Summary
Denne protokollen beskriver den trinnvise prosessen for å bygge både elektriske og magnetiske stimulatorer som brukes til å stimulere biologisk vev. Protokollen inkluderer en retningslinje for å simulere beregningsmessig elektriske og magnetiske felt og produksjon av stimulatorenheter.
Abstract
Elektriske felt (EFer) og magnetiske felt (MFs) har blitt mye brukt av vevsteknikk for å forbedre celledynamikken som spredning, migrasjon, differensiering, morfologi og molekylær syntese. Variabler som stimuli styrke og stimuleringstider må imidlertid vurderes ved stimulering av enten celler, vev eller stillaser. Gitt at EFer og MFs varierer i henhold til cellulær respons, er det fortsatt uklart hvordan man bygger enheter som genererer tilstrekkelig biofysiske stimuli for å stimulere biologiske prøver. Faktisk er det mangel på bevis angående beregning og distribusjon når biofysiske stimuli påføres. Denne protokollen er fokusert på design og produksjon av enheter for å generere EFer og MFs og implementering av en beregningsmetodikk for å forutsi biofysisk stimulifordeling i og utenfor biologiske prøver. EF-enheten bestod av to parallelle elektroder i rustfritt stål plassert øverst og nederst i biologiske kulturer. Elektroder ble koblet til en oscillator for å generere spenninger (50, 100, 150 og 200 Vp-p) ved 60 kHz. MF-enheten var sammensatt av en spole, som ble strømførende med en transformator for å generere en strøm (1 A) og spenning (6 V) ved 60 Hz. En polymetylmetakrylatstøtte ble bygget for å lokalisere de biologiske kulturene midt i spolen. Beregningssimuleringen belyste den homogene fordelingen av EFer og MFs i og utenfor biologisk vev. Denne beregningsmodellen er et lovende verktøy som kan endre parametere som spenninger, frekvenser, vevsmorfologier, brønnplatetyper, elektroder og spolestørrelse for å estimere EFs og MFs for å oppnå en cellulær respons.
Introduction
EFer og MFs har vist seg å endre celledynamikk, stimulere spredning og øke syntesen av de viktigste molekylene knyttet til den ekstracellulære matrisen av vev1. Disse biofysiske stimuliene kan brukes på forskjellige måter ved å bruke spesifikke innstillinger og enheter. Når det gjelder enhetene for å generere EFer, bruker direkte koblingstimulatorer elektroder som er i kontakt med biologiske prøver in vitro eller implantert direkte i vev av pasienter og dyr in vivo2; Det er imidlertid fortsatt begrensninger og mangler som inkluderer utilstrekkelig biokompatibilitet av elektrodene i kontakt, endringer i pH og molekylær oksygennivå1. Tvert imot genererer indirekte koblingsenheter EFer mellom to elektroder, som er plassert parallelt med biologiske prøver3, slik at en ikke-invasiv alternativ teknikk kan stimulere biologiske prøver og unngå direkte kontakt mellom vev og elektroder. Denne typen enhet kan ekstrapoleres til fremtidige kliniske applikasjoner for å utføre prosedyrer med minimal invasjon til pasienten. I forhold til enheter som genererer MFer, skaper induktive koblingstimulatorer en tidsvarierende elektrisk strøm, som strømmer gjennom en spole som ligger rundt cellekulturer4,5. Til slutt er det kombinerte enheter, som bruker EFer og statiske MFer til å generere forbigående elektromagnetiske felt1. Gitt at det er forskjellige konfigurasjoner for å stimulere biologiske prøver, er det nødvendig å vurdere variabler som spenning og frekvens når biofysiske stimuli påføres. Spenning er en viktig variabel, siden den påvirker oppførselen til biologisk vev; For eksempel har det vist seg at cellemigrasjon, orientering og genuttrykk avhenger av amplituden til anvendt spenning3,6,7,8,9,10. Frekvens spiller en viktig rolle i biofysisk stimulering, da det har blitt bevist at disse forekommer naturlig in vivo. Det har vist seg at høye og lave frekvenser har gunstige effekter på celler; spesielt i cellemembranspenningsporterte kalsiumkanaler eller endoplasmic retikulum, som utløser forskjellige signalveier på intracellulært nivå1,7,11.
I følge ovennevnte består en enhet for å generere EFer av en spenningsgenerator koblet til to parallelle kondensatorer12. Denne enheten ble implementert av Armstrong et al. for å stimulere både spredningshastigheten og den molekylære syntesen av kondrocytter13. En tilpasning av denne enheten ble utført av Brighton et al. som modifiserte cellekulturbrønnplater ved å bore topp- og bunnlokkene. Hullene ble fylt av dekselsklier, hvor bunnbrillene ble brukt til å dyrke biologisk vev. Elektroder ble plassert på hvert dekselsklie for å generere EFer14. Denne enheten ble brukt til å stimulere kondrocytter, osteoblaster og bruskplanter elektrisk, noe som viser en økning i celleproliferasjon14,15,16 og molekylær syntese3,17. Enheten designet av Hartig et al. besto av en bølgegenerator og en spenningsforsterker, som var koblet til parallelle kondensatorer. Elektroder ble laget av rustfritt stål av høy kvalitet plassert i et isolerende etui. Enheten ble brukt til å stimulere osteoblaster, som viser en betydelig økning i spredning og proteinsekresjon18. Enheten som brukes av Kim et al. besto av en bifasisk strømstimulatorbrikke, som ble bygget ved hjelp av en produksjonsprosess av komplementære halvledere av høyspent metalloksid. En kulturbrønnplate ble designet for å dyrke celler over en ledende overflate med elektrisk stimulering. Elektroder ble belagt i gull over silisiumplater19. Denne enheten ble brukt til å stimulere osteoblaster, som viser en økning i spredning og syntese av vaskulær endotel vekstfaktor19, og stimulerer produksjonen av alkalisk fosfataseaktivitet, kalsiumavsetning og benmorfogene proteiner20. På samme måte ble denne enheten brukt til å stimulere spredningshastigheten og uttrykket for vaskulær endotel vekstfaktor for menneskelig benmarg mesenchymale stamceller21. Enheten designet av Nakasuji et al. var sammensatt av en spenningsgenerator koblet til platinaplater. Elektroder ble bygget for å måle det elektriske potensialet på 24 forskjellige punkter. Denne enheten ble brukt til å stimulere kondrocytter, som viste at EFer ikke endret cellemorfologi og økt spredning og molekylær syntese22. Enheten som brukes av Au et al. besto av et glasskammer utstyrt med to karbonstenger koblet til en hjertestimulator med platinatråder. Denne stimulatoren ble brukt til å stimulere kardiomyocytter og fibroblaster, forbedre celleforlengelse og fibroblastjustering23.
