Summary
El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.
Abstract
El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.
Introduction
En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan la organización cromosómica3,4,5. En los mamíferos, los límites tad están ocupados por la cohesina y el factor de unión a CCCTC (CTCF)6,7,8. El complejo de cohesina extruye la cromatina y se detiene en los sitios de unión a CTCF que se disponen en una orientación convergente en la secuencia genómica para formar bucles de cromatina estables9,10,13,14. La alteración genética del sitio de unión al ADN de CTCF en los límites o la reducción de la abundancia de CTCF y proteína de cohesina da como resultado interacciones anormales entre los elementos reguladores, la pérdida de la formación de TAD y la desregulación de la expresión génica9,10,11,13,14.
En Drosophila, los límites entre los TADs están ocupados por varios AP, incluyendo el factor asociado al elemento límite 32 kDa (BEAF-32), la proteína de unión al Motivo 1 (M1BP), la proteína centrosómica 190 (CP190), el supresor del ala peluda (SuHW) y el CTCF, y están enriquecidos en modificaciones activas de histonas y polimerasa II16,17,18. Se ha sugerido que en Drosophila, los TADs aparecen como consecuencia de la transcripción13, 17,19,y el papel exacto de los AP independientes en la formación de límites y las propiedades de aislamiento aún está bajo investigación. Por lo tanto, queda por caracterizar completamente si los dominios en Drosophila son una consecuencia exclusiva de la agregación de regiones de estados transcripcionales similares o si los AP, incluido el CTCF, contribuyen a la formación de límites. La exploración de contactos genómicos a alta resolución ha sido posible a través del desarrollo de tecnologías de captura de conformación cromosómica junto con la secuenciación de próxima generación. El protocolo Hi-C se describió por primera vez con la etapa de ligadura realizada "en solución"2 en un intento de evitar productos de ligadura espurios entre fragmentos de cromatina. Sin embargo, varios estudios apuntaron a la comprensión de que la señal útil en los datos provenía de productos de ligadura formados en núcleos parcialmente lisados que no estaban en la solución20,21.
El protocolo se modificó para realizar la ligadura dentro del núcleo como parte del experimento Hi-C unicelular22. El protocolo Hi-C en el núcleo se incorporó posteriormente a la población celular Hi-C para producir una cobertura más consistente en todo el rango de distancias genómicas y producir datos con menos ruido técnico23,24. El protocolo, descrito en detalle aquí, se basa en el protocolo Hi-C de la población en el núcleo23,24 y se utilizó para investigar las consecuencias de eliminar genéticamente los motivos de unión al ADN para CTCF y M1BP de un límite de dominio en el locus del gen Notch en Drosophila25. Los resultados muestran que la alteración de los motivos de unión al ADN para los AP en el límite tiene consecuencias drásticas para la formación del dominio Notch, defectos topológicos más grandes en las regiones que rodean el locus Notch y la desregulación de la expresión génica. Esto indica que los elementos genéticos en los límites del dominio son importantes para el mantenimiento de la topología del genoma y la expresión génica en Drosophila25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fijación
- Comience con 10 millones de células de la línea 2 plus (S2R+) de Schneider para preparar 17,5 ml de suspensión celular en medio Schneider que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente (RT).
- Añadir formaldehído libre de metanol para obtener una concentración final del 2%. Mezclar e incubar durante 10 min en RT, teniendo cuidado de mezclar cada minuto.
NOTA: El formaldehído es un producto químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas, y trabaje en la campana de humos. - Apaga la reacción añadiendo glicina para conseguir una concentración final de 0,125 M y mezclar. Incubar durante 5 min en RT, seguido de 15 min en hielo.
- Centrifugadora durante 400 × g a RT durante 5 min y luego durante 10 min a 4 °C; deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet cuidadosamente en 25 ml de solución salina fría tamponada con fosfato 1x.
- Centrifugar a 400 × g durante 10 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante.
NOTA: Si continúa con el protocolo, vaya al paso 2.1 para la lisis; de lo contrario, congele el pellet en líquido N2 y guárdelo a -80 °C.
2. Lisis
- Resuspend las células en 1 mL de tampón de lisis helado-frío (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% de surfactante no iónico (ver la Tabla de Materiales);10 mM NaCl; 1x inhibidores de la proteasa), y ajustar el volumen a 10 mL con tampón de lisis helado. Ajustar el volumen para obtener una concentración de 1 × 106 células/ml. Incubar en hielo durante 30 min, mezclando cada 2 min invirtiendo los tubos.
- Centrifugar los núcleos a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y luego desechar cuidadosamente el sobrenadante. Lave el pellet 1x con 1 ml de tampón de lisis en frío y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Lave el pellet 1x con 1 mL de tampón de restricción frío de 1.25x, y vuelva a gastar cada pellet de célula en 360 μL de tampón de restricción de 1.25x.
- Añadir 11 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% por tubo (concentración final del 0,3%), mezclar cuidadosamente mediante pipeteo e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 700-950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir los grumos varias veces durante la incubación.
- Snchs el SDS añadiendo 75 μL de surfactante no iónico (solución al 10%, véase la Tabla de Materiales)por tubo (concentración final del 1,6%) e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para interrumpir los grupos durante la incubación.
