تحليل وقت السكون أحادي الجزيء لانقسام الحمض النووي بوساطة نوكلياز التقييد
Summary
باستخدام الحمض النووي المسمى بالنقاط الكمومية والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي ، يمكننا التحقيق في آلية تفاعل نوكلياز التقييد أثناء استخدام البروتين غير المسمى. تسمح تقنية الجزيء الواحد هذه بمراقبة متعددة الإرسال على نطاق واسع لتفاعلات البروتين والحمض النووي الفردية ، ويمكن تجميع البيانات لتوليد توزيعات وقت مكوث مكتظة بالسكان.
Abstract
يسهل هذا الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي الجديد القياس المتزامن لطول الدورة التحفيزية لمئات من جزيئات نوكلياز التقييد الفردي (REase) في تجربة واحدة. لا يتطلب هذا الفحص وضع علامات على البروتين ويمكن إجراؤه باستخدام قناة تصوير واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تجميع نتائج التجارب الفردية المتعددة لإنشاء توزيعات وقت مكوث مكتظة بالسكان. يمكن أن يساعد تحليل توزيعات وقت السكون الناتجة في توضيح آلية انقسام الحمض النووي من خلال الكشف عن وجود خطوات حركية لا يمكن ملاحظتها مباشرة. مثال على البيانات التي تم جمعها باستخدام هذا الفحص مع REase المدروس جيدا ، EcoRV – وهو نوكلياز داخلي من النوع IIP من النوع الثاني يشق التسلسل التناظري GAT↓ATC (حيث ↓ هو موقع القطع) – تتفق مع الدراسات السابقة. تشير هذه النتائج إلى أن هناك ثلاث خطوات على الأقل في مسار انقسام الحمض النووي الذي يبدأ بإدخال المغنيسيوم بعد أن يربط EcoRV الحمض النووي في غيابه ، بمتوسط معدل 0.17 s-1 لكل خطوة.
Introduction
نوكلياز التقييد (REases) هي إنزيمات تؤثر على فواصل مزدوجة الشريط خاصة بالتسلسل في الحمض النووي. أدى اكتشاف REases في سبعينيات القرن العشرين إلى تطوير تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف ، وهذه الإنزيمات هي الآن أدوات مختبرية لا غنى عنها للتعديل الوراثي والتلاعب1. الإنزيمات من النوع الثاني هي الإنزيمات الأكثر استخداما في هذه الفئة؛ لأنها تشق الحمض النووي (DNA) في موقع ثابت إما داخل تتابع التعرف عليها أو بالقرب منه. ومع ذلك ، هناك قدر كبير من الاختلاف بين النوع الثاني من REases ، وهي مقسمة إلى عدة أنواع فرعية بناء على خصائص إنزيمية معينة بدلا من تصنيفها وفقا لعلاقاتها التطورية. من بين كل نوع فرعي ، هناك استثناءات متكررة لنظام التصنيف ، والعديد من الإنزيمات تنتمي إلى أنواع فرعية متعددة2. تم تحديد الآلاف من أنواع REases من النوع الثاني ، والمئات منها متاحة تجاريا.
ومع ذلك ، على الرغم من التنوع بين النوع الثاني من REases ، فقد تمت دراسة عدد قليل جدا من REases بالتفصيل. وفقا ل REBASE ، قاعدة بيانات إنزيم التقييد التي أنشأها السير ريتشارد روبرتس في 19753 ، تتوفر بيانات الحركية المنشورة لأقل من 20 من هذه الإنزيمات. علاوة على ذلك ، في حين أن بعض REases قد لوحظت مباشرة على مستوى الجزيء الواحد أثناء انتشارها على طول الحمض النووي قبل مواجهة تسلسل التعرف عليها4،5،6،7 والارتباط به ، إلا أن هناك عددا قليلا جدا من الدراسات أحادية الجزيء لحركية تفاعل الانقسام. الدراسات الحالية إما لا تبلغ عن إحصاءات كافية لإجراء تحليل مفصل للتباين في الأوقات التي تحدث فيها أحداث الانقسام الفردي8،9،10 أو أنها غير قادرة على التقاط التوزيع الكامل لأوقات الانقسام11. يمكن أن يكشف هذا النوع من التحليل عن وجود وسيطات حركية طويلة العمر نسبيا ويمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لآليات انقسام الحمض النووي بوساطة REase.