Ulike MF-enheter er produsert basert på Helmholtz-spoler for å stimulere til flere typer biologiske prøver. For eksempel har Helmholtz-spoler blitt brukt til å stimulere spredning og molekylær syntese av kondrocytter24,25, forbedre proteoglykansyntese av leddbrusk explants26, forbedre gen upregulering relatert til beindannelse av osteoblastlignende celler27, og øke spredning og molekylær uttrykk for endotelceller28. Helmholtz-spoler genererer MFs gjennom to spoler som ligger den ene foran den andre. Spolene må plasseres med en avstand som er lik spolens radius for å sikre en homogen MF. Ulempen med å bruke Helmholtz-spoler ligger i spoledimensjonene, fordi de må være store nok til å generere den nødvendige MF-intensiteten. I tillegg må avstanden mellom spoler være tilstrekkelig for å sikre en homogen fordeling av MFs rundt biologisk vev. For å unngå problemer forårsaket av Helmholtz-spoler, har forskjellige studier vært fokusert på solenoidspoler produksjon. Solenoidspoler er basert på et rør, som er såret med kobbertråd for å generere MFs. Kobbertrådinnganger kan kobles direkte til stikkontakten eller en strømforsyning for å energisere spolen og lage MFs i midten av spolen. Jo flere svinger spolen har, jo større genereres MF. MF-størrelsen avhenger også av spenningen og strømmen som påføres for å energisere spolen29. Solenoidspoler har blitt brukt til å stimulere magnetisk forskjellige typer celler som HeLa, HEK293 og MCF730 eller mesenchymale stamceller31.
Enheter som brukes av forskjellige forfattere har ikke vurdert verken tilstrekkelig størrelse på elektroder eller riktig lengde på spolen for homogent å distribuere både EFer og MFs. Videre genererer enheter faste spenninger og frekvenser, noe som begrenser bruken av dem til å stimulere spesifikke biologiske vev. Av denne grunn utføres en beregningssimuleringsretningslinje i denne protokollen for å simulere både kapasitive systemer og spoler for å sikre homogen distribusjon av EFer og MFs over biologiske prøver, og unngå kanteffekten. I tillegg er det vist at utformingen av elektroniske kretser genererer spenninger og frekvens mellom elektrodene og spolen, og skaper EFer og MFs som vil overvinne begrensninger forårsaket av impedans av cellekulturens brønnplater og luft. Disse modifikasjonene vil tillate opprettelse av ikke-invasive og adaptive bioreaktorer for å stimulere ethvert biologisk vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Simulering av EFer og MFs
MERK: Simulering av EFer og MFs ble utført i COMSOL Multiphysics.
- Velg en aksisymmetrisk 2D-konfigurasjon som representerer både domener som er elektriske og magnetiske.
- I den fysiske konfigurasjonen velger du enten det elektriske strømgrensesnittet for å beregne EFer i parallelle elektroder eller magnetfeltgrensesnittet for å beregne MFer rundt spoler.
- I studiekonfigurasjonen velger du Frekvensdomene for å beregne responsen til en lineær eller linearisert modell utsatt for harmonisk eksitasjon for en eller flere frekvenser.
- Når du er inne i grensesnittet for å begynne å bygge modellen, følger du de neste trinnene i henhold til modellen av interesse.
- Bygge en modell for EFer
- Opprett geometrier. Velg Geometrii Modellverktøy. Deretter finner du Enheter-delen og velger mm. Velg Rektangel på geometriverktøylinjen, og skriv inn dimensjonene for hver komponent i boksen Størrelse og form i innstillingene for Rektangelvindu . Geometrien består av luft, to parallelle elektroder, en kulturbrønnplate, kulturmedier og en biologisk prøve, som i dette tilfellet er representert av et stillas av hyaluronsyre - gelatinhydrgel (se dimensjoner av hvert element i tabell 1). Når alle geometriene er bygget, klikker du Bygg alle objekter.
- Opprett valg. Klikk Eksplisitt på definisjonsverktøylinjenfor å opprette et valg for metalldomenet. Velg geometriene som representerer elektrodene. Deretter høyreklikker du på Eksplisitt 1 for å gi den nytt navn. Skriv inn Metal i det nye etiketttekstfeltet.
- Klikk derimot Komplementpå definisjonsverktøylinjen. Finn delen Inndataenheter i vinduet Utfyllende innstillinger. Klikk deretter Legg til under Markeringer som skal inverteres, og velg Metall i listen Markeringer som skal inverteres fra dialogboksen Legg til . Deretter høyreklikker du i Komplement 1 for å gi den nytt navn. Skriv inn Modelldomene i det nye etiketttekstfeltet.
- Opprett grenser. Klikk Eksplisitt på definisjonsverktøylinjen. Når du har funnet delen Inndataenheter i Innstillinger-vinduet for Eksplisitt, og velg Grense fra listen Geometrisk enhetsnivå. Her velger du alle grenser for bunnelektroden. Høyreklikk Eksplisitt 2 for å gi den nytt navn. Skriv inn Grunngrenser i det nye etiketttekstfeltet. Gjenta disse trinnene, men velg alle grenser for den øvre elektroden. Deretter høyreklikker du Eksplisitt 3 for å gi den nytt navn. Skriv inn Terminalgrenser i det nye etiketttekstfeltet.
- Legg til elektriske strømmer. Klikk Elektriske strømmer (ec)under Komponent 1 i Modellverktøy -vinduet. Finn deretter Domain Selection-delen i vinduet Innstillinger for elektriske strømmer. Velg Modelldomenefra Valg -listen. Klikk Grenser på verktøylinjen for fysikk, og velg Jord. Deretter finner du delen Grensevalg i vinduet Bakkeinnstillinger og velger Grunngrenser fra valglisten.
- Deretter klikker du Grenser og velger Terminal på fysikkverktøylinjen. Til slutt finner du delen Grensevalg i Terminalinnstillinger-vinduet og velger Terminalgrenser fra valglisten. her finner du Terminal-delen og velger Spenning fra Terminal-listen og skriver inn 100 V.