NOTA: Si los grupos son grandes y difíciles de interrumpir, disminuya la velocidad de rotación a 400 rpm durante los tratamientos con SDS y surfactante. Si los grupos son difíciles de desagregar mediante pipeteo, divida la muestra en dos; ajustar los volúmenes de tampón de restricción, SDS y surfactante; y proceder a la permeabilización. A continuación, gire los núcleos a una velocidad mínima (200 × g),deseche cuidadosamente el sobrenadante, aglutina las muestras en un tampón de restricción 1X y proceda con la digestión. Tome una alícuota de 10 μL como muestra no digerída (UD).
3. Digestión enzimática
- Digiera la cromatina añadiendo 200 unidades (U) de Mbo I por tubo, e incube a 37 °C durante un período que va desde 4 h hasta durante la noche mientras gira (950 rpm).
- Al día siguiente, agregue 50 U adicionales de Mbo I por tubo e incube a 37 ° C durante 2 h mientras gira (950 rpm).
- Inactivar la enzima incubando los tubos a 60 °C durante 20 min. Coloque los tubos sobre hielo.
NOTA: Tome una alícuota de 10 μL como muestra digerida (D).
4. Biotinilación de los extremos del ADN
- Para rellenar los voladizos de fragmentos de restricción y etiquetar los extremos de ADN con biotina, agregue 1.5 μL cada uno de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0.4 mM de biotina dATP, 17.5 μL de tampón Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0] y 10 μL de 5 U / μL de Klenow (fragmento grande de ADN polimerasa I) a todos los tubos. Mezclar cuidadosamente e incubar durante 75 min a 37 °C. Agitar a 700 rpm cada 10 s durante 30 s. Coloque todos los tubos sobre hielo mientras prepara la mezcla de ligadura.
5. Ligadura
- Transfiera cada mezcla de cromatina digerida a un tubo separado de 1 ml con mezcla de ligadura (100 μL de tampón de ligadura 10x, 10 μL de albúmina sérica bovina de 10 mg/ml, 15 U de ligasa de ADN T4 y 425 μL de agua de doble destilación [ddH2O]). Mezclar bien mediante pipeteo suave e incubar durante la noche a 16 °C.
6. Reversión de reticulación y purificación de ADN
- Degradar las proteínas añadiendo 50 μL de 10 mg/ml de proteinasa K por tubo, e incubar a 37 °C durante 2 h. Reticula los enlaces cruzados aumentando la temperatura a 65 °C e incuba durante la noche.
- Degradar el ARN añadiendo 20 μL de 10 mg/ml de RNasa A, e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Realizar extracción de fenol:cloroformo seguida de precipitación de etanol.
- Añadir 1 volumen de fenol-cloroformo, y mezclar bien por inversión para obtener una fase blanca homogénea.
NOTA: El fenol es un químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas. Trabajar en la campana de humos. - Centrifugadora a 15.000 × g durante 15 min. Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco de 2 ml. Realice una extracción posterior de la capa inferior con 100 μL de tampón TLE y transfiera la fase acuosa al mismo tubo de 2 ml.
- Precipitar el ADN añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico al 100% (EtOH), 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 μL de glucógeno de 20 mg/ml. Incubar a -20 °C durante un período que va desde 2 h hasta la noche.
- Girar a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C, y lavar los pellets 2x con 70% etOH helado. Seque los gránulos en RT y vuelva a sususpend en 100 μL de tampón TLE. Cuantificar el ADN utilizando un colorante fluorogénico que se une selectivamente al ADN y un fluorómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los productos de ligadura a 4 °C a corto plazo o a -20 °C a largo plazo. Utilice una alícuota (100 ng) del material como muestra ligada (L) para el control de calidad.
- Añadir 1 volumen de fenol-cloroformo, y mezclar bien por inversión para obtener una fase blanca homogénea.
7. Evalúe la calidad de la plantilla Hi-C
- Controles cualitativos de digestión y ligadura
- Purificar el ADN de las alícuotas UD y D invirtiendo los enlaces cruzados, y realizar la extracción de fenol:cloroformo y precipitación de etanol como se describió anteriormente.
- Cargue 100 ng de muestras de UD, D y L en un gel de agarosa al 1,5%. Busque un frotis centrado alrededor de 500 pb en la muestra D frente a una banda de alto peso molecular para la muestra L (ver resultados representativos).
- Control cuantitativo de la eficiencia de la digestión
NOTA: Para evaluar la eficiencia de la digestión con mayor precisión, utilice las muestras UD y D como plantillas para realizar reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) utilizando cebadores diseñados de la siguiente manera.- Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN que contenga el sitio de restricción de ADN para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I en el presente protocolo), llamado R en la fórmula del paso 7.2.3.
- Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN de control que no contenga el sitio de restricción para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I para el presente protocolo), llamado C en la fórmula del paso 7.2.3.
- Utilice los valores umbral de ciclo (valores ct) de la amplificación para calcular la eficiencia de restricción de acuerdo con la fórmula que se muestra a continuación:
% restricción = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
Donde CtR se refiere al valor Ct del fragmento R, y CtC se refiere al valor Ct del fragmento C para la muestra D y la muestra UD.
