимым контактам.
Применение эксперимента в ядре Hi-C, описанного здесь, к коллекции мутантных клеточных линий с измененными сайтами связывания ДНК AP на границах TAD(рисунок 4)показало, что генетические элементы необходимы на границах для структурирования генома дрозофилы в доменах и поддержания регуляции экспрессии генов, как полностью обсуждалось Arzate-Mejía et al.25. Таким образом, генетическое редактирование регуляторных элементов с помощью системы CRISPR/Cas9 в сочетании с профилированием геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием описанного здесь протокола Hi-C в ядре может стать мощной стратегией проверки структурной функции генетических элементов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Программы технологических инноваций и поддержки исследований UNAM (PAPIIT) IN207319 и грантом Национального совета по науке и технике (CONACyT-FORDECyT) номер 303068. А.Е.-Л. является студентом магистратуры при поддержке Национального совета по науке и технике (CONACyT) CVU No 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