- Legg til materialer. Klikk Legg til materiale på hjemverktøylinjen for å åpne vinduet Legg til materiale. Søk i luft og rustfritt stål og legg dem til i Modellbygger-vinduet. Klikk deretter tomt materiale på hjemmeverktøylinjen og legg til tre nye tomme materialer for kulturmedier, stillas (hydrogel) og polystyren (kulturbrønnplate).
- Velg et tomt materiale for å tilordne de dielektriske egenskapene. Finn Materialegenskaper -listen i Materialinnstillinger-vinduet, og velg relativ tillatelse og elektrisk ledningsevne fra alternativlisten Grunnleggende egenskaper . Dielektriske egenskaper for kulturmedier, hydrogel og kultur velplate er i tabell 2. Gjenta denne fremgangsmåten for alle tomme materialer.
- Tilordne hvert materiale til geometriene som tidligere ble bygget. Velg luftmaterialet fra Modellbygger-vinduet. Velg deretter domenene som tilsvarer luft fra grafikkvinduet. Gjenta dette trinnet for alle materialer som er opprettet. Kontroller at hvert domene tilsvarer riktig materiale. For å sikre at alle materialer er riktig tilordnet, klikker du på hvert materiale fra Modellbygger-vinduet og observerer om domenene er uthevet i blått i grafikkvinduet.
- Bygg netting. Høyreklikk Mesh 1 i Modellverktøy -vinduet, og velg Fri trekantet. Gjenta dette trinnet ved å velge Størrelse. I vinduet Nettinnstilling velger du Nett kontrollert av brukeren fra Sekvenstype -listen. Deretter utvider du nettalternativene i Modellverktøy -vinduet og klikker Størrelse.
- Finn elementstørrelsesparametere i størrelsesinnstillingsvinduet og skriv inn 1 mm for maksimal elementstørrelse, 0,002 mm for minimum elementstørrelse, 1,1 for maksimal varevekstrate, 0,2 for krumningsfaktor og 1 for oppløsning av smale områder. Deretter utvider du nettalternativene i Modellverktøy -vinduet og klikker Fri trekantet 1. Her velger du alle domener som skal maskeres. Til slutt klikker du på Bygg alt i nettinnstillingsvinduet.
- Opprett studier. Klikk på Studie 1 i Modellverktøy-vinduet. Finn deretter Studieinnstillinger-delen i Studieinnstillinger-vinduet, og fjern merket for Generer standardplott . Utvid Study 1 -noden i Modellverktøy -vinduet, og klikk Trinn 1: Frekvensdomene. Til slutt finner du Delen Studieinnstillinger i vinduet Innstillinger for frekvensdomene og skriver inn 60 kHz i tekstfeltet Frekvenser.
- Beregn studie. Klikk Vis standard problemløser på studieverktøylinjen . Deretter utvider du noden Study 1 Solver Configurations i Modellverktøy-vinduet. Utvid solution 1-noden (sol1) i Modellverktøy-vinduet. Deretter klikker du Stasjonær problemløser 1 i vinduet Innstillinger for stasjonær problemløser og finner Delen Generelt og skriver inn 1e-6 i tekstfeltet Relativ toleranse. Til slutt klikker du Beregn på studieverktøylinjen.
- Plott resultater. Velg Resultater -delen på Hjem -verktøylinjen, og legg til 2D-tegnegruppe. Høyreklikk deretter 2D-plottgruppe 1 i Modellverktøy -vinduet, og velg Overflate. Deretter finner du Data-delen i Vinduet Surface-innstillinger og velger Forløper. Deretter finner du Uttrykk-delen i Vinduet Overflateinnstillinger. Her klikker du i plusssymbolet (+) for å åpne et nytt vindu og finne følgende rute fra valglisten (Modell - Komponent 1 - Elektriske strømmer - Elektrisk). Her velger du ec.normE - EF Norm. Til slutt klikker du på Grafikk i Surface Settings-vinduet for å tegne inn resultatene.
- Bygge en modell for MF-er
- Opprett geometrier. Velg Geometrii Modellverktøy. Finn deretter Enheter-delen og velg mm. Velg Rektangel på geometriverktøylinjen, og skriv inn dimensjonene for hver komponent i boksen Størrelse og form i Innstillingene for rektangelvindu . Geometrien består av luft og cooper (se dimensjoner for hvert element i tabell 1). Når alle geometriene er bygget, klikker du Bygg alle objekter.
- Legg til materialer. Klikk Legg til materiale på hjemverktøylinjen for å åpne vinduet Legg til materiale. Søk i luft og kobber og legg dem til i Modellbygger-vinduet. Dielektriske egenskaper for kobber er i tabell 2.
- Opprett grenser. Klikk på Magnetfelt i Modellverktøy-vinduet. Her finner du Formelliste i vinduet Innstillinger for magnetiske felt og velger Frekvensdomeneligning fra Formelskjema-listen. Velg Fra problemløseri Frekvens -listen. Deretter finner du Ampere's Law på Magnetfelt-listen i Modellbygger-vinduet. I type 293.15[K] i Temperatur, 1[atm] i Absolutt trykk fra listen Inngangsmodell . Velg deretter Heldekkende fra Materialtype-listen i Ampere's Law Settings-vinduet. Kontroller at elektrisk ledningsevne, relativ tillatelse og relativ permeabilitet tilsvarer Fra-materialet i listen.
- Finn aksialsymmetri i Magnetfelt -listen i Modellverktøy-vinduet. Kontroller at den aksiale symmetrilinjen er uthevet i både Grensevalg-listen og Grafikk-vinduet. Deretter finner du Magnetisk isolasjon på Magnetfelt -listen i Modellverktøy-vinduet. Kontroller at grenser fra geometrien er uthevet i både Grensevalg-listen og Grafikk-vinduet.
- Finn startverdier i Magnetfelt -listen i Modellverktøy-vinduet. Velg geometrier som tidligere er bygget, og inkluder dem i Domenevalg i vinduet Innstillinger for innledende verdier.
- Introduser spolefunksjoner. Finn flere spoler i Magnetfelt -listen i Modellverktøy-vinduet. Her velger du geometrien som representerer spolen, og inkluderer dem i Domenevalg fra vinduet Flere spoleinnstillinger.
- Finn listen over flere spoler i vinduet Innstilling av flere spoler. her finner du spoleeksitasjonslisten og velger Gjeldende; Deretter skriver du inn 1[A] i spolestrømlisten, 450 i antall svinger og 6e7[S/m] i spoleledningsevnen.