NOTA: El porcentaje de restricción refleja la eficiencia de la enzima de restricción que escinde el fragmento de ADN restringido (R) en comparación con un fragmento de ADN de control (C) que no contiene el sitio de ADN de restricción. Se recomienda una eficiencia de restricción de ≥ 80%.
- Detección de interacciones conocidas
- Realizar PCR para amplificar un control de ligadura interna para examinar interacciones de corto y/o medio o largo alcance (ver resultados representativos).
- Alternativamente, diseñe cebadores para amplificar un producto de ligadura en el que los cebadores estén en orientación hacia adelante-adelante o hacia atrás-hacia atrás en fragmentos de restricción adyacentes.
- Control de relleno y etiquetado de biotina
- Verificar el marcado Hi-C y la eficiencia de la ligadura mediante la amplificación y digestión de una interacción conocida o un producto de ligadura entre fragmentos de restricción adyacentes en el genoma, como se describió anteriormente.
NOTA: El relleno y la ligadura exitosos del sitio Mbo I (GATC) generan un nuevo sitio para la enzima de restricción Cla I (ATCGAT) en la unión de ligadura y regeneran el sitio Mbo I. - Digiera el producto de PCR con Mbo I, Cla I o ambos. Después de ejecutar las muestras en un gel al 1,5-2%, estimar el número relativo de uniones de ligadura 3C y Hi-C cuantificando la intensidad de las bandas cortadas y sin cortar26.
NOTA: Se desea una eficiencia de > 70% (ver resultados representativos).
- Verificar el marcado Hi-C y la eficiencia de la ligadura mediante la amplificación y digestión de una interacción conocida o un producto de ligadura entre fragmentos de restricción adyacentes en el genoma, como se describió anteriormente.
8. Sonicación
- Sonicar las muestras para obtener fragmentos de ADN de 200-500 pb. Para el instrumento utilizado en este protocolo (véase la Tabla de materiales),diluya la muestra (de 5 a 10 μg) en 130 μL de ddH2O por tubo, y ajuste el instrumento a sonicar a 400 pb: nivel de llenado: 10; factor de derecho: 10%; potencia máxima incidente (w): 140; ciclos por ráfaga: 200; tiempo(s): 80.
9. Eliminación de biotina / reparación final
NOTA: Los pasos que se muestran a continuación se ajustan para 5 μg de ADN Hi-C.
- Para realizar la eliminación de biotina, transfiera la muestra (130 μL) a un tubo de microcentrífuga fresco. Añadir 16 μL de tampón de ligadura 10x, 2 μL de dATP de 10 mM, 5 μL de ADN polimerasa T4 (15U) y 7 μL de ddH2O (160 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.
- Añadir 5 μL de 10 mM dNTP, 4 μL de tampón de ligadura 10x, 5 μL de polinucleótido quinasa T4 (10 U/μL), 1 μL de Klenow y 25 μL de ddH2O (200 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.
10. Selección de tamaño
- Para seleccionar fragmentos principalmente en el rango de tamaño de 250-550 pb, realice primero la selección secuencial de tamaño de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) con 0.6x, seguida de 0.90x de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y eluye el ADN usando 100 μL de TLE.
11. Ligadura de biotina pulldown/A-tailing/adapter
NOTA: Realice los lavados resuspensando las perlas magnéticas mediante vórtice, gire las muestras durante 3 minutos en una rueda giratoria y luego gire brevemente hacia abajo la muestra y colóquela en el soporte magnético. Deje que las cuentas se peguen al imán, deseche el sobrenadante y continúe con el siguiente paso de lavado. Realice los lavados a 55 °C en un termobloque con rotación en lugar de la rueda giratoria.
- Ensanar el volumen final a 300 μL por muestra con TLE para pull-down. Prepare los tampones de lavado de cuentas: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- Utilice 150 μL de perlas magnéticas ligadas a la estreptavidina (consulte la Tabla de materiales)por biblioteca. Lavar las perlas 2x con 400 μL de 1x TB. Luego resuspenda las perlas en 300 μL 2x NTB.
- Mezcle las perlas con el material Hi-C de 300 μL e incube en RT durante 30 minutos en una rueda giratoria para permitir que la biotina se una a las perlas de estreptavidina.
- Lavar las perlas con 400 μL de 0,5x TB, e incubar a 55 °C durante 3 min, girando a 750 rpm. Lave las perlas en 200 μL de tampón de restricción 1x.
- Resuspend las perlas en 100 μL de mezcla de relaves dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampón de restricción 10x, 5 μL de klenow exo-, y 80 μL de ddH2O). Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Retire el sobrenadante, lave las perlas 2x con 400 μL de 0,5x TB incubando a 55 °C durante 3 min y girando a 750 rpm.
- Lavar las perlas con 400 μL de 1x NTB y luego con 100 μL de 1x tampón de ligadura.
- Resuspend las perlas en 50 μL de tampón de ligadura 1x, y transfiera la suspensión a un nuevo tubo. Añadir 4 μL de adaptadores de PE precocidos (15 μM de stock) y 2 μL de ligasa T4 (400 U/μL, es decir, 800 U/tubo); incubar en RT durante 2 h.