على مستوى الجزيء الواحد ، تكون العمليات الكيميائية الحيوية عشوائية – وقت الانتظار لحدوث مثيل واحد من العملية ، τ ، متغير. ومع ذلك ، يمكن توقع أن تطيع العديد من قياسات τ التوزيع الاحتمالي ، p (τ) ، الذي يدل على نوع العملية الجارية. على سبيل المثال ، ستخضع عملية من خطوة واحدة ، مثل إطلاق جزيء ناتج من إنزيم ، لإحصائيات بواسون ، وستتخذ p (τ) شكل توزيع أسي سالب:
حيث β هو متوسط وقت الانتظار. لاحظ أن معدل العملية ، k ، سيكون مساويا ل 1/β ، معكوس متوسط وقت الانتظار. بالنسبة للعمليات التي تتطلب أكثر من خطوة واحدة ، ستكون p (τ) هي التفاف التوزيعات الأسية المفردة لكل خطوة من الخطوات الفردية. الحل العام لالتفاف دوال الاضمحلال الأسي الأحادي N مع متوسط أوقات انتظار متطابقة ، β ، هو توزيع احتمال جاما:
حيث Γ (N) هي دالة جاما ، التي تصف استيفاء مضروب N-1 إلى القيم غير الصحيحة ل N. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذا الحل العام كتقدير تقريبي عندما يكون متوسط أوقات الانتظار للخطوات الفردية متشابهة ، يجب أن يكون مفهوما أن وجود خطوات سريعة نسبيا سيتم حجبه بخطوات ذات أوقات انتظار أطول بكثير. بمعنى آخر ، تمثل قيمة N حدا أدنى لعدد الخطوات12. مع وجود عدد كاف من قياسات وقت الانتظار ، يمكن تقدير المعلمات β و N عن طريق تجميع الأحداث وملاءمة توزيع جاما مع الرسم البياني الناتج أو باستخدام نهج تقدير الاحتمال الأقصى. وبالتالي يمكن أن يكشف هذا النوع من التحليل عن وجود خطوات حركية لا يمكن حلها بسهولة في مقايسات المجموعة ويتطلب عددا كبيرا من الملاحظات لتقدير المعلمات بدقة12,13.
تصف هذه الورقة طريقة لاستخدام الحمض النووي المسمى بالنقاط الكمومية والمجهر الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) لمراقبة مئات من أحداث انقسام الحمض النووي الفردية بوساطة REase بالتوازي. يتيح تصميم الفحص تجميع نتائج العديد من التجارب ويمكنه إنشاء توزيعات في وقت الإقامة تحتوي على آلاف الأحداث. يسمح الثبات الضوئي العالي وسطوع النقاط الكمومية بدقة زمنية تبلغ 10 هرتز دون التضحية بالقدرة على مراقبة أحداث الانقسام التي تحدث حتى بعد دقائق عديدة من بدء التجربة. تسمح الدقة الزمنية الجيدة والنطاق الديناميكي الواسع ، جنبا إلى جنب مع القدرة على جمع مجموعة كبيرة من البيانات ، بالتوصيف الدقيق لتوزيعات وقت السكون للكشف عن وجود خطوات حركية متعددة في مسارات الانقسام في REases ، والتي لها معدلات دوران في نطاق 1 min-1 . في حالة EcoRV ، يمكن حل ثلاث خطوات حركية ، تم تحديدها جميعا من خلال وسائل أخرى ، مما يؤكد أن الفحص حساس لوجود مثل هذه الخطوات.