- Finn spoletrådens tverrsnittsområde og velg Nordamerikansk kabeldiameter (Brown &Sharpe) fra listen og skriv inn 18 i AWG-alternativet. Kontroller at relativ tillatthet og relativ permeabilitet samsvarer med Fra-materiale i listen.
- Bygg netting. I vinduet Nettinnstilling velger du Nett kontrollert av fysikken fra Sekvenstype -listen. Deretter finner du Elementstørrelsesparametere i nettinnstillingsvinduet og velger Ekstremt fint. Til slutt velger du alle domener som skal maskeres, og klikker på Bygg alt i nettinnstillingsvinduet.
- Opprett studier. Klikk på Studie 1 i Modellverktøy-vinduet. Finn deretter Studieinnstillinger-delen i Studieinnstillinger-vinduet, og fjern merket for Generer standardplott . Utvid Study 1 -noden i Modellverktøy -vinduet, og klikk Trinn 2: Frekvensdomene. Til slutt finner du Delen Studieinnstillinger i vinduet Innstillinger for frekvensdomene og skriver inn 60 Hz i tekstfeltet Frekvenser.
- Beregn studie. Klikk Vis standard problemløser på studieverktøylinjen . Deretter utvider du noden Study 1 Solver Configurations i Modellverktøy-vinduet. Utvid solution 1-noden (sol1) i Modellverktøy-vinduet. Deretter klikker du Stasjonær problemløser 1 i vinduet Innstillinger for stasjonær problemløser og finner Delen Generelt og skriver inn 1e-6 i feltet Relativ toleransetekst . Til slutt klikker du Beregn på studieverktøylinjen.
- Plott resultater. Velg Resultater -delen på Hjem -verktøylinjen, og legg til 2D-tegnegruppe. Høyreklikk deretter 2D-plottgruppe 1 i Modellverktøy -vinduet, og velg Overflate. Deretter finner du Data-delen i Vinduet Surface-innstillinger og velger Forløper.
- Finn Uttrykk-delen i Overflateinnstillinger-vinduet. Her klikker du i plusssymbolet (+) for å åpne et nytt vindu og finne følgende rute fra valglisten (Modell - Komponent 1 - Magnetfelt - Magnetisk). Her velger du mf.normB - Magnetisk flukstetthet Norm. Til slutt klikker du på Grafikk i Surface Settings-vinduet for å tegne inn resultatene.
- Bygge en modell for EFer
2. Design og produksjon av elektriske og magnetiske stimuleringsenheter
- Den elektriske stimulatorenheten
MERK: Den består av en krets basert på Wien Bridge Oscillator og to parallelle elektroder i rustfritt stål. Kretsen er en RC-oscillator av faseskift, som bruker en positiv og negativ tilbakemelding. Wien Bridge Oscillator er sammensatt av et blylagnettverk, som deler inngangsspenningen ved kombinasjonen av to armer på broen: en motstand. R5 med kondensator C2 i serie, og en motstand R6 med kondensator C3 parallelt (Figur 1A). Disse komponentene modulerer oscillatorens frekvens. Følg de neste trinnene for å bygge den elektriske stimulatorenheten:- Beregn frekvensen ved hjelp av resonansfrekvensligningen (1).
Der R = R5 = R6 er motstander og C = C2 = C3 er kondensatorer. Både R og C er plassert i broens to armer (Figur 1A). Bruk R5 = R6 = 2,6 kΩ og C2 = C3 = 1 nF for å oppnå en frekvens på 60 kHz. Motstander og kondensatorer kan beregnes hvis en annen frekvens er nødvendig. - Design kretsen på en slik måte at spenningsforsterkningen til forsterkeren automatisk kompenserer amplitudeendringene til utgangssignalet. I figur 1A er det mulig å observere kretsens ordning, mens i materialtabelldelen er de elektroniske komponentene oppført for å bygge kretsen.
- Beregn kombinasjonen av motstander for å generere de fire utgangsspenningene. Som vist i figur 1A, bruk en kombinasjon av motstander R11, R12, R13 og R14 (tilsvarende motstand på 154 Ω) for å generere en spenning på 50 Vp-p; motstander R17, R18 og R19 i serie (tilsvarende motstand på 47,3 Ω) for å oppnå en spenning på 100 Vp-p; motstander R9 og R10 i serie (tilsvarende motstand på 25,3 Ω) for å generere en spenning på 150 Vp-p; og en kombinasjon av motstander R15 og R16 (tilsvarende motstand på 16,8 Ω) for å oppnå en spenning på 200 Vp-p.
- Bruk en transistor (TIP 31C) og en ferrittkjernetransformator for å implementere et signalforsterkningsstadium. En toroidal ferrittkjerne ble brukt til å vikle en AWG 24 kobbertråd, og fullførte et forhold 1:200. Bruk to kondensatorer (C4 og C5) på 100 nF parallelt før transformatoren for å rette opp signalet (Figur 1A).
- Klargjør PCB ved hjelp av en tredjeparts PCB-produksjonstjeneste. Det skjematiske diagrammet for kretsen finnes i figur 1. Plasser alle komponenter på PCB med antistatiske pinsett. Bruk tinn loddejern og loddejern for å lodde alle komponenter.
- Lag et plastdeksel med inngangskontakter for å beskytte kretsen. Implementer tre inngangskontakter for å energisere kretsen (12 V, -12 V og jord). Bruk to inngangskontakter for å koble til elektrodene. Inkluder tre brytere for å endre motstandskombinasjonen for å oppnå de fire utgangsspenningene. Monter den elektroniske kretsen i plasthuset (Figur 1B).
- Lag to parallelle elektroder i rustfritt stål (200 x 400 x 2 mm) og loddeinngangskontakter til hver kant. Elektrodene er plassert over Teflon- eller akrylstøtter for å eliminere enhver kontakt med inkubatorens metalloverflate (figur 1C).
- Bruk en autoklav ved 394,15 K (121 °C) i 30 minutter for å sterilisere elektrodene og bruk ultrafiolett over natten for å sterilisere ledningene som er i kontakt med inkubatoren.
- Test den elektriske stimuleringsanordningen. Juster strømforsyningen i serie for å generere en utgangsspenning på +12 V og -12 V mellom bakken og positive og negative terminaler. Kontroller utgangsspenningen til strømforsyningen med et multimeter. Koble til hver utgang på strømforsyningen i riktig inngang på den elektriske stimulatoren (+12 V, -12 V og jord). Koble hver elektrode i riktig inngangskontakt på den elektriske stimulatoren. Polariteten er ikke viktig, da vi jobber med vekselstrøm. Plasser en kulturbrønnplate mellom elektrodene og kontroller utgangssignalet med et oscilloskop. Juster bryterne til den elektriske stimulatoren for å generere de fire utgangsspenningene (50, 100, 150 og 200 Vp-p).