NOTA: Pre-anneal los adaptadores añadiendo volúmenes iguales de adaptadores PE 1.0 y PE 2.0 (stock de 30 μM) e incubando durante 10 min en RT (ver la Tabla de Materiales). - Vuelva a capturar las perlas quitando el sobrenadante y lavando las perlas 2x con 400 μL de TB. Lave las perlas con 200 μL de 1x NTB, luego con 100 μL de tampón de restricción 1x, y resuspenda las perlas en 40 μL de 1x buffer de restricción.
12. Amplificación por PCR
- Configure PCR de 25 μL de volumen con 5, 6, 7 y 8 ciclos. Para cada PCR, utilice:
Receta de reacción Cuentas Hi-C 2,5 μL Imprimación PCR PE 10 μM 1 (Tabla de materiales) 0,75 μL Imprimación PCR PE 10 μM 2 (Tabla de materiales) 0,75 μL 10 mM dNTP 0,6 μL Búfer de reacción 5x 5 μL ADN polimerasa 0,3 μL ddH2O 14,65 μL Total 25 μL Ciclos Temperatura Hora 1 98 °C 30 s n ciclos 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7 minutos
13. Amplificación final por PCR
- Realizar la amplificación final por PCR utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente y el número de ciclos seleccionados. Divida la muestra usando 5 μL de perlas Hi-C como plantilla en reacciones de 50 μL.
- Recoja todas las reacciones de PCR y transfiéralas a un tubo nuevo. Use el imán para eliminar las perlas de estreptavidina y recuperar el sobrenadante (productos de PCR). Transfiera las perlas a un tubo nuevo, lave las perlas como se indica en el paso 11.2.9 y guárdelas en un búfer de restricción 1x a 4 °C como respaldo.
- Purifique los productos de PCR utilizando 0,85 veces el volumen de las perlas SPRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elute con 30 μL de tampón TLE.
- Cuantificar la biblioteca Hi-C utilizando un instrumento fluorométrico y confirmar la calidad de la biblioteca mediante electroforesis capilar basada en chip.
- Como último punto de control de calidad, utilice 1 μL de la biblioteca Hi-C como plantilla para realizar una reacción de PCR utilizando 10 ciclos utilizando las mismas condiciones descritas en el paso 12.1. Divida el producto de PCR en dos tubos de microcentrífuga: digiera uno con Cla I y deje el otro sin digerir como control. Ejecute los productos en un gel de agarosa al 1.5-2% (ver resultados representativos).
- Proceda a la secuenciación de extremo pareado de 50 pb o 75 pb en una plataforma de secuenciación adecuada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A continuación se describen los resultados de un protocolo Hi-C exitoso (consulte un resumen del flujo de trabajo del protocolo Hi-C en la Figura 1A). Hay varios puntos de control de calidad durante el experimento Hi-C en el núcleo. Las alícuotas de muestra se recogieron antes (UD) y después (D) del paso de restricción de cromatina, así como después de la ligadura (L). Los enlaces cruzados se invirtieron, y el ADN se purificó y se ejecutó en un gel de agarosa. Se observó un frotis de 200-1000 pb cuando la restricción con Mbo I fue exitosa (Figura 1B). El tamaño esperado de la molécula depende de la enzima de restricción de elección. Si la ligadura fue exitosa, se observó una banda de alto peso molecular en la parte superior del gel(Figura 1B). La eficiencia de la digestión también puede ser confirmada por qPCR como se describe en detalle en el protocolo. Una eficiencia de digestión aceptable es del 80% o superior(Figura 1C).
Para evaluar la eficiencia de la ligadura Hi-C en detalle, los cebadores se pueden diseñar para amplificar un control interno del producto de ligadura en el que los cebadores están en orientación hacia adelante o hacia atrás-hacia atrás en fragmentos de restricción adyacentes. Alternativamente, los cebadores se pueden diseñar para amplificar las interacciones conocidas. La Figura 2A muestra la amplificación de una interacción conocida de rango medio (300 kb) en Drosophila25. Los productos de ligadura Hi-C (en los que el marcado, el relleno y la ligadura de biotina ocurrieron con éxito) se pueden estimar mediante la digestión del producto de PCR recuperado en la amplificación. Después del relleno y la ligadura, los amplicones Hi-C contendrán un nuevo sitio de restricción Cla I en el sitio original de Mbo I, que se conserva tras la ligadura de extremo romo. Si la restricción con Cla I no es completa, la reacción de relleno y el marcado de biotina serán ineficientes. Se recomienda una eficiencia de digestión de más del 70% para evitar tener una gran proporción de lecturas no útiles para las bibliotecas después de la secuenciación(Figura 2A,compare la digestión Cla I de la 3C versus la plantilla Hi-C).