يتم إنتاج ركائز الحمض النووي المزدوجة التي تحتوي على تسلسل التعرف محل الاهتمام عن طريق تلدين قليل النوكليوتيد البيوتينيل إلى شريط مكمل موسوم بنقطة كمومية نانوية شبه موصلات واحدة متصلة تساهميا. يتم إدخال هذه الركائز في قناة تدفق مبنية فوق غطاء زجاجي مع عشب من جزيئات البولي إيثيلين جلايكول عالية الوزن الجزيئي (PEG) متصلة تساهميا بسطحه. يتم التقاط ركائز الحمض النووي عن طريق ارتباط البيوتين – الستربتافيدين – البيوتين بواسطة جزء صغير من جزيئات PEG التي تحتوي على البيوتين في نهايتها الحرة. في الفحص المجهري TIRF ، توفر الموجة المتلاشية التي تتحلل أضعافا مضاعفة مع المسافة من واجهة الزجاج والسائل الإضاءة. عمق الاختراق بترتيب الطول الموجي للضوء المستخدم. في ظل هذه الظروف ، سيتم إثارة النقاط الكمومية فقط المربوطة بالسطح بواسطة جزيء الحمض النووي الذي تم التقاطه على السطح الزجاجي الوظيفي. لن تكون النقاط الكمومية الحرة في المحلول مقيدة داخل المنطقة المضيئة وبالتالي لن تلمع. إذا كان الحمض النووي الذي يربط نقطة كمومية بالسطح مشقوقا ، فستكون هذه النقطة الكمومية حرة في الانتشار بعيدا عن السطح ، وستختفي من الصورة الفلورية.
على الرغم من أنه من المعروف أن العديد من أنواع REases من النوع الثاني تربط الحمض النووي في غياب المغنيسيوم14 ، إلا أن جميعها تتطلب المغنيسيوم للتوسط في انقسام الحمض النووي15. يمكن أن تربط هذه REases الحمض النووي المجمد على السطح في غياب المغنيسيوم. عندما يتم تدفق المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم عبر قناة مع ارتداد REase إلى الحمض النووي ، يبدأ الانقسام على الفور ، كما يتضح من اختفاء النقاط الكمومية. يسهل التزامن الذي يتحقق عن طريق الربط المسبق لجزيئات REase ، ثم بدء انقسام الحمض النووي عن طريق إدخال المغنيسيوم ، قياس وقت التأخر حتى اكتمال انقسام الحمض النووي بشكل مستقل لكل جزيء في مجموعة الإنزيمات التي لوحظت في التجربة. يتم تضمين الفلوريسئين كصبغة تتبع في المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم للإشارة إلى وصول المغنيسيوم إلى مجال الرؤية. نظرا لعدم تضمين أي إنزيم في المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم ، فإن وقت التأخر من وصول المخزن المؤقت المحتوي على المغنيسيوم إلى اختفاء كل نقطة كمومية يشير إلى الوقت الذي يستغرقه REase المرتبط بالفعل بالحمض النووي لشق الحمض النووي وإطلاق النقطة الكمومية من سطح الزجاج. يحدث اختفاء النقاط الكمومية بسرعة ويؤدي إلى انخفاض حاد في مسار الشدة ، مما يوفر مؤشرا واضحا على الوقت الذي يتم فيه شق جزيء الحمض النووي المعين. يتم تحديد أوقات الأحداث من خلال التحليل الرياضي لمسارات الشدة ، وتؤدي التجربة النموذجية إلى مئات من أحداث الانقسام التي يمكن تحديدها. يمكن تجميع نتائج التجارب المتعددة لتوفير إحصاءات كافية للسماح بتقدير المعلمات ، N و β ، إما عن طريق المربعات الصغرى غير الخطية أو تحليل الاحتمال الأقصى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تمييز ركيزة الحمض النووي لهذا الفحص بنقطة كمومية باستخدام مخطط تفاعل من خطوتين باستخدام sulfo-SMCC. يتكون هذا الرابط المتشابك ثنائي الوظيفة من مجموعة إستر NHS التي يمكن أن تتفاعل مع أمين أولي ، وجزء ماليميد يمكن أن يتفاعل مع مجموعة سلفهيدريل20. يتم شحن قليل النيوكليوتيدات الثيو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بالجائزة رقم K12GM074869 للتعليم الطبي المستمر من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | Store in dessicator box |
| 5 Minute Epoxy | Devcon | 20845 | use for sealing the microfluidic device |
| acetone | Pharmco | 329000ACS | use for cleaning coverslips |
| bath sonicator | Fisher Scientific | CPXH Model 2800 | catalog number 15-337-410 |
| Beaker, glass, 100 mL | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | BIO-SVA-5K | Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate |
| biotinylated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Biotin modification and HPLC purification |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0903-5G | prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 °C before using |
| Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns | Princeton Separations | CS-100 or CS-101 | used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond |
| Centrifuge tubes 1.5. mL | |||
| Coverslips, 1-inch square glass | |||
| coverslip holders | |||
| diamond point wheel | Dremel | 7134 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | A39255 | No-Weigh Format, 7.7 mg/vial |
| drill press rotary tool workstation stand | Dremel | 220-01 | facilitates quartz drilling |
| EcoRV (REase used to generate example data) | New England Biolabs | R0195T or R0195M | Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases |
| ethanol | various | CAS 64-17-5 | denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS | BioUltra, anhydrous, store in dessicator box |
| Flea Micro Spinbar | Fisherbrand | 14-513-65 | 3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack |
| fluorescein | Acros Organics | 17324 | use to make experimental buffers |
| gravity convection oven | Binder | 9010-0131 | |
| handheld rotary multitool | Dremel | 8220 | use for drilling holes in quartz flow cell topper |
| ImagEM X2 EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-23B | air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control |