- Sikkerhetsanbefalinger. For å unngå problemer ved overføring eller fjerning av elektrodene fra inkubatoren, må du passe på at kablene ikke er sammenflettet. Koble kabler fra oscillatoren før du fjerner elektrodene fra inkubatoren. Plasser aldri elektrodene uten akryl- eller Teflon-støttene.
- Beregn frekvensen ved hjelp av resonansfrekvensligningen (1).
- Den magnetiske stimulatorenheten
- Beregn antall svinger for å garantere en homogen MF inne i spolen ved hjelp av ligningen (2), som beskriver MF inne i en spole.
hvor μ0 er vakuumets magnetiske permeabilitet (4π×10-7), N er antall svinger av kobberledningen, jeg er strømmen, og h, som skal være større enn diameteren, er lengden på spolespolen. - Bestem antall svinger ved å velge en lengde (t) på 250 mm, strøm på 1 A og en Bint = 2mT.
- Produksjon av spolen. Bygg et PVC-rør (polyvinylklorid) med en lengde på 250 mm og en diameter på 84 mm for å vikle en AWG 18 kobbertråd som fullfører 450 omdreininger (Figur 2A). Dimensjoner ble valgt basert på tilgjengelig plass inne i inkubatoren.
- Produsere en cellekultur godt plate støtte. Bygg en PMMA-støtte (polymetylmetakrylat) for å sikre at brønnplater på 35 mm alltid var plassert midt i spolen der MFs er homogene (Figur 2A).
- Produksjon en transformator for å øke strømmen av kretsen. Bygg en transformator med en effekt på 1 A - 6 V AC for å nå maksimalt MF på 2 mT. Transformatorens inngangsspenning var 110 V AC ved 60 Hz. Disse parametrene tilsvarer utgangsspenningen og frekvensen til et Sør-Amerika-uttak.
- Koble til kretsen. Transformatoren er koblet direkte til utløpet. Bruk en variabel motstand (rheostat) for å variere strømmen og generere MFs fra 1 til 2 mT. Koble til en sikring for å beskytte kretsen (Figur 2B).
- Bruk ultrafiolett over natten for å sterilisere ledningene som er i kontakt med inkubatoren. Pakk spolen med gjennomsiktig stretchfilm og bruk etanol for å sterilisere spolen.
- Test MF-enheten. Bruk et teslameter for å måle MF-størrelsen inne i spolen. Teslameter-sonden var plassert i midten av spolen, slik at måling av MFs og strømmer samtidig.
- Varier MF-størrelsen. Bruk en reostat til å endre kretsens motstand (Figur 2B). En motstandsverdi på 0,7 Ω ble brukt til å generere MF-er på 1 mT.
- Sikkerhetsanbefalinger. For å unngå problemer ved overføring eller fjerning av spolen fra inkubatoren, må du passe på at kablene ikke er sammenflettet. Koble kablene fra transformatoren før du fjerner spolen fra inkubatoren. Plasser aldri spolen uten PMMA-støtten. Ta godt tak i både PMMA-støtte fra basen og spolen når du overfører eller fjerner fra inkubatoren.
- Beregn antall svinger for å garantere en homogen MF inne i spolen ved hjelp av ligningen (2), som beskriver MF inne i en spole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beregningssimulering
Distribusjoner av EFer og MFer vises i figur 3. På den ene siden var det mulig å observere den homogene fordelingen av EFer i kapasitivsystemet (figur 3A). EF ble plottet inn for å observere i detalj størrelsen på feltet inne i den biologiske prøven (Figur 3B). Denne simuleringen var nyttig for å parametrize størrelsen på elektrodene og produsere dem for å unngå kanteffekten. På den annen side var det mulig å observere den homogene fordelingen av MFs generert av spolespolen (Figur 3C). MF ble plottet inn for å observere i detalj størrelsen på feltet inne i spolen (Figur 3D). Denne simuleringen var viktig for å måle avstanden der MF er den samme og bygge PMMA-støtten. Denne støtten sikrer en homogen fordeling av MF ikke bare i midten av spolen, men også i de biologiske prøvene som skal stimuleres.
Signaler generert av elektriske og magnetiske stimulatorer
Utgangssignaler generert av elektriske stimulatorer vises i figur 4. Det er relevant å markere at signaler fanget av oscilloskopet ble direkte tatt i elektrodene, da om målingen tas direkte til utgangskablene, vil spenningene være høyere (Figur 4A). Denne spenningsvariasjonen er gitt ved kapasitans av elektroder. Utgangsspenningen svinger i en rekkevidde på ± 5V ved 60 kHz; For eksempel var utgangssignalene 54.9 Vp-p (Figur 4B), 113 Vp-p (Figur 4C), 153 Vp-p (Figur 4D) og 204 Vp-p (Figur 4E) for henholdsvis 50, 100, 150 og 200 Vp-p.
Utgangssignalet som genereres av den magnetiske stimulatoren, er vist i figur 5. Signalet som ble fanget opp av oscilloskopet ble direkte tatt i utgangskablene til spolen (figur 5A). Utgangsspenningen svinger i området ± 15V p-p ved 60 Hz (Figur 5B).
Figur 1. Elektrisk stimuleringsanordning. A) Krets som genererer spenninger på 50, 100, 150 og 200 Vp-p ved 60 kHz sinusbølgeform. B) Kretskort i saken. C) Elektroder inne i inkubatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Magnetisk stimuleringsenhet. A) Skjematisk representasjon av den magnetiske stimulatorenheten og PMMA-støtten. B) Krets for å generere MFs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Beregningssimulering av EFer og MFer. A) Distribusjon av EFer i og utenfor kapasitive systemet. B) Fordeling av EFer innenfor hydrogelen, interesseområdet er angitt i rød detalj. C) Distribusjon av MFs i og utenfor spolen. D) Distribusjon av MFs i midten av spolen, regionen av interesse er angitt i en rød detalj. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Sinusformet signal generert av elektrisk stimulator. A) Signalverifisering generert av den elektriske stimulatoren. B) Signal ved 50 Vp-p. C) Signal ved 100 Vp-p. D) Signal ved 150 Vp-p. E) Signal ved 200 Vp-p. Alle målinger svinger i en rekkevidde på ± 5V ved 60 kHz. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Sinusformet signal generert av den magnetiske stimulatoren. A) Signalverifisering generert av den magnetiske stimulatoren. B) Signal på 15 Vp-p på 60 Hz. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| system | Komponenter | Bredde (mm) | Høyde (mm) |
| Elektrisk system | luft | 100 | 100 |
| Elektroder | 50 | 5 | |
| Brønnplate | 7 | 20 | |
| Hydrogel | 3.5 | 3.5 | |
| Kulturmedier | 6 | 8 | |
| Magnetisk system | luft | 500 | 600 |
| spiral | 2 | 250 |
Tabell 1. Dimensjon av geometrier som komponerer elektriske og magnetiske systemer.