Para determinar un número adecuado de ciclos de amplificación de PCR para amplificar la biblioteca final de Hi-C, se configuraron reacciones de PCR utilizando 2,5 μL de una biblioteca dada en cuentas, como se describe en el protocolo. El número de ciclos de PCR para la amplificación final es un ciclo menor que el número de ciclos para los que el frotis es visible (Figura 2B). En este caso, se eligieron 4 ciclos de amplificación por PCR. Como punto de control de calidad final, una alícuota de la biblioteca Hi-C fue reamplificada y digerida con Cla I. El nivel de digestión de la biblioteca (una disminución en el tamaño de la mancha) indica la abundancia de pares Hi-C válidos y refleja la proporción de lecturas útiles que se obtendrán de la biblioteca(Figura 2C). Una relación entre el rango de tamaño superior (determinado por el tamaño presente en la muestra de UD) y el rango de tamaño inferior en las muestras de UD y D debe producir una relación > 1 para la UD y una relación ≤ 1 para la muestra digerida si la digestión Cla I es eficiente.
Después de la secuenciación de extremo pareado, los archivos FASTQ(Tabla 1)se procesaron utilizando HiCPro28 y las estadísticas generadas se trazaron utilizando MultiQC28. Una herramienta alternativa a HiCPro es la tubería HiCUP30 que produce resultados similares (no se muestran). La Figura 3 y la Tabla 2 muestran la información estadística detallada de las lecturas secuenciadas. Se informa la alineación de lectura completa y la alineación después del recorte. Estas dos categorías corresponden a lecturas alineadas con éxito que se utilizarán en análisis posteriores para encontrar pares Hi-C válidos. La categoría alineación-después-recorte se refiere a lecturas que abarcan la unión de ligadura, que no se alinearon en el primer paso y se recortan en el sitio de ligadura para luego realinear su extremidad 5'al genoma28 (Figura 3B,C y Tabla 2). Las estadísticas de contacto muestran que la biblioteca Hi-C fue de alta calidad con un 82,2% de pares válidos y un 7,6% de lecturas no útiles que caen en las categorías de autocírculo del mismo fragmento, extremos colgantes del mismo fragmento, religación, pares filtrados y pares volcados(Figura 3A, Figura 3Dy Tabla 2). Además, el número de duplicados de PCR es muy bajo, lo que indica que la complejidad de la biblioteca es alta, y que los ciclos de PCR introdujeron artefactos mínimos(Figura 3E y Tabla 2).
Utilizando los pares Hi-C válidos únicos, se realizó un análisis básico de la distribución de pares utilizando HiCPro27. Este experimento produjo un 46,5% de contactos cis únicos ≤ 20 kbp, un 47,1% de contactos cis únicos > 20 kbp y un 5,8% de contactos trans únicos(Figura 3D). La distribución de pares cis a trans válidos correspondió a los resultados esperados para un experimento Hi-C exitoso con la mayoría de las interacciones detectadas dentro del mismo cromosoma. Una alta proporción de contactos trans indica una fijación ineficiente. Usando los pares válidos Hi-C de HiCPro27,las matrices se normalizaron mediante corrección iterativa y descomposición de vector propio (ICE)30,y se generaron matrices de resolución de 1 kb y 5 kb utilizando HiCPlotter30,31,32. Se presentan matrices de contacto normalizadas a una resolución de 1 kb y 5 kb para el locus del gen Notch en Drosophila(Figura 4A, Figura 4Cy Figura 4D). En la Figura 4A,el locus del gen Notch se puede ver junto con los AP, dominio l y II, así como modificaciones de histonas a lo largo del locus(Figura 4A y Tabla 1). El diseño de la deleción CRISPR-Cas9 involucró el motivo de CTCF y M1BP(Figura 4B).
Tras la eliminación de la región que contiene los sitios de unión al ADN CTCF y M1BP en el límite de 5' del locus Notch (5pN-delta343, Tabla 1),se puede observar un cambio dramático en los contactos de cromatina con pérdida de interacciones dentro del locus Notch y ganancia de contactos con el TAD aguas arriba en comparación con el tipo salvaje (WT)(Figura 4C,D). Finalmente, la Figura 4E muestra un panorama detallado de wt y perfiles de interacción mutante a nivel de fragmento de restricción del gen Notch 5' UTR, mostrando una disminución en la proporción de contactos realizados con el locus del gen Notch y un aumento en los contactos con el dominio aguas arriba. Las vistas virtuales 4C del gen Notch 5' UTR se obtuvieron utilizando HiC-Pro27. Una herramienta alternativa es la cuantificación de otros extremos Hi-C disponible en SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/. Todos los resultados presentados en la Figura 4 se obtuvieron aplicando el protocolo Hi-C in-nucleus en células WT y mutantes S2R+ Drosophila, según lo descrito por Arzate-Mejía et al.25.