| Imaging spacer, double-sided, adhesive | |||
| Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high) | |||
| magnesium chloride hexahydrate | Fisher Bioreagents | BP214-500 | use to make experimental buffer with magnesium |
| MATLAB software | Data analysis | ||
| metal tweezers | Fisher Brand | 16-100-110 | |
| methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000) | Laysan Bio | M-SVA-5K | Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| multiposition magnetic stirrer | VWR | 12621-022 | |
| N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) | Acros Organics | AC20818 | CAS 103-47-9, use to make CHES buffer |
| orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes | Q Instruments | 1808-0506 | with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes |
| Parafilm | |||
| PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm) | Intramedic | 6258917 | 22 G blunt needles are a good fit for this tubing size |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x | Sigma Aldrich | P7059 | Use at 1x strength |
| potassium hydroxide | VWR Chemicals BDH | BDH9262 | use a 1 M solution to clean coverslips |
| Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Invitrogen | Q21521MP | |
| Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick | Electron Microscopy Sciences | 72250-10 | holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion |
| reinforced plastic tweezers | Rubis | K35a | use for handling coverslips and building microfluidic device |
| SecureSeal Adhesive Sheets | Grace Biolabs | SA-S-1L | cut to form spacer for microfluidic device |
| Single channel syringe pump for microfluidics | New Era Pump Systems | NE-1002X-US | fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle |
| Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL | Thermo Scientific | 69570 or 69572 | used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA |
| sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8 |
| sodium chloride | Macron | 7581-12 | use to make experimental buffers |
| Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water) | Sigma Aldrich | 94046 | use to make 100 mM sodium phosphate buffer |
| Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water) | Sigma Aldrich | 74092 | use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer |
| Streptavidin from Streptomyces avidinii | Sigma Aldrich | S4762 | dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 ℃ |
| Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) | Thermo Scientific | A39268 | No-Weigh Format, 2 mg/vial |
| Syringe fitted with blunt 21 G needle | |||
| Syringe pump | |||
| thiolated oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | custom – see protocol for design considerations | Request 5' Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton |
| TIRF imaging system with 488 nm laser illumination | various | custom built | |
| Tris -HCl | Research Products International | T60050 | use to make experimental buffers |
| Tris base | JT Baker | 4101 | use to make experimental buffers |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | use to make blocking buffer |
| Ultrapure water | |||
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| Wash-N-Dry Coverslip Rack | Electron Microscopy Sciences | 70366-16 | used for surface functionalization of coverslips |
References
- Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).
- Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE–a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, 298-299 (2015).
- Bonnet, I., et al. Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Huang, C. -. F., et al. Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI. Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).
- Palma, M., et al. Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations. Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).
- Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).
- van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway. Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).
- Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Loparo, J. J., van Oijen, A., Hinterdorfer, P., Oijen, A. Single-molecule enzymology. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 165-182 (2009).
- Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity. Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).
- Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529 (2009).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689 (2010).
- Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).
- Winkler, F. K., et al. The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments. EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).
- Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis. Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).