| system | Komponenter | Relativ tillatelse (ε) | Konduktivitet (σ) |
| Elektrisk system | luft | 1 | 0 |
| Elektroder | 1 | 1.73913 [MS/m] | |
| Brønnplate | 3.5 | 6.2E-9 [S/m] | |
| Hydrogel | 8.03E3 | 7.10E-2 [S/m] | |
| Kulturmedier | 2.67E4 | 7.20E-2 [S/m] | |
| Magnetisk system | spiral | 1 | 5.998E7[S/m] |
Tabell 2. Dielektriske egenskaper til elementer som komponerer elektriske og magnetiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandlinger som brukes til å helbrede forskjellige patologier som påvirker humant vev er farmakologiske terapier32 eller kirurgiske inngrep33, som søker å lindre smerte lokalt eller erstatte berørte vev med explants eller transplantasjoner. Nylig har autolog celleterapi blitt foreslått som en alternativ terapi for å behandle skadet vev, hvor celler er isolert fra pasienten og utvidet, gjennom in vitro-teknikker, som skal implanteres på skadestedet34. Gitt at autolog celleterapi har vist seg å ha direkte innflytelse over vevsgjenoppretting, er det utviklet forskjellige strategier for å øke effektiviteten av denne teknikken. For eksempel har biofysiske stimuli blitt brukt som en ikke-invasiv alternativ terapifor å stimulere flere typer biologiske prøver, modulere cellefunksjonalitet ved å forbedre celleproliferasjon og molekylær syntese35,36. Blant de mest brukte biofysiske stimuliene har elektrostimulering og magnetoterapi blitt mye brukt til å stimulere celler, vevsutløp og stillaser. Det har blitt bevist at elektrostimulering reduserer smerte og øker helbredelsesprosessene til flere vev37. Når det gjelder magnetoterapi, har det blitt beskrevet at denne stimulansen forbedrer integrasjonen av implantater med vertsvev, akselererer helbredelsesprosesser, lindrer smerte lokalt og økerarrstyrken 8,38.
Tatt i betraktning nevnt ovenfor, har kombinasjonen av biomaterialer, cellekultur og eksterne biofysiske stimuli som EFs og MFs, på in vitro-nivå, blitt introdusert i vevsteknikk som en alternativ terapeutisk teknikk for å helbrede skadet vev8,39. Men å finne en bioreaktor som bidrar til å stimulere forskjellige vev, enten det er sunt eller påvirket av traumatiske patologier, er en utfordring. I denne sammenhengen tar den nåværende protokollen sikte på å utvikle både elektriske og magnetiske stimulatorer. For tiden er det to mulige ordninger for å søke EFer. Den første metoden består av å generere EFer gjennom direkte koblingssystemer, som brukes til å evaluere cellemigrering og orientering40,41,42. Det er imidlertid begrensninger som endringer i biokompatibilitet av cellekulturmediet av elektroder i kontakt, mulige endringer i pH og molekylær oksygennivå1. I tillegg kan direkte koblet stimulering ikke forsterke høyfrekvente signaler. Utgangen har en tendens til å variere med tiden, og genererer forsyningsspenningsendringer. Den har liten temperaturstabilitet, på grunn av dette endres driftspunktene og ved lave frekvenser kondensatoren svikter og fungerer som en åpen krets43. Tatt i betraktning disse begrensningene ble den andre metoden implementert, hvor eksterne parallelle elektroder ble brukt. Denne indirekte koblingssystemmetoden har bevist en økning i celleproliferasjon og molekylær syntese3,7,17,22,44,45; Imidlertid har enhetene utviklet av forskjellige forfattere ikke vurdert størrelsen på elektroder for å distribuere homogene EFer. For eksempel genererer enheter faste spenninger og frekvenser, noe som begrenser bruken av dem til å stimulere bestemte celler og vev. Følgelig ble størrelsen på elektrodene i denne studien modellert for å sikre en homogen fordeling av EFer over biologisk vev. I tillegg ble en krets designet for å generere en frekvens og høye spenninger mellom elektroder, og skape forskjellige EFer som overvinner begrensningene forårsaket av impedansen av cellekulturens brønnplater og luft.
Solenoidspoler er allsidige enheter som kan brukes til å stimulere biologiske prøver i inkubatoren, slik at atmosfæriske forhold forblir stabile uten å påvirke fysiologiske egenskaper ved biologiske prøver. Denne fordelen belyser at solenoidspoler er mulige alternativer mer enn Helmholtz-spoler, da disse må være større i størrelse, og forhindre stimulering inne i inkubatorer46. Stimulering av biologiske prøver utenfor inkubatoren kan føre til flere problemer som cellekulturforurensning, cellestress, pH-endringer i kulturmedier, blant andre. Gitt at forskjellige stimulatorenheter er utviklet for å stimulere flere celletyper og vev24,25,26,27, er det relevant å bygge enheter der MF-intensiteter kan varieres for å stimulere et bredt spekter av biologiske prøver29,30. Følgelig er den magnetiske stimulatoren i denne protokollen koblet til en reostat, som kan variere strømmen som strømmer gjennom spolen ved å endre motstand og strøm, parametere som er direkte relatert til generering av MFs. En annen viktig funksjon å vurdere i øyeblikket for å bygge magnetiske enheter er distribusjonen av MFs. Her ble en beregningssimulering brukt til å simulere MF-fordelingen inne i spolespolen. Denne simuleringen tillot å beregne antall svinger av kobbertråden og lengden på spolen for å generere homogene MFs midt i spolen. Beregningssimuleringen er et nyttig verktøy for å beregne antall biologiske prøver som skal stimuleres, slik at alle prøver får samme feltstyrke47.