Figura 1: Controles de digestión y ligadura Hi-C en el núcleo. (A) Descripción general del protocolo Hi-C. Las células se entrecruzan con el formaldehído, lo que resulta en enlaces covalentes entre los segmentos de cromatina (fragmentos de ADN: rosa, púrpura) y las proteínas. La cromatina se digiere con una enzima de restricción (representada por tijeras), en este ejemplo, Mbo I. Los extremos pegajosos resultantes se rellenan con nucleótidos, incluyendo un dATP biotinilado (círculos azul oscuro). El ADN se purifica y las uniones biotiniladas se enriquecen utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (círculos grises). Los fragmentos que interactúan se identifican mediante secuenciación de extremo pareado de próxima generación. (B) Controles de calidad de digestión y ligadura Hi-C para dos réplicas biológicas (Hi-C 1 y Hi-C 2). Las bibliotecas de Hi-C se resolvieron en un gel de agarosa al 1,5%. Ambas bibliotecas digeridas, D, funcionan como un frotis alrededor de 600 pb. Las muestras ligadas, Lig, funcionan como una banda bastante apretada de más de 10 kb similar a las muestras de UD no digeridos. Las diferencias en la intensidad de la señal se deben a cantidades desiguales de ADN cargado en el gel. (C) Control cuantitativo de la digestión Hi-C mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para las mismas dos réplicas biológicas que en (B) (Hi-C 1 y Hi-C 2) utilizando los valores umbral de ciclo detallados en el protocolo. Una digestión exitosa tiene ≥ restricción del 80%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Controles de relleno y ligadura de extremo romo Hi-C en el núcleo. (A) Evaluación del relleno y etiquetado de biotina. Se utilizó como control una interacción conocida entre fragmentos situados a 300 kb de distancia en el cromosoma X y se amplificó utilizando los cebadores indicados con flechas negras (ver parte superior del esquema en (B), imprimación 1 (izquierda), imprimación 2 (derecha), Tabla 1), generando un amplicón de 347 pb. Los productos de ligadura Hi-C se pueden distinguir de los producidos en un experimento 3C por la digestión del sitio de ligadura. Las uniones Hi-C fueron digeridas por Cla I en el sitio original de Mbo I, ya que se formó tras la ligadura de extremo romo. Las uniones Hi-C y 3C se digirieron con Mbo I a medida que el sitio de restricción se regenera tras la ligadura (izquierda del gel). En contraste, las uniones 3C no fueron digeridas por Cla I en el sitio de Mbo I, sino solo por Mbo I. Compare el perfil de digestión de los productos Hi-C y 3C usando Cla I. Se obtuvo un fragmento de 53 pb digiriendo el producto Hi-C (debido a la restricción del sitio Cla I formado en el sitio Mbo I y la restricción de un sitio Cla I ya presente en la región). Este fragmento no se observó en la digestión del producto 3C ya que el único sitio Cla I disponible era el que ya estaba presente en la región. (B) Después de la amplificación por PCR de la biblioteca Hi-C utilizando diferentes ciclos de PCR, los productos se ejecutaron en un gel de agarosa al 1,5%. Se esperaba y observó un frotis de 400-1000 pb. Los ciclos numéricos apropiados para la PCR de amplificación final deben tomarse como el número inmediatamente inferior a aquel en el que un frotis es simplemente visible. (C) Biblioteca final Cla I digestión. Una alícuota de la biblioteca final fue re-amplificada y digerida con Cla I. La reducción del tamaño del frotis confirmó que una gran proporción de las moléculas en la biblioteca eran pares Hi-C válidos. El análisis densitométrico de este gel se puede realizar para obtener una relación entre las muestras UN y D, como se detalla en la sección de resultados representativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estadísticas HiC-Pro de la biblioteca Hi-C. (A) Representación esquemática de pares Hi-C válidos y los diferentes tipos de pares no válidos que pueden ser producidos durante el experimento y filtrados por HiCPro27 (Tabla 2). Estos incluyen lecturas que caen en secuencias contiguas, extremos colgantes, mismo fragmento, autocírculo, religaciones y duplicados de PCR. (B) Estadísticas cartográficas. Las lecturas que no se alinearon se muestran (gris), y tanto las lecturas completamente alineadas como las lecturas alineadas después del recorte se muestran en azul y azul claro, respectivamente. Estas dos categorías representan las lecturas útiles que se consideran en análisis posteriores. (C) Estadísticas de emparejamiento. Las lecturas multialineadas (naranja oscuro) representan lecturas que están alineadas en múltiples regiones del genoma. Las lecturas alineadas de forma única (azul oscuro) representan los pares de lectura que se alinean una vez en el genoma, y las singletons (naranja claro) representan pares de lectura en los que solo se secuentó una región genómica en ambas lecturas. (D) Estadísticas de filtrado. Los pares de lectura válidos (azul) representan productos de ligadura Hi-C exitosos como se describe en (A). Los auto-círculos de auto-fragmentos (rosa claro) son lecturas no útiles ya que representan el mismo fragmento genómico que se muestra en (A). Los extremos colgantes del mismo fragmento (naranja) representan lecturas en las que se secuentó un solo fragmento de restricción. Los pares filtrados y volcados (marrón) también son lecturas no útiles que tienen el tamaño incorrecto o para las cuales no se pudo reconstruir el producto de ligadura. Finalmente, las lecturas de re-ligadura (rojo) representan lecturas en las que dos fragmentos adyacentes fueron re-ligados, produciendo así información no útil. (E) Distribución de contacto de pares de lectura válida en el genoma. Los contactos cis únicos (azul) son más frecuentes que los contactos trans únicos (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Matrices de contacto Hi-C y análisis virtual 4C de células WT y S2R+ mutantes. (A) Hi-C mapa de calor normalizado de una región de 50 kb a una resolución de 1 kb centrada en el locus del gen Notch. Se muestra la puntuación de separación TAD32 para el locus, junto con la partición del locus Notch en dos dominios topológicos (Dominio 1 y Dominio 2). Los datos de ChIP-seq para AP, ARN Pol II y marcas de histonas para las células S2 / S2R +34,35,36,37 se muestran debajo del mapa de calor(Tabla 1). Las posiciones de los límites del dominio Notch 1 se resaltan en verde claro. (B) Representación esquemática del límite B1 CRISPR mutante. El rectángulo verde indica la región de 343 pb eliminada. Las tijeras indican sgRNAs utilizados para la edición del genoma mediada por CRISPR. Los sitios de unión de motivos para AP se muestran como cuadros para CTCF y M1BP. Las cumbres máximas para los AP de unión al ADN que se muestran en (A) también se indican35. (C) Hi-C normalizó mapas de calor a una resolución de 1 kb que cubre una región de 50 kb centrada en Notch para el WT y las células mutantes. A la izquierda, mapas de calor Hi-C de las diferencias log2 en la frecuencia de interacción entre WT y células mutantes. (D) Mapas de calor normalizados Hi-C que cubren una región de 250 kb centrada en Notch a una resolución de 5 kb para WT y células mutantes. A la izquierda, mapas de calor Hi-C de las diferencias log2 en la frecuencia de interacción entre WT y células mutantes. (E) Virtual-4C para WT y células mutantes utilizando el UTR de 5' de Notch como punto de vista. Se muestran los porcentajes de interacciones entre el punto de vista y las regiones dentro del kirredomain-2aguas arriba, el dominio Notch 1, el dominio Notch 2 y el dominio dnc aguas abajo tanto para WT como para células mutantes25. Abreviaturas: WT = tipo salvaje; TAD = dominio topológicamente asociado; ChIP = inmunoprecipitación con cromatina; AP = proteína arquitectónica; ARN Pol = ARN polimerasa; S2R+ = receptor S2 más; SG ARN = ARN guía único; UTR = región no traducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento | Muestra | Número de acceso de GEO |
| Chip | CP190 | GSM1015404 |
| Chip | SuHW | GSM1015406 |
| Chip | Mod(mdg4) | GSM1015408 |
| Chip | CTCF | GSM1015410 |
| Chip | Ibf1 | GSM1133264 |
| Chip | Ibf2 | GSM1133265 |
| Chip | BEAF32 | GSM1278639 |
| Chip | Pita | GSM1313420 |
| Chip | ZIPIC | GSM1313421 |
| Chip | ARN PolII | GSM2259975 |
| Chip | H3K4me1 | GSM2259983 |
| Chip | H3K4me3 | GSM2259985 |
| Chip | H3K27ac | GSM2259987 |
| Chip | MSL2 | GSM2469507 |
| Chip | H4K16ac | GSM2469508 |
| Chip | M1BP | GSM2706055 |
| Chip | GAF | GSM2860390 |
| Chip | Entrada | GSM1015412 |
| Hi-C | Células S2R+ WT | GSE136137 |
| Hi-C | Celdas S2R+ 5pN-delta343 | GSE136137 |
Cuadro 1: Números de acceso GEO.
| Estadísticas de HiC-Pro | Lee | Porcentaje |
| Estadísticas de mapeo | ||
| Alineaciones de lectura completa | 131515921 | 82.20% |
| Alineaciones de lectura recortada | 16408309 | 10.30% |
| Error al alinear | 12110964 | 7.60% |
| Estadísticas de emparejamiento | ||
| Alineado de forma única | 79428455 | 50.90% |
| Singleton | 19063418 | 12.20% |
| Multi Alineado | 57700021 | 36.90% |
| Estadísticas de filtrado | ||
| Pares válidos | 71373989 | 90.12% |
| Same-Fragment: Autocírculo | 2340697 | 2.90% |
| Mismo fragmento: Extremos colgantes | 2578783 | 3.20% |
| Pares filtrados | 2773043 | 3.50% |
| Pares volcados | 196565 | 0.20% |
| Estadísticas de contacto | ||
| Único: cis ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| Único: cis > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| Único: trans | 4133602 | 5.80% |
| Duplicar pares de lectura | 398400 | 0.60% |
Tabla 2: Estadísticas de HiC-Pro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones33. Por ejemplo, al procesar un tejido en lugar de una suspensión unicelular, el tejido se tamiza a través de un filtro de 70 μm, y se realiza el paso de lisis mientras se homogeneiza el material utilizando un homogeneizador Dounce. Además, como el genoma de los mamíferos es 25 veces más grande que el genoma de Drosophila, el número de pares de lectura válidos necesarios para construir matrices de resolución de 1-5 kb es mayor. El método Hi-C en núcleo difiere del método Hi-C original2 en su evitación de la lisis nuclear con 1% SDS a 65 °C antes de la ligadura, preservando así la integridad nuclear, y ligando en 1 mL en lugar de 7 mL23,24.