De biofysiske stimulatorene utviklet i denne protokollen har noen begrensninger. For det første genererer den elektroniske kretsen designet for elektrisk stimulator fire utgangsspenninger med en bestemt frekvens. Selv om kretsen overvinner begrensningen ved å generere høye spenninger mellom elektroder1, kan det forbedres for å generere variable spenninger og frekvenser. Kretsen kan modifiseres for å generere forskjellige frekvenser som bare beregner enten motstander eller kondensatorer ved hjelp av ligning (1); Det er imidlertid mulig å bruke variable motstander for å variere motstandsverdien manuelt. På samme måte kan en variabel motstand brukes i forsterkningsfasen av kretsen for å variere utgangsspenningen. For det andre genererer den elektroniske kretsen til den elektriske stimulatoren sinusformede signaler. Det ville være nyttig å generere forskjellige typer signaler som firkantede, trekantede, trapesformede og rampe, da disse typer signaler kan brukes til å stimulere et bredt spekter av celler og biologiske prøver48,49. For å generere forskjellige typer signaler kan driftsforsterkeren erstattes av en monolittisk funksjonsgenerator, som kan produsere bølgeformer av høy kvalitet med høy stabilitet og nøyaktighet med lav amplitude, og forsterkningsstadiet kan erstattes av en ikke-inverterende driftsforsterker eller et stadium med NPN-transistorer. For det tredje, selv om den magnetiske stimulatoren genererer små MF-størrelser, har det blitt bevist at disse intensitetene har direkte innvirkning over dynamikken i biologiske prøver24,28,30,38; Den magnetiske enheten kan imidlertid forbedres for å generere variable MF-er og frekvenser for å stimulere et bredt spekter av biologisk vev29.
Samlet sett er denne protokollen et nyttig verktøy som gir et teknologisk bidrag til det vitenskapelige samfunnet som arbeider med biofysisk stimulering av biologisk vev. Disse enhetene vil tillate forskere å bruke EFs og MFs for å stimulere funksjonen til sunt biologisk vev eller de som endres av en bestemt patologi. Tatt i betraktning dette i videre in vivo-studier, vil forskjellige parametere og variabler som elektroder størrelse, antall svinger av spolen, stimuli styrke og stimulering ganger være fast bestemt på å homogent distribuere både EFs og MFs hos dyr som griser, kalver, marsvin eller kaniner. I tillegg kan bioreaktorer designet i denne protokollen ekstrapoleres til kliniske innstillinger for å forbedre regenerative teknikker som autolog celleimplantasjon. Her kan bioreaktorer spille en viktig rolle ved å stimulere biologiske prøver, på in vitro-nivå, for å forbedre de cellulære og molekylære egenskapene til celler, vev og stillaser før de implanteres i pasienten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker den økonomiske støtten fra "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" og Universidad Nacional de Colombia gjennom stipendet Nr. 80740-290-2020 og støtten mottatt av Valteam Tech - Research and Innovation for å gi utstyr og teknisk støtte i utgaven av videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | ---- Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | ---- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | ---- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | ---- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT - T13 | ---- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | ---- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | ---- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | ---- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | ---- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | ---- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | ---- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | ---- | P1041 - 4 mm - 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | ---- | 4 mm male-male/female-female adapters - 15 A Quantity: 1 |
| Case | ---- | ---- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | ---- | ---- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | ---- | ---- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | ---- | ---- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | ---- | ---- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | ---- Quantity: 1 |
| Transformer | ---- | ---- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | ---- | ---- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
References
- Balint, R., Cassidy, N. J., Cartmell, S. H. Electrical Stimulation: A Novel Tool for Tissue Engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (1), 48-57 (2013).
- Ercan, B., Webster, T. J. The effect of biphasic electrical stimulation on osteoblast function at anodized nanotubular titanium surfaces. Biomaterials. 31 (13), 3684-3693 (2010).
- Brighton, C., Wang, W., Clark, C. The effect of electrical fields on gene and protein expression in human osteoarthritic cartilage explants. The Journal of Bone and Joint Surgery-American. 90 (4), 833-848 (2008).
- Baerov, R. M., Morega, A. M., Morega, M. Analysis of magnetotherapy effects for post-traumatic recovery of limb fractures. Revue Roumaine des Sciences Techniques- Série électrotechnique et énergétique. 65 (1-2), 145-150 (2020).
- Escobar, J. F., et al. In Vitro Evaluation of the Effect of Stimulation with Magnetic Fields on Chondrocytes. Bioelectromagnetics. 41 (1), 41-51 (2019).
- Brighton, C., Wang, W., Clark, C. Up-regulation of matrix in bovine articular cartilage explants by electric fields. Biochemical and Biophysical Research Communications. 342 (2), 556-561 (2006).
- Xu, J., Wang, W., Clark, C., Brighton, C. Signal transduction in electrically stimulated articular chondrocytes involves translocation of extracellular calcium through voltage-gated channels. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (3), 397-405 (2009).
- Xia, Y., et al. Magnetic field and nano-scaffolds with stem cells to enhance bone regeneration. Biomaterials. 183, 151-170 (2018).
- Richter, A., Bartoš, M., Ferková, Ž Physical Analysis of Pulse Low-Dynamic Magnetic Field Applied in Physiotherapy BT. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering 2018. , 239-245 (2019).
- Miyakoshi, J. Effects of static magnetic fields at the cellular level. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 87, 213-223 (2005).
- Zhang, K., Guo, J., Ge, Z., Zhang, J. Nanosecond Pulsed Electric Fields (nsPEFs) Regulate Phenotypes of Chondrocytes through Wnt/β-catenin Signaling Pathway. Scientific Reports. 4 (5836), 1-8 (2014).
- Brighton, C. T., Unger, A. S., Stambough, J. L. In vitro growth of bovine articular cartilage chondrocytes in various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 15-22 (1984).
- Armstrong, P. F., Brighton, C., Star, A. M. Capacitively coupled electrical stimulation of bovine growth plate chondrocytes grown in pellet form. Journal of Orthopaedic Research. 6 (2), 265-271 (1988).
- Brighton, C., Townsend, P. Increased cAMP production after short-term capacitively coupled stimulation in bovine growth plate chondrocytes. Journal of Orthopaedic Research. 6 (4), 552-558 (1988).
- Brighton, C. T., Jensen, L., Pollack, S. R., Tolin, B. S., Clark, C. Proliferative and synthetic response of bovine growth plate chondrocytes to various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 7 (5), 759-765 (1989).