El protocolo tiene algunos pasos clave para asegurar una alta eficiencia. El primer paso que puede introducir ineficiencias de digestión y relleno es la formación de grupos durante los tratamientos de permeabilización y surfactante de SDS al 0,3%. Si los grupos son grandes y difíciles de interrumpir, la velocidad de rotación debe reducirse a 400 rpm durante los tratamientos con SDS y surfactante. Si los grupos siguen siendo difíciles de desagregar por pipeteo, la muestra debe dividirse en dos ajustando los volúmenes con tampón de restricción, SDS y el surfactante no iónico antes de proceder con la permeabilización. A continuación, los núcleos deben centrifugarse a una velocidad mínima (200 × g),el sobrenadante cuidadosamente descartado y las muestras agrupadas en 450 μL de tampón de restricción 1x antes de proceder con la digestión. En segundo lugar, la estimación de la eficiencia de la digestión es importante para proporcionar suficientes fragmentos de ADN para el relleno y la ligadura. Si tras una evaluación cualitativa, se descubre que la digestión es ineficiente, se debe realizar una segunda ronda de digestión con la enzima de restricción durante un período que va desde 4 h hasta la noche.
En tercer lugar, la estimación de la eficiencia de la ligadura es importante. Si tras una evaluación cualitativa, se encuentra que la ligadura es ineficiente (es decir, en lugar de la banda de alto peso molecular, se observa un frotis similar al observado para la muestra digerida), la ligadura debe repetirse centrifugando los núcleos a 200 × g y resuspiéndolos en una mezcla de ligadura utilizando tampón de ligadura fresco 10x y ligasa. Cuarto, el porcentaje de productos válidos para Hi-C debe estimarse digiriendo un amplicón pcr de una interacción esperada con Cla I (para la digestión original de Mbo I). La amplificación eficiente y la digestión del amplicón de la interacción esperada confirma la ligadura y formación exitosas de las uniones Hi-C. Si la digestión del amplicón no es eficiente, la mayoría de las moléculas serán 3C en lugar de productos Hi-C, y esto debe tenerse en cuenta si se secuenciará la biblioteca. Esto también se puede confirmar realizando el control de digestión Cla I de la biblioteca final, como se describe en la sección de resultados representativos. Finalmente, la selección del menor número de ciclos de PCR es importante para evitar duplicados de PCR. Si al secuenciar, se encuentra que el porcentaje de duplicados de pares de lectura es alto, el número de ciclos de PCR debe disminuirse aún más.
Esta técnica Hi-C en el núcleo tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el protocolo descrito aquí representa el experimento Hi-C realizado para una población celular. Por lo tanto, la señal de la frecuencia de los contactos genómicos representa millones de genomas con conformaciones individuales variables. Para obtener el conjunto de contactos genómicos de un solo genoma, se recomienda un experimento Hi-Cunicelular 22. En segundo lugar, Hi-C se basa en la ligadura de fragmentos de ADN proximal. Por lo tanto, si las regiones genómicas son parte de un gran complejo proteína-cromatina, la distancia entre fragmentos podría impedir la ligadura. Por ejemplo, se ha demostrado que los contactos trans están mal representados en Hi-C38. Además, Hi-C termina con la secuenciación de extremo pareado, recuperando así pares de contactos genómicos. Sin embargo, varios fragmentos de ADN pueden interactuar simultáneamente en el mismo complejo de cromatina. Para obtener la identidad de múltiples fragmentos de ADN en un complejo de cromatina, se pueden aplicar métodos alternativos de secuenciación a Hi-C39,o se pueden emplear diferentes estrategias experimentales en las que no se realiza la ligadura38,40,41. Finalmente, aunque Hi-C mide los contactos genómicos, no revela la identidad de las proteínas que median las interacciones. Se deben aplicar métodos alternativos para identificar las interacciones genómicas mediadas por una proteína particular de interés42 o la identidad del conjunto de proteínas en elementos genómicos específicos43.
En conclusión, con un experimento Hi-C de alta calidad como el descrito aquí para el genoma de Drosophila(Tabla 2),se pueden construir matrices en una amplia gama de resoluciones (de 1, 5 kb, 50 kb o menos; ver Figura 4). Además, si una región particular del genoma tiene que ser evaluada a nivel de fragmento de restricción, los datos se pueden utilizar para construir un paisaje virtual 4C del punto de vista deseado (por ejemplo, el gen Notch 5' UTR en la Figura 4E). La herramienta hi-C de otros extremos en SeqMonk es una opción muy fácil de usar que permite la visualización de este paisaje. La aplicación de la herramienta de cuantificación 4C, también parte de SeqMonk, a este panorama puede producir contactos estadísticamente significativos.
La aplicación del experimento Hi-C en el núcleo descrito aquí a una colección de líneas celulares mutantes con sitios alterados de unión al ADN AP en los límites TAD(Figura 4)reveló que se necesitan elementos genéticos en los límites para estructurar el genoma de Drosophila en dominios y mantener la regulación de la expresión génica como lo discutió completamente Arzate-Mejía et al.25. Por lo tanto, la edición genética de elementos reguladores con el sistema CRISPR / Cas9, combinada con el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando el protocolo Hi-C en el núcleo descrito aquí, puede ser una estrategia poderosa para probar la función estructural de los elementos genéticos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