- Brighton, C. T., Okereke, E., Pollack, S. R., Clark, C. In vitro bone-cell response to a capacitively coupled electrical field. The role of field strength, pulse pattern, and duty cycle. Clinical Orthopaedics and Related Research. 285, 255-262 (1992).
- Wang, W., Wang, Z., Zhang, G., Clark, C., Brighton, C. T. Up-regulation of chondrocyte matrix genes and products by electric fields. Clinical Orthopaedics and Related Research. 427, 163-173 (2004).
- Hartig, M., Joos, U., Wiesmann, H. P. Capacitively coupled electric fields accelerate proliferation of osteoblast-like primary cells and increase bone extracellular matrix formation in vitro. European Biophysics Journal. 29 (7), 499-506 (2000).
- Kim, I. S., et al. Biphasic electric current stimulates proliferation and induces VEGF production in osteoblasts. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (9), 907-916 (2006).
- Kim, I., et al. Novel Effect of Biphasic Electric Current on In Vitro Osteogenesis and Cytokine Production in Human Mesenchymal Stromal Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 2411-2422 (2009).
- Kim, I., et al. Novel action of biphasic electric current in vitro osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stromal cells coupled with VEGF production. Bone. 43, 43-44 (2008).
- Nakasuji, S., Morita, Y., Tanaka, K., Tanaka, T., Nakamachi, E. Effect of pulse electric field stimulation on chondrocytes. Asian Pacific Conference for Materials and Mechanics. 1, Yokohama, Japan. 13-16 (2009).
- Au, H. T. H., Cheng, I., Chowdhury, M. F., Radisic, M. Interactive effects of surface topography and pulsatile electrical field stimulation on orientation and elongation of fibroblasts and cardiomyocytes. Biomaterials. 28 (29), 4277-4293 (2007).
- Vanessa, N., et al. In vitro exposure of human chondrocytes to pulsed electromagnetic fields. European Journal of Histochemistry. 51 (3), 203-211 (2007).
- Pezzetti, F., et al. Effects of pulsed electromagnetic fields on human chondrocytes: An in vitro study. Calcified Tissue International. 65 (5), 396-401 (1999).
- De Mattei, M., et al. Effects of electromagnetic fields on proteoglycan metabolism of bovine articular cartilage explants. Connective Tissue Research. 44 (3-4), 154-159 (2003).
- Sollazzo, V., Massari, L., Caruso, A., Mattei, M., Pezzetti, F. Effects of Low-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields on Human Osteoblast-Like Cells In Wtro. Electromagnetobiology. 15, 75-83 (2009).
- Martino, C. F., Perea, H., Hopfner, U., Ferguson, V. L., Wintermantel, E. Effects of weak static magnetic fields on endothelial cells. Bioelectromagnetics. 31 (4), 296-301 (2010).
- Wada, K., et al. Design and implementation of multi-frequency magnetic field generator producing sinusoidal current waveform for biological researches. 2016 18th European Conference on Power Electronics and Applications (EPE'16 ECCE Europe). 2016, 1-8 (2016).
- Cho, H., Kim, S., Kim, K. K., Kim, K., Kim, K. Pulsed Electromagnetic Fields Stimulate Cellular Proliferation in Different Types of Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 52 (7), 1-4 (2016).
- Yan, J., Dong, L., Zhang, B., Qi, N. Effects of extremely low-frequency magnetic field on growth and differentiation of human mesenchymal stem cells. Electromagnetic Biology and Medicine. 29 (4), 165-176 (2010).
- Enoch, S., Grey, J. E., Harding, K. G. ABC of wound healing. Non-surgical and drug treatments. BMJ. 332 (7546), 900-903 (2006).
- Bhosale, A. M., Richardson, J. B. Articular cartilage: Structure, injuries and review of management. British Medical Bulletin. 87 (1), 77-95 (2008).
- Al Hamed, R., Bazarbachi, A. H., Malard, F., Harousseau, J. -L., Mohty, M. Current status of autologous stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood Cancer Journal. 9 (4), 44 (2019).
- Massari, L., et al. Biophysical stimulation of bone and cartilage: state of the art and future perspectives. International Orthopaedics. 43 (3), 539-551 (2019).
- Naskar, S., Kumaran, V., Basu, B. Reprogramming the Stem Cell Behavior by Shear Stress and Electric Field Stimulation: Lab-on-a-Chip Based Biomicrofluidics in Regenerative Medicine. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 5 (2), 99-127 (2019).
- Hunckler, J., de Mel, A. A current affair: electrotherapy in wound healing. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 10, 179-194 (2017).
- Henry, S. L., Concannon, M. J., Yee, G. J. The effect of magnetic fields on wound healing: experimental study and review of the literature. Eplasty. 8, 393-399 (2008).
- Hiemer, B., et al. Effect of electric stimulation on human chondrocytes and mesenchymal stem cells under normoxia and hypoxia. Molecular Medicine Reports. 18 (2), 2133-2141 (2018).
- Chao, P. H., et al. Chondrocyte translocation response to direct current electric fields. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (3), 261-267 (2000).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J., McCaig, C. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117 (3), 397-405 (2004).
- Li, X., Kolega, J. Effects of direct current electric fields on cell migration and actin filament distribution in bovine vascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 39 (5), 391-404 (2002).
- Singh, B., Dixit, A. Multistage amplifier and tuned amplifier. Analog Electronics. , Laxmi publications (P) LTD. Boston, MA. 87-131 (2007).
- Esfandiari, E., et al. The effect of high frequency electric field on enhancement of chondrogenesis in human adipose-derived stem cells. Iranian Journal Basic Medical Sciences. 4 (3), 571-576 (2014).
- Mardani, M., et al. Induction of chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by low frequency electric field. Advanced Biomedical Research. 5 (97), 1-7 (2016).
- Karaman, O., Gümüşay, M., Demirci, E. A., Kaya, A. Comparative assessment of pulsed electromagnetic fields (PEMF) and pulsed radio frequency energy (PRFE) on an in vitro wound healing model. International Journal of Applied Electromagnetics and Mechanics. 57, 427-437 (2018).
- Glinka, M., et al. Test chambers for cell culture in static magnetic field. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 331, 208-215 (2013).
- Vacek, T. P., et al. Electrical stimulation of cardiomyocytes activates mitochondrial matrix metalloproteinase causing electrical remodeling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 404 (3), 762-766 (2011).
- Okutsu, S., et al. Electric Pulse Stimulation Induces NMDA Glutamate Receptor mRNA in NIH3T3 Mouse Fibroblasts. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 181-187 (2008).
